JPH04505256A - 微生物検出装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｊ１１ ｍ■ 本発明は、試料中での細菌増殖を検出する方法及びデバ要素を監視することによ って試料中での微生物増殖を検出する電子的装置に係わる。

臨床試料が微生物に汚染されていることは通常、試料を栄養素の存在下に培養し 、所定時間経過後に試料の変化。

または試料を覆う雰囲気の変化を介して微生物活性を検出することによって決定 する１例えば、＾ｈｎｅ１等の米国特許第４，１８２，６５６号では、試料を炭 素１３発酵可能な基質を含む培地と共に容器に入れる。容器を密閉して試料を、 生物学的活性に導く条件下に置いた後、試料を覆う気体雰囲気中の炭素１３の既 知の炭素１２に対する比を決定して初期の比と比較する。米国特許第４．１５２ ，２１３号で特許請求された方法では、密閉容器内の試料中に酸素消費性細菌が 存在することを、試ａｔ覆う雰囲気中の酸素の減少を容器内の気体の監視によっ て検出することにより決定する。米国特許第４．０７３，６９１号は、培地を収 容した密閉容器内に細面を含めた生物活性物質が存在することを、試料を覆う気 体雰囲気の特性の所定時間経過後の変化を測定することによって決定する方法を 提供する。

１９８４年４月４日付で公開されたヨーロッパ特許出願第８３１０８４６８．６ 号に開示されているように、気体雰囲気中のＣＯ２変化の非侵入的検出方法がＳ ｕｐｐａｍｎ等によって教示されている。これら及び他の刊行物に述べられてい る方法及び装置はいずれも、培養後の気体雰囲気の変化を測定するのに放射線測 定法の適用または密閉容器への侵入を必要とするか、または容器が赤外線の透過 を妨げない特別の材料で製造されることを必要とする。

試料、特に血液培養物の微生物汚染を測定する他の公知方法には、温度、ｐｉ、 濁り、色、バイオルミネセンス及びインピーダンスの微細な変化の測定などが有 る。これらの方法は通常、細菌の代謝副産物の検出によって微生物汚染を決定す る。微生物汚染は継代培養及び／または染色によっても評価することができる。

これらの方法のうち、インピーダンス測定法、放射Ｉ！測定法及び赤外分光測定 法のみが臨床試料を自動処理し得る可能性を示している６インピーダンス測定法 及び赤外線測定法を除けば上記諸方法も、液体試料、または該試料を覆う気体雰 囲気の測定を行なうべく容器内に侵入することを必要とする。

測定の度に試料を覆う雰囲気を汚染し、またその組成を変えてしまう恐れが有る ことに加え、これらの方法では、比較的長期間にわたって短い時間間隔で連続的 に、または容易に測定を行なうことはできない、汚染微生物の増殖速度が微生物 の種類、及び元の試料中の微生物の数次第で異なるので、試料が汚染されている ことによって雰囲気または液体試料が検出可能な変化を示す時期を予測できない ことから、このことは重大な欠点となる。

関連する問題点として、汚染を液体試料の９Ｈ変化によって決定する場合、様々 な代謝産物が試料のｐＨを様々に変化させるということが有る。例えば、アンモ ニアの生成はｐＨを高めるが、Ｃ０２の生成はｐｎを低下させる。異なる汚染微 生物は異なる増殖速度を有することから、ｐＨが成る時点で高くなり、別の時点 では低くなる可能性も有る。このように変化可能な上昇−低下は、ｐｉを長い時 閉間隔で測定したのでは検出できない。更に、全血試料のｐＨ測定によって変化 分検出する場合、特にインジケーターがｐｉｆ決定手段である場合には、インジ ケーターの外観が血液細胞の存在によって影響され、もしくは曖昧となる恐れが 有ることもエラーの原因となり得る。比色測定型インジケーターは、試料の性質 によって惹起されるエラーが色素の外観に影響することを防止できる場合にのみ 有効に用い得る。

１１匹」ｉ 本発明は、微生物増殖用培地を含む試料のｐＨレベルまたはＣＯ□レベルの変化 を連続的に監視する装置を提供することを目的とする。

本発明はまた、密閉容器内の試料のｐＨまたはＣ０２変化を容器に侵入せずに監 視する装置を提供することも目的とする。

更に本発明は、ｐＨレベルまたは００２レベルを連続的に指示するｐｉ（及び／ またはＣＯ□インジケーターであって、増殖培地中に有色成分が存在することに よって影響されないものを提供することをも目的とする。

本発明は、ｐｉｆ及び／またはＣＯ□変化を連続的監視に基づいて分析すること をも目的とする。

２輻対値と２Ｈの変化速度との両方を監視することも本発明の目的である６本発 明の上記その他の目的は、血液その他の体液のような臨床試料を密閉した透明な 滅菌容器内の滅菌増殖培地で培養することによって該試料中に微生物が存在する ことを検出する装置を実現することにより達成される。微生物の存在は、容器の 内側面に貼り付けた使い捨てのセンサーを用いて試料のｐＨ変化または試料中で の００２生成を検出もしくは測定することによって決定する。本発明によれば、 高濃度の赤血球のような妨害物質の存在下にも、放射線測定法及び侵入的測定法 を用いない手段によって微生物を検出することが可能である。試料のｐＨレベル 及び／またはＣＯ２レベルが変化すると、使い捨てセンサーの光反射及び／また は吸収特性が対応して変化する。センサーの反射特性の変化量は発光及び受光機 構が検出し、この機構は可視反射／吸収の量及び変化速度を監視する装置に信号 を送る。上記速度及び量を分析して、試料もしくは標本中で微生物が増殖してい ることを予測し、決定する。センサーの変化の量及び速度の詳細な特徴を収集す るべく、センサーを連続的に、または短い時間間隔で頻繁にサンプリング及び／ または監視することが可能である。

添付図面を考慮しながら以下の詳細な説明を参照することによって本発明がより 良く理解されれば、本発明はより完全に評価され、また本発明の付随的な利点の 多くが容易に認識されよう。

図　の　ｔ： 第１図は試料容器及び光検出装置の断面図である。

第２図はセンサーの反射率と試料のｐＨとの特徴的関係を示すグラフである。

第３図は試料において細菌Ｅ、　ｃｏｌｉの増殖によって惹起されるｐＨ及びＣ Ｏ２変化を例示する特性曲線のグラフである。

第４図は本発明によって測定した様々な微生物の反射率の経時変化を示すグラフ である。

第５図はしきい値速度発生しベル対一定勾配監視検出方法を示すグラフである。

第６図は本発明の分析装置の主要な構成要素を示す概略的なブロック線図である 。

第７図は本発明の、同時に８つの試料を監視する例の説明図である。

且１ｊ１１反朋一 本発明の装置及びデバイスは、血液その他の体液の試料のような臨床試料中に微 生物が存在することを微生物が産生する代謝産物の増加を測定することによって 検出する非侵入的手段を提供する。試料は、成る一定の微生物代謝産物の生成を 促進する、特別に調製された培地に添加される。

第１図に示したように、試料及び特別に調製した培地３はインキュベーションの ために培養瓶もしくは培養容器１に収容される。容器１は図示しない頂部におい て密閉されている。

新規な使い捨てセンサーもしくはインジケーター２が瓶１内に、該層の内側面に 当接するように配置されている。センサー２は、付着媒体もしくは保持媒体と呼 称される固体組成物もしくは膜と、保持媒体上または保持媒体中に設置された指 示媒体とを含む、このような形態の下に、センサー２は容器１の内側面に対して 平らに配置され、その際指示媒体は外側から見え、かつ細胞、タンパク質その他 の固体や、試料または培地の不透明な、または有色の成分がインジケータ−２と 容器１との間に入り込まないようにして密に封入されている。このような構成は 、インジケーター２と検出機構４及び５との闇にいかなる物体が入り込むことも 防止する。場合によっては、インジケーター２は試料とその増殖培地３から、気 体分子は透過させるがイオンの透過は防止する膜または固体層によって分離され る。このようにしてインジケーター２は、ｐＨまたはＣＯ２変化には所望のよう に晒されるが培地３には直接晒されない。

本発明を用いれば、血液などの体液の、１ミリリツトル当たり１個程度の僅かな 微生物しか含有しない試料を検出することができる。そのような試料は、微生物 の集団が臨界レベルに達するまで、または代謝産物の増加が測定可能となるまで に７日にもわたるインキュベーションを必要とする０本発明の機能の下では、成 る種の微生物の場合濃度が１０’ＣＦＵ／ｍｌであれば測定可能なｐＨまたはＣ Ｏ□レベルが実現することが判明した。１０７〜１０’ＣＦＵ／ｍｌの濃度では 総ての微生物が測定可能な結果を示した。

本発明は、幾つかの点で新規かつ有利である。

（１）　微生物の代謝産物を、試料を覆う雰囲気中でなく、培養瓶内の液相中で 測定する。

（２）新規な使い捨てセンサー２を瓶１の内側面に貼り付け、測定を瓶１の透明 な壁の外側から、瓶１の一体性を損なわずに行なうことができる。

（３）外部からの測定は、肉眼で調べることによってか、またはセンサー２の反 射率の測定によって所期の測定を行なう装置を用いて実施し得る。

（４）試料３の不透明成分または有色成分はセンサー２の、ｐＨ及び／またはＣ Ｏ□レベル変化を検出及び指示する能力を妨げない。

（５）指示薬分子が１かな体積中に、即ち膜上に、変色が容易に観察され得るよ うな高濃度で保持される。

（６）容器に侵入してのサンプリングや容器の手動操作が不要なので、センサー ２を短い時間間隔でのサンプリングで実質的に連続して観察し得る。

（７）連続的な監視から、ｐｉｆまたはＣ０２の絶対レベル及び変化速度を表す 特性曲線を描くことができる。

複合微生物培地を構成する栄養成分は、微生物が用いる代謝経路に影響を及ぼす 。有機酸、塩基及び様々な気体が、用いられる栄養素に依存する比率で産生され る。また、産生される物質は微生物の種毎に様々である。このような物質が液体 培地中に存在することによって、該培地のｐｉｔが変化し得る。本発明で用いる センサーは、環境のｐＨ変化に応答して測定可能な変化を遂げるｐＨ感応性指示 薬を含む。ｐ、Ｈセンサーを、気体は透過させるがイオンは透過させない膜で被 覆すれば、指示薬のｐＨに影響するＣＯ□やアンモニアのような気体の存在を測 定できる。即ち、微生物の増殖は液体培地のｐＨ変化によってか、または微生物 によって産生されて培地に溶解した気体を測定することによって検出し得る。二 酸化炭素はあらゆる微生物が産生する普遍的な代謝物であり、従って微生物増殖 の検出に好ましく用い得る代謝物である。

本発明において教示したＣＯ２センサーとｐＨセンサーとは、ｐ）Ｉ指示薬とし て有用な分子種と付着／保持媒体という二つの共通の構成要素を有する。　ｐＨ 指示薬は保持媒体に、共有結合によってかまたは共有結合によらずに付着させ得 る。

あるいは他の場合には、ｐＨ指示薬を、硬化前のポリマーマトリックス中に分散 させたりして気体透過性のポリマーマトリックスに封入することが可能である。

ＣＯ□センサーは第三の構成要素、即ちインジケーター膜を試料及び増殖培地か ら完全に分離する半透性物質を有するにれらのセンサーは適当な透明容器１の内 側に適当な接着剤で固定する。

ｐＨまたはＣＯ□センサーの活性分子種としては、蛍光性及び可視性の様々なｐ Ｈ指示薬を用い得る。指示薬の選択を制限するのは通常、指示薬は許容可能な動 的ｐＨ範囲を有し、かつ既存の前面蛍光または反射率技術で容易に検出可能な波 長変化を呈しなければならないという条件のみである。

培地のｐＨ変化を検出する本発明によるセンサーは、約５．０から約８．０まで のｐＨ範囲にわたって蛍光強度または可視色の変ｆヒを呈するべきである。

ＣＯ□センサー用の指示薬は、Ｃ０２濃度変化の検出のために約１０．０から６ ．０までのｐＨ範囲内で蛍光強度または可視色の変化を呈するべきである。

保持媒体と共有結合的にかまたは非共有結合的に結合し得、かつそのｐＨ指示特 性を維持し得るのは成る一定のｐＨ指示薬分子のみである。本願出願人は、キサ ンチン、フェノールフタレイン及びフェノールスルホンフタレインのグループに 属する指示薬が有用であることを発見した。

付着／保持媒体は、有機反応を用いてｐＨ指示薬を共有結合により付着させ得る セルロースのような物質であり得る。

正または負のゼータ電位を有するナイロン膜のようなイオン性保持物質を用いれ ば、ｐＨ指示薬の非共有結合的付着を実現することが可能である。使用可能なイ オン性保持物質としては他に、正または負に荷電されたジエチルアミノエチル（ ＤＥＡＥ）樹脂または（ＤＥＡＥ）セルロースのようなイオン性樹脂を挙げるこ とができる。インジケーター膜を微生物増殖培地と直接接触させなければならな い場合は、予め保持物質をタンパク質で処理することが必要となり得る。

ｐＨ指示薬センサーは微生物増殖培地のｐＨ環境に起因するｐＨ変化と直接検出 する。しかし、上記センサーは、気体の拡散を選択的に許す一方イオン及び／？ ！体を透過させない能力を特徴として有するシリコン、ラテックス、テフロンま たは様々なプラスチックのような選択的半透性組成物もしくは膜で被覆すること により、液体増殖培地中の気体（例えば二酸化炭素またはアンモニア）と選択的 に反応するように製造することが可能である。センサーがポリマーマトリックス に封入された指示薬を含む場合は、マトリックスを構成するポリマーが、気体は 透過させるがイオンは透過させない半透性バリヤーとして機能し得る。

ポリマーマトリックスに封入された指示薬を含むＣＯ２センサーは、ｐＨ６〜ｐ Ｈ１０のｐＨ範囲内で反応性である可視性または蛍光性のｐＦＩ指示薬と、ＣＯ □の検出に最適なｐＨ環境を維持する水酸化ナトリウムまたは等価塩基と、液状 指示薬を未硬化ポリマー中に分散させて指示薬のミセルを形成し得るグリセリン または等価乳化剤と、指示薬のための適正環境を維持する室温ＲＴＶホワイトシ リコンのような未硬化ポリマーとから成る。ポリマーは、気体は透過させるがイ オンは透過させない特性を有し、かつこの特性がオートクレーブ処理による滅菌 を行なった時に変化せず、しかもポリマー自体の化学的または物理的特性によっ ても、硬化のための必要条件によっても指示薬の化学活性に影響しない任意のポ リマーを用い得る。

上記４成分で乳濁液を製造し、かつポリマーを硬化させて、ｐＨ指示薬のミセル を包囲する半透性マトリックスを形成するが、このマトリックスは液体微生物増 殖培地に由来するＣＯ□その他の気体を選択的に拡散させ、それによって指示薬 を前記気体に測定可能なように晒して、該指示薬の測定可能な可視変色を実現す る。センサー２は別個に製造して培養瓶の内側面に接着し得るが、他の場合には センサー２を瓶の底部に形成し、その場で硬化させることも可能である。硬化後 、センサーを具備した甑をオートクレーブ処理などで滅菌する。その明細書が本 明細書に参考として含まれる１９８８年３月１５日付出願の同時係属米国特許出 願第０７／１６８，２９１号に、ｐＨ及びＣＯ□センサーの特定例が幾つが示し である９本明細書では、特定のｐｔ＋及びＣＯ２指示薬についてこれ以上詳述し ない。センサーは、後述する装置及び設備と適正に共働するために、ｐＨ及び／ またはＣＯ２変化を視覚的に検出可能に指示するものでなければならない。

培地の調製も上記同時係属出願第０７／１６８，２９１号に述べであるので、こ こて′は詳述しない。

第１図は、試料及び培地３を収容した培養容器１、及び容器１の底面に貼り付け られたセンサー２の断面図である。図示した容器１は、光検出器５が挿入された 孔８と発光器４が挿入された孔９とを有するプラットホーム７上に配置されてい る。

発光器４と検出器５とは共に、細部を第６図に示した分析装置６と接続されてい る。

容器１は、第７図に示したように通常シリンダ形で、支持台７の上面に設けられ た孔１０に挿入される。弾性充填材１２ができる。孔１０の内側に充填材１２が 内張すされており、充填材１２は孔１０に挿入された容器１の側壁を弾性的に押 圧する。この充填材は、後述する支持台７の移動の際に容器１が孔１０から抜は 落ちるのを防止するべく設置されている１発光器４及び検出器５は、インジケー ター２からの反射光の受け取りが最も好ましく行なわれる相対角度αを成して取 り付けられている。図示した好ましい具体例での角度αは４５度であるが、４５ 度に近い他の相対角度も許容可能な結果をもたらす。３０〜６０度の範囲が好ま しく、最良の反射効率を達成するうえで最適であると判明した。

発光器４及び検出器５は、適当な相対角度を成すと共にインジケーター２に対し て、光が容器１の外側面で反射されずにインジケーター２に到達し、該インジケ ータ−２から反射されるような適当角度を成して配置さなければならない。

更に、検出器５は、不正確な読み取りを防止するべく発光器４による直接照射か ら遮蔽されなければならない。

第７図に、本発明の一具体例の構成の全体を示す。第７図から知見され得るよう に、ベース部材７は試料瓶１を受容するシリンダ形のスロット孔１０を複数具え ている。任意数の瓶１が、支持台もしくはベース７のスロット１０内に配置され 得る。ベース７は、揺動モーター２６及び該モーター２６に取り付けられた揺動 機ｆ１１２８によって揺動され得るように設置されている。揺動は、適正な微生 物増殖を促進するべく混合物を瓶１内で適正な振動攪拌状態に維持するのに必要 である。ベースはまた、該ベースに固定されたヒーター３０によってか、または 制御インキュベーション装置において該ベースを全体的に包囲することによって 加熱される。各スロット１０は、センサーを適当に照射し、かつ反射されたルミ ネセンスを検出する発光器及び検出器を含む。

後段に詳述するように、各層１は、当該層の抽入されたスロットに付属する検出 器の出力を選択的に読み取ることによって独立に監視され得る。このようにして 、コンピューター２０が複数の試料を同時に監視することが可能となり、即ちコ ンピューターは各試料に関するサンプル読み取りを所望の所定サンプリング速度 で所望のように実施し、各試料の微生物増殖の進捗度を後段に詳述するようにし て評価する。

第６図は、第１図及び第７図に示した信号分析装置６の信号受信及び処理部の回 路図である。ＬＥＤ　Ｄｌｌ〜Ｄ１８はツェナー安定化定電流源１４によって給 電される。この電流源はトランジスタＱ１、演算増幅器ｏｐ１７及びツェナーダ イオードＤ９を含む、を流源１４は、受光ダイオードＤ１〜Ｄ８を照射するＬＥ ＤＤｌｌ〜０１８の照射を安定させる。

ＬＥＤ　Ｄｌｌ〜０１８は第１図に示した発光器４を表し、ホトダイオードＤ１ 〜Ｄ８は第１図に示した光検出器５を表している。

第６図及び第７図に示した例では支持台７に８個のダイオードが取り付けられて おり、そのうちの４個が図示しである。

図示の具体例は８個の発光器、８個の検出器、及び八つの並列回路を有するが、 これは単なる例であり、信号処理装置６によって評価されるべき試料の数に応じ て任意数の発光器−検出器対を用いることが可能である。

図示したホトダイオードＤ１〜Ｄ８は、例えばＥＣに　Ｖａｃｔｅｃｈｏｆ　Ｓ ｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ製のホトダイオードＶＴＰ　５０５１で あり得る。所与のスペクトル域内での悪巧検出が可能な同様のホトダイオードで あれば任意のものを用いることができる。他の電磁スペクトル域内での検出が可 能な他のホトダイオードを用いることも、発光器４をそのスペクトル域内で発光 するように設計し、かつセンサー２を上記他のスペクトル域内での反射特性がｐ ＨまたはＣＯ２産生の変化に応答するように設計すれば可能である。

各ダイオードの出力は、低駆動反転形態に配列された１対の低オフセツト演算増 幅器によって増幅される。上記配列形態は第６図において、図示した回路の該当 部分に参照符号１６を付して示しである。

演算増幅器の出力は個々の入力ライン１８を介してマルチプレクサ−ＭＵＸＯ８ に送られ、多重化される。このようにして、個別ダイオードＤ１〜Ｄ８のうちの いずれか１個の出力が監視及び／′または分析のために選択され得る。アドレス ライン式０〜Δ２上に３ピントアドレスが発生されることによって、コンピュー ター２０は所望のダイオード出力を選択して、マルチプレクサ−ＭＵＸＯ８から のＤＲＮライン８上に読み出すことがてきる。マルチプレクサ−から出力した信 号は受動的に低域Ｐ波及び増幅され、コンピューター２０に付与されるアナログ 信号出力とされる。出力端子２２に現れるこのアナログ信号は、まずデジタル信 号に変換してからコンピューターの入力端子２４へと送ることも、アナログ信号 のまま直接コンピューターに送ることも可能である。

コンピューター２０では様々な検出器の出力がコンパイルされて、様々な試料の ｐＩまたはＣＯ□濃度の変化の量及び速度を表す、第５図に示したような曲線が 描かれる。コンピューターは、描かれた特性曲線を評価して、微生物が増殖する 培養物が存在するかどうかを後述のように決定するうえで必要な分析も行なう。

第５図を参照して、本発明による分析法の、先行技術または肉眼での検査による 分析法に対して優れている点を以下に説明する。

第５図の第一のグラフＩには、ＣＯ２の絶対レベルを時間に対してプロットして あり、また微生物汚染が存在するかどうかの決定に用いられ得るＣＯ，シきい値 レベルも示してある、溶液の絶対ＣＯ２濃度値は、容器１内のインジケーター２ の変色を分析することによって決定される。血液などの体液はそれ自体がＣＯ２ を産生ずることに注意するべきであり、このことは３本の曲線のいずれにおいて もレベルが恒常的に上昇する点に認められる。このバックグラウンド産生の規模 は試料によってきわめて様々である。特性曲線＾、Ｂ及びＣは微生物増殖の例を 示している。特性曲線＾は高レベルのバックグラウンド産生を表すが、微生物の 増殖は表さない、特性曲線＾はしきい値を越え、従って先行技術による分析法の 下では陽性と看做されようが、実は偽の陽性であろう６特性曲線Ｂは中ぐらいの レベルのバックグラウンド産生と、非常に目立った増殖とを表す、特性曲線Ｂも しきい値レベルを越えるので、真の陽性として検出されよう。

これらは有意の時間間隔での周期的サンプリング法で検出され得、なぜならＣＯ ２レベルはしきい値より高い値に有意の期間留まるからである。特性曲線Ｃは低 レベルのバックグラウンド産生と僅かな増殖とを表し、その結果先行技術による 検出分析では偽の陰性と看做される。

第二のグラフ■は、第一のグラフに示したデータの一次導関数、即ちＣ０２産生 速度を示す。への速度は高いが絶えず低下し続けること、Ｂの速度は中ぐらいで 、微生物増殖時に増加していること、及びＣの速度は低く、しかしやはり微生物 増殖時に増加していることが知見される。

第三のグラフ■は、第一のグラフに示したデータの二次導関数、即ち増殖加速度 を示す。このグラフで、特性曲線＾が示す加速度は常に負であり、一方Ｂ及びＣ が示す加速度は成る期間に大きい正の値を取る。これらのグラフを比較してみて 、試料＾に関し、グラフＩに示したＣ０２値はしきい値を越えるが、グラフ■で 有意な勾配変化を呈せず、従ってグラフ■において加速度が認められないことが 見て取れる。グラフ■では、真の陽性である二つの試料Ｂ及びＣが試料へには無 い正の特性を示すことが知見され得る。

特性曲線ＣはＣＯ□発生速度が比較的低い微生物増殖を示し、前記速度を低下さ せる要因としては様々なものが存在し得る。上記速度が低い場合に、先行技術に よるサンプリング法を用いるか、または本発明のインジケーター２を肉眼で検査 すると試料Ｃは陰性と決定されようが、実は偽の陰性であろう、これは、試料Ｃ の００２の絶対値が、陽性との判断を下すうえで必要とされるしきい値を決して 上回らないことに起因する。しかし、後述する本発明のサンプリング、分析及び 評価法を用いれば、試料Ｃで実際に生起している微生物増殖が、該試料のＣＯ□ レベルをグラフ■のしきい値レベルより高めるのに十分でなくとも微生物存在陽 性として検出され、従って試料Ｃは真の陽性と看做される。

本発明のコンピューター２０は、指示されるｃｏ２ｉを任意の時間間隔で読み取 るように設定され得る。例えば、１度の読み取りから次の読み取りまでのサンプ リング間隔を１０分とした場合、コンピューターはマルチプレクサ−ＭＵＸＯ８ に、適当なセンサーからの入力から読み取ったデータを１０分間隔で出力するよ うに命令する。出力された読み取りデータはコンピューターによって読み取られ 、がっ記録される。その後、１０分経過したらコンピューターは新たな読み取り を行ない、値を記録する。

６回のインターバルが過ぎ、７回目のインターバルに入ると、最初のサンプル（ 測定値）が放棄される。このように、最も古いサンプルを放棄し、かつ最も新し いサンプルを付加することによってコンピューターは更新を継続し、それによっ てコンピューターは常に１時間分のデータを保持する。

コンピューター２０はこれらのデータを用いて、各２個の相前後するｐＨ示度を つなぐ曲線の勾配を連続的に決定し、即ち１０分間隔で相前後する各２個の示度 同士の間の“瞬間的な°′勾配値を確立する。この勾配は１インターバル前の勾 配と比較され、かつ全部で６インターバル前までの、即ち１時間前までの勾配と 比較される。それによって、コンピューターはグラフ■及び■に示した速度値及 び加速度値を得る。

目下の１０分サンプリング休止期間の勾配は、一つ前の期間の勾配とのみ比較す ることも、また重み付けして直前の５期間の勾配と比較することも可能である。

コンピューターは、第５図のグラフｍの曲線Ｂ及びＣが示すような正の加速度を 探す、正の加速度の持続時間が監視されるが、加速度は装置の揺らぎあるいはそ の他のバックグラウンド干渉が持続し得る期間より長い期間工であり続けなけれ ばならない０例えば、グラフ■の期間ｔ、は不十分であるが、期間ｔ２は十分で ある。

この分析方法は、微生物増殖に関して陽性である例Ｂ及びＣのいずれもが本発明 によって検出される点で有利である。この分析法は試料中で発生するＣ０２の絶 対値には左右されず、Ｃ０２増加速度の変化にのみ従属し、この変化は生物学的 陽性試料の指示手段として、絶対ＣＯ□値がしきい値を越えることよりも確実で あると判明した。

この分析方法は、連続的な監視及び短い時間間隔でのサンプリングを可能とし、 高い精度でのＣＯ□読み取りを可能にするモ分な悪魔を具えたインジケータ−２ を提供する本発明の装置及び教示によってのみ実施できる。

本発明装置によって監視されるセンサーは、増殖する、または代謝を行なう微生 物が存在すると変色し、ｐｌ！変化またはＣＯ２変化を知らせる指示薬を含む。

上記変色は肉眼に明らかであり得るが、装置６を用いることによって、測定が外 部から高精度で連続的に行なわれるという利点が得られる。好ましい具体例では 、発光器及び検出器は各センサー毎に設置される。しかし、全試料の連続監視を 可能にするものであれば変形した他の例も有効である。そのような変形例には、 各試料瓶を１個以上の定置検出器に関して移動させるか、または１個以上の検出 器を定置された試料瓶に関して移動させる手段の適用が含まれる。

上述の好ましい具体例では固体型の（ｓｏｌｉｄ　５ｔａｔｅ）照射器及び検出 器が用いられるが、本発明の開示後は当業者にとって明らかとなるように、白熱 電球及びアークランプのような照射源を用いることも、また鏡、レンズ、光ファ イバー、及び光を瓶の中のインジゲーターまで誘導して検出手段への反射を実現 するその他の手段を用いることも可能である。

本発明のその他の目的、利点及び特徴は、上述及び引き続く検討から当業者には 明らかとなろう。

ＦＩＧ、　ｊ 靭 ｉ１＃聞 呂・ｊ魚、１ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成３年１１月１５日 １、特許［ｉ１Ｄ表示　ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０２６３１、発明の名称　微生物 検出装置 ３、特許出願人 住　所　オランダ国、６８００・エル・ニス・アーネム、ビー譬オー・ボックス ・１８６、フエルペルウエヒ・７６名　称　アクゾ・エヌ・ヴエー ４、代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正書の提 出年月日　１９９１年３月２２日６、添附書類の目録 （１）補正書の翻訳文　１通 まｆｆ１ １、試料中での微生物増殖を監視する装置であって、その内部スペースにおいて 試料が滅菌培地で培養される、少なくとも一部が透明な密閉可能でかつ滅菌可能 な容器と、この容器内で透明部分の領域に配置されており、微生物増殖の代謝物 に晒されると、容器の透明部分を通して検出され得るその測定可能な特性が、前 記透明部分を通して容器外部から監視され得る変化を呈し、それによって密閉後 の容器への侵入を伴わずに微生物増殖を監視する滅菌可能な指示手段と、 指示手段の測定可能な特性の少なくとも一つに影響を及ぼす信号を発生する、こ の信号が前記透明部分を通して指示手段に当たるように指示手段に対して位置決 めされた信号発生手段と、 前記透明部分を通して指示手段から前記信号を受け取ってそれに対応する第二の 信号を生成するように指示手段に対して位置決めされた信号検出手段と、 第二の信号を受信及び処理して指示手段の測定可能な特性の大きさ分計価し、そ れによって密閉後の密閉可能容器内での微生物増殖を監視する処理手段と を含む装置。

２、第二の信号を受信する処理手段が回路手段であることを特徴とする請求項１ に記載の装置。

３、信号発生手段が発光ダイオードを含むことを特徴とする請求項１に記載の装 置。

４、信号検出手段が発光ダイオードの放射光を受け取るホトダイオードを含むこ とを特徴とする請求項３に記載の装置。

５、第二の信号を受信する処理手段が発光ダイオードのための安定電流源を含む ことを特徴とする請求項３に記載の装置。

６、回路手段が 第二の信号を選択された時間間隔で受信し、かつ受信の度に当該時間間隔の中で 第二の信号の特性に生じる何等かの変化を比較する手段 を含むことを特徴とする請求項２に記載の装置７、回路手段が、第二の信号を周 期的にサンプリングし、第二の信号のサンプル同士を比較し、かつ前記サンプル の変化の速度を計算する計算手段を含むことを特徴とする請求項２に記載の装置 。

８、変化速度を検出してこの変化速度の持続時間を測定する手段ら含むことを特 徴とする請求項１に記載の装置。

９、試料中での微生物増殖を検出する方法であって、その壁の少なくとも一部が 透明である滅菌可能な容器と、この容器内で前記透明部分の領域に配置された、 微生物増殖の代４ａ４ｍに晒されると変化する指示手段とを用意するステップと 、 指示手段の測定可能な特性に影響を及ぼす第一の信号を発生する、第一の信号が 前記透明部分を通して指示手段に当たるように指示手段に対して位置決めされた 信号発生手段を用意するステップと、 指示手段から前記第一の信号を受け取ってそれに対応する第二の信号を生成する ように指示手段に対して位置決めされた信号検出手段を用意するステップと、第 二の信号を受信及び処理して指示手段の測定可能な特性の大きさの変化を評価す る処理手段を用意するステップと、試料を滅菌条件下に容器内に導入するステッ プと、容器内の試料をインキュベートするステップと、第二の信号の変化または 第二の信号の大きさを検出し、それによって密閉後の密閉可能容器内での微生物 増殖を検出するステップと を含む方法。

１０、第二の信号を選択された時間間隔で受信するステップ、及び 当該時間間隔の中で第二の信号の特性に生じる何等かの変化を比較するステップ をも含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。

１１、第二の信号をサンプリングするステップ、第二の信号の連続するサンプル 同士を比較するステップ、及び 連続するサンプル同士の間での変化の速度の増加率を計算するステップ をも含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。

１２、増加率を検出するステップ、及び検出した増加率の持続時間を測定するス テップをも含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。

１３、試料中に微生物が存在することを決定する方法であって、 請求項１に記載の装置を用意するステップと、試料を滅菌容器内に導入するステ ップと、容器内の試料をインキュベートするステップと、指示手段の測定可能な 特性の変化を検出手段で、少なくとも１種の時間間隔で監視するステップと、前 記測定可能な特性の変化の速度を計算し、それによって該特性の一次導関数を決 定するステップと、測定可能な特性の一次導関数の大きさを分析して、試料中に 微生物が存在することを確定するステップとを含む方法。

１４、試料中に微生物が存在することを決定する方法であって、 請求項１に記載の装置を用意するステップと、試料を滅菌容器内に導入するステ ップと、容器内の試料をインキュベートするステップと、指示手段の測定可能な 特性の変化を検出手段で、少なくとも１種の時間間隔で監視するステップと、前 記測定可能な特性の大きさを測定して、試料中に微生物が存在することを確定す るステップと を含む方法。

ｔｓ、　ａＩ！Ｉ定可能な特性の二次導関数を計算するステップ、及び 前記二次導関数の大きさを分析し、それによって試料中に微生物が存在するかど うか確認するステ・ノブをも含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。

１６、前記二次導関数の持続時間を測定するステ・ノブも含むことを特徴とする 請求項１５に記載の方法。

１７、指示手段が膜と、微生物の代謝物に晒されると検出可能な変化を呈する指 示媒体とを含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。

１８、膜が容器の内側面に貼り付けられていることを特徴とする請求項１に記載 の装置。

１９、指示媒体が容器の内側面に当接するように配置されており、指示手段の膜 は指示媒体を培地から分離することを特徴とする請求項１に記載の装置。

２０、代謝物がＣＯ□であることを特徴とする請求項１に記載の装置。

２１、指示媒体がｐＨに対して化学的に応答することを特徴とする請求項１に記 載の装置。

２２、測定可能な特性が吸光特性、燐光特性、光散乱特性、屈折特性、蛍光特性 及び光反射特性の中から選択されることを特徴とする請求項１に記載の装置。

２３、測定可能な特性が吸光特性、燐光特性、光散乱特性、屈折特性、蛍光特性 及び光反射特性の中がら選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。

２４、測定可能な特性が吸光特性、燐光特性、光散乱特性、屈折特性、蛍光特性 及び光反射特性の中がら選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。

２５、変化の加速度を検出する手段をも含むことを特徴とする請求項１に記載の 装置。

２６、検出した加速度の持続時間を測定することも特徴とする請求項２５に記載 の装置。

２７、第二の信号の大きさを測定する手段をも含むことを特徴とする請求項ｌに 記載の装置。

２８、第二の信号の大きさの持続時間を測定することも特徴とする請求項２７に 記載の装置。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成３年１１月１５日 、□９□　ゆア　ヨ　や　団 １、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０２６３１、発明の名称　微生物検 出装置 ３、特許出願人 住　所　オランダ国、６８００・エル・ニス・アーネム、ピー・オー・ボックス ・１８６、フェルペルウエヒ・７６５、補正書の提出年月日　１９９１年３月２ ８日　。

６、添附書類の目録 一部・１魚２ １逮ｏｉ旧１ １、試料中での微生物増殖を監視する装置であって、その内部スペースにおいて 試料が滅菌培地で培養される、少なくとも一部が透明な密閉可能でかつ滅菌可能 な容器と、この容器内で透明部分の領域に配Ｉされており、微生物増殖の代謝物 に晒されると、容器の透明部分を通して検出され得るその測定可能な特性が、前 記透明部分を通して容器外部から監視され得る変化を呈し、それによって密閉後 の容器への侵入を伴わずに微生物増殖を監視する滅菌可能な指示手段と、 す信号を発生する、この信号が前記透明部分を通して指示手段に当たるように指 示手段に対して位置決めされた信号発生手段と、 前記透明部分を通して指示手段から前記信号を受け取ってそれに対応する第二の 信号を生成するように指示手段に対して位置決めされた信号検出手段と、 第二の信号を受信及び処理して指示手段の測定可能な特性の変化または大きさを 評価し、それによって密閉後の密閉可能容器内での微生物増殖を監視する処理手 段とを含む装置。

２、第二の信号を受信する処理手段が回路手段であることを特徴とする請求項１ に記載の装置。

３、信号発生手段が発光ダイオードを含むことを特徴とする請求項１に記載の装 置。

４、信号検出手段が発光ダイオードの放射光を受け取るホトダイオードを含むこ とを特徴とする請求項３に記載の装置。

５、第二の信号を受信する処理手段が発光ダイオードのための安定電流源を含む ことを特徴とする請求項３に記載の装置。

６、回路手段が 第二の信号を選択された時間間隔で受信し、かつ受信の度に当該時間間隔の中で 第二の信号の特性に生じる何等がの変化を比較する手段 を含むことを特徴とする請求項２に記載の装置。

７、回路手段が、第二の信号を周期的にサンプリングし、第二の信号のサンプル 同士を比較し、かつ前記サンプルの変化の速度を計算する計算手段を含むことを 特徴とする請求項２に記載の装置。

８、変化速度を検出してこの変化速度の持続時間を測定する手段も含むことを特 徴とする請求項１に記載の装置。

９、試料中での微生物増殖を検出する方法であって、その壁の少なくとも一部が 透明である滅菌可能な容器と、この容器内で前記透明部分の領域に配置された、 微生物増殖の代謝物に晒されると変化する指示手段とを用意するステップと、 指示手段の測定可能な特性に影響を及ぼす第一の信号を発生する、第一の信号が 前記透明部分を通して指示手段に当たるように指示手段に対して位置決めされた 信号発生手段を用意するステップと、 指示手段から前記第一の信号を受け取ってそれに対応する第二の信号を生成する ように指示手段に対して位置決めされた信号検出手段を用意するステップと、第 二の信号を受信及び処理して指示手段の測定可能な特性の変化または大きさを評 価する処理手段を用意するステップと、試料を滅菌条件下に容器内に導入するス テップと、容器内の試料をインキュベートするステップと。

第二の信号の変化または第二の信号の大きさを検出し、それによって密閉後の密 閉可能容器内での微生物増殖を検出するステップと を含む方法。

１Ｇ、第二の信号を選択された時ｆｍｍ隔で受信するステップ、及び 当該時間間隔の中で第二の信号の特性に生じる何等かの変化を比較するステップ をも含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。

１１、第二の信号をサンプリングするステップ、第二の信号の連続するサンプル 同士を比較するステップ、及び 連続するサンプル同士の間での変化の速度の増加率を計算するステップ をも含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。

１２、増加率を検出するステップ、及び検出した増加率の持続時間を測定するス テップをも含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。

１３゜試料中に微生物が存在することを決定する方法であって、 請求項１に記載の装置を用意するステップと、試料を滅菌容器内に導入するステ ップと、容器内の試料をインキュベートするステップと、指示手段の測定可能な 特性の変化を検出手段で、少なくとも１種の時間間隔で監視するステップと、前 記測定可能な特性の変化の速度を計算し、それによって該特性の一次導関数を決 定するステップと、測定可能な特性の一次導関数の大きさを分析して、試料中に 微生物が存在することを確定するステップとを含む方法。

１４、試料中に微生物が存在することを決定する方法であって、 請求項１に記載の装置を用意するステップと、試料を滅菌容器内に導入するステ ップと、容器内の試料をインキュベートするステップと、指示手段の測定可能な 特性の変化を検出手段で、少なくとも１種の時間間隔で監視するステップと、前 記測定可能な特性の大きさを測定して、試料中に微生物が存在することを確定す るステップと を含む方法。

１５、測定可能な特性の二次導関数を計算するステップ、及び 前記二次導関数の大きさを分析し、それによって試料中に微生物が存在するかど うか確認するステップをも含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。

１８、前記二次導関数の持続時間を測定するステップも含むことを特徴とする請 求項１５に記載の方法。

１７、指示手段が膜と、微生物の代謝物に晒されると検出可能な変化を呈する指 示媒体とを含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。

１８、膜が容器の内側面に貼り付けられていることを特徴とする請求項１に記載 の装置。

１９、指示媒体が容器の内側面に当接するように配置されて　゛おり、指示手段 の膜は指示媒体を培地から分離することを特徴とする請求項１に記載の装置。

２０、代謝物がＣ０２であることを特徴とする請求項１に記載の装置。

２１、指示媒体がＩ）Ｆｌに対して化学的に応答することを特徴とする請求項１ に記載の装置。

２２、測定可能な特性が吸光特性、燐光特性、光散乱特性、屈折特性、蛍光特性 及び光反射特性の中から選択されることを特徴とする請求項１に記載の装置。

２３、測定可能な特性が吸光特性、燐光特性、光散乱特性、屈折特性、蛍光特性 及び光反射特性の中から選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。

２４、測定可能な特性が吸光特性、燐光特性、光散乱特性、屈折特性、蛍光特性 及び光反射特性の中から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。

２５、変化の加速度を検出する手段をも含むことを特徴とする請求項１に記載の 装置。

２６、検出した加速度の持続時間を測定することも特徴とする請求項２５に記載 の装置。

２７、第二の信号の大きさを測定する手段をも含むことを特徴とする請求項１に 記載の装置。

２８、第二の信号の大きさの持続時間を測定することも特徴とする請求項２７に 記載の装置。

国際調査報告 １ｍｊＭ口ｌｌｍ−＾１１１１＋ｌ１ｌＩＩＩｌｌａＰＣＴ／υ５９０１０２６ ３１国際調査報告

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．マイクロバクテリア増殖の副産物に晒されるとその反射特性が変化するイン ジケーターを監視する装置であって、前記副産物に晒す間インジケーターを受容 し、かつインジケーターを所望の向きに位置決めするハウジングと、インジケー ターの反射特性のスペクトル範囲内の信号を発生する、発生信号がインジケータ ーに当たるようにインジケーターに対して位置決めされた信号発生器と、前記信 号のインジケーターからの反射を感知してそれに対応する第二の信号を生成する ようにインジケーターに対して位置決めされた信号検出器と、 前記第二の信号を受信及び処理してインジケーターの反射特性の変化を評価する 回路手段と を含む装置。
2. ２．信号発生器が発光ダイオードを含むことを特徴とする請求項１に記載の装置 。
3. ３．信号検出器が発光ダイオードの放射光の反射を受け取るホトダイオードを含 むことを特徴とする請求項２に記載の装置。
4. ４．回路手段が発光ダイオードのための安定電流源を含むことを特徴とする請求 項２に記載の装置。
5. ５．回路手段が 第二の信号を選択された時間間隔で受信し、かつ当該時間間隔の中で第二の信号 の特性に生じる何等かの変化を比較する計算手段 を含むことを特徴とする請求項３に記載の装置。
6. ６．回路手段が、第二の信号を周期的にサンプリングし、第二の信号の連続する サンプル同士を比較して連続するサンアル同士の間での変化の速度の増加率を計 算する計算手段を含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
7. ７．計算手段が、正の増加率を検出して正の増加率の持続時間を測定する手段を 含むことを特徴とする請求項６に記載の装置。
8. ８．マイクロバクテリア増殖の副産物に晒されるとその反射特性が変化するイン ジケーターを監視する方法であって、前記副産物に晒す間インジケーターを受容 し、かつインジケーターを所望の向きに位置決めするハウジングを用意するステ ップと、 インジケーターの反射特性のスペクトル範囲内の信号を発生する、発生信号がイ ンジケーターに当たるようにインジケーターに対して位置決めされた信号発生器 を用意するステップと、 前記信号のインジケーターからの反射を感知してそれに対応する第二の信号を生 成するようにインジケーターに対して位置決めされた信号検出器を用意するステ ップと、前記第二の信号を受信及び処理してインジケーターの反射特性の変化を 評価する回路手段を用意するステップとを含む方法。
9. ９．第二の信号を選択された時間間隔で交信するステップ、及び 当該時間間隔の中で第二の信号の特性に生じる何等かの変化を比較するステップ をも含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. １０．第二の信号を周期的にサンプリングするステップ、第二の信号の連続する サンプル同士を比較するステップ、及び 連続するサンプル同士の間での変化の速度の増加率を計算するステップ をも含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
11. １１．正の増加率を検出するステッア、及び正の増加率の持続時間を測定するス テップをも含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。