JPH04505263A - ズブチリシン変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １２、たんばく賞を分解し得る酵素的クリ−ニゲ組成物で、ａ）界面活性剤、お よび ｂ）バチルス　アミロリクエファシェンスズブチリシンにおける＋１２３または ＋２７４と等価な前駆体カルボニルヒドロラーゼにおける部位のアミノ酸を別の アミノ酸に置換することにより、該前駆体から誘導される天然にはないアミノ酸 配列を有するカルボニルヒドロラーゼ変異体。

以上ａ）およびｂ）を含む組成物。

１３、前記カルボニルヒドロラーゼ酵素がズブチリシンを含む請求の範囲１２記 載の組成物。

１４、前記ズブチリシンが以下のアミノ酸配列：を有する請求の範囲１３記載の 組成物。

１５、界面活性剤が洗剤を含む請求の範囲１２記載の組成物。

１６、スプレードライ洗剤顆粒を含む請求の範囲１５記載の組成物。

明細書 ズブチリシン変異体 （発明の分野） 本発明は前駆体カルボニルヒドロラーゼの１つ以上のアミノ酸残基、特ｆトバチ ルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｈｖｅｆａ ｃｉｅｎｓ　）のズブチリシン中の残基＋１２３および、または＋２７４に対応 する部位のアミノ酸残基が別のアミノ酸に置換した新しいカルボニルヒドロラー ゼに関する。一般にこのようなカルボニルヒドロラーゼ変異体は前駆体アミノ酸 配列中のこれらのアミノ酸残基の１つまたは両方の置換のみまたは別の置換を組 合せた置換、前駆体アミノ酸配列中の挿入または欠失をコードするような天然も しくは組換えカルボニルヒドロラーゼをコードする前駆体ＤＮＡ配列のインビト ロ突然変異誘発により得られる。

（発明の背景） セリンプロテアーゼはカルボニルヒドロラーゼのサブグループである。これらに 広範囲の特異性および生物学的機能を有する多様なりラスの酵素が含まれる。ス トラウド（Ｓｔｒｏｕｄ）　、Ｒ，Ｍ。

（１９７４）　、Ｓｃｉ、　Ａｍｅｒｏ、　１３１　、７４〜８８゜それらの機 能的多様性にもかかわらずセリンプロテアーゼの触媒機械は少なくとも２つの遺 伝的に異なる酵素群：ズブチリシンおよび哺乳類キモトリプシン関連および相同 的バクテリアセリンプロテアーゼ（たとえば、トリプシンおよびＳ、ブレシラス （ｇｒｅｓｉｕｓ）　）リプシン）によって手がかりが得られてきた。これら２ つのセリンプロテアーゼ群はその触媒機構が著しく似ている。クラウド（にｒａ ｕｔ）、Ｊ、　（１９７７）、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　４６． ３３１−３５１３　、さらに−次構造は関連がないが２つの酵素群の３次構造が セリン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸からなるアミノ酸の保存的触媒性三つ 組を有している。

ズブ、チリシンは広範囲のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種および他の微生物か ら大量に分泌されるセリンエンドプロテアーゼ（ＭＷ２７、０００）である。ズ ブチリシンのたんばく質配列は少なくとも４種のバチルス（Ｂａｃ　ｉ　Ｉ　Ｉ ｕｓ）由来のものが決定されている。マークランド（ｌａｒｋｌａｎｄ）　Ｆ、 　Ｓ、等（１９８３）、ｆ（ｏｎｎｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、　Ｐｈｙｓｉｏ ｌ。

Ｃｈｅｍ、、　３６４’、　１５３７−１５４０　、２．５　Ａの分解能のバチ ルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆ ａｃｉｅｎｓ）のズブチリシンの三次元結晶構造も報告されている。ライ）　（ Ｗｒｉｇｈｔ）　、Ｃ，Ｓ。

等（１９６９）　、Ｎａｔｕｒｅ、　２２１．２３５−２４２、ドレンス（Ｄｒ ｅｎｔｈ）　、Ｊ。

等（１９７２）　、Ｂｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　２６．１７７−１８ １　、これらの研究でズブチリシンは一般に哺乳類セリンプロテアーゼとは関係 がないが、同様の活性部位を有していることが示された。共有結合で結合したペ プチドインヒビターを含むズブチリシン（ロバータス（Ｒｏｂｅｒｔｕｓ）　、 Ｊ、　Ｄ、、等（１９７２）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１１．２４３９−２４４９ ）または生成物複合体（ロバータｘ　（Ｒｏｂｅｒｔｕｓ）　Ｊ、　Ｄ、等（１ ９７２）　、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５１．１０９７−１１０３）のＸ線結晶構造もズブ チリシンの活性部位および推測上の基質結合クレットに関する情報を提供してい る。さらに、多数の速度論的および化学修飾的研究がズブチリシンに関して報告 されており（フィリップ（Ｐｈｉｌｉｐｐ）、４等チリシンの残基２２２のメチ オニンの側鎖を過酸化水素でメチオニン−スルホキシドに転換したもの（ストフ ァー（ＳＬａｎｆｆｅｒ）、Ｄ、　Ｃ，等（１９６５）　、Ｊ、　Ｒｉａｌ、Ｃ ｈｅｍ、２４４．５３３３−５３３８）および残基２２１のセリンの側鎖を化学 修飾することによりシスティンに変換したもの（ボルガ−（Ｐｏｌｇａｒ）等、 （１９８１）　、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ 、　６６７．３５１−３５４＞が含まれている。

各々１９８５年１月９日に公表された米国特許Ｎａ４．７６０．０２５およびＥ Ｐ○公開Ｎａ　０１３０７５６はバチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）のズブチリシンのチロシン −１、アスパラギン酸＋３２、アスパラギン＋１５５、チロシン＋１０４、メチ オニン＋２２２、グリシン＋１６６、ヒスチジン＋６４、グリシン＋１６９、フ ェニルアラニン＋１８９、セリン＋３３、セリン＋２２１、チロシン＋２１７、 グルタミン酸＋１５６およびアラニン＋１５２に対応するズブチリシンのアミノ 酸残基の修飾について公開している。１９８８年１月７日に公表されたＥＰＯ公 開Ｎα０２５１４４６は有用なズブチリシン変異体を形成するバチルス　アミロ リクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏ−１ｉｑｖｅｆａｃｉｅｎ ｓ）のズブチリシンの他のアミノ酸残基および置換、挿入または欠失による修正 可能な、および米国特許Ｎα４．７６０．０２５で同定されている残基の修飾と 組合せ得るそれらの等漬物を公開している。しかし本明細書で同定されている特 定の残基はそれらの参考文献において同定されたものではない。同様に各々１９ ８９年１０月１９日刊行のＰＣＴ公開Ｎａ　ＷＯ８９１０９８１９およびＮＯ８ ９１０９８３０はズブチリシンをコードするヌクレオチド配列を変異させて作っ たズブチリシン酵素を公開している。これら各々の刊行物において修正し得る多 くのアミノ酸が同定されている。しかし、先に述べた参考文献同様ここにも本発 明の残基は同定されていない。

したがって本発明の目的はバチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）のズブチリシン中＋１２３および 、または＋２７４に対応する前駆体カルボニルヒドロラーゼ中のアミノ酸残基の 置換を含むカルボニルヒドロラーゼ変異体を提供することにある。一般にこのよ うな変異体はそのような変異体のアーミノ酸が誘導される前駆体のカルボニルヒ ドロラーゼノイくつかの性質とは異なる少なくとも１つの性質を有している。

さらに本発明の目的はこのようなカルボニルヒドロラーゼ変異体をコードするＤ ＮＡ配列ならびにこれらの変異体ＤＮＡ配列を含む発現ベクターを提供すること にある。

さらに本発明の目的はこれらのベクターでトランスホームした宿主細胞ならびに これらのＤＮＡを発現させて細胞内または細胞外にカルボニルヒドロラーゼ変異 体を産生じ得る宿主細胞を提供することにある。

（発明の概要） 本発明は変異体のアミノ酸配列を誘導する前駆体カルボニルヒドロラーゼと比較 して異なるたんばく質分解活性、安定性および、または性能特性を有する非天然 のカルボニルヒドロラーゼ変異体に関する。前駆体カルボニルヒドロラーゼは天 然のカルボニルヒドロラーゼまたは組換えヒドロラーゼである。特にこれらのカ ルボニルヒドロラーゼ変異体は天然では見られないアミノ酸配列を有しており、 前駆体がカルボニルヒドロラーゼの１つ以上のアミノ酸を１つ以上の別のアミノ 酸で置換することにより誘導される。

前駆体酵素の１つ以上のアミノ酸はバチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）のズブチリシンのＡ、ｓ ｎ＋１２３および、またはＡＩａ＋２７４、または他のカルボニルヒドロラーゼ またはズブチリシンの同等のアミノ酸残基に対応している。また本発明はこのよ うなカルボニルヒドロラーゼまたはズブチリシン変異体をコードする変異ＤＮＡ 配列に関する。

これらの変異ＤＮＡ配列は天然または組換え前駆体酵素をコードする前駆体ＤＮ Ａ配列から誘導する。変異体ＤＮＡ配列バチルスアミロリクエ７７シエンス（Ｂ ａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）のズブチリシン中＋１ ２３および、または＋２７４に対応する頗駆体ＤＮＡ配列によってコードされる １つ以上の特異的アミノ触残基を置換するよう前駆体ＤＮＡ配列を修正すること により誘導される。これらの組換えＤＮＡ配列は新しいアミノ酸配列、および一 般には前駆体カルボニルヒドロラーゼＤＮＡ配列によりコードされる酵素の性質 とは実質的に異なる少なくとも１つの性質を有するカルボニルヒドロラーゼ変異 体をコードしている。これらの性質にはたんばく質分解活性、安定性および、ま たは性能特性の増加などが含まれる。

また本発明にはバチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍ ｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）のズブチリシン中のＡｓｎ＋１２３と等価な 部位にセリンなど異なるアミノ酸残基を有する原核性および真核性のズブチリシ ンおよびバチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏ ｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）中の部位２７４と等価な部位に異なるアミノ酸残基 を有するズブチリシンが含まれる。

さらに本発明にはカルボニルヒドロラーゼ変異体のＤＮＡ配列を含む発現ベクタ ーならびに該ベクターでトランスボームしそのような変異体を産生じ得る宿主が 含まれる。また本発明は本発明のカルボニルヒドロラーゼ変異体を含む洗剤組成 物に関する。

（図面の簡単な説明） 第１図はバチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌ ｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ　）のズブチリシンのＤＮＡおよびアミノ酸配列および この遺伝子の制限地図の一部を示している。

第２図はバチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌ ｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）枯草菌（［１ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）ｖ ａｒ１１６８およびバチルス　リチェニポルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｒ ｎｉｆ　ｉｒｍｉｓ）由来のズブチリシン間に保存されているアミノ酸Ｉ　残基 を示してきる（カールスバーゲ７−／Ｘ　（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）） 。

＊　第３Ａ図および第３Ｂ図はバチルス　アミロリフエフアシエン蓼　ス（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）　、枯草菌（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓＬ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｗａｒ　Ｉ　１６８およびバチルス　リチェニポ ルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　）由来のズブチリシ ンのアミノ酸配Ｆ　列を示している。

−第４図は３つのズブチリシンのアミノ酸配列を示している。上し　はバチルス 　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉ ｅｎｓ）由来のズブチリシン（時にはズブチリシンＢＰＮ’　と呼ばれる）のア ミノ酸配列を示している。中央はバチＢｖＸ　ｔ／７タス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 Ｉｅｎｔｕｓ）由来のズブチリシン（ＰＣＴ刊行Ｎα１１０８９１０６２７６に おけるズブチリシン３ｏ９）のアミノ酸配列を示している。下はＧＧ−ＲＹＳＡ と命名した本発明の好ましい態様のアミノ酸配列を示している。記号＊はズブチ リシンＢＰＮ’と比較して特定のアミノ酸残基が無いことを示している。

１　第５図はプラスミドｐｃ、ｃ　Ａ２７４の構築を示している。

第６図はプラスミドｐＧＧ−ＲＹＳＡへの中間体であるｐＧＧ−ＫＶＮＡの構築 を示している。

第７図は合成バチルス　レングス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｅｎｔｕｓ）ズブチリ シン遺伝子の構築に用いたオリゴヌクレオチド二重鎮法を示している。

第８図はバチルス　レングス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｅｎｔｕｓ）ズブチリシン をコードする合成遺伝子を構築するための戦略を示している。

第９図はカセット突然変異誘発にょるコドン部位＋１２３におけるＤＮＡの置換 に用いたカセットを示している。ｘＸｘは部位＋１２３のアミノ酸置換をコード するよう修正したコドンを表ゎしている。

第１０図は本発明の好ましい態様のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示している。こ のＤＮＡ配列は合成りＮＡの配列である。この図中のＤＮＡは部位２７がアルギ ニン、部位７８がセリン、部位１０４がチロシン、部位１２３がセリンおよび部 位２７４がアラニンをコードするよう修正されている。

（本発明の詳細な説明） バチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｖｅ ｆａｃｉｅｎｓ　）ズブチリシンの＋１２３に対応するアミノ酸残基にカルボニ ルヒドロラーゼズブチリシンのインビトロ突然変異が起こるき前駆体ズブチリシ ン以上のタンパク質分解活性を示すズブチリシン異変体が生成することが発見さ れた。

またバチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑ ｖｅｆａｃｉｅｎｓ　）ズブチリシン中の＋２７４に対応する残基にインビトロ 突然変異が起こると安定性が変化した、たとえば自己たんばく質分解安定性が変 化したズブチリシン変異体が生成することが発見された。ある場合には後者の変 異体を洗剤組成物に用いたとき優れた性能を示す。

カルボニルヒドロラーゼは以下の化学式：Ｃ式中Ｘは酸素または窒素である。） で表わされる結合を含む化合物を加水分解する酵素である。それらには天然のカ ルボニルヒドロラーゼおよび組換えカルボニルヒドロラーゼが含まれる。原則と して天然のカルボニルヒドロラーゼにはズブチリシンまたはメタロプロテアーゼ などのヒドロラーゼ、たとえばペプチドヒドロラーゼが含まれる。ペプチドヒド ロラーゼにはα−アミノアシルペプチドヒドロラーゼ、ペプチジルアミノ酸ヒド ロラーゼ、アシルアミノヒドロラーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、メタロ カルボキシペプチダーゼ、チオールブロティナーゼ、カルボキシプロティナーゼ およびメタロプロテアーゼが含まれる。セリン、メタロ、チオールおよび酸プロ テアーゼにはエンドおよびエクソブロテアーゼが含まれる。

“組換えカルボニルヒドロラーゼとは天然のカルボニルヒドロラーゼをコードす るＤＮＡ配列がカルボニルヒドロラーゼアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸の 置換、挿入または欠失をコードする変異体ＤＮＡ配列を生ずるよう修正されたカ ルボニルヒドロラーゼを意味する。適当な修正法は本明細書、１９８５年１月９ 日に刊行さｔしたＥＰｏ刊行物ＮｎＯ１３０７５６および１９８８年１月７日刊 行されたＥＰＯ公開Ｎ（１０２５１４４６に公開されている。

“ズブチリシン”とはバクテリアまたは菌類カルボニルヒドロラーゼであり一般 にはたんばく質またはペプチドのペプチド結合を切断するよう作用する。ここで 使用されているように“ズブチリシン”とは天然ズブチリシンまたは組換えズブ チリシンを意味している。一連の天然ズブチリシンは種々の微生物種によって生 産され、しばしば分泌されることが知られている。このシリーズのアミノ酸配列 は全てが相同的ではない。しかし、このシリーズのズブチリシンは同じまたは同 様のたんばく質分解活性を示す。

このクラスのセリンプロテアーゼはキモトリプシン関連のセリンプロテアーゼと 区別される触媒性三つ組を規定する共通のアミノ酸配列を共有している。ズブチ リシンおよびキモトリプシン関連セリンプロテアーゼの両方はアスパラギン酸ヒ スチジンおよびセリンを含む触媒性三つ組を有している。ズブチリシン関連プロ テアーゼの場合、アミノ末端からカルボキシ末端の方向でこれらのアミノ酸の相 対的順番はアスパラギン酸−ヒスチジン−セリンの順である。しかしキモトリプ シン関連プロテアーゼの場合この相対的順番はヒスチジン−アスパラギン酸−七 リンの順である。したがって本明細書のズブチリシンはズブチリシン関連プロテ アーゼの触媒性三つ組を有するセリンプロテアーゼを意味する。例としては本明 細書の第３図に示したズブチリシンおよびＰＣＴ公開Ｎｎ　Ｎｏ　８９１０６２ ７６およびＥＰＯ公開Ｈａ　Ｏ２８３０７５に報告されているズブチリシンが含 まれる。

１組換えズブチリシン”とはズブチリシンをコードするＤＮＡ配列を修正し、天 然のズブチリシンアミノ酸配列中の１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入 をコードする変異ＤＮＡ配列を産生ずるズブチリシンを意味する。このような修 正を行う適当な方法および本明細書に公開されている方法と組合せ得る適当な方 法１．：　ｊｔ　Ｅ　Ｐ　Ｏ公開Ｎａ　Ｏ１３０７５６および０２５１４４６お よびＰＣＴ公開Ｎ１１１１０８９１０６２７９．１１０８９１０９８３０　＄ヨ び１１０８９１０９８１９１．Ｊ示されている方法が含まれる。

“非ヒトカルボニルヒドロラーゼおよびこれをコードするＤＮＡは多くの原核性 および真核性生物から入手し得る。原核性生物の適当な例には大腸菌またはシュ ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などのグラム陰性！！およびマイクロコ ツカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）またＧｔバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）など のダラム陽性菌が含まれる。カルボニルヒドロラーゼおよびそれらの遺伝子を入 手する真核性生物の例にはサツカロミセスセレビシェ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅ ｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのイースト、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇ ｉｌｌｕｓ）種　などの菌類およびたとえばカルボニルヒドロラーゼキモシンを コードする遺伝子を入手し得るウシ（ｂｏｖ　１ｎｅ）種などの非ヒト哺乳類が 含まれる。ズブチリシンと同様に一連のカルボニルヒドロラーゼはそれらのシリ ーズ間では全く相同的ではないが同じまたは同様の生物学的活性を示すアミノ酸 配列を有する種々の関連種から入手し得る。したがって本明細書に述べられたて いる非ヒトカルボニルヒドロラーゼは直接的または間接的に原核生物および真核 生物に関連するカルボニルヒドロラーゼに関する機能を有している。

１力ルボニルヒドロラーゼ変異体”は１前駆体カルボニルヒドロラーゼ″のアミ ノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列を存している。前駆体カルボニルヒドロラ ーゼには天然カルボニルヒドロラーゼおよび組換えカルボニルヒドロラーゼが含 まれる。カルボニルヒドロラーゼ変異体のアミノ酸配列は前駆体アミノ酸配列の １つ以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入により前駆体ヒドロラーゼアミノ酸 配列から“誘導”される。このような修正は前駆体カルボニルヒドロラーゼ酵素 自体の取扱いというよりはむしろ前駆体カルボニルヒドロラーゼのアミノ酸配列 をコードする６前駆体ＤＮＡ配列”に関する。前駆体ＤＮＡ配列の取扱いに適し た方法ニハ本発明書およびＥＰＯ刊行ＮａＯ１３０７５６および０２５１４４６ に公開されている方法が含まれる。

バチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｖｅ ｆａｃｉｅｎｓ　）ズブチリシンの部位＋１２３および＋２７４に対応する特定 の残基の置換について同定する。これらのアミノ酸部位番号は第１図の成熟バチ ルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａａ＋ｙｌｏｌｉｑｖｅ ｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシン配列に割当てられた番号である。しかし本発明は この特定のズブチリシンの変異に限定される訳ではなく、バチルス　アミロリク エファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズ ブチリシンにおける特定の残基を等価な１部位のアミノ酸残基を含む前駆体カル ボニルヒドロラーゼに拡張される。

前駆体カルボニルヒドロラーゼの残基（アミノ酸）はバチルスアミロリクエファ シェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリ シン中の特定の残基またはその残基の一部に相同的な（すなわち−次または三次 構造中の部位に関して）または類似する（すなわち化学的に結合、反応または相 互作用する同じ、または同様の機能を有する）場合バチルス　アミロリクエファ シェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｆｆｉｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）の残 基と等価である。

−次構造のホモロジーを確認するための前駆体カルボキシルヒドロラーゼのアミ ノ酸配列をバチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌ ｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシンの一次配列、特に配列が分っている 全てのズブチリシンに共通することが分っている一連の残基と直接比較した（第 ２図）。保存的残基が整列するよう必要な挿入および欠失を考慮すると（すなわ ち任意の挿入および欠失により保存的残基の除外を回避して）バチルス　アミロ リクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ ）ズブチリシンの一次配列中の特定のアミノ酸に相当する残基が限定される。

おそらく保存的残基の整列はそのような残基の１００％を保存している。しかし 、７５％以上または５０％程の保存的残基を整列させても等価な残基を限定する ことができる。触媒性三つ組ＡＳＰ３２／Ｈｉｓ６４／５ｅｒ２２１の保存は維 持されている。

たとえば第３図でバチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａ ｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）　、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ ｉｌｉｓ）変異体■１６８およびバチルス　リチェニホルミル（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓｌｉｃｈｅｍｆｏｒｍｉｓ）のズブチリシンのアミノ酸配列（カールスバーゲ ンシス）を各アミノ酸配列間で最高のホモロジーを示すように整列させている。

これらの配列の比較で各配列中に多くの保存的残基が含まれていることが示され た。これらは第２図で同定された残基である。

したがってこれらの保存的残基を用いて・バチルス　レングス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ　Ｉｅｎｔｕｓ）由来のズブチリシン（１９８９年７月１３日刊行のＰＣＴ刊 行Ｎａ　Ｗｏ　８９１０６２７９）や本発明の好ましいズブチリシン変異体など 他のカルボニルヒドロラーゼにおいてバチルスアミロリクエファシェンス（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシンの対応する アミノ酸残基を限定することができる。これらの特定のアミノ酸配列を第４図に 保存的残基とホモロジーが最大となるようバチルス　アミロリクエファシェンス （Ｂａｃｉｌｌｕｓａｎ＋ｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）の配列と整列させ である。ここから分るようにバチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ　ａｎ＋ｙｌｏ−１ｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシンと比べてバチ ルス　レングス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｅｎｔｕｓ）ズブチリシンおよび本発明 の好ましいズブチリシン変異体の配列中には多くの欠失がある。バチルス　アミ ロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎ ｓ）ズブチリシン中のＶａｌ−１６５と等価な他のズブチリシン中のアミノ酸は Ｖａｌ−１６５の下に示されている特定のインロイシンである。

第４図において、部位１２３のアミノ酸はバチルス　アミロリクエファシェンス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシン中の アスパラギンである。バチルス　レングス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｅｎｔｕｓ） ズブチリシンにおける等価な残基は特定のアスパラギンであることが示されてい る。しかし本発明の好ましいズブチリシンの場合バチルス　アミロリクエファシ ェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏ　−１ｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチ リシンの＋１２３に相当するアミノ酸はアスパラギンというような第４図に示さ れているセリンとした方が良いであろう。同様に第４図においてバチルス　アミ 口リクエフアシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎ ｓ）ズブチリシン＋２７４のアミノ酸はアラニンである。ここから分るようにバ チルス　レングス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｅｎｔｕｓ）ズブチリシンにおけるこ れと等価なアミノ酸は第４図に示されている特定のスレオニンである。本発明の 特定の好ましいズブチリシン変異体の場合、部位２７４の等価なアミノ酸は第４ 図に示されているようにアラニンである。

このよう１こバチルス　レングス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｅｒ＋ｔｕｓ）ズブチ リシンおよび本発明の好ましい態様のズブチリシンに関する部位＋１２３と＋２ ７４のアミノ酸は第４図の一次アミノ酸配列から同定される。しかし、バチルス 　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃ ｉｅｎｓ）ズブチリシン中の特定のアミノ酸と等価な他の種々のアミノ酸残基も 変化している可能性がある。

好ましい態様において、バチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシン中部位２７のアミノ酸 リジンはバチルス　レングス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｅｎｔｕｓ）ズブチリシン 中部位２７に等価なリジンを有している。実施例に示されているように、本発明 の好ましい態様の１つを含むズブチリシンはバチルス　レングス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　１ｅｎｔｕｓ＞ズブチリシンをコードするＤＮＡ配列を修正することによ り誘導した。このＤＮＡに対するこのような修正にはバチルス　アミロリクエフ ァシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチ リシンの部位１２３および２７４に等価なコドンの修正も含んでいる。しかし、 他の２つの修正はバチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａ ｍｙｌｏ−１１ｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシン中の残基２７および１０４ と等価なバチルス　レングス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｅｎｔｕｓ）のアミノ酸配 列中の部位に行なわれた。このように第４図から分るようにバチルス　レングス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｅｎｔｕｓ）中の等価な残基２７にあるリジンは好まし い態様中アルギニンをコードするよう修正した。同様にバチルスアミロリフｘ　 ７７　シｘ　ンｘ　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ ）ズブチリシン中のチロシン１０４と等価なバチルス　レングス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　Ｉｅｎｔｕｓ）の部位１０４のバリン残渣もチロシンをコードするよう修 正した。このように第４図に示した好ましい態様にはバチルス　アミロリクエフ ァシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏ〜１ｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブ チリシンの部位２７．１０４．１２３および２７４と等価なバチルス　レングス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｅｎｔｕｓ）ズブチリシンの残基を修正することにより 該ズブチリシンから誘導されるアミノ酸配列を含んでいる。

またＸ線結晶学により三次構造が測定されている前駆体カルボニルヒドロラーゼ の三次構造レベルでのホモロジーを測定することにより等価残基を限定し得る。

等価残基とは前駆体カルボニルヒドロラーゼおよびバチルス　アミロリクエファ シェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリ シンの特定のアミノ酸の２つ以上の主鎖原子（ＮとＮ５ＣＡとＣＡ、ＣとＣ１お よび０と０）の原子座標が整列後０．１３　ｎｍ、好ましくは０．１　ｎｍ以内 にある残基と定義する。整列はバチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシンに対し問題のカ ルボニルヒドロラーゼの水素以外のたんばく質原子の原子座礁が最も重なるよう に最良のモデルを配向させることにより達成させる。

この最良のモデルは入手し得る最も高い分解能の実験的回折データに関し最も低 いＲ因子を与える結晶学的モデルである。

バチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏ−１ｉｑ ｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシンの特定の残基と機能的に類似する等価残基と はバチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑ ｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシンの特定の残基に限定されかつ寄因する様式で たんばく質構造、気質結合または触媒性を変化、修正またはそれらに寄与するよ う構造を適用させ得る前駆体カルボニルヒドロラーゼのアミノ酸と定義される。

さらにこれらは所定の残基の主鎖原子は相同的部位の占有に基づき等優性の基準 を満足しない場合でもそのい残基の側鎖原子の少なくとも２つの原子座標がバチ ルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏ−１ｉｑｖｅ ｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシンの対応する側鎖原子の０．１３　ｎｍ以内に存在 する程度に類似部位を占有する前駆体カルボニルヒドロラーゼ（この三次構造が Ｘ線結晶学から判明している）の残基である。バチルス　アミロリクエファシェ ンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏ−１ｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシ ンの三次元構造の座標はＥＰＯ刊行Ｎ［１０２５１４４６に報告されており、先 に概説したようにこれらを用いて三次構造レベルで等価残基を決定し得る。

置換、挿入または欠失についても同定される残基には保存的残基が含まれるがそ の他のものは保存的残基ではない。

保存されない残基の場合１つ以上のアミノ酸の置換は天然に存在するもので相当 しないアミノ酸配列を有する変異体を生ずる置換に限定される。保存的残基の場 合、これらの置換で天然の配列は生じない。本発明のカルボニルヒドロラーゼ変 異体にはカルボニルヒドロラーゼ変異体の成熟型および該ヒドロラーゼ変異体の プロ型およびプレプロ型が含まれる。プレプロ型はカルボニルヒドロラーゼ変異 体の発現、分泌および成熟を容易にすることから好ましい構築物である。

“プロ配列”とは除去されたときカルボニルヒドロラーゼ成熟”型となるカルボ ニルヒドロラーゼ成熟型のＮ末端部分に結合するアミノ酸配列である。多くのた んばく質分解酵素が翻訳性プロ酵素産物として天然に存在し、また翻訳後プロセ シングがない場合もこの様式で発現される。別のズブチリシンプロ配列モ使用で きるがカルボニルヒドロラーゼ変異体、特にズブチリシン変異体を産生ずるため の好ましいプロ配列はバチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ 　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシンの推定上のプロ配列であ る。実施例においてはバチルスレングス（ＡＴＣＣ２１５３６）由来のズブチリ シンの推定上のプロ配列を用いた。

“シグナル配列”または“プレ配列”とはヒドロラーゼの成熟型またはプロ型の 分泌に関係するカルボニルヒドロラーゼのＮ末端部分またはプロヒドロラーゼの Ｎ末端部分に結合するアミノ酸配列を意味する。

このシグナル配列の定義は天然条件下ズブチリシンまたは他のカルボニルヒドロ ラーゼの分泌の達成に関与するズブチリシン遺伝子または他の分泌可能なカルボ ニルヒドロラーゼのＮ末端部分によってコードされているこれら全てのアミノ酸 配列を含む機能的配列である。本発明はこれらの配列を利用し、本明細書で定義 されているカルボニルヒドロラーゼ変異体の分泌を達成している。

実施例で使用している好ましいシグナル配列には枯草菌（１３ａ（：１ｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ズブチリシン由来のシグナル配列の最初の７個のアミノ酸残 基をバチＪＬ、スＬ／７タｘ　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｅｎｔｕｓ）　（ＡＴＣ Ｃ２１５３６）ズブチリシンのシグナル配列の残り部分に融合したものが含まれ る。

′フレフロ″型のカルボニルヒドロラーゼ変異体はヒドロラーゼのアミノ末端に 機能的に結合するプロ配列を有する成熟型のヒドロラーゼおよびそのプロ配列の アミノ末端に機能的に結合する“ブレ”または“シグナル″配列を含む。

発現ベクターとは適当な宿主中ＤＮＡ発現が可能な適当なコントロール配列と機 能的に結合するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ４１染物を意味する。このようなコント ロール配列には転写を行うプロモーター、このような転写をコントロールするオ ペレーター、適当なｍＲＮＡのりボゾーム結合部位をコードする配列および転写 および翻訳の停止をコントロールする配列が含まれる。これらのベクターにはプ ラスミド、ファージ粒子または単に潜在的ゲノム挿入物がある。適当な宿主にト ランスホームされればこのベクターは宿主ゲノムとは独立して複製および機能す るか、またはある場合にはゲノム自体に組込まれる。本明細書ではプラスミドは 現在最も一般的に用いられているベクターであることから１プラスミド″と“ベ クター”はしばしば同義的に使われている。しかし、本発明には等価な機能を示 し、当分野で知られている他の発現ベクターも含まれる。

一般に本発明で使用されている“宿主細胞”は好ましくはＥＰＯ公開Ｎα０１３ ０７５６で公開されている方法により酵素的に活性なエンドプロテアーゼを分泌 し得ないようにした原核性および真核性宿主である。ズブチリシンを発現する好 ましい宿主細胞は酵素的に活性な中性プロテアーゼやアルカリプロテアーゼ（ズ ブチリシン）を欠損するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　Ｂ　Ｇ　２０３６株で ある。

ＢＧ２０３６株の構築はＥＰＯ刊行Ｎ（１０１３０７５６に詳しく報告されてお り、さらにヤン（Ｙａｎｇ）　、Ｍ、　Ｙ、等（１９８４＞　、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１６０．１５−２１に報告されている。ズブチリシン を発現する他の宿主細胞には枯草菌１１６８が含まれる（ＥＰＯ刊行Ｎα０１３ ０７５６）。

宿主細胞は組換えＤＮＡ技術を用いて構築したベクターでトランスホームまたは トランスフェクションされる。これらのトランスホーム宿主細胞はカルボニルヒ ドロラーゼ変異体を］　−）’スルベクターの複製または望ましいカルボニルヒ ドロラーゼ変異体の発現が可能である。ブレまたはプレプロ型のカルボニルヒド ロラーゼ変異体をコードするベクターの場合、発現されたこれらの変異体は宿主 細胞から宿主細胞培地へ分泌される。

２つのＤＮＡ領域間の関係について使用される“機能的に結合する”という語句 は単にそれらが互いに機能的に関連することを意味する。たとえばブレ配列はそ れがシグナル配列の切断を伴った成熟型のタンパク質の分泌に関与するシグナル 配列として機能する場合ペプチドに機能的に結合している。プロモーターは配列 の転写をコントロールする場合コード配列に機能的に結合している。リポソーム 結合部位は翻訳を可能とする位置に存在する場合コード配列に機能的に結合して いる。

天然の前駆体カルボニルヒドロラーゼをコードする遺伝子はＥＰＯ刊行Ｎα０１ ３０７５６およびＯ２５１４４６に報告されている一般的方法で得られる。本明 細書で公開されている実施例から分るように一般的にこれらの方法には目的のヒ ドロラーゼの推定上の配列コード領域を有するラベル化プローブの合成、該ヒド ロラーゼを発現する生物由来のゲノムライブラリーの調製およびプローブのハイ ブリダイゼーションによるライブラリーからの目的遺伝子のスクリーニングが含 まれる。それからハイブリダイズしたポジティブクローンのマツピングおよびシ ーケンシングを行う。

このクローン化したカルボニルヒドロラーゼを宿主細胞のトランスホームに用い てヒドロラーゼを発現させる。このヒドロラーゼ遺伝子は高コピー数のプラスミ ド中に連結する。このプラスミドは複製に必要な要素二問題の遺伝子に機能的に 結合するプロモーター（もしｆｆｌ！されるならばその遺伝子の自分自身の相同 的プロモーターとして供給され得る、すなわち宿主によって転写される）、外来 の、またはヒドロラーゼ遺伝子の内在性ターミネータ−領域によって供給される 転写終止およびポリアゾニレ−ジョン領域（特定の真核性宿主細胞中のヒドロラ ーゼ遺伝子由来の宿主により転写されるｍＲＮＡの安定性に必要なもの）および 望ましくは抗生物質含有培地中での増殖によりプラスミド感染宿主細胞の連続的 培養を可能にする抗生物質耐性遺伝子などの選択遺伝子を含むという意味で宿主 中で複製する。また高コピー数のプラスミドは宿主の複製オリジンが含まれ、こ れにより染色体に制限されることなしに多数のプラスミドが細胞質中に生成し得 る。しかし、多数のヒドロラーゼ遺伝子が宿主ゲノム中に組込まれることも本発 明の範囲内に含まれる。このことは特に相同組換えを起こす原核性および真核性 生物で容易に起こる。

別に、天然または変異した前駆体カルボニルヒドロラーゼをコードする合成遺伝 子を生成し得る。このような方法においては前駆体ヒドロラーゼのＤＮＡおよび アミノ酸配列が決定される。その後多重重複合成−重鎮ＤＮＡフラグメイトを合 成し、ハイブリダイゼーションによりライゲーションで前駆体ヒドロラーゼをコ ードする合成りＮＡを構築する。この方法はカルボニルヒドロラーゼ変異体を作 るための修正を容易にするためコードされているアミノ酸配列を変化させること なく制限部位をそのＤＮＡに配置しなければならない天然の遺伝子のクローニン グを越えていくつかの利点は提供する。さらに、この合成法は合成遺伝子のコド ン採用の調整に関して使用する特定の発現宿主のコドンの偏りを満足させ得る。

合成遺伝子構築の例を実施例に示す。

一度天然または合成前駆体カルボニルヒドロラーゼがクローン化されれば多くの 修正を加えて天然の前駆体カルボニルヒドロラーゼの合成の範囲を越えたその遺 伝子の使用を促進させることができる。このような修正にはＥＰＯ刊行Ｎａ　１ ０１３０７５６および０２５１４４６に公開されている組換えカルボニルヒドロ ラーゼの生産および本明細書に述べられているカルボニルヒドロラーゼ変Ａ体の 生産を含まれる。

部位指定突然変異誘発を含む他の方法も使用できるが以下に示すカセット突然変 異誘発法は本発明のカルボニルヒドロラーゼ変異体の構築および同定に使用し得 る。第１にヒドロラーゼをコードする天然の遺伝子を入手し、全部またはその一 部をシーケンシングする。それからこの配列をコードされる酵素中の１つ以上の アミノ酸に変異（欠失、挿入または置換）を起こすのに望ましい点についてスキ ャンする。この点に隣接する配列を発現された時、種々の変異体をコードする遺 伝子の短かいセグメントを置換するため制限部位の有無を評価する。これらの制 限部位とその遺伝子セグメントの置換が可能なようにヒドロラーゼ遺伝子内に唯 一存在することが望ましい。しかし、もし制限消化により生成する遺伝子セグメ ントが適当な配列に再構成されるならばヒドロラーゼ遺伝子中に豊富に存在しな い簡便な制限部位ならどれでも使用し得る。もし制限部位が選択した点から簡便 な距離（１０〜１５ヌクレオチド）内に存在しないならばこれらの部位は最終構 築物中読み枠およびコードされるアミノ酸のいずれも変化させない様にその遺伝 子中のヌクレオチドを置換することにより作成する。望ましい配列を満足させる ようにその配列を変化させる遺伝子の突然変異は従来法に従ったＭ１３ブロイマ ー伸長により達成される。

適当な隣接領域を設けたりまた２つの簡便な制限部位配列を作るために必要な変 化を評価する仕事は遺伝子コードの縮退、その遺伝子の制限地図および多種類の 制限酵素によりルーチンに行なわれている。もし簡便な隣接制限部位が入手でき れば上記方法はその部位を含まない隣接領域と合せてのみ用いる必要があること に注意せよ。

一度天然ＤＮＡまたは合成りＮＡがクローン化されれば変異させる部位に隣接す る制限部位を同種の制限酵素で消化し、多くの末端相補的オリゴヌクレオチドカ セットをその遺伝子中にライゲーションできる。全てのオリゴヌクレオチドは同 じ制限部位を持つよう合成でき、かつ合成リンカ−は制限部位を作る必要がない ので突然変異誘発はこの方法により著しく簡素化される。本明細書で用いられる ようにたんばく質分解活性とは活性酵素ミリグラム当りのペプチド結合の加水分 解速度上定義される。たんばく質分解活性を測定する多くの方法が知られている （Ｋ、　Ｍ、カリス（Ｋａ　Ｉ　１ｓｚ）、′微生物ブロティナーゼ”　、Ａｄ ｖａｎｃｅｓ　ｉｎＢ　Ｉｏｃｈｅｍ　１ｃａｏεｎｇ１ｎｅｅｒＩｎｇ　／Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ａ、フィーフタ−（Ｆｉｅｃｈｔｅｒ）編、１９ ８８）。

本発明の１つの特徴としてその目的は前駆体カルボニルヒドロラーゼと比べてよ り大きい（数値的に大きい）たんばく買分解活性を有するカルボニルヒドロラー ゼ変異体を得、これを使用して標的基質により効率よく作用させることである。

バチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖ ｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシン中の＋１２３に等価な残基部位にあるズブチリ シン型カルボニルヒドロラーゼにそのような結果をもたらすのに有効な特定のア ミノ酸が実施例に示されている。

ある場合にはより低いたんばく質活性が望ましいこともある。

このような場合、たんばく買活性の減少はバチルス　アミロリクエファシェンス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎ、ｓ）ズブチリシン中 ＋１２３に等価な残基部位を実施例で同定されたアミノ酸に置換することにより 達成される。

バチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏ−１ｉｑ ｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシン＋１２３に等価な部位の残基がセリンではな い前駆体ズブチリシンの場合、その前駆体の部位＋１２３にセリンを用いたとき 最高のたんばく質分解活性が得られる。さらに、バチルス　アミロリクエファシ ェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏ−１ｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリ シン中の＋１２３に等価な部位にセリンを含む天然のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ）ズブチリシンが存在することは知られていない。この部位のセリンがたんば く質分解活性を増加するという発見に基づき、この部位にセリンを含む天然の変 異体を同定かつクローン化するために天然のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ズブ チリシンをスクリーニングし得る。このような天然のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ）ズブチリシン変異体も本発明の範囲内にある。

カルボニルヒドロラーゼがバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）以外のものに由来し、 かつセリンがその前駆体酵素の＋１２３よ存在する場合、その置換はたんばく質 分解活性を減少させるものであり得る。このことはカルボニルヒドロラーゼの合 成活性（ペプチド合成に関して）が望まれる場合に有用である。このような合成 の産物を破壊し得るたんばく質分解活性が減少することが望まれる。

本発明のもう１つの特徴として、バチルス　アミロリクエファシェンス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシン中の＋２７４ と等価な残基は洗剤組成物中この酵素の全体的性能を調節する上で重要であるこ とが分った。実施例に示したように、等価部位＋２７４におけるバチルス　レン グス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｅｎｔｕｓ）ズブチリシンのスレオニンは好ましい 態様中アラニンに変異して性能が増加した変異酵素を提供し得る。また実施例で 公開しているように、スレオニン以外のアミノ酸、たとえばロイシン、セリン、 バリン　およびアラニンによるこの残基の置換はこの変異体の安定性を減少させ る。このような安定性の減少はこの変異体の自己触媒的分解の結果であると考え られている。このようにバチルス（Ｂａｃ　ｉ　Ｉ　Ｉｕｓ）ズブチリシンの＋ ２７４と等価な残基の修正は洗剤組成物中その酵素の全体的性能を増加し、かつ その酵素の全体的安定性を調節し得る。本発明のこの特徴において、その目的は 洗剤組成物中で用いたとき前駆体カルボニルヒドロラーゼに比べて性能の高いカ ルボニルヒドロラーゼ変異体を探すことにある。本明細書で用いられているよう に、洗剤中の性能の増加とは草や血液など特定の酵素感受性のじみのクリーニン グ能力の増加と定義される。このクリーニング能は標準的洗浄サイクル後の目視 観察で決定する。

本発明の好ましい態様はバチルス　レングス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｅｎｔｕｓ ）ズブチリシンにおいて部位２７のリジンがアルギンと、部位１０４のバリンが チロシンと、部位１２３のアスパラギンがセリンと、および部位２７４のスレオ ニンがアラニンと置換したものを実施例に示す。この酵素の安定性は前駆体バチ ルス　レングス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｅｎｔｕｓ）ズブチリシンよりもいくぶ ん低下するが、洗剤組成物中でのこの酵素の性能は実質的に増加し、未修正のバ チルスレングス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｅｎｔｕｓ）ズブチリシンと比べたとき このバチルスレングス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｅｎｔｕｓ）ズブチリシン変異体 は約半分量で同様の性能を示す。

これやこれ以外のズブチリシン変異体を用いて得られた結果に基づきバチルス　 アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏ−１ｉｑｖｅｆａｃ ｉｅｎｓ）ズブチリシン中の部位＋１２３および＋２７４と等価なカルボニルヒ ドロラーゼ中の残基はこれらの酵素のたんばく質分解活性、性能および、または 安定性に重要であることは明白である。

本発明の多くのカルボニルヒドロラーゼ変異体、特にズブチリシンは種々の洗剤 組成物を調合するのに有効である。本発明のカルボニルヒドロラーゼ変異体を含 む組成物に適した洗剤は多く知られている。それらには非イオン性、アニオン性 、カチオン性、または両性イオン性の洗剤が含まれる（バ’Ｊ　−（Ｂａｒｒｙ ）、Ｊ、アンダーツ７　（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）　、Ｕ、　Ｓ、　４，４０２．１ ２８およびシリ　フローラ（Ｊｉｒｉ　Ｆｌｏｒａ）等、Ｕ、　Ｓ、　４，２６ １．８６８参照）。この分野ではクリーニング組成物として用い得る種々の成型 物が知られている。

本発明のズブチリシンは約０．０１乃至約５重量パーセント、好ましくは０．１ 乃至０．０５重量パーセントのレベルで、６．５乃至１２．０のｐＨ値を有する 粉末および液体の洗剤に成型し得る。またこれらのクリーニング組成物には成型 剤や安定剤同様他の酵素も含み得る。

従来のクリーニング組成物への本発明のズブチリシンの添加はいかなる特定の使 用制限を産まない。他言すれば、その洗剤に適したいかなる温度およびｐＨ値も Ｉ）Ｆｌ値が上記範囲内に含まれ、かつ温度が本発明のズブチリシン変性温度以 下であるかぎり本発明の組成物に適している。さらに本発明のズブチリシンはそ れ自体または成型剤および安定化剤と組合せて洗剤を含まないクリーニング組成 物に使用し得る。

以下に実施例を示すが、これらは請求の範囲を制限するものではない。

（実施例１） （枯草菌におけるバチルスレングス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｅｎｔｕｓ）ズブチ リシン遺伝子発現のための構築物） プラスミドｐＳＡＲ，（第５図）は枯草菌（Ｂ、　５ｕｂｒｉｌｉｓ）およびＢ 、アミロリクエファシェンス（ａｍｙｌｏｌｉｆａｃｉｅｎｓ）のズブチリシン 遺伝子の７番目／８番目のシグナル配列コドンに共通の５ａｎ３Ａ制限部位を介 して翻訳融合物を有している。第５図に示されているように、ＥｃｏＲＩ　−Ｂ ａｍＨＩ　２．　Ｏｋｂ７ラグメント上のコノ遺伝子をＭ１３ｍｐ１９にサブク ローンし、部位指定突然変異誘発に使用する一本鎖テンブレー）ＤＮＡを単離す るための　ｐＳＡＲ−Ｑ２７５Ｒを作製した。突然変異誘発は基本的にシラー（ Ｚｏ　ｌ　１ａｒ）、屹等の方法（１９８３）　、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｎｚｙｍ ｏｌ、　１００．４６８−５００、（１））を用い、かつ以下に示す配列：２７ ５Ｒ （式中アステリスクは野生型遺伝子の配列からの変化を示し、また下線はＱ２７ ５Ｒ変化をコードする特定の変異体遺伝子をスクリーニングするのに使用するた め導入したＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を表わしている） で表わされる合成オリゴヌクレオチドを使用して行った。これらの変化は（１） バチルスレングス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｅｎｔｕｓ）ズブチリシンに存在する アミノ酸にこの部位のアミノ酸を変換するもの、およびバチルス　レングス（Ｂ ａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｅｎｔｕｓ）　（ＡＴＣＣ２１５３６）由来のｐＧＧ３６に 同様に導入されたＰｓｔ部位を介してバチルスレングス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉ ｅｎｔｕｓ）の成熟コード領域にｐＳＡＲ中のターミネータ−を連結させるもの （２）である。

プラスミドｐＧＧ３６（第５図）にはシャトルベクターｐＢＳ４２に標準的方法 でクローン化される完全なズブチリシン遺伝子をコードするバチルス　レングス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｅｎｔｕｓ）　（ＡＴＣＣ２１５３６）由来の２．１　 ｋｂゲノムＤＮＡフラグメントが含まれる。

バンド（Ｂａｎｄ）　、２　、等（１９８４）　、ＤＮＡ、３．１７−２１゜こ のズブチリシンのアミノ酸配列はＰＣＴ刊行Ｎｏ、　８９１０６２７９のズブチ リシン３０９に関して公開されているものと同じである。

この遺伝子をｐＳＡＲに導入した部位に対応するこの遺伝子中の同じ位置にＰｓ ｔ１部位を導入するため１）、および部位２７４のスレオニンをアラニンに置換 してｐＧＧ３６−Ｔ２７４Ａを構築するため２）、以下の配列： ５’　−Ｃ−ＡＡＴ−ＧＣＡ−ＧＡＡ−Ｇ（”Ｔ−ＧＣＡ−ＧＣＴ−（”ＧＣ’ −ＴＡＡ−ＴＣＡ−Ａ−３’２７４Ａ で表わされるオリゴヌクレオチドを用いた部位指定突然変異誘発のため上述の方 法でＭ１３にサブクローン化した。変異体ｐ　５ＡＲ−Ｑ２７５ＲおよびｐＧＧ ３６−Ｔ２７４Ａ遺伝子を各々Ｐｓ口／ＢａｍＨＩ消化、フラグメント単離およ びライゲーション（４）ｐＢＳ４２にサブクローンし直して第５図に示したプラ スミドＧＧ−Ａ　２７４　Ｂ、　ａｍｙ、ｔｅｒｍ、を作製した（全テ標準法ニ ヨる）。

合成り　Ｎ　Ａ　Ｕンカーは以下に示す配列：５’　−Ｇ−ＡＴＣ−ＧＴＣ−Ｇ ＣＧ−ＴＣＧ−ＡＣＣ−ＧＣＡ−ＣＴＡ−ＣＴＣ−ＡＴＴ−ＴＣＴ−ＧＴＴ−Ｇ ＣＴ−ＴＴＴ−ＡＧＴ−ＴＣＡ−Ｔ−３’および、 ５’　−ＣＧＡ−ＴＧＡ−ＡＣＴ−ＡＡＡ−ＡＧＣ−ＡＡＣ−ＡＧＡ−ＡＡＴ− ＧＡＧ−ＴＡＧ−ＴＧＣ−ＧＧＴ−ＣＧＡ−ＣＧＣ−ＧＡＣ−３’の相補的−木 調オリゴヌクレオチドをアニールし第６図に示した二本ｔＪＩ　Ｄ　Ｎ　Ａフラ グメント非２とすることにより作製した。この二本鎖リンカ−の切断された左お よび右側末端は各々フラグメント＃１　（ｐＳＡＲ由来）の５ａｕ３Ａ末端およ びフラグメント＃３（ｐ　ＧＧ−Ａ　２７４　Ｂ、　ａｍｙ　、　ｔｅｒｍ由来 ）のＣ１ａＩ末端に相補的である。これら３つのフラグメントを標準法によるプ ラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化、フラグメント単Ｍ１およびライゲーシ ョン後ｐＳＡＲ−Ｑ２７５Ｒ由来のフラグメント４と合せてプラスミドｐＧＣ， −ＫＶＮＡを生成した。名称ＧＧ−ＫＶＮＡは、このズブチリシンが部位２７に リジン（Ｋ）、部位１０４にバリン（Ｖ）、部位１２３にアスパラギン（Ｎ）お よび部位２７４のスレオニンのアラニン（Ａ）による置換を含むｐＧＧ−３６に よりコードされるズブチリシンを含むことを示している。

（実施例２） （ｐＧＧ−ＫＶＮＡの修正） 第６図に示されているように、配列： に２７Ｒ （ｂ）　５’　−Ａ−ＧＴＡ−ＴＴＡ−ＧＧＧ−ＧＣＴ−ＡＧＣ−ＧＧＴ−ＴＣ Ａ−ＧＧＴ−ＴＣＧ−ＴＡＣ−ＡＧＣ−１０４ｙ ＴＣＧ−ＡＴＴ−３’ （ｃ）　５’　−ＧＧＧ−ＡＡＣ−ＡＡＴ−ＧＧＡ−ＡＴＧ−ＣＡＣ−ＧＴＴ− ＧＣＴ−ＡＧＣ−ＴＴＧ−ＡＧＴ−ＴＴＡ、−３’１２３Ｓ を有するオリゴヌクレオチドを用いた３回連続の部位指定突然変異誘発を行うた めＣＧ−ＫＶＮＡ遺伝子（２，１ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−Ｂａｍ４１１フラグメント ）をＭ１３にサブクローニングした。アステリスクは野生型遺伝子からの変化を 示している。下線は各々連結されたＲ２７、Ｙ２Ｏ２および５１２３変異の存在 に関するスクリーニングに用いるため導入されたＸｂａ部位（ａ＞およびＮｈｅ １部位（ｂとＣ）を表わしている。さらに（Ｃ）の場合、上線は破壊された５ｐ ｈＩ部を表わしている。最後に枯草菌宿主で発現させるため２．１ｋｂ　ＧＧ− ＲＹＳＡ遺伝子をｐＢｓ４２にサブクローニングした。

生成したプラスミドをｐＧＧ−ＲＹＳＡと命名した。この名称はｐＧＧ−ＫＶＮ Ａプラスミド４個の残基が変化していることを示している。部位２７のリジン（ Ｋ）がアルギニン（Ｒ）へ、部位１ｆ）４のバリン（Ｖ）がチロシン（Ｙ）へ、 部位１０３のアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）に。残基２７４の先に置換して いるアラニンはこの操作では変化しない。部位２７のリジンはズブチリシン３０ ９のアミノ酸シーケンシングに基づくとアルギニンに置換していた。ＰＣＴ刊行 Ｎ（Ｌ　Ｎｏ　８９１０６２７９に示されているように部位２７はリジンである 。しかし、このズブチリシンたんばく質を独立にシーケンシングすると最初のデ ータはアルギニンが部位２７の残基であることを示した。残基１０４のバリンの チロシンによる置換の場合、この置換はバチルス　アミロリクエファシェンス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシン（しば しばＢＰＮ’と呼ばれる）について先に得られた結果と比べてｐＨ活性プロフィ ールを低下させかつ酵素の性能を増加した。部位１２３のアスパラギンのセリン による置換は後に得られる結果に基づいている。その結果では部位１２３のセリ ンの置換は関連変異体においてその酵素のタンパク質分解活性を最高のものにす ることが測定された。

（実施例３） （合成バチルス　レンタスズブチリシン遺伝子の構築）バチルス　レングス（Ｂ ａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｅｎｌｔ）ズブチリシンのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ は合成りＮＡ配列をコードする遺伝子を構築することによって調製した。

プラスミドｐＧ０３６由来の２．１ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ｍゲノムフラグメントをシ ーケンシングした。成熟型遺伝子産物（ＧＧ３６ズブチリシン）のアミノ酸配列 を誘導して以下の性質を有する合成熟成コード配列を設計した。（１）一般に、 その遺伝子中部合の良い位置に制限酵素部位を生ずる場合以外、７種の枯草菌遺 伝子（マルヤマ（Ｍａｒｕｙａｍａ）　、Ｔ、、等、（１９８６）、Ｎｕｃｌ、 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１４　、ｐＰ　ｒ１５１−ｒ１９７の第２表使用コドン 表から）中の各アミノ酸に対してもっとも高頻度に使用されているコドンを用い た。（２）〜０，８成熟コード領域の約４０〜６ｏｐ、ｂ、毎に２または３個の 特別に選択したしコドンを組合せることにより非常に均等に間隔をもったユニー クな制限部位を導入した。これらの部位はＣＢ’）後に行なうカセット突然変異 誘発および（ｂ）　１つ以上の変異を含めた構築を容易にするように選択した。

（３）ユニークなＰｓｔＩ制限部位が同じ３つのコドンを同様に修正したバチル スアミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃ ｉｅｎｓ）のターミネータ−配列までの連結を可能にし、かつ部位２７４のスレ オニンをアラニンで置換したコドン２７２−２７４に含まれるように設計した。

（４）ユニークなＮｒｕＩＲ位が合成二本鎖ＤＮＡリンカ−を介してＧＣ３６プ レプロコード配列への連結が可能なように成熟コドン残基９−１０をカバーする よう導入した。この投設に基づきオリゴヌクレオチド（“オリゴ″）を合成した 。この結果所定の〜６０ｂ、ρ、コード領域にコードおよび非コードオリゴをア ニーリングすることにより生成した二本ｌＮＤＮＡフラグメントはその遺伝子の 次の二本鎖フラグメントの末端に相補的な末端−重鎖領域を有することになる（ ！７図参照）。

先に概説したように図中では全部で３６個のオリゴ（１８個の二本鎖を含む）を 用い、〜０．８ｋｂ二本鎮合成成熟コード領域を生成する（第８図フラグメント ３）。

最後にもう１つのベアまたは合成オリゴを合成する、これらがアニールすると（ 第８図フラグメント２を与える）その５′末端にＮｃｏＩＮ位（成熟コドン５− ６のＧＧ３６Ｎｃｏ１部位に相補的）および３′末端にＮｒｕＩ部位（フラグメ ント３の５′末端に相補的）が生ずる。

枯草菌プロモーターおよびシグナル配列の残りの部分をコードするＧＧ３６配列 まで連結するシグナル配列の最初の７個のアミノ酸、完全なプロ配列および最初 の６個の成熟アミノ酸（ＧＧ−ＫＶＮＡ由来のフラグメント１）、成熟残基７〜 ２７４をコードする合成遺伝子（フラグメント２＋３）＃よびバチルス　アミロ リクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｖｅｆａｃｉｅｎｓ ）のターミネータ−領域（最後の成熟遺伝子コドン２７９）（フラグメント４） を含む完全な発現ユニットを与える最終的構築は第６図に示したフォーウェイラ イゲーションで行った。

最後に、この全長ハイブリッド遺伝子の成熟コード領域に別に３つの変異を導入 した。最初は部位２７のリジンをアルギニンで置換した。罵２は部位１０４のバ リンをチロシンで置換した。第３は部位１２３のアスパラギンをセリンで置換し た。生成したプラスミドはｐＢＣ３−ＲＹＳＡと命名した。以下の実施例は合成 遺伝子中の部位１２３を修正するのに用いた方法を示している。

同様の方法を用いてこの合成遺伝子中の部位２７および１０４も修正した。

（実施例４） （部位１２３変異体の構築） 部位指定突然変異誘発により（Ｍ１３におけるプライマー伸長突然変異誘発）３ つの発現型的サイレント変異を起こすこ七で実施例３の合成遺伝子のコドン１１ １／１１２にＸｈｏＩ部位を導入した。生成したプラスミドｐＸ１２３　（第９ 図）をＸｈｏＩおよびＡｖａＩで消化し、より大きいベクター含有フラグメント をアガロースゲルからの電気溶出で単離した。相補的合成オリゴヌクレオチドを アニールし、ｐＸ１２３ラージフラグメントにライゲーションしてから大腸菌Ｍ Ｍ２９４にトランスホームした。これらのカセットは部位１２３に各々天然の２ ０種のアミノ酸をコードしており、かつさらにｐＸ１２３中ＸｈｏｌおよびＡｖ ａＩＢ位間に存在する５ｐｈｒ部位を破壊するサイレント変異を含んでいた。大 腸菌のトランスホーマントから得たプラスミドはユニークな５ｐｈＩ部位の欠失 に関してスクリーニングした。制限分析のポジティブ（すなわち５ｐｈｔネガテ イブ）プラスミドをシーケンシングしてシャトルベクターにサブクローン化され た目的の部位１２３変異の存在を確認し、発現のため枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ 　５ｕｎｂｔｉｌｉｓ）　ＢＧ２０３６にトランスホームした。

（実施例５） （種々の＋１２３変異体の活性） 上述の部位＋１２３修正変異体によってコードされる各ズブチリシン変異体のた んばく質分解活性は遠心した培養培地を０．ＩＭＦリス（ｐＨ８，６０）中１％ ｗ　／　ｖカゼイン溶液０．０４ｒｎｉと混合することにより検定した。３７℃ 、２０分間のインキュベーション後、１０％のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）による 沈澱で反応を停めた。１０％ＴＣＡによる沈澱後上清の波長２８０ｎｍでの吸光 度から活性を測定した。

第１表 Ａｓｎ−１２３変異体に対して標準化したコドン１２３変異体の相対的たんばく 質分解活性 酵素ＢＣ３−ＲＹＳＡをコードする合成遺伝子のＤＮＡ配列を最終的に確認する 過程において、部位７８にセリン（バチルスレングス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｅ ｎｔｕｓ）ズブチリシンにおけるこの位置のアミノ酸）の代りにプロリンがある ことが分った。部位１２３変異の最初の性質はこの酵素、ＢＣ３−ＲＰＹＡ　（ 部位７８にプロリン）でテストした。これらの結果を第１表に示す。その後この 遺伝子のこの領域に相当する合成りＮＡ二本鎖を置き換えることにより部位７８ のアミノ酸をセリンに戻し、第１０図に示したＤＮＡおよびアミノ酸配列を作っ た。これから分るように部位１２３におけるＡｓｎのＳｅｔによる置換はたんば く質分解活性を実質的に増加させた。ここで議論している種々のズブチリシンの 関係は、部位２７．７８．１０４．１２３および２７４について第２表にまとめ た。

第■表 部位 （実施例６） （部位２７４変異体の安定性） ＢＣ３−ＲＰＹにおける（バチルス　レングス（ＢａｃｉｌｌｕｓＩｅｎｔｕｓ ）ズブチリシン）中部位２７はアルギニン、部位７８はプロリンおよび部位１０ ４はチロシン）部位２７４変異体の安定性を第１表に示した。データは５０ｍＭ 　ＥＤＴＡ中３７℃、６０分間のインキュベーション後に残存する活性パーセン トで示した。

第１表 明らかにこの部位の変異は酵素の安定性に影響する。この部位でのアラニン変異 はセリンまたはスレオニンはど安定ではないが、この酵素は先に述べた使用条件 下ではバチルス　レングス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｅｎｔｕｓ）ズブチリシンに 比べ秀れた性能を提供する。

別の応用については部位２７４に他のアミノ酸を使用し得る。

（実施例７） （洗剤組成物） 以下の組成のリン酸系洗剤スプレードライ顆粒を調製した。

成　分　重量ノぐ−セント Ｃ１２直＄１１アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム　８．４５タローアルコ ール硫酸ナトリウム　４．２３Ｃ１４〜１５直鎮アルキル硫酸ナトリウム　４． ２３トルエンスルホン酸ナトリウム　１．００トリポリリン酸ナトリウム　５． ６０ ピロリン酸ナトリウム　２２．４０ 硅酸塩（１，６ｒ）　５．５０ 硫酸ナトリウム　２９．８３ ポリアクリル酸ナトリウム（４５００ＭＷ）　１．１７光沢剤　０．２２ 炭酸ナトリウム　１２．３０ ホリエチレンクリコール（Ｍ１ｖ８０００）０．４７Ｃ１２−１３アルコールポ リエトキシレート（６，５）　”　０．５０雑　＋　水　で１００％に プロテアーゼ−０，０３４ ＊　アルコールおよびモノエトキシレートアルコールは除く＊＊活性酵素■／ｇ （２，０■活性酵素／ｇ−ストック）水中０．１重量パーセントのこの組成物溶 液のｐＨは１０．０であった。本発明のズブチリシン変異体を含む組成物（第７ 図）は、硬度６グレインパーガロン（ｇｐｇ）　（３：　Ｉ　Ｃａ／Ｍｇ）　、 ９５°Ｆ（３５℃）での洗濯において、０．０６８■活性酵素／ｇ、生産物の濃 度でバチルス　レングス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　１ｅｎｔｕｓ）ズブチリシンと比 較したとき、酵素感受性シミに秀れたクリーニング効果を示した。

この出願を通じ一般的１文字および３文字コードで種々のアミノ酸を参照してい る。これらのコードは“たんばく質：構造および分子プロテアーゼ、トーツス（ Ｔｈｏ　ｍａｓ）Ｅ、クレイトン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）編、Ｗ、　Ｎ、　７リ ーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）、Ｎ、　Ｙｏ、Ｎ、　Ｙ、（１９８３）、ｐ、３、に 示されてものと同一である。

以上に本発明の好ましいものについて説明してきたが、本発明は全体的に理解す れば請求の範囲で定義されている本発明の範囲を逸脱することなしに種々の変化 や等価な修正を行うことが可能であることは当業者にとって明白であろう。

本明細書における全ての刊行物は参考として引用している。

５１−二　２已　す１　；旨　ｆ３　ご口ＩｊＬｌ　＞Ｉｊ　（Ｌｊ　Ｊ＜　工 ＜（Ｌ：＋　ロロ浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、−２ 浄書（内容に変更なし） バチルスプロテアーゼのホモロジ− ）書１内容に変更なし） ■＞　くロ　Ｉ−α　ｉ＞　Ｌｊ＞　Ｌ）ψ　０二ロー　口Ｌ　（Ｌｌｌ　ｌｊ 　−Ｌ：ｌ　−（−（いａｔ：Ｊ　ｕ乙　口く　ロロ　ロロ　Ｕ工　くくωＯ） 　Ｌ）１１１　（１：　（ＪＱＩ　Ｌ）Ｌ　１−４Ｊ　１−−ＬｆｆｌＬ　（− （−１−７Ｌ）ｏＪＬｊａｌ　５ｅｔＯく　ω工　ＬＪＬ＋　（−（ｔ／＋　（ Σ　口〉Ｌ）ｃｌ（Ｌ　とＬ　ヒｄ　ト飄−ｄ ＜ｌｌ’ｌ　ＩＩ　ＬＩＣＬＩＩＶ　ＬＪ　−Ｌ：ｌ　−ｕ　−＜（ｌ＜１−　 ＋η　口＜Ｉｊロ　ロく口Ｌｌ’ｌ　（Ｌ　Ｌ）Ｌ　ＬＪｅ　ｔＪ＞　Ｌｅｅ　 （ｅ（−ｕＪ：　ωω　くい　ロー　く切　く−Ｕ＝　（＋−１−い　くく　じ 口　＜＜　Ｕ口←ｄ　ＣＬ　ＬＩＯ口ζ　くコ　Ｌｌｅ　＜コ〇−１＋：＋ω　 ＣＬ　（Ｌｌｌ　←ω　くψ　くｄ口く　くい　Ｌ）匡　（く　←−くく　じ口 １−ＣＩＬｌａｌｌ（コ　トロ　ω飄　くコω７＋−−１１−〇　−ｄ　ロー　 Ｉ−０口（（ｍｌｌ−Ｊ　口〉　ロビ　ト」 ｔ−ｏ　Ｌ）＞　＜コ　トロ　（ＬＪ１　Ｓｄ　（ＬωＳ＋　ロー　くｄ　ロー 　くメ　ω−Ｕ；Ｌ）ＣＬ　Ｌ：１００口　口＜＜」　口く　くヒ＋ｄ　（Ｌ　 Ｌ）＞　ｌ−ｄ　Ｉ−一　口αトｄωｄ　ω二　Ｌ）　−ロー　１−ｄ　とＬ　 Ｌ）　−口（（Ｓ　Ｌ）口　Ｌ：ｌ（ｌｊ＞　１−ト　ロ（＜Ｃ，ｌ−α　ωロ 　Ｏｄ　１−６　ロコ　ω（＜−＜−■（トロ　ω−（−Ｌ）ａｌ ωｌｊ　１．：ｌ（ｕユ　く−口く　ロロ　（−ωΣく０ω＞　ｕｕ’＋　口Ｌ 　ω中　口≧Ｉｊ７ＬｊＬ　ロー　（−（ＪΦ　ヒー　ローＬ）Ｌ）　（＜　口 Ｏωエ　−い　く−ロロロＣＬＩ−−Ｌ）Σ　く（ヒ０　←（ＵＪＬ）Ｌ　１− ｅｌ　Ｉｊ　７Ｌ）Ｊ：　Ｌ）Ｌ　Ｌｌω　ヒΦ１−←　口〉Ｌ：１０　くヒ　 Ｕ乙　ヒリ　ω」くｏ　ωメく口Ｌ）飄ヒｄ　ＣＬ　Ｌ）Ｌω（ロー　Ｕ（ロー 　〇−口υ　口Φ ωＬ　１ｊｌｊ　＜（口Ｏりく　くη　くψロー　０（ヒω　ロｕｌ＋−Ｌ）Ｌ ＜コトｄ　口ａｔ　ヒー　く−ヒｄ　く＼ヒω口）　くい　く−ω工　口〉　ヒ Ｉ−ヒトく（ω＞　）−ｅ　Ｕ＞　ωスＬ）Ｌ　Ｌ）ＬＬ＋ｌｌ＋　ＬＤ　−＜ ｖ＋　ｔｐ　−ｔｐ−口ω　ＬＩＱｌｌ−１／ｌ　ＬｊＬ）　（（ロロ　口Ｕ　 くり　（ｌ＜ｅ　（Ｌ　ｌ−コ　ＱＣくフ　ＱΣヒトく−　ω二　トΦ　く鴇　 ヒω　じ−　ω−ω口　くヒ　ＬＩＪ　＜（、１−一　口ＬＩｌｊ＜口ｄ　くフ 　ヒＣＬＬ）Σ　トロ　■（ヒーω−←ω　＜ｌＪ’ｌｌ　ロー　ヒｄ　口υ　 −〇Ｕく　ヒ」　じく　じｌｊ　口＞　（Ｌ４　Ｉｊ＞Ｌ）Ｌ　＜Ｌ　口ｄ　＜ Ｌ　＜Ｌ　ヒ（Ｏｄ　０工　υ−ＬＩＪ：　ＬＪル　Ｕ二Ｉ−ψ　くヒ　ロ＜　 ＜＋　Ｓη　（ヒく＞　Ｏｄ　じ−　）−）、１−０　←ＬＯ＋　ロー　ヒｄ　 口＋　ＣＬ　口ω １ｊＬｌＬ）＜　Ｌｌ＞　ｔ、ｓｏ　Ｌ）ＣＬ　（Ｃ／ＩＩ−ｄ　Ｌｌ＞　０Φ 　Ｌ）ｃ　Ｌｅｅ　Ｌｌ論ω−ロー　ヒー　くψ　くψ　ロー とく　トロ　（−’　（（＜＜　０口 ■＞　ヒー　ヒｃＬ　ロフ　くψ　くフロー　Ｌ：Ｊ（ｊ（Ｌｌｌｌ−Φ　くΣ トΦＩｊＬ１１−〉　口く　ヒＪ　＜Ｊ　ＩｊＬ）Ｌ　Ｌａ６　＜コ　Ｌ）Ｌ　 （ｃ　ＬＩＬＬｌａＩ　じ−　ヒ伽　クシ　く−口Φくい　口＜ト」＜η　０口 　くい ０ζ　Ｉ−＋ａ　Ｌ）＞　口ｄ　（ψ　ヒ（ト■くψ　＜ａＪ　ロー　Ｕ−＜＞ Ｕ二　〇しくく　ω工　Ｌ：フロ　口（（Ｊ　（Ｓ　口くＬＪ＞　Ｌ）ｄ　ｌ− ｄ　（ＪＬ　１−−　１−ｄ　Ｉ−ｄ口＋　ロー　■−（ス　ヒｄ　Ｌ）−＋　 ω−Ｌ）Ｌ：ｌ　ヒ＜　ａ＜　ヒト　口〉　口く　口くＬ）Ｌ　（ｅ　ｔＪ＞　 （Ｌ　（］　＜（＜ｄｌｊＱｌ　＜Ｌｌ’ｌ　Ｌ）−ω工＋ｗ　ｕ二　〇−くη 　Ｓ＜　Ｌ）Ｌ）　（ヒ　ω」＜ト　ロ（ＬＪｄ　ωＣＩ　Ｌ）Ｌ　ＣＬ　（ｄ 　ＬＩＣトｄＵ−Ｏ−＜＞　口ω　Ｌ）　−＜ψ　Ｌ）　−口（Ｕ＜　１−ヒ　 （ｌ　口＜＜り　口（←−（Ｌ　＜ｄ　ＣＬ　ｌ−−Ｌ）■　くフ１−ｄ　ｌ− ＞　Ｌ）　−Ｌｌａ＋　１−（５１ｊｕ　１−１１＋口＞　Ｌ）＋’　Ｌｌ（（ ψ　口〉　ω＜ト」Ｌ）＞　ω（くＯ（仁　Ｏｄ　ωω　ω＼Ｌ）−ＬｌｌａＩ 　リＬ　＜　−（−１”−一　ローＬ）Ｌ：ｌ　（（／ｌ　＜＜　ｕロ　ω工　 く−０口（■Ｌ）ａｔ　Ｌ）ｅ　Ｓ−＋−０（ｃ　ω（Ｌ）Ｌ　ｌ−−（Ｖｌｌ −ｄ　Ｌ）Ｌ　＜　−Ｌ）ω（（＜ｔ−’　＜（口〉　ωエ　ωａ　く−１−Ｌ 　Ｉ　Ｌ）（：　ＬＩＣ（Ｌ　ｌ−−Ｌ）＞ωω　Ｌ　くり　（ｉｌｌ　Ｌ）二 　ヒｄ　ロートリ　１（（（（くヒ　ロ）　−口 く（１０ｅｌ−−１ｊｄ　ＱＣＱＬ Ｕ二　１１　＜φ　ｌ−６Ｕ−＜ψ　く飄（＋−１＜＜Ｃ口＞　ａ＜　＜＜　ヒ ト１−ｄｌ＜ζ　■＞Ｌ）ゼ　Ｌ）Ｌ　＜フＬ）−１１（−Ｌ）−ヒｃｕＬ）ａ ｔ　ヒΦ口く　１　ωＬ：Ｉ　ｃＯく工　くり　ヒトＬ）Ｌ　ｌ　１−（ｌ　ｌ −０１ｊＬ　１ｊｃＬ　Ｌ）ＣＬｊｏＪｌ　ｌ　＜Ｉ／１ＬｊＬ　Ｌｌ（ＬＪ　 ＩｊＬ　＜ＩＡ（１／ＩＩＬＩ＜　０龜　卜ｚ＋ヒ　くく平成　年　月　日

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．バチルス アミロリクエファシエンスズプチリシンにおける＋１２３または ＋２７４と等価な前駆体カルボニルヒドロラーゼにけおる部位のアミノ酸残基を 別のアミノ酸残基に置換することにより該前駆体から誘導される天然には存在し ないアミノ酸配列を有するカルボニルヒドロラーゼ変異体。
2. ２．前記前駆体カルボニルヒドロラーゼがズブチリシンである請求の範囲１記載 のカルボニルヒドロラーゼ変異体。
3. ３．前記置換が＋１２３と等価な部位で起こる請求の範囲２記載のズブチリシン 変異体。
4. ４．前記ズブチリシン変異体における前記部位のアミノ酸がセリンである請求の 範囲３記載のズブチリシン変異体。
5. ５．バチルスズブチリシンから誘導される範囲２記載のズブチリシン変異体。
6. ６．バチルス アミロリクエファシエンスズプチリシンにおける＋１２３と等価 な部位のアミノ酸残基がセリンに変化した天然もしくは変異前駆体バチルスズプ チリシンから誘導されるたんばく質分解活性が改良されたバチルスズプチリシン 変異体。
7. ７．バチルス アミロリクエファシエンスズプチリシンにおける＋１２３と等価 な部位にセリンを有するバチルスズプチリシン。
8. ８．バチルス ズプチリシン変異体で、以下に示すアミノ酸配列：【配列があり ます】 を有する変異体。
9. ９．請求の範囲１記載のカルボニルヒドロラーゼ変異体をコードするＤＮＡ。
10. １０．請求の範囲９記載のＤＮＡをコードする発現ベクター。
11. １１．請求の範囲１０記載の発現ベクターでトランスホームした宿主細胞。
12. １２．たんぱく質を分解し得る酵素的クリーニグ組成物で、ａ）界面活性剤、お よび ｂ）バチルス アミロリクエファシエンスズプチリシンにおける＋１２３または ＋２７４と等価な前駆体カルボニルヒドロラーゼにおける部位のアミノ酸を別の アミノ酸に置換することにより、該前駆体から誘導される天然にはないアミノ酸 配列を有するカルボニルヒドロラーゼ変異体。 以上ａ）およびｂ）を含む組成物。
13. １３．前記カルボニルヒドロラーゼ酸素がズブチリシンを含む請求の範囲１２記 載の組成物。
14. １４．前記ズブチリシンが以下のアミノ酸配列：【配列があります】 を有する請求の範囲１３記載の組成物。
15. １５．界面活性剤が洗剤を含む請求の範囲１２記載の組成物。
16. １６．スプレードライ洗剤顆粒を含む請求の範囲１５記載の組成物。