JPH04504803A

JPH04504803A - Ｈｈｖ／ｓｉｅゲノムから誘導された核酸断片と診断試薬及びｈｈｖ６感染の診断法

Info

Publication number: JPH04504803A
Application number: JP2512026A
Authority: JP
Inventors: コランドル、エレーヌ; モンタニエ、ルック; アグゥト、アンリ; ベシェ、ジャン―マリ
Original assignee: アンスティートゥ　パストゥール; ユニヴェルシテ　パリ　シージェム
Priority date: 1989-08-18
Filing date: 1990-08-17
Publication date: 1992-08-27
Also published as: FR2651007B1; WO1991002794A1; US5698392A; US5545520A; ATE135404T1; EP0440772B1; FR2651007A1; CA2039159A1; EP0440772A1; EP0688874A3; EP0688874A2; DE69025907T2; DE69025907D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＨＶ／ＳＥＥゲノムから誘導された核酸断片と診断試薬及びＨＨＶ６感染の診断法この発明は、ＨＨＶ６ウイルスゲノムから誘導された核酸断片、その断片を含有するベクター、及びそのウィルスを含む感染の診断への使用に関する。

ヘルペス−ウィルス群に分類された二本鎖含有ウィルスである）ｒＨＶ６ウイルスは、ＡＩＤＳ患者又はリンパ増殖異常の患者から単離されている。このウィルスはまた、小児バラ診の病因ともみなされている。

このウィルスの各種の菌株が知られている。すなわち、ＨＢＬＶ株は、特にＢリンパ株に感染するもので、５ＡＬＡＨＵＤＩＮら（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４虹３９６．１９８６）やＰＣＴ出願Ｗ○８８１０１３８７に記載されており、３９ＴＡＮ株ＣＡＧＵＴら、　Ｒｅｓ、　Ｖｉｒｏｌ、　１４０工２３、１９８９）やＳＩＥ株はＴリンパ球を感染しく　ＡＧＵＴら。

Ｌａｎｃｅｔ　ｉ、　７１２．１９８８）がある。

ＳＩＥ株のゲノムは約１６０ｋｂの大きさで、本質的に直線状の二本鎖ＤＮＡからなり、そのＧＣ含貴は３８〜４０％の間で、繰り返し末端配列を有する。

この発明の目的は、ＨＨＶ６／ＳＩＥ感染の特異診断ができる核酸試薬、およびいずれのＨＨＶｅ株を含有する感染の一般的の診断ができる核酸試薬も提供することにある。この目的のため、この発明者らは、ウィルスＨＨＶ６／ＳＩＥゲノムの３つの断片を選択、クローン、特性化した。

この発明の主題は、適当な１１Ｆ！！酵素での消化により得られることを特徴とするＨＨＶ６／ＳＩＥウィルスのゲノムＤＮＡ断片である。

この発明の好ましい具体例によれば、その二本ｆｆ１ＤＮＡ断片の１つは、ＨＨＶ６／Ｓ　Ｉ　ＥウィルスのゲノムＤＮＡを酵素ＢａｍＨＩでの消化によって得られること、そのサイズは５ｋｂであること、その末端の１つから、ＥｃｏＲＩ制限部位１．８ｋｂを含むことを特徴としている。

この発明の他の好ましい具体例によれば、その二本鎖ＤＮＡ断片の１つは、ＨＨＶ６／Ｓ　ＩＥウィルスのゲノムＤＮＡを酵素ＢａｍＨＩでの消化で得られること、そのサイズが８５０ｂｐであること、および次の配列５’−ｅＣＧ＾ＣＧＣＣＴＮコＡＮコεＧＴＣＧＡ？ででＣＴ入コ１にｔまＣＣＧ？ぬ１・・・−３′ （Ｅｌを有することで特徴づけられる。

ＨＨＶ６／Ｓ　ＩＥゲノムのこの断片は、全ての公知法に保存されているＨＨＶ６ゲノムのゾーンに対応する。

この発明は、また、合成、半合成又は遺伝子工学によって得られ、かつ上記に定義したごときＤＮＡ断片から誘導されるヌクレオチド配列で、その配列が、前記断片の配列の全部又は一部を含有する二本ｊｉＤＮＡ配列であるかまたは上記の断片の１つまたは他のストランドの全部又は１部に相補の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの何れも包含する。

この発明の好ましい具体例では、特に次のオリゴヌクレオチド配列式中ＸはＴ又はＵで、配列（Ｉ）から誘導されるものを包含する。

この発明の他の好ましい具体例は、オリゴヌクレオチド配列（Ｉｔ）と（Ｉ［）又はオリゴヌクレオチド配列（Ｉ［）と（ＩＶ）をイニシエーターとし、ＨＨＶ６ゲノムＤＮＡをマトリックとして用いてＰＣＲ増幅法で得られ、それぞれの長さが２４９と１７０ｂｐであるヌクレオチド配列からなる。

この発明の他の好ましい具体例は、この発明によるＨＨＶ　６／Ｓ　Ｉ　Ｅゲノム断片の１つの配列の全部又は１部を含有する組換えＤＮＡ配列からなり、特に次のもののようなものからなる。

上記の５ｋｂＤＮＡ断片をプラスミドＰＴＺ　１９Ｒに挿入して得られるプラスミドｐＨＣ−５、および上記の８５０　ｂｐＤＮＡ断片をプラスミドＰＴＺ　１９Ｒに挿入して得られるプラスミドｐＨＣ−５゜この発明の主題は、また、上に定義したごとき少なくとも１つの組換えＤＮＡ配列を含有する形質転換の真核生物又は原核生物である。

上記のプラスミドで形質転換されたＥｃｏＤＨ５のクローンは、ナショナル　コレクション　才ブ　マイクロオルガニズムカルチャーズ（ＣＮＣＭ）に１９８９年７月１９Ｅｒに提出されたものであり、プラスミドｐＨＣ−５で形質転換されたクローンは、ファイルＮａｌ−８９５で、プラスミドＩ）ＨＣ−１４７で形質転換されたクローンのファイルＮαは、ｌ−８９６である。

この発明の主題は、また、この発明によるＨＨＶ＆／Ｓ　ＩＥウィルスゲノム（上記に定義）の少なくとも１つと、少な（とも１つの適当な検出手段との組合せを含むことを特徴とする診断薬である。

この診断薬は、ハイブリッド形成及び／又は増幅による核酸検出をベースとする非常に多数の診断技法に用いることができる。特に８５０ｂｐＢａｍＨｒ断片からの試薬は保存配列に対応し、全てのＨＨＶ６株の検出ができる。

この発明は結果として、生体サンプルをこの発明による試薬と接触させる工程と、その試薬と生体サンプル中に存在しつるウィルスの１以上のＤＮＡとの間の特異相互作用を検出する工程とからなることを特徴とする、生体サンプル中のＨＨＶ６／ＳＩＥウィルスの検出またはより一般的には生体サンプル中のＨＨＶ６ウイルスの検出の何れかができる診断法に関する。

この発明の好ましい具体例では、検出は、ＰＣＲ増幅法（Ｔａｑポリヌクレアーゼによるチェーン増＠）によって行われ、上で定義したＤＮＡ断片からのオリゴヌクレオチド配列はイニシエーターとして、かつ適当な場合にはプローブとして用いられる。

この具体例の好ましい変形では、ＨＨＶ６株の全部の検出かできるように、ヌクレオチド配列（Ｉ［）と（ＩＩＩ）又はヌクレオチド配列（ＩＩＩ）と（ＩＶ）がイニシエーターとして用いられ、ヌクレオチド配列（ＩＶ）が適当な場合にプローブとして用いられる。

この発明の主題は、またこの発明の少なくとも１つの試薬と上記の方法を行なうための手段との組合せからなることを特徴とするＨＨＶ６及び／又はＨＨＶ６／ＳＩＥ感染診断用キットである。

この発明は、この発明の試薬の調製とそれのＨＨＶの検出への用途についての実施例に関する。次の残りの記載を参照することにより良く理解されるであろう。

■、この発明による核酸断片と分子の調製Ａ）ＨＨＶ６　ＩＥ　の　とＨＨＶ６／Ｓ　ＩＥ株は、ＨＴＬＶ−１白血病でＨＩＶ−：Ｈ，：セロポジティブの患者から単離された。

ウィルスを末梢血リンパ球中で繁殖する。

この株の単離と繁殖はＡＧＵＴら（Ｌａｎｃｅｔ　ｉ、　７１２．　１９８８）の刊行物中に記載されている。

Ｂ）この　によ　の　゛実施例１：５ｋｂと８５　ｏｂｐ　Ｂａｍ　ＨＩ断片の製造とクローン化感染ＢｐＬ　（末梢血リンパ球）セルから抽出したＤＮＡを酵素ＢａｍＨＩで完全に消化させる。

消化で得られる断片は１０〜３０％シュクロース傾斜で分離される。

１５ｋｂより小さなサイズの断片を多官能プラスミドＰＴＺ１９ＲのＢａｍＨＩ部位に挿入し、Ｅ、ｃｏｌ　１ＤＨ５菌に導入する。

このようにして得られたゲノムブランクを、１０〜６０％シュクロース傾斜で精製されたピリオンから単離のウィルス性ＤＮＡを用いてスクリーニングし、かつＣＴＰ”Ｐでラベル化する。

次いで、２つの組換え体が選択された。すなわちＨＨＶ　６　／ＳＩＥゲノムＤＮＡの８５０ｂｐ挿入断片からなるプラスミドｐＨＣ−５を含むクローンで、このクローンは、ＣＮＣＭに、受理番号１−８９４として１９８９年７月１９日に提出されている。

図１はプラスミドｐＨＣ−５の制限マツプを示す。ノ＼ツチしたゾーンは、８５０ｂｐ挿入断片の所在を示す。この挿入断片には、酵素Ｈｉｎｄ　［、Ｋｐｍ　Ｉ、Ｓａｃ　Ｉ、　Ｓｍａ　Ｉ　に対する何れの制限部位も含まない。この挿入断片は、部分的に配列か決められた。最初の３１０塩基に対応する配列は式（Ｉ）で表わされる。

プラスミドｐＨＣ−１４７を含有するクローンはＨＨＶ６／ＳＩＥゲノムＤＮＡの５ｋｂ挿入断片からなる。この断片は、ＣＮＣＭに受理番号ｌ−８９６として１９８９年７月１９日に提出されている。

図２はプラスミド１４７の制限マツプを示す。ハツチしたゾーンは、５ｋｂ挿入断片の所在を示す。この挿入断片は、その末端の１つにＥ、ｃｏＲＩ制限部位１．８ｋｂを有し、酵素ＳｍａＩ。

Ｓａｌ　ｒ、Ｓａｃ　ｒ、　Ｋｐｍ　ｒ、及びＸｂａｒの何れの部位も含まない。

実施例２　：３．９ｋｂ　ｌａ　Ｉ　の　゛　クローンこの手法は、実施例１と、ＢｐＬセルから抽出したＤＮＡが酵素Ｃ１ａＩで消化され、得られた断片をプラスミドｂｐＲ３２２のＣ−１ａ　Ｉ部位に挿入する以外、同じである。

組換えクローンを、得られたゲノムブランクから選択した。

このクローンは、ＨＨＶ６／Ｓ　ＩＥゲノムＤＮＡの３．９ｋｂ挿入断片を保持するプラスミドｐＨＣ−４４を含む。このクローンは、ＣＮＣＭに、１９８９年７月１９２ｉ受理番号ｌ−８９５として提出されている。

図３はプラスミドｐＨＣ−４４の制限マツプを示す。ハツチしたゾーンは、３．９ｋｂ挿入断片の所在を示す。この断片はその末端の１つにＰｓｔ　１部位５４ｂｐを保持し、何れのＨｉｎｄＩ［部位も含まない。

■、生体サンプル中のＨＨＶ６ウイルスの存在の検出実施例３　：　ＰＣＲを使用する検出法次の配列（Ｉ）から合成オリゴヌクレオチドを得た。　第１　（Ａ）は配列（Ｉ）の最初の２０塩基に対応する配列（ｆｆ）からなる。　第２（Ｂ）は配列（１）の塩基２２７〜２４９を相補する配列（■）からなる。

第３（Ｓ）は配列（ＩＶ）からなり、配列（Ｉ）の塩基７９〜９１に対応する。

これらのヌクレオチドはＴａｑポリメラーゼを用いるチェーン増幅反応に使用される。

反応混合物は、全量１９０μｇに対し、２つのイニシェーター（Ａと８１又はＢ、！：ｓ）の各ｈＯ）０．１−０．５ｔｔＭ、　４ツ（７）デ、１−キシリボヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ。

ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の各２００　ｕＭＳＭｇ　Ｃ１ｚ（７）１．５ｍＭ、　ＫＣ１、の５−０ｍＭ、　ｐＨ８，３のトリス−ＭＣＩの１０ｍＭ、ゼラチンの０．１％（重量／容量）　、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ）の１単位と、増幅される配列を含みそうなりＮＡサンプル００〜３００ｎ　ｇを含有する。

次表Ｉに示した条件下で３ａ増幅サイクルを行なう。

表１変　性　９４℃　５分　１分　１分ジョン　７２℃　１分　１分　７分増幅生成物をエチジウムプロミド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）　１　ｇ／ｓｔ’含有のアガロースゲル上で分析し、２５４ｎｍでの蛍光を測定して検出した。

増幅反応の特異性は、“サザーン　ブロッティング法を用いる反応の生成物を検出することにより証明される。すなわち、増幅生成物は、アガロースゲルからナイロン膜（ゼタブローブ）に移送され、プローブとしてｓｔｐ標識標識オリゴヌクレオチド用いて検出が行われる。

オリゴヌクレオチドＡと８をイニシエーターとして使用すると、２４９ｂｐ断片が３０増幅サイクル後に検出され、オリゴヌクレオチドＢとＳをイニシエーターとして使用すると、１７０ｂｐ断片−が３０増幅サイクル後に検出される。

これら２つの断片をＨＨＶ６／ＨＢＬＶ、ＨＨＶ６／３９ＴＡＮ及びＨＨＶ６／ＳＩＥ株に属するウィルス感染のセルからのＤＮＡからなる全サンプル中で検出することが可能である。

検出の感度は、増幅サンプルとして、所望の配列含有のＨＨＶ６／ＳＩＥウィルスゲノムの断片が挿入されているプラスミドＤＮＡか又はＨＨＶ６で感染したＰＢＬセルの全ＤＮＡを用いて決定された。すなわち第１のケースで、低検出限界番よりＮへの０．３ｆｇに相当し、第２のケースで、ＤＮＡの５　ｆｇＧこ相当する。

上記から分かるように、発明は、ここにより詳細に記載した具体例、手段及び応用のものに限定されるものではなく、この発明の構成又は範囲の何れから離れることなく当業者が考えることができる全ての変形も包含される。

トーーーｓｔＩ国際調査報告一一−−＾沖−”””’　ＰＣＴ／ＦＤ　Ｑｌｌ／ｎｎ＆＋ａ国際調査報告ＦＲ９０００６１８ＳＡ　３９８２４

Claims

【特許請求の範囲】

１．そのゲノムＤＮＡの適当な制限酵素による消化によって得ることができることを特徴とし、酵素ＣｌａＩでの消化によって得られる３．９ｋｂ断片を除く、ＨＨＶ６／ＳＩＥウィルスのゲノムＤＮＡ断片。
２．酵素ＢａｍＨＩでの消化によって得られること、そのサイズがほぼ５ｋｂであり、その末端の１つにＥｃｏＲＩ制限部位１．８ｋｂを含有することを特徴とする請求項１によるＤＮＡ断片。
３．酵素ＢａｍＨＩでの消化によって得られること、そのサイズが８５０ｂｐであり、そのストランドの１つが次の配列：【配列があります】（Ｉ）を含有することを特徴とする請求項１によるＤＮＡ断片。
４．請求項１〜３の何れかによるＤＮＡ断片の全部又は１部からなり、又はその断片の１つ又は他のストランドの全部又は１部を相補するものであることを特徴とするヌクレオチド配列。
５．次の配列【配列があります】（ＩＩ）（Ｘ＝Ｔ又はＵ）を含むか又はからなることを特徴とするヌクレオチド配列、又はその相補配列。
６．次の配列【配列があります】（ＩＩＩ）（ＸはＴ又はＵ）を含むか又はからなることを特徴とするヌクレオチド配列、又はその相補配列。
７．次の配列【配列があります】（ＩＶ）（ＸはＴ又はＵ）を含むか又はからなることを特徴とするヌクレオチド配列、又はその相補配列。
８．イニシエーターとしてヌクレオチド配列（ＩＩ）と（ＩＩＩ）をマトリックスとしてＨＨ▽６ゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅法で得られ、かつその長さが２４９ｂｐであることを特徴とする請求項４によるヌクレオチド配列。
９．組換えで得られることを特徴とする請求項４によるヌクレオチド配列。
１０．プラスミドｐＨＣ−１４７からなり、そのプラスミドが請求項２によるＤＮＡ断片のプラスミドＰＴＺ１９Ｒ中に挿入することによって得られることを特徴とする請求項９による組換えＤＮＡ。
１１．プラスミドｐＨＣ−５からなり、そのプラスミドが請求項３によるＤＮＡ断片のプラスミドＰＴＺ１９Ｒ中に挿入することによって得られることを特徴とする請求項９による組換えＤＮＡ。
１２．請求項９〜１１の何れか１つによる少なくとも１つの組換えＤＮＡ配列を含むことを特徴とする形質転換された真核生物又は原核生物。
１３．ＣＮＣＭ（ナショナルコレクションオブマイクロオルガニズムカルチャーズ）にＮｏ．Ｉ−８９５として提出され、プラスミドｐＨＣ−５で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉＤＨ５株の細菌細胞からなることを特徴とする請求項１２によるクローン。
１４．ＣＮＣＭにＮｏ．Ｉ−８９６として提出され、プラスミドｐＨＣ−１４７で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉＤＨ５株の細菌細胞からなることを特徴とする請求項１２によるクローン。
１５．請求項４〜１１の何れか１つによる少なくとも１つのヌクレオチド配列と少なくとも１つの検出手段との組合せを含むことを特徴とする診断薬。
１６．生体サンプルを請求項１５による試薬と接触させる工程と、その試薬と生体サンプル中に存在しうるそのウィルスの１以上のＤＮＡ配列との間の特異相互作用を検出する工程からなることを特徴とする生体サンプル中のＨＨＶ６／ＳＩＥウィルス及び／又はＨＨＶ６ウィルスの存在を診断する方法。
１７．請求項１〜３の何れか１つによるＤＮＡ断片からのオリゴヌクレオチド配列をイニシエーターとして、かつ適当な場合にはプローブとして用いることを特徴とする、ＰＣＲ増幅法で行われる増幅工程からなる請求項１６による方法。
１８．ヌクレオチド配列（ＩＩ）と（ＩＩＩ）、又はヌクレオチド配列（ＩＩＩ）と（ＩＶ）をイニシエーターとして用い、ヌクレオチド配列（ＩＶ）を適当な場合にプローブとして用いることを特徴とする請求項１７による方法。
１９．請求項１５による少なくとも１つの試薬と請求項１６〜１８の何れか１つによる方法を行なうための手段との組合せからなることを特徴とするＨＨＶ６及び／又はＨＨＶ６／ＳＩＥ感染の診断用キット。