JPH04504842A - Ａｉｄｓ、ａｒｃおよびｈｉｖ感染の治療または予防のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＡＩＤＳ、ＡＲＣおよびＨＩＶ感染の治療または予防のための組成物および方法 １１ユ１皿立旦 本発明は、後天性免疫不全症候群、エイズ関連疾患、およびＨｒ　ｖ！ｇ染の治 療および予防に有用なワクチン、組成物、および方法に関する。特に、本発明は 、ＡＩＤＳ％　ＡＲＣ。

およびＨＩＶ感染の治療あるいは予防のための、薬学的に有効な組成物に関する 。この組成物は、免疫学的に有効な量の可溶性Ｔ４タンパクによって特徴づけら れる。この可溶性Ｔ４タンパクは、治療されている患者に可溶性Ｔ４タン／ｆり に対する抗体の形成を引出すか、あるいは代わりに、ＡＩＤＳ、ＡＲ仁　あるい はＨＩＶ感染の拡散、重篤の程度、免疫不全にする影響に対する防御あるいは軽 減に、かわって効果を示す他のタンパクの放出を、治療されている患者に引き出 す。

１肌囚！ｌ １９２３球として知られる免疫調節細胞のクラスは、２つの広い機能上のクラス に分けられる。一つのクラスには、Ｔヘルパーあるいはインデューサー細胞が含 有され、これらはＴ細胞の増殖、リホカインの放出、あるいはＩｇ放出のための ヘルパー細胞の相互作用を媒介する。そして、二つ目のクラスには、細胞傷害性 Ｔ細胞あるいはサプレッサー細胞が含有され、これらは、Ｔ細胞媒介の傷害およ び免疫応答抑制に関係する。一般に、リンパ球のこの二つのクラスは、２個の表 面糖タンパクのうちの１個の発現によって区別される。Ｔ４すなわちＣＤ４　（ 分子量５５０００〜６２０００ダルトン）は、これはＴヘルパーあるいはインデ ニサー細胞に発現される、おそらく単量体タンパクであり、Ｔ８すなわちＣＤ８ 　（分子量３２０００ダルトン）は、細胞傷害性Ｔ細胞あるいはサプレッサーＴ 細胞に発現される二量体のタンパクである。

免疫適格者では、１４９２８球は、免疫系の他の特別な型の細胞と相互作用して 、感染に対して免疫を与えるか、あるいは感染を防御するＣ　Ｅ、　Ｌ、　Ｒｅ １ｎｈｅｒｚおよびＳ、　Ｆ、　Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ、−Ｔｈｅ　Ｄｉｆｆｅ ｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ−Ｃｅｌｌｓ −、Ｃｅ１ｌ。

１９、ｐ＋）、８２１−２７（１９１１０）］。特に、Ｔ４リンパ球は、免疫系 の活性化に重要な成長因子の生産を刺激する。例えば、造血幹細胞から派生した Ｂ細胞を刺激するのに作用し、防御性の抗体の生産を促進する。さらに、マクロ ファージ（”キラー細胞”）を活性化して、感染した宿主細胞あるいはなんらか の異常のある宿主細胞を攻撃し、ならびに、単球（″スキャベンジャー細胞”） を誘導して侵入した病原菌を封じんで破壊する。

ある感染因子の最初の標的は、１４表面タンパクであることが見いだされた。こ れらの因子には、例えば、ウィルスおよびレトロウィルスが含まれる。１４９２ ８球がこのような因子にさらされると非活性になる。結果として、宿主の複雑な 免疫防御系は破壊され、そして宿主は広範囲の日和見感染にかかりやすくやる。

このような免疫抑制は、後天性免疫不全症候群（”ＡＩＤＳ”）にかかつている 患者に見られる。ＡＩＤＳは、深刻なあるいは典型的な完全な免疫抑制、および 付随する広範囲の日和見感染症および悪性感染症にたいする宿主抑制性によって 特徴付られる。ある場合には、ＡＩＤＳは中枢神経系の異常を伴う。ＡＩＤＳの 完全な臨床上の症状には、通常、慢性全身性のリンパ節症、発熱、および体重の 減少などのエイズ関連疾患（”ＡＲＣ”）が先行する。ヒト免疫不全ウィルス（ ’ＨＩＶ″）のようなレトロウィルスは、ＡＩＤＳ感染およびその前兆であるＡ ＲＣに関わる病因因子であると考えられている［Ｍ、　Ｇ、　Ｓａｒｎｇａｄｈ ａｒａｎら、”　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｃｏｎｔ ｉｎｕｏｕｓ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　Ｒｅｔｒ ｏｖｉｒｕｓｅｓ　（ＨＴＬｌ／−１１１）　Ｆｒｏｍ＋　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　 Ｗｉｔｈ　ＡＩＤＳ　Ａｎｄ　Ｐｒｅ−ＡＩＤＳ−、５ｃｉｅｎｃｅ、　２２４ ．　ｐｐ、　４９７−５０８　（１９８４）コ。＊Ａ　Ｉ　ＤＳ／ＡＲＣ３の集 団テストで８５〜１００％がＨＩＶに対して血清学的に陽性であった　ＣＧ、Ｎ 、５ｈａｖら、”　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　 Ｏｆ　ｌ（ｕｍａｎＴ−Ｃｅｌｌ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ（Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉ ｃ）Ｖｉｒｕｓ　Ｔｙｐｅ　Ｉｌｌ　Ｉｎ　Ｔｈｅ　Ａｃｑｕｉｒｅｄ　Ｉｍｍ ｕｎｅ　Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ−，５ｉｅｎｃｅ、　２２６ ．ｐｐ、１１６５−７０（１９８４）コ　。

＊本願におけるヒト免疫不全ウィルス（”ＨＩＶ”）は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ ｎａｌ　Ｃｏｍｍ１ｔｔｅｅ　Ｏｎ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ　Ｏｆ　Ｖｉｒｕｓｅｓ のヒトレトロウィルス小委員会に採用されている総称であって、ＡＩＤＳ患者か ら個別に単離されもののことであり、それらにはヒトＴ細胞９冫３ じＬＡＶ”）、ヒト免疫不全ウィルス１型（”ＨＩＶ−１”）およびＡＩＤＳ関 連レトロウィルスじＡＲＶ”）が含まれる。

一連のＨＩＶウィルスの宿主は、Ｔ４表面糖タンパクを有する細胞に関連する。

このような細胞には、１４９７８球および脳細胞が含まれる［　Ｐ．Ｊ　、Ｍａ ｄｄｏｎら、−Ｔｈｅ　Ｔ４　Ｇｅｎｅ　Ｅｎｃ。

ｄｅｓ　Ｔｈｅ　ＡＩＤＳ　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｎｄ　Ｉｓ　Ｅ ｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｉｎ　Ｔｈｅ　１ｍｎ＋ｕｎｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ａｎｄ　Ｔ ｈｅ　Ｂｒａｉｎ−、Ｃｅｌｌ，４７，ｐｐ．３３３−４８（１９８６）コ　。

ＨＩＶウィルスによる宿主の感染で、１４９７８球は非活性になる。ＡＩＤＳ／ ＡＲＣ症候群の進行は、Ｔ４表面糖タンパクを示すＴ４”！Ｊンバ球の減少と相 関性が有り得る。引続き免疫不全が伴うこのＴ４細胞の減少は、感染および溶解 生長の再発サイクル、および細胞媒介によるウィルスの拡散の両者に原因し得る 。さらに、臨床上の症状は、ＨＩＶウィルスが、多くのＡＩＤＳ患者に見られる 中枢神経系の異常に直接関係していることを示唆′している。

Ｔ４”細胞に対するＨＩＶウィルスの同性は、膜アンカー性のウィルスレセプタ ーとしてのＴ４４細胞面糖タンパクの役割に原因していると考えられる。ＨＩＶ ウィルスレセプターとしてＴ４は動くので、その細胞外配列は、ＨＩＶ結合にお いて直接的な働きをしている。特に、ＨＩＶエンベロープタンパクは、宿主細胞 への侵入開始にこの相互作用を用いて、選択的にＴ４エピトープに結合すると考 えられている［Ａ．Ｇ。

Ｄａｌｇｅｌｉｓｈ　ら、”Ｔｈｅ　ＣＤ４（Ｔ４）　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｉｓ　 Ａｎ　Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｃ。

ｍｐｏｎｅｎｔ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｆｏｒ　Ｔｈｅ　ＡＩＤＳ 　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ−、Ｎａｔｕｒｅ，　３１２．　ｐｐ．　７６３−６７ 　（１９８４）　；Ｄ．　Ｋｌａｔｚｍａｎｎ　ら、”Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔ ｅ　Ｔ４Ｍｏｌｅｃｕｌｅ　Ｂｅｈａｖｅｓ　Ａｓ　Ｔｈｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ 　Ｆｏｒ　Ｈｕｍａｎ　ＲｅｔｒｏｖｉｒｕｓＬＡＶ　、”Ｎａｔｕｒｅ．３１ ２，ｐｐ．７６７−６８（１９８４）］。従って、Ｔ４の細胞発現は、Ｔ４タン パクがＨＩＶウィルスのレセプターとして働くのでＨＩＶ結合に十分であると考 えられている。

可溶性Ｔ４タンパクに基づく治療法は、ＨＩＶ関連感染症ＡＩＤＳおよびＡＲＣ の治療および予防のために提案された。

ヒトＴ４タンパクの全長を意図的にコードするＤＮＡのヌクレオチド配列および 推定アミノ酸配列が報告されている［Ｐ。

Ｊ．Ｍａｄｄｏｎ　ら、”　Ｔｈｅ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅ ｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　Ｏｆ　Ａ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｃｏｄｉｎｇ　Ｔｈ ｅ　Ｔ　Ｃｅ１ｌ　５ｕｒｆａｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔ４：　Ａ　ＮｅｗＭｅ ｍｂｅｒ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｆａｍｉ ｌｙ　、−Ｃｅ旦．　４２．　１）Ｉ）、　９３−１０４　（１９８５）］。推 定された一次構造に基づいて、Ｔ４タンパクは次のドメインに分けられる。

（以下余白） 出　される　二土△１旦血！ 疎水性／分泌シグナル　−２３　〜ー１■ー領域相同／細胞外　＋１　〜＋９４ Ｊ−領域相同／細胞外　＋９５　〜＋１０９糖分解領域／細胞外　＋１１０〜＋ ３７４疎水性／ トランスメンブラン配列＋３７５〜＋３９５高親水性／細胞質内　＋３９６〜＋ ４３５可溶性Ｔ４タンパクは、Ｔ４タンパクの全長をアミノ酸の３７５の位ｌｆ で切断して、トランスメンブレムドメインおよび細胞質ドメインを取り除いて構 築された。このようなタンパクは組換え技術によって生産される［　Ｒ．　Ａ． 　Ｆ　１ｓｈｅｒら、−ＨＩＶ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　Ｉｓ　Ｂｌｏｃｋｅｄ　 Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｂｙ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　５ｏｌｕｂｌｅ　ＣＤ４。

”Ｎａｔｕｒｅ　、３３１．ｐｐ．７６７６−７１１（１９８］。　可溶性Ｔ４ タンパクは、１４表面タンパクを発現する細胞のＨＩＶ感染を阻害する阻害機構 あるいは競合結合機構によってＴ４／ＨＩＶ相互作用を都合よく妨害する。そし て、可溶性Ｔ４タンパクは、Ｔ４４リンパ球と抗原提示細胞との相互作用、およ びＴ４’リンパ球と７　４　”　’Ｊンパ球媒介傷害性標的物との相互作用を阻 害する。

可溶性ウィルスレセプターとして作用することによって、可溶性Ｔ４タンパクは 、Ｔ４”細胞へのＨＩＶ結合、およびウィルスにより誘導される融合細胞形成を 阻害するための抗ウイルス治療剤として有用である。

ＡＩＤＳおよびＡＲＣの治療および予防に提案された方法は、サラにウィルスの ライフサイクル中の特有な過程であるＨＩＶの逆転写酵素を標的とする抗レトロ ウィルス剤の開発を目指してきた。このような薬剤は、作用機構としてＨＩＶの 逆転写酵素の阻害を用いる。このような薬剤には、例えば、スラミン、アジドチ ミジン（”ＡＺＴ”）、およびジデオキシシチジンが含まれる［Ｈ，Ｍｉｔｓｕ ｙａ　ら、−３’−Ａｚｉｄｏ　−３−Ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　（ＢＷ 　ＡＳＯ９Ｕ）：Ａｎ　Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ａｇｅｎｔ　Ｔｈａｔ　Ｉｎｈｉ ｂｉｔｓＴｈｅ　［ｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ　Ａｎｄ　Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　Ｅ ｆｆｅｃｔ　Ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　Ｖｉｒｕｓ　 Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ／Ｌｙｍｐｈａｄｅｎｏｐａｔｈｙ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　 Ｖｉｒｕｓ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ、−Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ、８２．ｐｐ、７０９６−７１００（１９８５）；■、Ｍｉｔｓｕｙａおよ びＳ、Ｂｒｏｄｅｒ、−Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　Ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｉｎ　Ｗｉｔｒ ｏ　［ｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ　Ａｎｄ　Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ　Ｅｆｆｅｃｔ　 Ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ−Ｌｙｍｐｈａｔｒｏｐｉｃ　Ｖｉｒｕｓ　Ｔｙｐｅ　Ｉ ＩＩ／Ｌｙｍｐｈｏｄｅｎｏｐａｔｈｙ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｖｉｒｕｓ（ ＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ）　Ｂｙ　２°、　３−Ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏ ｓｉｄｅｓ、　”　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、１１３ ．ｐｐ、１９１１−１５（１９８６）；　Ｒ，Ｙａｒｃｈｏａｎ　ら、”Ａｄｍ ｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　Ｏｆ　３°−Ａｚｉｄｏ−３’−Ｄｅｏｘｙｔｈｙｍ ｉｄｉｎｅ、　Ａｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｏｆ　ＨＴＬＩ／−１１１／ＬＡＹ 　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、　Ｔｏ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　Ｗｉｔｈ　ＡＩＤＳ　 ｏｒ　ＡＩＤＳ−Ｒｅｌａｔｅｄ　ＣｏｍｐｌｅｘどＬａｎｃｅｔ、ｐｐ、５７ ５−８０（Ｍａｒｃｈ　１５゜１９８６）］。

これらの薬剤は各々、インビトロでＨＩＶに対して活性を示すが、ＡＺＴのみが 、厳密に擬薬用に制御された臨床試行によってその臨床上の信頼性が確かめられ た。しかし、ＡＺＴを受ける患者の数は増加しているが、少量の投与にしか耐え られない。ＡＺＴのある程度の投薬量にはリン７−ｅ毒性があると報告されてい る［　Ｙａｒｃｈｏａｎら、上記］。ＡＺＴの有効量の投与には、顆粒球減少お よび貧血のような望ましくない衰弱させる副作用がある。それ故に、ＡＩＤＳお よびＡＲＣの治療に長期間にわたってＡＺＴを用いるのには、血液毒性が重大な 制限因子として現れる［Ｄ、Ｄ、Ｒｉｃｈｍａｎら、”　Ｔｈｅ　Ｔａｘｉｃｉ ｔｙ　Ｏｆ　Ａｚｉｄｏｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　（ＡＺＴ）　Ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｔｒ ｅａｔｍｅｎｔ　Ｏｆ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　Ｗｉｔｈ　ＡＩＤＳ　Ａｎｄ　ＡＩ ＤＳ−Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｃｏｍｐｌｅｘ：　Ａ　Ｄｏｕｂｌｅ−Ｂｌｉｎｄ、　 Ｐｌａｃｅｂｏ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｔｒｉａｌ、”　Ｎ、Ｅｎ　、Ｊ、Ｍ ｅｄ、、３１７．ｐｐ、１９２−９７（１９８７）］。

他の多（の予防剤および治療剤の規制は、ウィルスの複製サイクル中の逆転写以 外の過程に対する抗レトロウイルス活性を示す薬剤に基づいている［ＰＣＴ特許 出願Ｎｏ　８７１０３９０３］。

このような方法には、植物アルカロイド　カスタノスペルミンのようなグルコシ ダーゼインヒビターの投与が含まれる。

これは、ＨＩＶ感染細胞のエンベロープ糖タンパクのＮ−結合オリゴ糖鎖の正常 な過程を阻害することによって、その糖タンパクのグリコジル化を改変し、細胞 表面の活性エンベロープタンパクの発現を減退させ、そして感染性のウィルス粒 子の生産を阻害する。しかしながら、このような抗レトロウィルス剤は、単一の 治療剤として与えられる場合、その使用量が多いときに細胞の代謝に毒性の影響 を及ぼし得る。

それ故に今日、ＡＩＤＳＳ　ＡＲＣ，およびＨＩＶ感染の治療および予防に、従 来の薬剤の不都合さを回避した、効果的な免疫治療剤、方法および方策の開発の 必要性が存在する。

１豆旦！互 本発明は、後天性免疫不症候群、エイズ関連疾患、およびＨＩＶ感染の治療およ び予防のための薬学上効果的な組成物および方法を提供することにより上記の問 題を解決する。本発明の組成物および方法は、可溶性Ｔ４タンパクによって特徴 づけられる。この可溶性Ｔ４タンパクは、治療される患者に可溶性Ｔ４タンパク に対する抗体の形成を引き起こすか、あるいはＡＩＤＳＳ　ＡＲＣＳ　ＨＩＶ感 染の拡散、重篤の度合、あるいは免疫不全にする影響を防御するかあるいは軽減 に、かわって効果を示す他のタンパクの放出をもたらす。

゛　の　な會　日 図１は、プラスミドｐＬ７Ｑ−２の、Ｔ４　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および 誘導されるアミノ酸配列を示す。

図２は、プラスミドｐＢＧ３８１の、Ｔ４　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および 誘導されるアミノ酸配列を示す。

図１および図２において、アミノ酸は次のように一文字の略号で示される。

＊は終止コドンの位置である。

図１において、Ｔ４タンパクの翻訳開始点（Ａ　Ａ−２３）はヌクレオチドの１ １９９−１２０１のメチオニンの位置にあり、そして成熟Ｎ末端はヌクレオチド １２７４−１２７６のアスパラギン（ＡＡ３）に位置している。

図２において、Ｔ４タンパクの翻訳開始点（Ａ　Ａ−２３）はヌクレオチドの１ ２０７−１２０９のメチオニンの位置にあり、そして成熟Ｎ末端はヌクレオチド １２８２−１２８５のアスパラギン（ＡＡ３）に位置している。

図３Ａは、ｒｓＴ４処理前、処理中、および処理後に、インビトロで外来のＳＩ Ｖ□。に感染させた正常サルの骨髄細胞の、逆転写酵素の活性値を示す。

図３Ｂにおいて、ｒｓＴ４処理のサルのブラスマの存在下に、インビトロで外来 のＳ　Ｉ　Ｖ、、。に感染させた正常サル由来のＰＢＬに生じた逆転写酵素の活 性を表に示す。

図４において、ＳＩＶ感染サル由来の骨髄細胞培養物、およびサルをｒｓ”ｒ４ で処理する前、処理中、および処理後の末梢血リンパ球（ＳＩＶ感染サル）／Ｈ ９共培養物の逆転写酵素の活性を表に示す。

図５において、ｒｓＴ４処理された５ＩＶ−ａａ感染サルでのＳＩＶｍ＊ｃ誘発 された疾病活性（ＳＩＶ、。、−Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ａｃｔｉｖ ｉｔｙ）によって生じた、機能異常に対するｒｓＴ４処理の効果をグラフで示す 。

図６において、ｒｓＴ４で前もって処理したサルにおける５Ｉｖｓａｏ誘発され た疾病活性によって生じた、機能異常に対するｒｓＴ４処理の効果をグラフで示 す。

図７において、ｒｓＴ４処理したＳＩＶ、、。感染サルにおけるＣＦＵ−ＧＭお よびＢＦＵ−Ｅコロニー数のｔｌ加をグラフで示す。

図８において、ｒｓＴ４処理したサル由来のプラズマ、あるいはｒ　ｓＴ４の、 ５Ｉｖ１．１．。感染サルの骨髄由来のコロニー形成細胞に対するｒｓＴ４のイ ンヒトａでの効果を表に示す。

図９において、ｒｓＴ４処理中に得たＳＩＶ□。感染サルの骨髄由来のコロニー 形成細胞に対する、ｒ　ｓＴ４処理したサル由来のプラズマのインビトロでの効 果を表に示ス。

図１０において、ｒｓＴ４処理完了後に得たＳＩＶｍａ。感染サルの骨髄由来の コロニー形成細胞に対する、ｒｓＴ４処理したサル由来のプラズマのインビトロ での効果を表に示ｆ。

図１１において、ｒｓＴ４あるいはｒｓＴ４処理したサル由来のプラズマを添加 しての、ＳＩＶｍａ。感染サルの骨髄中の、インビトロでのＣＦＵ−ＧＭの増加 を表に示す。

図１２において、ｒｓＴ４処理したサルのプラズマのＩｇＧ画分および非ＩｇＧ 画分のＣＦＵ−ＧＭの増加を表に示す。

図１３において、ｒｓＴ４処理したサルの循環リンパ球の表面結合免疫グロブリ ンを示す。

図１４において、ｒｓＴ４処理したサルのプラズマの、ＣＤ８“をのぞいてＣＤ ４”ヒトリンパ球に対する免疫グロブリンの結合を示す。

図１５において、ｒｓＴ４処理したサルのプラズマ中の、ＣＤ８°をのぞいてＣ Ｄ４ゝア力ゲザルリンパ球に対する免疫グロブリンの結合を示す。

図１６において、ｒｓＴ４免疫したサル由来のプラズマ免疫グロブリンのサルＰ ＢＬに対する結合を示す。

図１７において、ｒｓＴ４免疫されたサルのプラズマによる、ｓ　ｒ　ｖ、、。

感染サルのＰＢＬでの逆転写酵素の阻害を表に示す。

図１８において、ｒｓＴ４免疫されたサルのプラズマによる、ＳＩＶ、、。感染 した骨髄マクロファージの逆転写酵素の阻害を表に示す。

図１９において、ｒｓＴ４免疫されたサルのプラズマの存在下での３匹のＳＩＶ □。感染したサルの骨髄細胞由来のＣＦＵ−ＧＭを表に示す。

図２０において、正常アカゲザル自来の骨髄マクロファージがｒｓＴ４／ＣＦＡ 免疫感作に続いてＳＩＶ、、。感染にたいして耐性になることを示す。

図２１において、正常アカゲザル由来のＰＢＬが、ｒｓＴ４免疫感作に続いてＳ ＩＶ、、。感染に対して耐性になることを示す。

図２２において、Ｓ　Ｉ　Ｖａｓｅ感染したサルの免疫感作後、アジュバント中 のｒｓＴ４のによって、ＰＢＬおよび骨髄細胞由来のウィルスの単離ができない ことを示す。

図２３において、アジュバント中のｒ　ｓＴ４による、免疫感作後のＳＩＶ□。

感染したサルの骨髄でのＣＦＵ−ＧＭおよびＢＦＵ−Ｈの増加を示す。

１五旦１亙ム且皿 本発明は、ＡＩＤＳＳ　ＡＲＣ，およびＨＩＶ感染の治療および予防のための薬 学上受容可能な組成物および方法に関する。特に、本発明は、免疫学上効果的な 量の可溶性Ｔ４タンパクを有する薬学上効果的な組成物に関する。この可溶性Ｔ ４タンパクは、治療される患者に可溶性Ｔ４タンパクに対する抗体の形成を引き 起こすか、あるいはＡＩＤＳ、ＡＲＣ１ＨＩＶ感染の拡散、重篤の程度、あるい は免疫不全にする影響を防御するかあるいは軽減に、かわって効果を示す他のタ ンパクの放出をもたらす。一つの実施態様に従って、本発明の方法には、ＨＩＶ 感染の免疫不全のする効果の減少、ＨＩｖ感染の予防、およびＨＩＶ感染の細胞 内拡散の予防に十分な期間、薬学上受容可能な方法で、免疫学上効果的な量の可 溶性Ｔ４タンパクによる、患者の治療および免疫感作が含まれる。

本発明のワクチン、組成物および方法は、ヒトを含む哺乳類のＡＩＤＳ、ＡＲＣ ，およびＨＩＶ感染の治療および予防に用いられ得る。さらに、これらのワクチ ン、組成物および方法は、ンミアン免疫不全ウィルスのようなレトロウィルスに よる、ヒトを含む哺乳類のエイズ様疾患の治療および予防に用いられ得る。

本願において用いられている用語”免疫学上効果的な“は、治療される患者に、 可溶性Ｔ４タンパクに対する抗体の形成をもたらす能力を指している。これはＡ ＩＤＳ、ＡＲＣあるいはＨＩＶ感染に対して、ある期間患者を保護するか、ある いはＡＩＤＳ、ＡＲＣあるいはＨＩＶ感染の拡散、重篤の程度、あるいは免疫不 全にする影響を減少さす効果がある。用語パ免疫学上効果的な”は、さらに、リ ンホカイン、コロニー増殖因子、あるいはＡＩＤＳ、ＡＲＣあるいはＨＩＶ感染 に対する防御、あるいはＡＩＤＳＳ　ＡＲＣあるいはＨＩＶ感染の拡散、重篤の 程度、あるいは免疫不全にする影響を減少さす効果がある程度に、患者に免疫応 答を促進する他のタンパクのような因子の生産あるいは放出をもたらす能力をさ す。

本発明の組成物および方法は、予防的あるいは治療的な、可溶性Ｔ４タンパクの 活性の二次的な機構によって特徴づけられる。理論に捕られれることなく、本発 明の方法および組成物を特徴付る可溶性Ｔ４タンパクの機能の二次的な機構は、 ＨＩＶ感染を防御する、あるいはＨＩＶ感染の治療に効果がある可溶性Ｔ４タン パクに対する抗体の発生に基づき得る。

一方、この可溶性Ｔ４タンパク活性の二次的な機構は、インターロイキンのよう なリンホカイン、コロニー増殖因子、あるいは患者に、Ｈ（Ｖ感染を防御するか 、あるいはＨＩＶ感染の治療に効果がある免疫応答を促進する他のタンパクの発 生に媒介され得る。

本願に使用されている”可溶性Ｔ４タンパク”には、天然あるいは組換えの可溶 性Ｔ４タンパク、あるいはそれらの可溶性の誘導体、および可溶性Ｔ４タンパク の免疫治療（抗レトロウィルス）活性によって特徴づけられる、全てのタンパク 、ポリペプチド、およびペプチドが含まれる：これらには、あらゆる起源の可溶 性Ｔ４様化合物、例えば、天然由来の可溶性Ｔ４タンパク、組換え可溶性Ｔ４タ ンパク、合成あるいは半合成の可溶性Ｔ４タンパクなどが含まれる。このような 可溶性Ｔ４様化合物は、都合よく、Ｔ４表面タンパクを発現する細胞のＨＩＶ感 染を阻害する、阻害あるいは競合結合機構によって、Ｔ４／ＨＩＶ相互作用を阻 害する。

可溶性Ｔ４タンパクには、下記の群から選ばれるポリペプチドが含まれる二図１ の式Ａ　Ａ−２３−Ａ　Ａ　３８２のポリペプチド、図１の式ＡＡｒ−ＡＡ３６ ２のポリペプチド、図１の式Ｍ　ｅ　ｔ　−ＡＡＩ−ＡＡ３６２のポリペプチド 、図１の式ＡＡＩ−ＡＡ３７４の゛ポリペプチド、図１の式Ｍｅ　ｔ−ＡＡＩ− ３７４のポリペプチド、図１の式ＡＡＩ−ＡＡ３７Ｔのポリペプチド、図１の式 Ｍ　ｅ　ｔ　−Ａ　Ａ　＋−３７７のポリペプチド、図１の式ＡＡ−２３−ＡＡ ３７４のポリペプチド、図１の式Ａ　Ａ　−２３Ａ　Ａ　３７７のポリペプチド 、あるいはこれらの一部分。

さらに、可溶性Ｔ４タンパクには、下記の群から選ばれるポリペプチドが含まれ る：成熟Ｔ４タンパクの式ＡＡ−２３−ＡＡ３６２のポリペプチド、成熟Ｔ４タ ンパクの式Ａ　Ａ　＋−３８２のポリペプチド、成熟Ｔ４タンパクの式Ｍｅ　ｔ −ＡＡＩ−３６２のポリペプチド、成熟Ｔ４タンパクの式Ａ　Ａ　＋−３７４の ポリペプチド、成熟Ｔ４タンパクの式Ｍｅ　ｔ−ＡＡＩ−３７４のポリペプチド 、成熟Ｔ４タンパクの式Ａ　Ａ　１−３７７のポリペプチド、成熟Ｔ４タンパク の式Ｍ　ｅ　ｔ　−Ａ　Ａ１−ｚｙ７のポリペプチド、成熟Ｔ４タンパクの式Ａ 　Ａ−２３Ａ　Ａ３７４のポリペプチド、成熟Ｔ４タンパクの式Ａ　Ａ　−２３ Ａ　Ａ　３７７のポリペプチド、あるいは、それらの一部分。

Ｔ細胞から単離された成熟Ｔ４タンパクのアミノ末端アミノ酸は、図１に示され ている配列の三番目のアミノ酸のりシンから始まる。従って、可溶性Ｔ４タンパ クには、さらに図１の式Ａ　Ａ３−　Ａ　Ａ３７７のポリペプチド、あるいは゛ その一部分が含まれる。このようなポリペプチドには、図１の式ＡＡ−３−ＡＡ ３６２のポリペプチド、図１の式ＡＡ３−ＡＡ３７４のポリペプチドからなる群 から選ばれるポリペプチドが含まれる。さらに、可溶性Ｔ４タンパクには、上に 挙げたポリペプチドでＮ末端メチオニン基が前についたポリペプチドも含まれる 。

本発明のワクチン、組成物および方法に有用な可溶性Ｔ４タンパクは、種々の方 法によって生産され得る。寄託されているクローンｐ１７０−２から得た全長の Ｔ４　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を図 １に示した。ｐ１７０−２の　Ｔ４　ｃＤＮＡは、上記のＭａｄｄｏｎらよって 報告されている約１７００ｂｐの配列にほとんど一致している。しかしながら、 ｐ１７０−２の　Ｔ４　ＣＤＮＡは、３個のヌクレオチド置換を有していて、こ れは、このｃ　ＤＮＡの翻訳産物中にＭａｄｄｏｎらの報告による配列に比較し て３個のアミノ酸置換を含むタンパクを生産する。これらの違いは、第３位のア ミノ酸で、Ｍａｄｄｏｎらの報告のアスパラギンがリジンに、アミノ酸の第６・ ４位で、Ｍａｄｄｏｎらの報告のトリプトファンがアルギニンに、およびアミノ 酸の２３１位で、Ｍａｄｄｏｎ　らの報告のフェニルアラニンがセリンにそれぞ れ入れ代わっているところにある。Ｌ堕ｍ二土の報告のアミノ酸の東３位のりシ ンに代わるアスパラギンは、ＤＮＡ配列決定の誤りであった［Ｄ。

Ｒ，Ｌｉｔｔｍａｎ　ら、−Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ　ＣＤ４５ｅｑｕｅｎｃｅ−、 Ｃｅ１１，５５．ｐ、５４１（１９８８）］。　可溶性Ｔ４タンパクの構築物は 、全長のＴ４配列を、種々の位置で切断して、トランスメンブレンドメインおよ び細胞質内ドメインのコーディング領域を取り除き、一方、ＨＩＶ結合に応答性 があると考えられている細胞外領域を残して、生産される。特に、可溶性Ｔ４タ ンパクは、オリゴヌクレオチドに特異的な変異誘発、制限酵素による消化、それ に続くリンカ−の挿入、あるいは、全長Ｔ４タンパクの酵素による接続などの従 来技術によって生産され得る。

このような構築に先だって、例えばｐＬ７０−２ような全長のＴ４クローンのｃ ＤＮＡコーディング領域は、次ぎに続く部位特異的変異誘発、および６４位およ び２３１位でのアミノ酸を修飾するための制限酵素断片の置換の過程で、修飾さ れ得る。例えば、６４位のアミノ酸を修飾するためにオリゴヌクレオチド特異的 変異誘発が用いられ得る。続いて、Ｔ４陽性リンパ細胞株［０，Ａｃｕｔｏら、 Ｃｅ１１，３４．ｐｐ、７１７−２６（１９８３）］から単離され、λｇｔｌｌ のライブラリーにあるＴ４ｃＤＮＡの一部のセリン２３１位のコドンを含む断片 による制限断片置換は、２３１位のアミノ酸を修飾するのに用いられ得る［Ｒ。

Ａ、　Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、上記〕。

可溶性Ｔ４タンパクをコードするＤＮＡ配列は、従来の組換え技術によって真核 および原核宿主細胞の形質転換に用いられ得る。その結果、組換え可溶性Ｔ４タ ンパクの臨床上および商業上有用な量が生産され得る。このような可溶性Ｔ４タ ンパクには、１９８７年９月４日出願された米国特許出願０９４．３２２．１９ ８８年１月７日出願された米国特許出願１４１，６４９、および１９８８年９月 １日出願のＰＣＴ特許出願Ｎｏ、ＰＣＴ／ＵＳ８８１０２９４０において開示さ れた製法により生産されるものが含まれる。これらの開示情報は、引用文献とし て本発明に組み込まれる。

可溶性Ｔ４タンパクをコードするＤＮＡ配列によって特徴づけられる微生物およ び組換えＤＮＡ分子は、メリーランド州、Ｌｉｎｔｈｉｃｕｍにあるインビトロ インターナショナルＩｎｃ、カルチャーコレクシコン（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉｎ ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ、ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に 、１９８７年９月２日に寄託された培養細胞により例示される。これらは、以下 のように受託番号が付与されている。

ＥＣ１００：　Ｌｌ；９上上　ＪＭ８］／ｐＥｃ１００　−　工ＶＸ　１０１４ ６ＢＧ３７７：　上ム≦２１Ｌ裏　ＭＣ１０６１／ｐＢＧ］７７　−　工Ｖ工　 １０１４７ＢＧ３””　ｚ−≦こ区ＬＬ　ＭＣ１０６１／ｐＢＧコ８０　−　工 Ｖ工　１０１４８ＢＧ３８１：　ｚ−≦■ｉ【Ｌ　ＭＣ１０６１／ｐＢＧ］８１ 　−　工■工　１０１４９゜一方、可溶性Ｔ４タンパクは、固相合成のような従 来のペプチド合成技術によって化学的に合成され得る［　Ｒ，Ｂ、　Ｍｅｒｒｉ ｆｉｅＬｄ、　”５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉ ｓ、　１．Ｔｈｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ＯｆＡ　Ｔｅｔｒａｐｅｐｔ　１ｄｅ −、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅ＋ａ、　Ｓｏｃ、　、　８３．　ｐｐ、　２１４９− ５４（１９６３）］。

本発明の一つの実施態様に従って、可溶性Ｔ４タン）＜りは、意図する受容者に おいて免疫原性を促進するために好ましく修飾されるか、あるいはタンパクを修 飾する処理に委ねられる。例えば、種々のアミノ酸の置換、修飾、あるいは欠損 が、可溶性Ｔ４タンパクの調製の過程で行われ得る。一方、可溶性Ｔ４タンパク は、投与前に種々の薬学的に受容可能なアジュバントタンパクの添加によって修 飾され得る。このようなアジュバントには、例えば、ムラミルジペプチド誘導体 、および界面活性剤およびフリーの脂肪酸の組合せを含むキャリアが含まれ得る 。このような修飾の形は、患者あるいはその種の内にある可溶性Ｔ４タンパクの 免疫原性に優ってさらにその可溶性Ｔ４タンパクの免疫原性を増す一つの方法で あり得る。

本発明のワクチンおよび組成物は、従来の種々の貯蔵形態であり得る。これらに は、錠剤、ビル、粉末、溶液ある％Ｘは懸濁液、リポソーム、カプセル、全開、 注射液および注入液などの、固体、半固体、および液体の使用形態が含まれる。

好ましい形態は、投与、および治療の意図される方法あるｌ、％は予防の適用に 依存する。

このような使用の形態には、当業者に知られている薬学上受容可能なキャリアお よびアジュバントが含まれ得る。コノようなキャリアおよびアジュバントには、 例えば、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レクチン、ヒト 血清アルブミンのような血清タンパク、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソル ビン酸カリウムのような緩衝剤、飽和植物脂肪酸の部分的にグリセリド化された 混合物、水、プロタミンサルフェート、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウ ム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、マグネシウムトリシリケートのような塩あるい は電解物、ポリビニルピロリドン、セルロースペース物質、およびポリエチレン グリコールがある。

局所用の形態あるいはゲルペース形態のアジュバントは、ソジウムカルボキシメ チルセルロース、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレ ン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよびウッドワックス（ｗｏｏ ｄ曹ａＸ）のアルコール類からなる群から選ばれる得る。

本発明のワクチンおよび組成物は、ざらに、免疫原性を促進する、あるいは患者 の劇薬性を改良するために他の成分を含み得るし、あるいは、調製時に、他の処 理に委ねられ得る。

一般的には、可溶性Ｔ４タンパクは、他の薬学的に重要なポリペプチド（例えば 、α−ＩＦＮ）に用いられる同様の方法および成分を用いて、製造され、そして 患者に投与され得る。腸管外の、静脈、筋肉、病巣内、あるいは皮下注射を含む あらゆる薬学的に受容され得る使用経路が、可溶性Ｔ４タンパクの投与に用いら れ得る。

例えば、可溶性タンパクは、薬学的に受容可能なあらゆる使用形態で患者に投与 され得る。この使用形態には、巨丸剤として、何時間、何日間、何週間あるいは 何カ月間にわたる継続的な注入によって、静脈に、を椎労および関節周囲を含む 筋肉内に、皮下に、皮膚に、関節内に、滑膜内に、鞘内に、病巣内に、骨膜にあ るいは、経口あるいは特別な経路によるものが含まれる。本発明の組成物は、単 位使用の形態が好ましく、通常患者には筋肉内に投与される。

可溶性Ｔ４タンパクは、患者に一回投与、あるいは一連の処置の間に投与され得 る。可溶性Ｔ４タンパクの投与および使用規制の最も効果的な方法は、治療に用 いられる特定の組成物および／あるいはアジュバント、感染の重篤の程度および 進行、予備治療、患者の健康状態および処置に対する応答、および治療医の診断 に依存する。

本発明の一つの実施態様に従って、可溶性Ｔ４タンパクは、−日の使用量が約１ 　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重からそれ未満の量が、−回あるいは数回の投与によっ てか、あるいは約１日から３０日の処置期間にわたって、日当たりその量が、貯 蔵形態から放出される方法によって、患者に投与され得る。

例えば、ＨＩＶ感染の治療および予防に、意図される虫者において免疫原性を促 進するために修飾された可溶性Ｔ４タンパクを用いる典型的な使用規制には、約 ３０日間、−日一回、患者にたいして約０．５ｍｇ／ｋｇ体重の投与法が含まれ る。患者は、断続的に週単位で、週に一度、日当り約ｌ。

Ｏｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重の使用を要求し得る。

本発明の好ましい実施態様において、可溶性Ｔ４タンパクあるいは修飾された可 溶性Ｔ４タンパクは、その免疫原性を増すためにアジュバントと共に投与される 。有用なアジュバントには、水酸化アルミニウムのような単純金属塩、および、 完全ならびに不完全のフロイントアジュバントのようなオイルペースのアジュバ ントが含まれる。オイルベースのアジュバントが用いられるとき、可溶性Ｔ４タ ンパクは通常アジュバント共に乳濁液として投与される。最も好ましくは、可溶 性Ｔ４タンパクは不完全フロイントアジ−パントで乳剤にして投与される。

可溶性Ｔ４タンパクがアジュバントと混合される場合には、その混合物は、通常 、筋肉内、皮膚内、あるいは皮下に数カ所に投与される。筋肉的投与が最も好ま しい。

投与前にアジュバントが可溶性Ｔ４タンパクに添加される場合、−日当り、その 約１ｍｇ／ｋｇ体重が投与され得て、所望の応答に達するまで、週に一度１　ｍ 　ｇ　／　ｋ　ｇ体重の投与が継続される。その後、約１　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ 体重の量が、月に一度投与され得る。

可溶性Ｔ４タンパクが、不完全フロインドアジュバントの乳化液の状態で投与さ れる場合、−日に患者当たり約１ｍｇが投与され得、引続き二ケ月間、約月に一 度、患者当たりｌｍｇの量が投与され、およびその後３ケ月に一度投与され得る 。

もちろん、使用量および処置の期間は、用いられる可溶性Ｔ４タンパク免疫原性 の程度、アジュバントが可溶性Ｔ４タンパクと共に投与されるかされないか、使 用されるアジュバントの性質、および処置される患者の免疫状態などの因子によ って異なることは理解される。例えば、より高い免疫原性が得られれば、使用量 および必要な処置時間が少なくなる。

同様に、使用量および処置時間は、可溶性Ｔ４タンパクがアジュバントと共に投 与されると減少するであろう。

本発明に従った使用量の規制には、投与される期間にわたって、１．０ｍｇ／ｋ ｇ体重／日より多い投与が含まれ得る。

ここに開示された本発明をさらに理解し得るために、次の実施例を挙げた。これ らの実施例は例を示すことのみを目的し、本発明を限定するものではない。

（以下余白） 実１１舛 これらの実施例は、可溶性Ｔ４タンパクのウィルス複製に対する阻害効果および ＳＩＶｍａｃ−誘発疾病活性に関連する機能的異常を回復する効果が説明されて いる。

これらの実施例において、使用する可溶性Ｔ４タンパクは、Ｂｉｏｇｅｎ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　Ｃａｒｐ、　（Ｃａｍｂｒｆｄｇｅ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔ ｔｓ）より市販されている組換えヒト可溶性Ｔ４タンパク（“ｒｓＴ４”）すな わち（“ｒ　ｓ　ＣＤ４”）であった。この組換え可溶性Ｔ４タンパクは、動物 細胞発現ベクターｐＢＧ３８’ｌによりトランスフェクトされたチャイニーズハ ムスター卵巣細胞由来であった［Ｒ，Ａ、Ｆｉｓｈｅｒら、′旧Ｖ　Ｉｎｆｅｃ ｔｉｏｎ　Ｉｓ　Ｂｌｏｃｋｅｄ　＋ｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｂｙ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎ ａｎｔ　５ｏｌｕｂｌｅ　ＣＤ４．’　Ｎａｔｕｒｅ、　３３１．　ｐｐ、　７ ６−７８（１９８８）］。ｐＢＧ３８１は、図２に示されているＴ４タンパクの Ａ１２３〜Ａ　Ａ　３ＴＴをコードするＤＮＡによって特徴づけられている。

我々は、２匹のアカゲザル（Ｍａｃａｃａ　ｍｕｌａｔｔａ）　（Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌａｎｄ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｐｒｉｍａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔ ｅｒ、　Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓの集落で生 まれ育った）を手に入れた。それぞれの重さが５〜７ｋｇであり、伝染病に感染 されていなくて健康であった。我々は、同じ重さの４匹のＳＩＶｍａ。感染７カ ゲザル（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｐｒｉｍａｔｅ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒの集落で生まれ育った）も手に入れた。これらの４匹 の動物に、セルフリーのＳＩＶ＋ｓｓｃウィルスを含有する細胞培養上清を静脈 注射してＳＩＶｍａ。感染を導入した。我々は、別の同じ重さの３匹のアカゲザ ル（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｐｒｉｍａｔｅ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒの集落で生まれ育った）にもＳ　Ｉ　Ｖ、、。感染を導入 した。これらのサルはｒ　ｓＴ４処理処理属するものではないウィルス感染サル のうち３匹は、処理の開始時点では比較的に正常な免疫パラメーターを持ってい たが、４四回のサルは循環リンパ球の絶対数が１ｍｍ３当り１００以下であった （正常ノアカゲザルは＞１，０ＯＯＴ４°ＰＢＬｓ／ｍｍ’である）。それぞれ のサルは可溶性Ｔ４タンＪ−ｅ／７投与の前に、霊長類集落の檻に６ケ月以上収 容されていた。投与期間中、それぞれのサルは新鮮果物で補足された通常のサル の食餌で飼われた。

処理および無処理群に記述されたサルは以下の通りに示さ、れた： 正常　ｒｓＴ４　理 Ｍｍ１５６−８４ Ｍｍ１５８−８４ ＳＩｖ９１、染　ｒｓＴ４　理 Ｍｍ１５６−８５ Ｍｍ１５９−８６ Ｍｍ１６７−８４ Ｍｍ２０２−８４ Ｓ　Ｉ　ＶＩＩｏ、　ｒ　ｓＴ４無几理Ｍｍ１２９−８６ Ｍｍ２４４−８６ Ｍｍ３３５−７８ ５０日間中、それぞれの正常な動物および４匹の感染動物が、組換えヒト可溶性 Ｔ４タンパクを１日１回大腿あるいは尻に部内注射を受けた。合計投与量は２ｍ ｇのｒｓＴ４．３（ｐＢＧ３８１−形質転換細胞株ＢＧ３８１由来）／日／匹で あった。クリアランス測定および肝臓および腎臓機能の評価のための血清サンプ ルは処理の８．１５、および４４日、および処理後の８および１８日に採取され た。感染サルの一匹、Ｍｍ１５６−８５は、最初の処理過程が完了した９６日日 月５０日間の再処理が開始された。ｒｓＴ４による有意な悪影響を受けた動物が 見受けられなかった。

全ての動物の末檎血リンパ球すブセ・、トの分布（Ｔ２＋、Ｔ４９、Ｔ８°、Ｉ Ｌ−２受容体１およびＢ１＋）およびこれらの細胞の機能（異種移植細胞および ポークライードマイトジェンによる刺激に伴う増殖）は処理過程の間で変化しな かった。

肝臓および腎臓を評価する血清化学上の結果はベースライン値と比べ変化しなか った。これらの動物が、骨髄顆粒球マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭｓ）前駆細胞 コロニー数の一時的な減少およびそれに伴う一時的な好中球減少症を経験したζ こもかかわらず、この一時的な骨髄抑制は臨床的に認められなかった。処理中、 正常あるいは感染されたサル（こは、末梢血リンパ球サブセットの分布、ＰＢＬ 機能、あるいは肝臓および腎臓機能を評価する血清化学上の変化を示すものはい なかった。＊ ＳＩＶ　立　の−１ 我々は、Ｓ’ＩＶ＠＠。２５１株（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ 　Ｐｒｉｍａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕ ｇｈ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから得た）を、健康なヒト提供者から得た 末梢血リンパ球（ＰＢＬ）培養物に感染させ、ＳＩＶ、、。含有培養物を調製し た。具体＊　処理開始に重症の免疫障害の証拠を示す感染されたサル（Ｍｍｌ　 ６７−８４）が、５０日間の処理完了後の３日目に、クームス陽性溶血性貧血の ため死亡した。死ぬ前の最後の１０日間では、この動物のヘモグロビンが７．７ から３，７グラム／デシリツトルに低下した。剖検で見られた病変には、小腸内 に多量の血塊、重症心筋線維症および肺臓リンパ小節の組織法浸潤が含まれてい た。後者の２つの病変は慢性的ＳＩＶ感染のアカゲザルには珍しいことではない 。近位の小腸（ｐｒｏｘｉｍａｌ　ｓｍａｌｌ　ｂｏｗｅｌ）に血が存在する現 象は、この動物の死因は急性胃腸出血であり、おそらく急性溶血によるストレス が二次的の死因であり得ることを指示した。このような著しい溶血性貧血がＡＩ ＤＳ患者に報告されている［　Ｚ、　Ａ、　５ｃｈｒｅ　１ｂｅｒら、Ｂｌｏｏ ｄ、　５２．　ｐ、１１７ａ（１９８３）］。従って、死亡がＳＩＶｌｍｌ。感 染の当然な結果であり得る。

的に、ＰＢＬを血液サンプルからフィコール−ジアドリゾエート密度勾配（ｓｐ 、ｇｒ、１．０７７）によって単離して、それを１μｇ　／　ｍ　ｌのコンカナ バリンＡ添加培地（ＲＦ’Ｍ１１６４０＋ｌＯ％ウシ胎児血清）で３日間インキ ュベートした。さらに、この刺激されたＰＢＬをハンスの平衡塩類溶液で洗浄し 、３Ｘ１０’細胞を２ユニツト／　ｍ　１のＩＬ−２添加培地で３０ｍ１になる ように合わせた（ＩＬ−２はＤｕ　Ｐｏｎｔ社の製品）。３７’Ｃで２時間イン キュベートした後、細胞を洗浄し、ＳＩＶ、、。２５１株含有組織培養培地を３ ｍｌ加えて、３７’Ｃでインキユベートした。　Ｍ、Ｋａｎｎａｇｉら（“Ｊ　 Ｇｒｏｗｔｈ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｓｉａ＋ｉａｎ　Ｔ− Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　Ｖｉｒｕｓ　Ｔｙｐｅ　ＩＩＩ、”　Ｐｒｏｃ、ａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２．　ｐｐ、　７０５３−５７（ １９８５））およびＭ、Ｄ、Ｄａｎ　ｉ　ｅ　ｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ。

２２８、　ｐｐ、　１２０１−０４（１９８５））が記述した通り、逆転写酵素 （ＲＴ）活性が最大の時ＣＲＴ活性が１．８ｘ　１０’ｃ　ｐｍ／ｍｌである） に、培養上清を回収した。この上清を０．４５μｍフィルターに通し、１ｍｌず つ分注して、使用まで一７０’Ｃに保存した。

立　の ヘパリン処理した骨髄サンプルを、ケタミン麻酔されたサルから背部腸骨稜を吸 引して得た。骨髄吸引液を密度勾配遠心して単核細胞を単離し、ハンスの平衡塩 類溶液で洗浄した。

そして１２．５％ＦＢＳおよび１２．５％ウマ血清添加イスコーフの改良ダルベ ツコＭＥＭ　（ＩＭＤＭ）に、４あるいは８チエンバの組織培養スライドガラス （Ｌａｂ−Ｔｅｋ、　ＭｉｌｅｓＳｅｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｎａｐｅｒｖｉｌｌ ｅ、　１１１ｉｎｏｉｓ）で、ｌＸｌ０’／ｍｌの細胞濃度で培養した。３７’ Ｃで７日間培養後、非付着細胞を除去した。

ＦＢＬ　Ｈ９立　の−１ 末梢血リンパ球をサルの血液サンプルから、フィコール−ジアドリゾエート密度 勾配遠心（ｓｐ９ｇｒ、１．０７７）で単離し、前記記述と同様に１μｇ　／　 ｍ　ｌのフンカナバリンＡで３日間刺激した。刺激されたＰＢＬをハンスの平衡 塩類溶液で洗浄し、１×１０８細胞をｌＸｌ０’非感染Ｈ９細胞（Ｄｒ、Ｒｏｂ ｅｒｔ　Ｃ，Ｇａ１ｌｏ、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕ ｔｅ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ。

Ｍａｒｙｌａｎｄからの寄贈物）に加え、この共培養物を３７°Ｃで少なくとも ３週間増殖させた。ウィルス複製の指標として培養上清の逆転写酵素の活性を観 察した。

ウィルス°　のアッセイ これらのサンプルにおいて、抗ウィルス剤および中和抗体の研究に用いられてい る様々なインビトロアッセイの改良方法を用いて、本発明の組成物の抗ウィルス 活性を評価した。

°−′　のアッセイ 前記記述と同様に調製された骨髄細胞サンプルを、ＳＩ■１Ｉａｏ培養上清（１ ，８ｘ　１０’ｃｐｍ／ｍｌのＲＴ活性）で１＝２０希釈して、１ｘｌＯ’／ｍ ｌの細胞濃度で２時間３７”Ｃで培養した。これらの細胞をざらにハンスの平衡 塩類溶液で２回洗浄し、完全培地で培養した。あるいは、前記記述と同様に調製 された、感染サルから得た骨髄細胞サンプルあるいはＰＢＬ／）（９共培養物を 完全培地中で培養した。培地は３〜４ａ毎に交換した。培養上清を２〜３日毎に 採取し、同量の培地（ＲＰ　Ｍ　ｒ　１６４０　＋　１０％ウシ胎児血清）を入 れ換えた。

次に、以下述べる通り、採取した培養上清のＲＴ活性を測定した。バックグラウ ンドの５倍あるいはそれ以上のＲＴ活性、例えば約１１０００ｃｐ／ｍ１以上、 を有する上清を５Ｉｖ１゜。感染に対する陽性であると見なした。

Ｍ、Ｋａｎｎａｇｆら（“Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｃｈａｒａｃｔｅ ｒｉｓｔｆｃｓ　ｏｆ　Ｓｆａ＋ｉａｎ　Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｆｃ　Ｖ ｆｒｕｓ　Ｔｙｐｅ　ＩＩｌ、”　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　、　Ａｃａｄ、　Ｓｅ ｔ、　ＵＳＡ、　８２．　ｐｐ、　７０５３−５７（１９８５））が記述したよ うに、ＨＩＶウィルスの複製に対する本発明の組成物の効果の指標として、逆転 写酵素活性を測定した。具体的には、１．４ｍｌのテストサンプルを１．５ｍｌ エノベンドルフチューブに加え、１２．ＯＯＯＸｇ、９０分遠心して、アッセイ 用のサンプルを調製した。次に、上清を除去して、ペレットにしたウィルスを水 上１０分間、２０μｍの分散緩衝液［０，ＯＩＭＩ−リス−ＭＣＩ　（ｐＨ７， ３）１０．２％トリトンＸ−１００１０，００１Ｍ　ＥＤＴＡｌｏ、０５Ｍジチ オトレイトール１０．０６ＭＫＣＩ　］中でインキュベートした。さらに、１５ μｌの分散したウィルス溶液に６０μｌのＲＴカクテル［０，０５Ｍ　トリス− ＨＣ１（ｐＨ８，２）１０．ｏ　０７Ｍ　ＭｇＣｌ　２／　０　、０６　Ｍ　Ｋ 　ＣＩ　／　１　ｍ　１当り０．０８ｍｇポリ（ｒＣ）・オリゴ（ｄＧ）プライ マー７０．００７Ｍジチオトレイトール／　３．３　μＣｉ　［ａ３２Ｐコ　ｄ ＧＴＰ　（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；　ＩＣ１＝３７ＧＢｑ；Ａ＋＋ｅｒｓｈａ ｍ）］を混合し、３７″Ｃで６０分インキュベートした。次に、ワットマン３濾 紙ディスク上に各サンプルを６０μｌ加え、各ディスクを、５％トリクロロ酢酸 ／２％ピロリン酸ナトリウムでビーカー内で洗浄した。さらに、これらのディス クを乾燥し、各ディスクの放射能を測定した。

コロニー≦　のアッセイ 前記記述通りに調製された骨随細胞サンプルにおける骨髄顆粒球単球（ＣＦＵ− ＧＭ）および赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）前駆細胞の増殖を以下の通りに定量した。

我々は、ＣＦＵ−ＧＭのコロニーを定量するために二層培養を設立した。下層の １ｍｌの０．５％ノーベル寒天（Ｎｏｂｅ　ｌ）に６０ｎｇ／ｍｌの組換えヒト 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１ｎｓｔｆｔｕｔ ｅ、Ｉｎｃ、、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓからの寄 贈物）を含有させた。上層には１０５の骨髄細胞を、１２．５％ＦＢＳおよび１ ２．５％ウマ血清添加の０．３％ノーベル寒天含有の１ｍｌのＩ　ＭＤＭ中に含 有させた。

、３５　ｘ　１　０　ｍｍＬ　ｕ　ｘ　（Ｎｕｎｃ、Ｉｎｃ、、Ｎａｐｅｒｖｉ ｌｌｅ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）の組織培養ディツシュに、上層を下層上に重ね、そ してこの二層培養を３７°Ｃで５％ＣＯ２が混入している、湿気を有する空気下 で維持した。

ＢＦＵ−Ｅコロニーを１０５の骨髄細胞の培養物で評価した。

骨髄細胞は、０．９％ｗ／ｖメチルセルロース（Ｄａｙ　Ｃｈｅｍｉｃａ％脱イ オン化されたウシ血清アルブミン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ、　Ｓｉｇｎａ、　Ｓ ｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、５Ｘ１０−５Ｍ　２−″＜　ルカブ トエタノール添加のＩＭＤＭに維持した。骨髄細胞培養物は６０　ｎ　ｇ　／　 ｍ　ｌの組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、１ユニット／ｍｌ のヒツジエリトロポエチン（Ｓｔｅｐ１！［、Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、　Ｗｉｌｌｏｖｄａｌｅ、　０ｎｔａｒｉｏ）および５％＋７）フ ィトへマグルチニン刺激のアカゲサルの調整培地ヲ含有した。フィトヘマグルチ ニン刺激のアカゲザルの調整培地を以下の通りに調製した。前記記述と同様、Ｐ ＢＬを、正常の７カゲザルのヘパリン処理された血液からフイフールージアトリ ゾエート密度勾配遠心によって単離した。これらのＰＢＬをさらに５日間、１０ μｇ　／　ｍ　１のフィトヘマグルチニン添加培地（ＲＰＭ１１６４０＋ｌＯ％ ウシ胎児血清）中でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を沈降し 、その上清を調整培地として使用した５０細胞以上を有するＣＦＵ−ＧＭおよび ＢＦＵ−Ｈのコロニーを、さらに倒立顕微鏡下で、細胞株の樹立後の１２〜１４ 日目に数日月。

末梢血液中の中好球総数を、ＥＤＴＡ−抗凝血液サンプルを用いて全血球算定お よび分画算定からめた。

轡の　マクロファージにおけるＳＩｖ　梠　に・　る！ 骨髄細胞培養物にＳＩＶｍｓ。を感染させ、前記記述のように培養上清のＲＴ活 性を測定した。非感染の正常サルから樹立した骨髄培養細胞の９０％より多くの 培養細胞を外来的に導入したｓｒｖ、、。により再現性よく感染し得ることが認 められた（結果は提示していない）。

２匹のｒｓＴ４処理した正常サル由来の骨髄は、処理前および処理の完了４週間 後、外来的に導入したＳＩＶ、、。によるインビトロ感染に対して感受性であっ た。しかし、ｒｓＴ４処理した正常サル由来の骨髄培養細胞に、５０日の処理期 間中に３回、および処理完了後の１８０に１回、感染を試みたが、陽性培養細胞 は得られなかった。

具体的には、我々は、ｒｓＴ４処理した正常サルから、以下に示す期日に、つま り処理前の１９日、処理中の１０．３０および４０日、処理後の１８．３２．８ ７．１０８．１２８．１５６．１６３．１８３日に、骨髄を採取し、これらの細 胞培養物に５ＩＶＩＩａ。を導入した。ＲＴ活性はこれらの培養物の上清から測 定した。その結果が下記の表および図３Ａに示されている。

５ＩＶｓａ。複製阻害における逆転写アツセイ正常サルＭｍ１５６−８４） 骨髄の　最大ＲＴ値　最大ＲＴ値が 采取旦　エニュユＺユ上ム　肚ＩＥ−江二星ｌ旦処理後−１８４６６３０ 処理後−３２１０３６５０ 処理後−８７１０８７１５ 処理後−１０８５８３０７５ 処理後−１２８３６２１５０ 処理後−１６３７４８９５０ 処理後−１８３２５０４３５０ ＳＩＶｎａ。複製阻害における逆転写アツセイ常サルＭｍ１５８−８４ 骨髄の　最大ＲＴ値　最大ＲＴ値が 骨髄の　最大ＲＴ値　最大ＲＴ値が 処理後−１８４１９３０ 処理後−３２７５４５０ 処理後−８７３２９８５０ 処理後−１０８１７８９５０ 処理後−１２８１１７５７５０ 処理後−１５６２２４６３７０ 処理後−１８３２８１６３５０ ｒｓＴ４処理したサルのプラズマの方がｒｓＴ４自身より、正常サルの骨髄細胞 マクロファージに対する５ＩＶａａｃ感染を強（阻害したことがわかった。この アツセイでは、前記記述したように、骨髄細胞培養物を調製し、ｒｓＴ４あるｔ ）はｒｓＴ４処理したサルのプラズマのいずれかを加えた。前記記述したように 、細胞培養物を外来のＳＩＶ、、。を感染させた。

下記の表に示されているように、ｒｓＴ４処理したサルのプラズマの方が、処理 期間中の動物のプラスマカ１ら得られたｒ　ｓＴ４の濃度でも、ｒ　ｓＴ４目身 より、正常の骨髄培養細胞における５ＩＶｓ。。感染を強く阻害した。＊ＲＴ（ ｃｐｍ／ｍｌ） 匁口里、　１９日　にアッセイ 対照区　７４８９ ｒｓＴ４　（２００μｇ／ｍｌ）　６３３３（２０μｇ／ｍｌ）　５７２７ プラｘマ（ａｒｓＴ４　Ａｂ＋）１：　５　３３１（処理４７日日月Ｍｍ１５６ −８５） １：　２５　１２８４ 図３Ｂに示されているように、ｒｓＴ４処理のサルＭｍ１５６−８４由来の処理 後４２日のプラズマも、正常７カゲザルのＰＢＬにおけるＳＩＶ□。複製を効率 よ（阻害した。

ｒ　ｓＴ４処理したサルの骨髄培養物あるいは処理したサルの末梢血リンパ球と Ｈ９細胞との共培養物においても、ｒｓＴ４処理期間前、期間中および期間後に 逆転写酵素活性を測定した。

＊　処理した動物のｒｓ’ｒ４プラスマレベルが、処理期間の１回目の最初ｒＳ Ｔ４投与の２時間後に、最高に達したことを観察した。正常サル１５８−８４に おいて、最高プラスマレベルの１４５７ｎｇ／ｍｌのｒｓＴ４が処理１８目のｒ ｓＴ４投与の２時間後に現れた。それに対して、処理の４７日日月、投与の２時 間後に達する最高プラズマは２４３　ｎ　ｇ／ｍ１であった。

図４に示されているように、Ｍ　ｍ　１５６−８５、Ｍｍ１５９−８６およびＭ ｍ２０２−８４のＰＢＬとＨ９細胞との共培養が、処理開始前およびｒｓＴ４処 理期間のおよそ第２週の終わりまでＳ　Ｉ　Ｖ、、。を産生じた。その後、ウィ ルス単離を試みたが、最も早（でも処理完了の１ケ月後まで成功しなかった。

Ｔリンパ球よりむしろマクロファージでのウィルス複製を反映する骨髄培養物で の５ＩＶ０゜複製が類似変化を示した。

Ｍｍ１５８−８５、Ｍ　ｍ　１５９−８６およびＭｍ２０２−８４の処理開始前 、ウィルスがＪ＃髄から容易に単離されたにもかかわらず、処理中ではウィルス の単離は成功しなかった。

骨髄からウィルスの単離が再びできるようになったのは、Ｍｍ１５６−８５では 処理完了後の１８日であったが、Ｍ　ｍ　１５９−８６およびＭｍ２０２−８４ では処理後４５日まで単離できないままであった。

処理の初めに免疫不全に陥ったサルＭｍ１６７−８４において、Ｈ９細胞と共培 養したＰＢＬから、ｒｓＴ４処理前処理媒の骨髄からは、処理開始前にはウィル スの単離ができたが、処理中ではウィルス単離を３回試みたが成功しなかった。

すなわち、ｒ　ｓＴ４処理のＳＩＶ□。感染サルにおいては、ウィルスの単離が 、ｒｓＴ４処理期間中の方が処理前および処理後より単離が困難であった。我々 は、これらの観察結果が感染サルにおけるｒｓＴ４処理のもたらしたウィルス複 製の量的減少を反映するものと考える。

ＳＩＶ　発　゛による　的　の口′ ｒｓＴ４処理のｓｒｖ、、。感染サルにおけるｓｒｖ、、。誘発疾病活性を反映 する機能的異常が、可溶性Ｔ４タンパク処理によって回復したことが認められた 。５ＩＶａｓｃ感染サルをｒｓＴ４処理する前に、これらのサルの骨髄由来のＣ ＦＵ−ＧＭおよびＢＦＵ−Ｅ＝＋ｏニーの両者のインビトロ増殖が抑制された。

これはＳＩＶ、、。感染サルおよびＨＩＶ−１感染ヒトに通常見られる現象であ る［Ｃ，Ｃ，５ｔｅｌｌａら、Ｊ、　Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、　８０．　ｐ ｐ、　２８６−９３（１９１１７）コ。１０匹の正常サルの一連のアッセイにお いて、ＣＦＵ−ＧＭコロニーが２２２±５２１５Ｘ１０’の培養骨髄細胞数であ って、ＢＦＵ−Ｅ数が７６±１２／２Ｘ１０５の培養骨髄細胞数であった。処理 の結果として、感染動物に見られる低いＣＦＵ−ＧＭおよびＢＦＵ−Ｅコロニー 数が増した。図５〜７に示されているように、ＳＩＶ感染動物の骨髄由来のコロ ニー形成細胞数および赤血球前駆細胞数がｒｓＴ４処理期間中増加した。

処理後、生き残った３匹のＳＸｖ感染動物のうちの２匹には、骨髄ＣＦＵ−ＧＭ およびＢＦＵ−Ｅコロニー数がベースライン値に降下した。Ｍｍ２０２−８４の コロニー数は上昇したままであった。４匹のサルのうちの２匹に、処理の最初の ２週間中一時的の好中球減少症が見られた。しかしながら、図５に示されている ように、これらの動物の骨髄由来のコロニー形成細胞数の上昇に伴い末梢血好中 球総数が最終的に上昇したことが観察された。

Ｍｍ１５６−８５を前記記述されている方法と全く同様に、最初の処理の８５日 後に再処理した。図６に示されているように、この処理と関連して同様のＣＦＵ −ＧＭおよびＢＦＵ−Ｅの上昇が見られた。

我々は、Ｓ　Ｉ　Ｖｓａｏｇ染サルの骨髄由来のコロニー形成細胞に対する、ｒ 　ｓＴ４あるいはｒｓＴ４処理したサルのプラズマのインビトロ効果を調べた。

その結果を図８に示している。

この図では、「ｒｓＴ４添加」の対照区はｒ　ｓ”ｒ４無添加、「プラズマ源」 の対照区はｒｓＴ４処理されていない正常サル由来のプラズマ、プラズマ源の「 処理前」はｒｓＴ４処理前の感染サル由来のプラズマであった。プラズマは１： ４０の最終希釈率で培養物に維持された。図８に示されているように、ｒｓＴ４ を高い濃度で添加したにもかかわらず、ｒｓＴ４処理したサルのプラズマの方が ｒｓＴ４よりコロニー形成細胞を有効的に増加させた。

図９および１０は、ｒｓ’ｒａ処理中（図９）およびｒｓＴ４処理後（図１０） のＳＩＶ、、。感染サルから採取した骨髄由来のコロニー形成細胞に対する、ｒ 　ｓＴ４処理したサル由来のプラズマのインビトロ効果を示している。これらの 図では、「プラズマ源」の対照区および「処理前」の定義は図８で記述している 通りである。図９に示されているように、感染動物のコロニー形成細胞が処理過 程にわたり増加した。その上、感染動物の再処理において、ＣＦＵ−ＧＭ細胞数 が再び増加した。図１０に示されているように、ｒｓＴ４処理したサル由来のプ ラズマがもたらした感染サルのＣＦＵ−ＧＭコロニーの増加が処理期間完了後の ある時期まで認められていた。

図１１は、ｒｓＴ４あるいはｒｓＴ４処理したサル由来のプラズマのいずれかの 添加後による、ＳＩＶ、＠。感染サルの骨髄のインビトロでのＣＦＵ−ＧＭの増 加を表している。図１１では、用いられた対照区はｒｓ’ｒ４あるいはプラズマ が加えられていない骨髄であった。図１１に示されているように、ｒｓＴ４処理 したサル由来のプラズマの方が、ｒｓＴ４処理したサルのプラズマから得られた ｒｓＴ４濃度よりはるかに高いｒｓＴ４濃度と比べ、３ＩＶｓａｃ感染サルのＣ ＦＵ−ＧＭコｃｒニー数をより高く増加させた。

図１２は、コロニー形成を増加する活性を有するプラズマの画分を決定するアッ セイの結果を示している。具体的には、プラズマをプロティンＡセファロースカ ラムに通した。カラムに吸着しないものを集め、「非ｒｇＧＪ画分として保持し た。吸着したものを以下の通りに溶出した。カラムを室温で３０分、約１カラム 容の溶出緩衝液（０，５８Ｍ酢酸、ｐＨ２、２／　０　、１５　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ ｌ　）中でインキュベートした。次に、カラムをＮａＨＣＯ３−中性溶出緩衝液 で溶出し、溶出物を一晩室温でリン酸緩衝液中に透析した。透析した溶出物を「 ＩｇＧ画分」として保持した。次に、これらの画分のＣＦＵ−ＧＭ増加活性を調 べた。図１２では、用いられた対照区は骨髄培養物のみであった。図１２に示さ れているように、ＣＦＵ−ＧＭ増加活性はｒｓＴ４処理したサルのプラズマのＩ ｇＧ画分に存在した。

ｒｓＴ４　几　（こよって　される　「欠の我々は、可溶性Ｔ４タンパクに対す るｒｓＴ４処理したサルの抗体応答は、観察された治療効果に関与する機能上の 抗ウイルス性に特徴づけられたと考える。従って、我々は次に観察された抗体応 答の性質を調べた。

先ず、ｒｓＴ４処理したアカゲザルの循環末梢血リンパ球の膜表面に抗体が結合 しているか否かを決めた。より具体的には、２匹のＳＩＶｍｓｃ感染ｒｓＴ４処 理の動物（Ｍｍ２０２−８４およびＭｍ１５６−８５）を以下の通りに評価した 。

前記記述されているように、ヘパリン処理した血液から、５０ａのｒｓＴ４処理 過程の完了後の５日に、ＰＢＬを単離した。ＰＢＬをインビトロで、ＦｆＴＣ複 合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｔａｇｏ）とに４０の希釈率で、リン酸緩衝液中３０分イ ンキュベートした。次に、細胞をハンスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄し、 フローサイトメトリで解析した（Ｅｐｉｃｓ　ＣＳ、　Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅ ｃｔｒｏｎｉｃｓ、　Ｈｉａｌｉａｈ、　Ｆｌｏｒｉｄａ）。［Ｈ，Ｍ。

５ｈａｐｉｒｏ、　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｆｌｏｗ　Ｃｔｏ＋ｍｅｔｒ　、Ａｌ ａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎｃ、。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８５）を一般的に参照。コＭｍ２ ０２　８４およびＭｍ１５６−８５のＰＢＬはそれぞれ３１％および４０％の表 面蛍光を提示した。Ｍｍ２０２−８４のＰＢＬはｒｓＴ４処理完了後の７１日ま で表面染色を示し続けた。Ｍｍ１５６−８５のＰＢＬは処理が完了した２０日で 、７％未満の細胞表面蛍光を提示した。しかし、この動物を、最初の処理過程の 完了後２０日ロー０．８ｍｌ容の４ｍｇのｒｓＴ４、および３４日ロー１．Ｏｍ ｌ容の５ｍｇをそれぞれ一回の筋肉内接種して再処理することによって、表面に Ｉｇが結合している細胞数の増加が観察された。図１３に示されているように、 このレベルは５０日間の処理過程完了後の４２日日月５０％の細胞に達した。す なわち、５ＩＶ１．。感染ｒｓＴ４処理のアカゲザルが明らかに、ｒｓＴ４処理 と関連する免疫グロブリン（Ｉｇ）をある一部の循環ＰＢＬに覆うように産生じ た。この現象は、処理したサルが全部の循環リンパ球ではな（ある一部のリンパ 球によって発現された分子に特異的な抗体応答を生み出したことを示唆した。

さらに、我々は観察された抗体応答の特異性を明確にした。

具体的には、Ｍｍ１５６−８４由来のプラズマの精製されたＣＤ８”およびＣＤ ４＋ヒトＰＢＬに結合する能力を調べた。

先ず、抗ＣＤ４　（１９７ｔｔｙ５Ｄ７）および抗ＣＤ８　（７ＰＴ３Ｆ９）モ ノクローナル抗体を用いて、抗体によって補体を溶解して母集団を産生じた［Ｍ ｉｓｋｅｌｌｔｄよヒｓｈｉｉｇｉ、　Ｓｅ士匹ｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ 　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　、　Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、　１ ９８０、　ｐ、　２１１］。用いた抗ＣＤ４および抗ＣＤ８モノクローナル抗体 はＤｒ、Ｓ、Ｆ、Ｓｃｈ　ｌ　ｏ　ｓ　ｓｍａｎ、　Ｄａｎａ　ＦａｒｂｅｒＩ ｎｓｔｉｔｕｔｅ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓからの寄贈 物であった０これらの抗体の特徴はＬｅｕｋｏｅ　ｔｅ　Ｔ　ｉｎ　Ｉｌ、　Ｓ ｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　 Ｒｅ１ｎｈｅｒｚら、Ｈａ　（１９８６）に述べられている。先ず、ＣＤ４”お よびＣＤ８＋細胞集団を、ｒｓＴ４処理した動物Ｍｍ１５６−８４のプラズマと １：４０の希釈で、３０分室温でインキュベートした。さらに、細胞をＨＢＳＳ で洗浄し、３０分室温でＦＩＴＣ複合ヤギ抗ヒトＩｇで１：４０に希釈してイン キュベートした。細胞をざらにＨＢＳＳで３回洗浄して、フローサイトメトリ（ Ｅｐｉｃｓ　ＣＳ）で解析した。図１４に示されているように、約９４％のＣＤ ４０細胞は蛍光を発するが、ＣＤ８”細胞では６％未満であった。

すなわち、ｒｓＴ４処理した動物のプラズマのＩｇはヒトＣＤ４＋に結合したが 、ＣＤ８“細胞に結合しなかった。

次に、ｒｓＴ４処理したサルのプラズマの、ＣＤ４”およびＣＤ８”アカゲザル ＰＢＬとの結合を評価した。前記記述されているように、正常アカゲザルからＰ ＢＬを単離した。これを１０μｌのフィコエリトリン複合抗ＣＤ４　（ＯＫＴ４ ，０ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）あるいはフイコエリトリン複合抗ＣＤ ８　（ＯＫＴ　８．　０ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のいずれかと３０ 分反応した。

次ニ、コレラノ細胞をＨＢＳＳで洗浄し、Ｍｍ１５６−８４のサル由来のプラズ マで１：４０に希釈して、３０分インキュベートした。これらの細胞をＨＢＳＳ で洗浄し、ＦＩＴＣ複合ヤギ抗ヒトＩｇ（Ｔａｇｏ）で１＝４０に希釈して、リ ン酸緩衝液中、室温で３０分インキコベートして、さらにまたＨＢＳＳで洗浄し た。これらの細胞を０．１％ノでラホルムアルデヒド−ＰＢＳで固定して、二色 フローサイトメトリ（Ｅｐｉｃｓ　Ｃ５）で解析した。図１５に示されているよ うに、プラズマがＣＤ４”を染めたが、ＣＤ８”アカゲザルＰＢＬを染色シなか った。３０％のＰＢＬはプラズマおよび０ＫＴ４の両者に染められたが、１９％ のＰＢＬは０ＫＴ４に染められたが、プラズマに染められなかった。

アジュバントｒｓＴ４による　サルの　１、前述されている通り、ｒｓＴ４処理 したサルのプラズマが効率よく、インビトロでのＳＩＶ、、。複製を妨害し、お よび骨髄造血機能を促進する。それに加えて、ｒｓＴ４処理したサルが抗ＣＤ４ 抗体応答を生み出した。これらの観察結果に基づき、我々は、アジュバントと共 に投与するかなり少量のｒＳＴ４の投与は、抗ＳＩＶ□。活性を含む抗体応答を 効率よく産生させるのであろうと考えた。この確信を評価するために、我々は２ 匹の正常アカゲザル、Ｍｍ１５２−８１およびＭｍ３４６−８０を手に入れた。

両方のサルは、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｐｒ１ａ＋ａｔｅ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔａｒ、　Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、　Ｍａｓｓ ａｃｈｕｓｅｔｔｓに集落で生まれ育った。それぞれが５〜７ｋｇで、伝染病に 感染されていなくて、健康であった。これらの動物を、フロイント完全アジュバ ント（Ｓｉｇｍａ）で乳化した１ｍｇのｒｓＴ４を０日に、およびフロイント不 完全アジュバント（Ｓｔｇｍａ）で乳化した１ｍｇをもう一度３０日に、免疫感 作した。

各々の免疫感作は総容量の０．４ｍｌを背中の異なる６カ所に皮下接種した。そ してこれらの動物を月２回採血した。

Ｍｍ３４６−８０由来のプラズマの、正常アカゲザルＰＢＬとのＩｇ結合を調べ た。ＰＢＬを前述されているように、ＣｏｎＡで活性化させ、Ｉ　Ｌ−２含有培 地で培養した。図１６に示されているように、活性化されたアカゲザルＰＢＬと の結合は、第１回目の免疫感作後の２８日に検出され、９０日には最高になり、 その際３４％の細胞に結合が検出された。

結合が茅１回目の免疫感作後の１６７日まで検出された。

さらに、ＰＢＬおよび骨髄のインビトロ培養におけるｒｓＴ４免疫したサルＭｍ ３４６−８０のプラズマの抗５Ｉｖｌｌ。

。活性を評価した。感染および逆転写酵素活性測定に用いる技術は前記通りであ る。図１７に示されているように、Ｍｍ３４６−８０プラスマをＲＰＭ１１６４ ０＋１０％ウシ胎児血清に１＝４０の最終希釈率で添加することが、ＳＩＶｍａ 。感染アカゲザルＭｍ３５１−８５由来のＰＢＬの示すＲＴ活性を１０倍近く阻 害した。正の対照区として、図１７には逆転写酵素活性に対する抗ＣＤ４モノク ローナル抗体１９Ｔｈｙ５Ｄ７（前記参照）の影響も示されている。図１８に示 されているように、Ｍｍ３４６−８０由来のプラズマが正常アカゲザルの骨髄細 胞におけるＳＩＶ、、。複製にも１０倍阻害した。

さらに、ｒｓＴ４免疫した７カゲザルのプラズマのインビトロ造血機能に対する 影響を、前記述べられている方法を用いて調べた。図１９に示されているように 、１：２５および１：　１２５の最終希釈のＭｍ３４６−８０ブラスマが、３匹 のＳＩＶ、、、感染アカゲザル（Ｍｍ２４４−８６、Ｍ　ｍ　１０８−８４およ びＭｍ１６９−７９）の骨ＵＳ胞由来のＣＦＵ−ＧＭを有意の増加をもたらした 。

ｒｓＴ４免疫した動物を調べ、抗ウィルス活性がこれらの動物の骨髄細胞あるい はＰＢＬに検出されるかについても測定した。これらの測定は、前記述べられて いる５ＩＶｆｆｉｓ。による感染に対する骨髄細胞のインビトロ感受性の評価方 法の通りに行われた。免疫感作後、ｒｓＴ４免疫した７力ゲザルＭｍ１５２−８ １およびＭｍ３４６−８０由来の骨髄細胞およびＰＢＬの両者を定期的にセルフ リーＳ　Ｉ　Ｖ　ｓａｃで種々の濃度に希釈して培養した。これらの培養上清の ＲＴ活性を前記述べられているように測定した。図２０および２１に示されてい るように、５ＩＶＩ１．。複製に対する有意の耐性が最初の免疫感作後の６２日 で検出され、そして約１４５日まで存続した。

その後、これらの動物のＰＢＬおよび骨髄細胞は、ｓｒｖ、。

。感染に対する感受性が免疫感作前と同程度のようであった。

アジュバントｒｓＴ４によるＳＩＶ、。１、　サルの　黙作次に、我々はｒｓＴ ４アジニバントの治療効果を測定した。

用いた３匹のＳＩＶｍｓｃ感染サル（Ｍｍ１７９−８６、Ｍｍｌｏ　４−８６お よびＭｍ３８８−８７）は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｐｒ ｉｍａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、 　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓに集落で生まれ育った。それぞれが５〜７ｋｇで 、実験的にＳ　Ｉ　Ｖ　ａｓ。２５１株で、この研究開始の４＝１２ケ月前に感 染させた。２匹のサル（Ｍｍ１７９−８６およびＭｍ１０４−８６）はフロイド 完全アジュバントのｒｓＴ４で０日に、およびフロイド不完全アジコバントで３ ０日に、前記述べられているように免疫した。３回目のサル（Ｍｍ３８８　８７ ）は対照区として用いられ、前記述べられているように免疫したが、ｒＳＴ４の 代わりに１ｍｇのヒト血清アルブミン（Ｈ３Ａ）で免疫した。前記述べられてい るように、これらの動物の骨髄細胞およびＰＢＬにおけるウィルスの存在を定期 的に測定した。

図２３に示されているように、免疫感作開始前には、３匹のサルの全てに、骨髄 細胞およびＰＢＬからウィルスが単離された。アッセイの過程にわたり、Ｈ３Ａ 処理した動物からウィルスがそのまままだ単離された。しかし、３０ＥＩ目に２ 回目のｒｓＴ４免疫感作後では、Ｍｍ１７９−８６由来の骨髄およびＰＢＬから は、１００日までウィルスが単離されなかった。さらに、Ｍｍ１０４−８６のサ ルのＰＢＬおよび骨髄からウィルスが一回単離されたのを除けば、Ｍｍ１０４− ８６からも３０日ロゼ２回目の免疫感作の時点からおよそ１００日までウィルス の単離ができなかった。

図２４に示されているように、この処理の間、２匹のｒｓＴ４免疫したサルの骨 髄細胞由来のＣＦＵ−ＧＭおよびＢＦＵ−Ｅが正常の範囲に向上したが、ＨＳＡ 免疫したサルの骨髄細胞由来には見られなかった。この造血能の向上は５ＩＶ１ 、。誘発の機能的異常の回復を指示している。従って、可溶性Ｔ４タンパクによ る日毎の処理後で観察された臨床上のおよびウィルス学士のパラメーターの回復 が、少量のアジニバント可溶性Ｔ４タンパクによる免疫感作によって代わりに有 利になされ得る。

我々は、この明細書に本発明の多数の実施態様を前記述べて来たが、本発明の工 程および組成物を用いる他の実施態様を提供するために我々の基本的な構造が変 更され得るのは明らかである。従って、本発明の範囲が実施例として前記示され ている特定の実施態様によって定義されるよりも、むしろこの明細書に付随して いる請求の範囲によって定義されていると認識されたい。

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Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．患者のＡＩＤＳ、ＡＲＣまたはＨＩＶ感染を治療あるいは予防する方法であ って、可溶性Ｔ４タンパクの免疫学的に有効な量を有する薬学的に受容可能な組 成物を、患者に投与する工程を包含する方法。
2. ２．前記可溶性Ｔ４タンパクが、患者の中で生じる可溶性Ｔ４タンパクの免疫原 性よりもその免疫原性を増すように修飾された、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記可溶性Ｔ４タンパクが、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日またはそれ未満か ら１．０ｍｇ／ｋｇ体重／日の量で患者に投与される、請求項２に記載の方法。
4. ４．前記可溶性Ｔ４タンパクが、薬学的に受容可能なアジュバントの添加によっ て修飾される、請求項２に記載の方法。
5. ５．前記可溶性Ｔ４タンパクが、約１ｍｇ／ｋｇ体重／日の量で患者に投与され る、請求項４に記載の方法。
6. ６．前記組成物が、約１日から３０日の間患者に投与される、請求項３あるいは ５に記載の方法。
7. ７．免疫学的に有効な量の可溶性Ｔ４タンパクを含有する、患者のＡＩＤＳ、Ａ ＲＣ、あるいはＨＩＶ感染を治療あるいは予防するための薬学的に受容可能な組 成物。
8. ８．前記可溶性Ｔ４タンパクが、患者の中で生じる可溶性Ｔ４タンパクの免疫原 性よりもその免疫原性を増すように修飾された、請求項７に記載の組成物。
9. ９．さらに薬学的に受容可能なキャリアを含有する、請求項７に記載の組成物。
10. １０．ＡＩＤＳ、ＡＲＣ、またはＨＩＶ感染の治療あるいは予防のための、免疫 学的に有効な量の可溶性Ｔ４タンパクを含有する薬学的に受容可能な組成物の使 用。
11. １１．前記可溶性Ｔ４タンパクが、患者の中で生じる可溶性Ｔ４タンパクの免疫 原性よりもその免疫原性を増すように修飾された、請求項１０に記載の使用。
12. １２．前記可溶性Ｔ４タンパクが、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日またはそれ未満 から１．０ｍｇ／ｋｇ体重／日の量で患者に投与される、請求項１１に記載の使 用。
13. １３．前記可溶性Ｔ４タンパクが、薬学的に受容可能なアジュバントの添加によ って修節される、請求項１１に記載の使用。
14. １４．前記可溶性Ｔ４タンパクが、約１ｍｇ／ｋｇ体重／日の量で患者に投与さ れる、請求項１３に記載の使用。
15. １５．前記可溶性Ｔ４タンパクが、約１日および３０日の間の期間、患者に投与 される、請求項１２あるいは１４に記載の使用。
16. １６．前記薬学的に受容可能な組成物が、さらにアジュバントを含有する、請求 項１あるいは２に記載の方法。
17. １７．前記可溶性Ｔ４タンパクが、一回の投与当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ体重ま たはそれ未満から１．０ｍｇ／ｋｇ体重の量で患者に投与される、請求項１６に 記載の方法。
18. １８．前記可溶性Ｔ４タンパクが、所望の免疫学的効果が達成されるまで週に一 度投与される、請求項１７に記載の方法。
19. １９．所望の免疫学効果に達した後、前記可溶性Ｔ４タンパクが月に一度投与さ れる、請求項１８に記載の方法。
20. ２０．前記薬学的に受容可能な組成物が、さらに不完全フロイントアジュバント を含有する、請求項１あるいは２に記載の方法。
21. ２１．前記可溶性Ｔ４タンパクが、患者一人当たり一投与約０．１ｍｇまたはそ れ未満から１．０ｍｇの量で患者に投与される、請求項２０に記載の方法。
22. ２２．前記可溶性Ｔ４タンパクが、二ヶ月間にわたり月に約一度投与され、およ びその後、約三ヶ月に一度投与される、請求項２１に記載の方法。
23. ２３．免疫学的に有効な量の可溶性Ｔ４タンパクおよびアジュバントを含有する 、ＡＩＤＳ、ＡＲＣ、およびＨＩＶ感染を治療あるいは予防するための薬学的に 受容可能な組成物。
24. ２４．免疫学的に有効な量のアジュバント、および患者の中で生じる可溶性Ｔ４ タンパクの免疫原性よりもその免疫原性を増すように佳節された可溶性Ｔ４タン パクを含有する、患者のＡＩＤＳ、ＡＲＣ、あるいはＨＩＶ感染を治療あるいは 予防するための薬学的に受容可能な組成物。
25. ２５．さらに、薬学的に受容可能なキャリアを含有する、請求項２３あるいは２ ４に記載の組成物。
26. ２６．患者のＡＩＤＳ、ＡＲＣ、あるいはＨＩＶ感染を治療あるいは予防するた めの免疫学的に有効な量の可溶性Ｔ４タンパクおよびアジュバントを含有する薬 学的に受容可能な組成物の使用。
27. ２７．前記可溶性Ｔ４タンパクが、患者の中で生じる可溶性Ｔ４タンパクの免疫 原性よりもその免疫原性を増すように修飾された、請求項２６に記載の使用。
28. ２８．前記可溶性Ｔ４タンパクが、一投与当たり約０．１ｍｇ／ｋｇ体重または それ未満から１．０ｍｇ／ｋｇ体重の量で患者に投与される、請求項２７に記載 の使用。
29. ２９．前記可溶性Ｔ４タンパクが、所望の免疫学的効果が達成されるまで週に一 度投与される、請求項２８に記載の使用。
30. ３０．所望の免疫学効果に達した後、前記可溶性Ｔ４タンパクが月に一度投与さ れる、請求項２９に記載の使用。
31. ３１．前記薬学的に受容可能な組成物が、さらに不完全フロイントアジュバント を含有する、請求項２４あるいは２５に記載の使用。
32. ３２．前記可溶性Ｔ４タンパクが、患者一人当たり一投与約０．１ｍｇまたはそ れ未満から１．０ｍｇの量で患者に投与される、請求項３１に記載の使用。
33. ３３．前記可溶性Ｔ４タンパクが、二ヶ月間にわたり月に約一度投与され、そし てその後、三ヶ月に約一度投与される、請求項３２に記載の使用。