JPH04505664A

JPH04505664A - 抗ストレプトキナーゼ抗体の検出方法

Info

Publication number: JPH04505664A
Application number: JP2508832A
Authority: JP
Inventors: ポドラセク，スタンリー・ジェイ; マクフェルソン，リチャード・エイ
Original assignee: ジョージタウン・ユニバーシティー
Priority date: 1989-06-02
Filing date: 1990-05-30
Publication date: 1992-10-01
Anticipated expiration: 2014-01-13
Also published as: CA2056449A1; EP0474769A1; EP0474769A4; ATE130099T1; US5342755A; EP0474769B1; JP2846463B2; WO1990015153A1; DE69023500D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】関連出願の相互参照この出願は、１９８９年６月２日付で出願された米国特許出順環０７／３６０，８２２号の一部継続出願である。

発明の分野この出願は、抗ストレプト牛ナーゼ抗体、すなわちストレプトキナーゼ、および／またはストレプトキナーゼと別のタンパクとの複合体を認識する抗体の検出方法に同けられている。本発明の方法は、乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌ　Ｄ）のサブユニットＭのような他のタンパクと抗ストレプトキナーゼ抗体とに同時に結合するストレプトキナーゼの能力に基づいている。特に、抗ストレプトキナーゼ抗体およびストレプトキナーゼ結合タンパクを含む試料に外因性のストレプトキナーゼを添加すると、ストレプトキナーゼ結合タンパクまたはそのサブユニットを検出するリポータ−法によって明らかにすることができる３成分複合体が形成される。本発明の方法は、ストレプトキナーゼに対する血清抗体検出用の診断試験として有用である。

Ｒ里Ω考屡急性の心筋梗塞に対する今日の治療法では、症状が現れてから最初の数時間以内に血栓溶解剤を静脈内投与して冠状動脈内の血餅を分解（溶解）することにより、影響を受けた心筋の損傷を回復させている。現在のところ、２種類の主要な血栓溶解剤、つまりストレプトキナーゼおよび組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）を利用することができる。

ストレプトキナーゼまたはＴＰＡのいずれかによってプラスミノーゲンが活性化されると、血餅を結合させる格子の主要成分であるフィブリンを分解するタンパク分解酵素のプラスミンが形成される。

ストレプトキナーゼは連鎖球菌由来の天然に存在する生産物である。ストレプトキナーゼは細菌の生産物であり、かつ抗原であるので、以前に連鎖球菌に感染（例えば、連鎖球菌性咽喉炎に罹患）したことのある多（の個体は、その血液中に抗ストレプトキナーゼ抗体を保持している。ストレプトキナーゼが薬剤として投与された場合、これらの抗体はそれを中和する［ブロッグデン・アール・エフ（Ｂｒｏｇｄｅｎ、　Ｒ，Ｎ、　）ら、ドラッグズ（Ｄｒｕｇｓ）　：　５巻：３５７〜４４５頁（１９７３年）］。１２０人の無作為標本における２Ｕ／ｍｌと４０２０／ｍｌとの間の抗ストレプトキナーゼ価が報告されている［バッハマン・エフ（Ｂａｃｈｍａｎｎ、　Ｆ）％　ジャーナル・オブ・ラボラトリ・アンド・クリニカル・メディスン（Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃ１１ｎ、　Ｍｅｄ、　）、７２巻＝２２８頁（１９６８年）コ。ストレプトキナーゼは、この抗体に結合した場合には、生化学的に不活性であり、ストレプトキナーゼと抗体の複合体は循環系から速やかに排出される［フレッチャー・エイ・ビー（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ。

Ａ、　Ｐ、　）ら、クリニカル・インベスティゲーシ１ン（ＣＩ　ｉｎ、　Ｉ　ｎｖｅｓｔ、　）、３７巻＋１３０６頁（１９５８年）コ。このような抗ストレプトキナーゼ抗体は、心筋梗塞の治療において、ストレプトキナーゼの投与が不適切であるために治療が失敗することの要因となりうる。

満足な臨床効果を得るためには、心筋梗塞が発生してがら速やかに（４時間以内に）血栓溶解治療を開始する必要がある。従って、どの薬剤を使用するのか、またどのくらい使用するのかについて急いで選択しなければならない。ストレプトキナーゼを選択した場合に効果的な治療を行うために、ストレプトキナーゼの投与量は、ストレプトキナーゼに対する内因性の循環抗体を中和するのに必要な用量を超える用量から始めなければならない〔ブロッグデン・アール・エフ（Ｂｒｏｇｄｅｎ、　Ｒ，Ｎ、　）ら、ドラッグズ（Ｄｒｕｇｓ）　＋　５巻：３５７〜４４５頁（１９７３年）］。これらの内因性抗体を中和するのに必要な量を超えない投与量は薬理学的に不活性である。ストレプトキナーゼによる治療に適切な投与量を決定することは重要である。投与量が多すぎると、プラスミンが過剰に形成され、例えば、循環フィブリノーゲンや凝固因子■および■のような、やはりプラスミンが分解する付加的なタンパクの欠乏を招く。従って、ストレプトキナーゼを多く使用しすぎると、出血の危険性がある。中枢神経系で出血が起こると、通常、重篤な神経障害が発生したり、死亡したりする［ブラウンバルト・イー（Ｂｒａｕｎｗａｌｄ、　Ｅ、　）ら、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・カレッジ・オブ・カージオロジ−（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｏ１１．　Ｃａｒｄｉｏｌ、　）、１０巻：９７０頁（１９８７年）；ハーバ−・イー（Ｈａｂｅｒ、　Ｅ、　）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４３巻：５１頁（１９８９年）コ。

このように、抗ストレプトキナーゼ抗体のレベルは個体によって様々であるので、患者中における有意量の抗ストレプトキナーゼ抗体の存在を速やかに決定することは、治療に必要なストレプトキナーゼの用量に関する医学的な決定を導く際に、非常に有用であろう。

抗ストレプトキナーゼ抗体が存在するという知識があれば、適切な初期中和投与量を投与した後で、血栓溶解状態の誘起に必要な遊離ストレプトキナーゼのレベルを維持するのに充分な量で、この薬剤を注入してよい。

また、このような検査は、特に、患者がストレプトキナーゼで治療を受けた後に、心臓の危険性に関する定期検査の一部として有用であろう。治療の８〜９日後、たいていの患者は、抗ストレプトキナーゼ抗体価が速やかに５０倍〜１００倍に上昇し、４〜６力月後に予備治療レベルへ戻るだけである［シニミニツツェラー・アール（Ｓｃｈｍｕｔｚｌｅｒ、　Ｒ，）ら、「血Ｋｌ＃固に関する最新の進歩（Ｐｏｌｌｅｒ　ＲｅｃｅｎｔＡｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）Ｊ中の「血栓溶解による治療（Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ　Ｔｈｅｒａｐｙ月、３２４頁、チャーチル、ロンドン、１９６９年］。従って、当初の治療の数カ月以内にストレプトキナーゼの経過を繰り返す前に、これらの患者中におけるストレプトキナーゼ抗体価を知ることは重要である。

さらに、ちょうどコレステロールが心臓疾患を進展させる危険性に関するスクリーニング試験として使用されるように、正規な基準に対する抗ストレプトキナーゼ抗体の状態について個体を定期的に予備スクリーニングすることが望ましい。

このような予備スクリーニングの結果は、将来の心臓発作を治療する際にストレプトキナーゼに効き目があるのかどうかを知りたいと思う個体にとっては価値があるだろう。

従って、抗ストレプトキナーゼ抗体の迅速かつ経済的な試験法が必要とされている。

細菌性血栓溶解剤のストレプトキナーゼが、ヒト、ブタ、およびニワトリのＬＤイソ酵素のサブユニットＭには結合するが、ＨまたはＣサブユニットには結合しないことが知られている［ポドラセク・ニス・ジェイ（Ｐｏｄｌａｓｅｋ、　Ｓ、　Ｊ、　）ら、クリニカル・ケミストリー（ＣＩｉｎ。

Ｃｈｅｗ、　）、３５巻：６９〜７３頁（１９８９年）］。ＬＤとプラスミノーゲン上のストレプトキナーゼ結合部位との間には、この相互作用を説明するアミノ酸配列の相同性が存在する。ストレプトキナーゼがＬＤサブユニットＭに結合すると、ＬＤ活性を有する血清中にストレプトキナーゼ−Ｌ’Ｄ複合体が形成される［ポドラセク・ニス・ジェイ（Ｐｏｄｌａｓｅｋ、　Ｓ、　Ｊ、　）ら、クリニカル・ケミストリー（Ｃ１ｉｎ、　Ｃｈｅｗ、　）、３５巻：６９〜７３頁（１９８９年）］。しかしながら、従来、個体の血清中における抗ストレプトキナーゼ抗体の測定用基準として、ＬＤに対するストレプトキナーゼの親和性を用いることは知られて被験体中における抗ストレプトキナーゼ抗体の存在を決定する簡単かつ独特な方法が提供される。さらに、この方法は、ストレプトキナーゼと他のタンパクとの複合体と反応する抗体を検出する。

酵素の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ）とプラスミノーゲン（ストレプトキナーゼの本来の標的）との間における類似性を示した従来の発展によって、ストレプトキナーゼとストレプトキナーゼ結合タンパク（例えば、サブユニット量−含有ＬＤ）との間の相互作用に基づ（方法を提供する本発明に至った。本発明の方法は、被験体の血清中における抗ストレプト牛ナーゼ抗体の存在を決定する検査法の基礎として使用しうる。この方法は、ＬＤとプラスミノーゲンとの間における、従来は認識されておらず、しかも思いも寄らない構造上の類似性を利用している点で独特である。この方法は、例えば、免疫学的技術、電気泳動法およびりａマドグラフィー技術のような、本質的にすべての病院検査室で現在利用することができる試薬、手法、および技術を用いている。それは迅速、簡便かつ簡単な方法である。

疑いのある試料中における、ストレプトキナーゼに対する抗体検出用として、ＬＤイソ酵素の電気泳動の使用を伴う診断検査法が開発されている。

図面の簡単な説明図１は、ストレプトキナーゼと様々なＬＤサブユニットとの反応を示すゲル電気泳動パターンである。添加されたストレプトキナーゼの濃度は１５，０ＯＯｒＵ／ｍｌであった。ストレプトキナーゼを血清（パネルＡル−ンｂのマーカー）と混合した場合には、ＬＤ活性の緊密なバンド（複合体）は電気泳動の原点く矢印）に残存した。ストレプトキナーゼは精製ＬＤ５の移動度を変化させたが、ＬＤＩやＬＤＸの移動度は変化させなかった。パネルＡ：レーンａ１正常なＬＤイソ酵素１．２．３．４、および５を含む血清；レーンｂ、血清＋ストレプトキナーゼ；レーンＣ１ストレプトキナーゼのみ；レーンｄ１半精製ＬＤＩ；レーンｅ、ＬＤＩ＋ストレプトキナーゼ：レーンｆ１半精製ＬＤ５；レーンｇ、ＬＤＳ＋ストレプトキナーゼ；レーンｈ、血清のみ。パネルＢ：レーンａ、血清のみ；レーンｂ、半精製ＬＤＸ、レーンＣ１ストレプトキナーゼのみ；レーンｄ、ＬＤＸ＋ストレプトキナーゼ；レーンｅ１血清のみ。

図２は、様々な濃度のストレプトキナーゼと血清中のＬＤイソ酵素との反応を示すゲル電気泳動パターンである。正常な血清は、ストレプトキナーゼと１時間混合し、電気泳動に付し、ＬＤ活性について展開した。各混合物中におけるストレプトキナーゼの濃度は：レーンａ１なし；Ｌ／−ンｂ、１５，０ＯＯＩＵ／ｍｌ；レーンｃ、７゜５００ＩＵ／ｍｌ；レーンｄ、１５０ＩＵ／ｍ！、最高濃度のストレプトキナーゼは原点（矢印）で多量のＬＤ活性を捕捉した。

図３は、ゲル濾過によるＬＤストレプトキナーゼ分子複合体の比較的な寸法での分類を示すゲル電気泳動パターンである。１ｍｌの試料、０．９ｍｌの血清、それに加えて０．１ｍｌのストレプトキナーゼ（最終濃度７，５００ＩＵ／ｍｌ）を、セファデックスＧ−２００カラムにかけ、リン酸緩衝食塩水で溶出した。１ｍｌの画分を採集した。約５ｍｌのボイド容量の後、ストレプトキナーゼ−ＬＤ［合体が画分１３〜１５（レーンａ−Ｃ）に溶出し、次いでＬＤイソ酵素（記入されているように、主として、ＬＤｌ、２および３）が画分１６〜２１（レーンｄ　−ｉ　）中へ順当に移動した。矢印は原点を示す。

図４は、ウサギの血清中における抗ストレプトキナーゼ抗体の検査を示すゲル電気泳動パターンである。ウサギｒＡＪは、第０日目に４５，０ＯＩＵのストレプトキナーゼで、第２８日目に１８０゜０００１Ｕのストレプトキナーゼで免疫化した。ウサギｒＢＪは、第Ｏ８目に４５，０００（Ｕのストレプトキナーゼで免疫化した。

血清は、免疫化の前および第４０日目にウサギｒＡＪおよびｒＢＪから得た。血清試料は、ストレプトキナーゼを添加することなく（予備免疫カラムおよび免疫カラムの両方におけるレーンＡおよびＢ）、あるいは最終濃度１５．０ＯＯＩＵ／ｍｌで１時間インキユベーシュンした後（予備免疫カラムおよび免疫カラムの両方におけるレーンｓＡおよびｓＢ）、ベックマンのバラボン８システムで電気泳動に付した。矢印は原点を示す。

図５は、ヒト血清中における抗ストレプト牛ナーゼ抗体の検査を示すゲル電気泳動パターンである。レーン１、ストレプトキナーゼと混合した試料Ａ；レレー２、試料Ａのみ；レーン１の電気泳動原点における沈殿物の存在は、血清が抗ストレプトキナーゼ抗体を含んでいることを示す。レーン３、ストレプトキナーゼと混合した試料Ｂ；レレー４、試料Ｂのみ；レーン３の電気泳動原点には、沈殿物が存在せず、それゆえ血清は抗ストレプトキナーゼ抗体を含まない。

矢印は原点を示す。

好ましい具体例の説明本発明は、抗ストレプトキナーゼ抗体と、ストレプトキナーゼと、抗体以外のストレプトキナーゼ結合タンパクとの間で複合体を形成する能力によって、試料中のこのような抗ストレプトキナーゼ抗体を検出する方法からなる。この複合体は、ここでは、「３成分複合体」と呼ばれる。

抗ストレプトキナーゼ抗体という用語によって、２種類の抗体を表す：すなわち、ストレプトキナーゼを認識（結合）する抗体、およびストレプトキナーゼと第２の（非抗体）タンパクとを含む複合体を認識する抗体である。

ある具体例では、非抗体ストレプトキナーゼ結合タンパクは、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼのサブユニｙトＭ、プラスミ／−ゲン、プラスミン、Ｌｐ（ａ）のような、ストレプトキナーゼ共通結合配列Ｐｈｅ／Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−任意／なし−Ａ　ｒ　ｇ−Ｖａ　ｉｌｌ　ｅ／Ｖａｌ−Ｇｌｙ−任意／なし−Ｇｌｙ−Ｃｙｓを含むタンパクである。

「複合体」（タンパク間）によって、２つ以上のタンパクが、このような複合体中のタンパクを単一の複合体または実体として抽出し、分析し、測定し得るような親和性を持って、水素結合、イオン吸引力および他の非共有結合手段によって、非共有結合様式で会合していることを表す。個体の血清試料中における「ストレプトキナーゼ結合タンパク−ストレプトキナーゼ−抗ストレプトキナーゼ抗体」複合体の形成は、個体の血清中におけるこのような抗ストレプトキナーゼ抗体の存在に関する迅速で特異的な検査として使用しうる。

好ましい具体例では、少なくとも１つのＭサブユニットを有するＬＤが非抗体結合タンパクとして使用される。ＬＤを含有する試料に外因性ストレプトキナーゼを添加することによってストレプトキナーゼとＬＤとの間に形成される複合体は、ストレプトキナーゼ抗体が試料中に存在すれば、ＬＤ−ストレプトキナーゼ複合体に対しても、それを解離させることなく結合するような親和性を有する。

３成分のストレプトキナーゼ結合タンパク−ストレプトキナーゼ−抗ストレプトキナーゼ抗体複合体の存在は、この複合体の存在を明らかにする如何なる技術によっても検出することができる。例えば、ＬＤをストレプトキナーゼ結合タンパクとして用いた場合、３成分複合体は、血清試料中におけるＬＤイソ酵素の寸法や寸法変化、あるいはストレプトキナーゼおよび血清の存在下で発生するＬＤイソ酵素の分布パターンの変化を明らかにする如何なる技術によっても検出することができる。従って、ストレプトキナーゼ抗体の存在は、患者の血清試料にストレプトキナーゼを添加した後のＬＤイソ酵素パターンの物性、例えば寸法や変化から予想しうる。

酵素の乳酸デヒドロゲナーゼは、個体中に少なくとも５つのイソ酵素型で存在する四量体の酵素である。この酵素の各サブユニットは約３３．５００ダルトンの分子量を宵するが、これらのイソ酵素は、Ｍ型、Ｈ型またはＣ型と呼ばれる３つのサブユニット型の１つの含量を変化させる。血清ＬＤイソ酵素分析は、医学的な診断において頻繁に使用され、臨床検査室では常套手段である。血清からＬＤイソ酵素を電気泳動によって分離すると、それぞれＬＤＩ、ＬＤ２、ＬＤ３、ＬＤ４およびＬＤ５で示される５つのＬＤ活性バンドが分離されるが、ＬＤＩは最も早くアノードへ移動し、ＬＤ５は最も早くカソードへ移動する。ＬＤＩは４つのＨ鎖の四量体であり、ＬＤ５は４つのＭ鎖の四量体である。ＬＤ２、ＬＤ３およびＬＤ４の四量体構造は、それぞれサブユニット型Ｈ，Ｍ、Ｈ，Ｍ、、およびＨＭ、の混合物からなる。Ｃサブユニットは、精子から単離されたＬＤＸと呼ばれるＬＤ中に見い已される。

本発明の方法を行うために、ストレプトキナーゼおよびストレプトキナーゼ結合蛋白間の複合体を生ぜしめる条件を与えることが必要である。このような複合体は、血清にストレプトキナーゼを添加し、少なくとも１５分ないし１時間、室温で該血清をインキュベートせしめると、生じるであろう。抗ストレプトキナーゼ抗体が存在する場合、抗ストレプトキナーゼとストレプトキナーゼ−ストレプトキナーゼ結合蛋白複合体との結合がストレプトキナーゼとストレプトキナーゼ結合蛋白との結合と同時に生じ得る。

一方、ストレプトキナーゼ結合蛋白の前結合複合体（ｐｒｅｂｏｕｎｄｃｏｌＩｌｐｌｅｘ）をそのまま血清に添加することができる。この場合、インキュベーションの時間の長さは、抗ストレプトキナーゼ抗体とストレプトキナーゼ−ストレプトキナーゼ結合蛋白複合体とを結合させるのに充分な長さだけ、例えば１５分ないし１時間必要である。

所望により、ＬＤがストレプトキナーゼ結合蛋白として使用される場合、Ｍサブユニットを含有する外因性ＬＤは、試験されるべき血清中に充分量のＭ含有ＬＤが確実に存在するように血清に付加され得る。

好ましい具体例において、アッセイにおけるストレプトキナーゼの最終濃度は、約１５００ｒＵ／ｉｆ２ないし１５０，０ＯＯＩＵ／ｘＱ。

最も好ましくは１５，０ＯＯＩＵ／ｘ（２である。ストレプトキナーゼを、少量の、好ましくは０．５ｘＱより少ない血清試料に添加し、１５〜６ｏ分間インキコベートし、ＬＤイソ酵素またはその複合体を分離する条件下で（例えば、電気泳動またはカラムクロマトグラフィー法を使用して）分析する。電気泳動を使用する場合、得られた電気泳動パターンを検査するために着色した後、抗ストレプトキナーゼ抗体の有無を肉眼で測定することができる。好ましくは、該着色は、多少のＬＤ活性を含有する蛋白結合だけが示されるような活性着色である。

３成分複合体および／またはＬＤイソチームを分離または検出させるいずれのプロトコルも（ＬＤがレポーターとして、およびストレプトキナーゼ結合蛋白として使用される場合）本発明の方法に有用である。特に、ストレプトキナーゼ−ＬＤを含有する複合体と抗ストレプトキナーゼ抗体−ストレプトキナーゼーＬＤを含有する３成分複合体とを区別するであろう如何なるクロマトグラフィー、エライザ（ＥＬ／ｌ５Ａ）法または電気泳動プロトコルも本発明の方法に有用である。当業者はこの区別をさせる条件およびゲル処方を設計することができる。ゲル電気泳動は、蛋白のゲル電気泳動、実用入門書（Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌｒＲＬプレス、ワシントン、１９８１で吟味されている。

好ましい具体例において、ＬＤをストレプトキナーゼ結合蛋白として使用し、ゲルマトリックスを介する電気泳動を使用して試料を分析する場合、ゲル多孔度および電気泳動緩衝液条件は、抗ストレプトキナーゼ抗体−ストレプトキナーゼーＬＤ複合体がゲル中に少量だけ移行するかまたは移行せず、３成分複合体はゲルの原点に残存するかまたは本質的に残存するようにする。ゲルの原点は該試料が電気泳動前にゲルに適用されたその位置である。非常に太き（てゲル構造中に非常に進んで移行するかまたは陽極および陰極に関して電気的に中性である複合体は、該原点に残存するかまたは本質的に残存する。一般に、このような蛋白は、ゲルを展開（着色）する際に洗い落とされないであろうが、ゲルの原点でゲルマトリックスと結合したまま、またはそれにひっかけられたままであろう。適当な多孔度を有する好ましいゲルの例は１％アガロースゲルである。

１００ＶでＬＤイソチームを分離するのに充分な時間（例えば、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）パラボン（Ｐ　ａｒａｇｏｎＲ）電気泳動システムで２０〜２８分）、ｐＨ８，２バルピタール緩衝液中での１％アガロースゲルの電気泳動、次いで、ゲル中のＬＤ活性の着色によって、電気泳動ゲルの原点でＬＤ？Ｊｊ合体の沈殿の存在によって抗ストレプトキナーゼ抗体の存在が示される。抗ストレプトキナーゼ抗体が存在しない場合、ストレプトキナーゼとＬＤとの複合体はゲル中に移行し、該原点で沈殿しないかまたはそこに残存しない。

ＬＤ活性に関する比色測定着色は、適切な量のＬＤ基質、例えば約２０８１Ｍ乳酸リチウムおよび５．６ｘＭ　ＮＡＤ”を含有する基質と接触して電気泳動されたゲルをインキュベートすることによって行われ得る。乳酸塩およびＮＡＤをピルビン酸塩およびＮＡＤＨに変換する際にＬＤ活性によって生じるＮＡＤＨは、ゲル中のＬＤイン酵素の位置に現れる。ＮＡＤＨおよびＬＤ活性の位置は、ＮＡＤＨの存在下で着色生成物に還元されるｐ−ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＥＴ）のような色素で比色測定的に検出され得る。例えば、０．３３ミリモル／Ｑフェナジン・メトスルフェート（ｐｈｅｎａｚｉｎｅｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅＸＰＭｓ）の存在下で１．９９／＋２のＮＢＴを添加すると、ゲル中のＬＤイン酵素の位置で青色のホルマザン指示顔料が形成される。酵素活性についてこの方法で展開されたゲルは、６０ｘＱ／Ｑ酢酸溶液中で固定され、加熱乾燥され得る。

イソ酵素蛋白は、蛍光法、ケミルミネッセンス法、放射性標識法、または免疫法を用いても同定され得る。

本発明の方法に使用され得るゲルマトリックスの例としては、アガロース、ポリアクリルアミド、スターチ、およびそれらの混合物が挙げられる。電気泳動によるＬＤイン酵素を分離するの条件は当該分野ではよく知られており、例えば、モーゼス、ジー・シー（Ｍｏｓｅｓ、　Ｇ、　Ｃ，）、クリニカル・ケミストリー（Ｃ１ｉｎ、Ｃｈｅａ、）、旦：　１８８５−１８９０（１９８８）：マッケンジー、ディーら（ＭｃＫｅｒ＋ｚｉｅ、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、）、クリニカル・ケミストリー、２９：１８９−１９５（１９８３）；およびＣ７７ン、ダブリ：Ｌ（Ｒｏｍａｎ、Ｗ、）、エンザイモロジア（旦＝だ坦匹ｂ）、３６　：　１８９ −２１９（１９６９）に開示されている。

アガロースゲル中でＬＤイソ酵素分析を行うために使用され得る緩衝液の例としては、バルビツール、バルビツール／ＥＤＴＡ、トリスーパルビタール、バルビツール／ＡＭＰＤ　（２−アミ７−２−メチル−１，３−プロパンジオール）、およびＭＯＰＳ○（３−（Ｎ−モルホリ／）−２−とドロキシプロパンスルホン酸）が挙げられる。

アセテートゲルを用いてＬＤイソ酵素分析を行うのに使用され得る緩衝液の例としては、トリスーパルビタールが挙げられる。

種々の電気泳動支持体および緩衝系に関するアッセイ条件の概要おり、本明細書に引用記載する。

ベックマンによって提供されたバラボン（Ｐ　ａｒａｇｏｎ”）ゲル系のような市販の入手可能なゲル系も本発明の方法に有用である。

抗ストレプトキナーゼ抗体の存在は、抗体の電気泳動測定に使用されたものと同様の濃度、１５００ＩＵ／ｘＩ２ないし１５０，０００ＩＵ／ｘＱ、最も好ましく　＋＊　１５．　ＯＯＯＩ　Ｕ／Ｉｊｆｉ終１度ノストｌｚブトキナーゼの添加の前後に血清中のＬＤ酵素活性をアッセイすることによっても検出され得る。

ストレプトキナーゼおよび抗ストレプト牛ナーゼ抗体を含有する複合体中でトラップされると、ＬＤ活性が減少することが発見された。したがって、ストレプトキナーゼ添加後のＬＤ活性の減少は、試料中の抗ストレプトキナーゼ抗体の存在を示すものである。

抗ストレプトキナーゼ抗体−ストレプトキナーゼ−ＬＤ１合体の存在は、カラムクロマトグラフィーまたは濾過（樹脂またはマイクロフィルターを用いる）によって抗体を含まない複合体と抗体含有ＬＤ複合体とを分離する方法によってもアッセイされ得る。例えば、当業者は、抗体を含むであろう大きい複合体と約１８７，０００ダルトンの分子ｊｌ（Ｌ　Ｄテトラマーの分子量１４０□ＯｏＯダルトンおよびストレプトキナーゼの分子量４７．　ＯＯＯダルトンの合計）を有する抗体不含ＬＤ複合体とを分離するクロマトグラフィー条件を設計し得る。このようなりロマトグラフイーは、好適なりロマトグラフィーマトリックス、特にサイズによって分離するもの、例えばセファロース（Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ”）およびセファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘＲ）、特にセファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ”）　Ｇ　−２００によって行われ得る。

１８７．０００ダルトンより大きい分子量の血清蛋白を含有する画分がＬＤ活性の無いものである場合、該血清は抗ストレプトキナーゼ抗体を含有しない。１８７，０００ダルトンよりも有意に大きい分子量を有する画分におけるＬＤ活性の出現は、個別に試験されている血清中のＬＤ−ストレプトキナーゼ−抗ストレプトキナーゼ複合体の存在および抗ストレプトキナーゼ抗体の存在を示すだろう。

血清中で見い出された抗体および抗体非結合蛋白、特にＬＤサブユニットＭの両方に対する親和性を有するいずれのストレプトキナーゼまたはそれらの一部分も、本発明の方法に有用である。このようなストレプトキナーゼは、例えば、ベーリンガー・マンノ−イム・バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　［インディアナ州インディアナポリスコおよびシグマ・ケミカルズ・カン商業的に入手可能である。さらにアルブミンまたはコラーゲンを含有する組成物中にストレプトキナーゼを含有する製剤、例えばヘキストールジーゼル・ファーマシニーティカルズ（Ｈｏｅｃｈｓｔ　− ＲｏｕｓｓｅｌＰ　ｈａｒｍａｃｅｕｔ　１ｃａｌｓ）からのストレブターゼ（Ｓ　ｔｒｅｐｔａｓｅ”）、またはカビービトラム（Ｋ　ａｂｉ　−Ｖ　１ｔｒｕａ＋）からのカビキナーゼ（Ｋ　ａｂｉｋｉｎａｓｅｌｌ）も本発明において有用である。

さらに、本発明のアッセイ用の物質は、キットの調製に理想的に適合している。

このようなキットは、厳重な監禁下で受けるために区分されているキャリヤ一手段、バイアル、試験管などのような１個以上の容器手段からなり得る。該容器手段の各々は、該方法で使用されるべき分離成分の１つからなる。

例えば、該容器手段の１つはストレプトキナーゼからなり得る。

第２の容器はＬＤの検出システムからなる。

さらに、該キャリヤーは、ＬＤ複合体またはイソ酵素の分離に必要な、種々の予め決定された既知量の緩衝液および他の溶液、ゲルまたは樹脂からなる複数の容器を含んでいてもよい。

本発明の実施において、抗ストレプトキナーゼ抗体の存在は、生物学的液および組織中で検出され得る。未知の量の抗ストレプトキナーゼ抗体を含有する如何なる試料も使用することができる。好ましくは、血清を使用する。通常、試料は、例えば血清、尿、唾液、涙滴、髄液、血液、血漿などのような液体である。例えば組織、糞などのような固体または半固体は、まず懸濁液中でホモジナイズされるかまたは放置された後に使用され得る。このような方法は当該分野で公知である。さらに、連鎖球菌感染にかかつているかまたは予めストレプトキナーゼに暴露したヒトまたは動物を除（、ヒトまたは動物の生物学的液または組織中にストレプトキナーゼに対する抗体が存在し得ることも公知である。

ＬＤ、特にＬＤサブユニットＭを検出する如何なる手段も使用され得る。例えば、ストレプトキナーゼ結合蛋白または３成分複合体、特にＬＤまたはＬＤサブユニットＭに対する検出可能な標識抗体は、ＬＤおよびストレプト牛ナーゼ間の複合体の存在、および抗ストレプトキナーゼ抗体の有無を示すのに使用され得る。

さらに、当業者は、本発明の方法が本明細書に記載の複合体に対する自己免疫応答によって生じるかまたはそれに関連する疾患経過を同定するのに、特に患者の血清中でストレプトキナーゼおよび血清ストレプトキナーゼ結合蛋白間の複合体を特異的に認識する抗ストレプト牛ナーゼ抗体の存在を同定するのに使用され得る。

以下の実施例によって本発明をさらに説明するが、特記しない限り本発明の範囲を決して限定するものではない。

外来患者１０人から採取した血清試料を、慣例の化学分析の完了後、ストレプトキナーゼとの混合実験に使用するためにプールした。

高濃度のＬＤイソ酵素１ならびにクレアチンキナーゼイソ酵素ＭＭおよびＭＢを含有する血清試料は、急性心筋梗塞を有する患者の慣例試験後に入手可能である。死亡２４時間以内に剖検で正常なヒトの肝臓および畢丸を入手する。食料品店から新鮮で生肉状態のブタおよびニワトリの心臓および骨格筋を共に入手する。

２．試薬ストレプターゼ（Ｓ　ｔｒｅｐｔａｓｅ”ン（ストレプトキナーゼ、ヒトアルブミンおよびコラーゲンペプチドを含有する）をニューシャーシ一州０８８７６サマービルのへキストールーゼル・ファーマシューテ。

カルズｅインコーポレイテッド（Ｈｏｅｃｈｓｔ−Ｒｏｕｓｓｅｌ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕ−ｔｉｃａｌｓ、　Ｉ　ｎｃ、　）から人手した。カビキナーゼ（Ｋ　ａｂｉｋｉｎａｓｅ”）　（ストレプトキナーゼおよびヒトアルブミンを含有する）をカリフォルニア州９４５０１アラメイダのカビービトラム・インコーボレイテ。

ド（Ｋ　ａｂｉ　−Ｖ　ｉｔｒｕｍ、　Ｉ　ｎｃ、　）から入手した。非薬物ストレプトキナーゼをベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Ｂ　ｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から入手した。

アルテブラーゼ（Ａｌｔｅ−ｐｌａｓｅ）組換えアクチバーセ（Ａｃｔｉｖａｓｅ”）　（組織プラスミノーゲン活性因子、ＴＰＡ）をカリフォルニア州９４０８０サウス・サンフランシスコのジェネンテック・インコーホレイテッド（Ｇ　ｅｎｅｎｔｅｃｈ。

Ｉ　ｎｃ、　）から入手した。ウロキナーゼ（ヒト腎臓細胞から誘導）ＱＡＥセフアゾ１クス（Ｑ５０−１２０）およびＮＡＤ”　Ｃグレード■−ベータ）をミズーリ州６３１７８セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓ　ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から入手した。セファデックスＧ−２００をニューシャーシ−Ｈ０８８５４ビスカッタウェイのイ　ファルマシア・ファイン・ケミカルズ・インコーホレイテッド（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ　Ｆ　ｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｉ　ｎｃ、　）から入手した。ポリゲリン（Ｐ　ｏｌｙｇｅｌｉｎｅ”）修飾コラーゲンをカリフォルニア州９２０３７ラジヨーラのカルビオケムーベーリング・ダイアグノスティクス（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　−Ｂ　ｅｈｒｉｎｇ　Ｄ　ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）から入手した。イソムンーＬ　Ｄ　（Ｉ　ｓｏｍｕｎｅ　−Ｌ　Ｄ　”）を二ニーシャーシー州０７１１０ナットリイのロチェ・ダイアグノスティクス（Ｒｏｃｈｅ　Ｄ　ｔａｇｎｏｓｔｉｃｓ）から入手した。ＬＤ、クレアチンキナーゼ、および血清蛋白（ＳＰＥ）アガロースゲルを有するバラボン（Ｐ　ａｒａｇｏｎＴＭ）ｉＪ気泳動システム、バルビタール緩衝液、酵素基質および展開剤ならびにアストラ（ＡｇｔｒａＴ１″）自動化学分析器における全ＬＤ活性の測定用試薬をカリフォルニア州９２６２１プレアのベックマン・インストゥルメンツ・インコーポレイテッド（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉ　ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉ　ｎｃ、）から人手した。

３、方法ＬＤイソ酵素分析、クレアチンキナーゼイソ酵素分析および血清蛋白電気泳動のために、カリフォルニア州ブレアのベックマン・インストウルメンツ・インコーホレイテッド（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉ　ｎ５ｔｒｕ口ｅｎｔｓ。

Ｉ　ｎｃ、　）のダイアグノスティック・システムズ・グループ（Ｄｉａｇｎｏｓ−ｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｇｒｏｕｐ）からの製造業者の指示（ベックマン指示書番号０１５−Ｌ５５６４６２−Ｇ（ＬＤについて）、番号０１５−５５６４６１−Ｈ（クレアチンキナーゼについて）および番号０１５−５５６４５８− Ｇ（血清蛋白について））に従って、バラボンゲルおよび試薬を使用した。

組織と同量の１４５ミリモル／Ｑ塩化ナトリウム中で組織を細かく刻んでＬＤイソエンチームを抽出し、次いで、５０００Ｘｇでの遠心分離によって清澄化した。２０ミリモル／ｆ２トリスＨＣ（１、ｐＨ８，２（緩衝液Ａ）中で平衡化されたＱＡＥ−セファデックス陰イオン交換カラム（支持床容量４５峠、高さ２７　ｃｍ、流速約３０１１２／時）を介して肝臓抽出物を通過させることによってＬＤ５を半精製した。

ＬＤＩ〜ＬＤ４を含まないＬＤ５を、そのままこのカラムを通過させた。同様のカラム上にイソ酵素中に豊富な血清を負荷し、１１２当たり塩化ナトリウム２１５ミリモルを含有する緩衝液ＡでＬＤ２〜ＬＤ５を洗い落とし、次いで、ＩＱ当たり塩化ナトリウム２６０ミリモルを含有する緩衝液Ａを用いて他のＬＤイソ酵素を含まないＬＤｌを溶離することによって、ＬＤＩを半精製した（ボドラセク。

ニス・ジェイら（Ｐｏｄｌａｇｅｋ、　Ｓ、　Ｊ　、　ａｔ　ａｌ、）、クリニカル・ケミストリー（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅｍ、）、３　ｔ　：　５２７−３２（１９８５）；フス、エムーワイら（）（５１，Ｍ−Ｙ、ｅｔ　ａｌ、）、クリニカル・ケミストリー、２５　：　１４５３−８（１９７９））。

ＬＤＸ（ｒサブユニットＣ」と言われるサブユニットを含有する精子から得たＬＤ）を半精製するために、１容量の畢丸抽出物を４容量のイソムン（Ｉ　ｓｏｍｕｎｅ）　−Ｌ　Ｄ溶液Ａ（ヤギ抗ヒトＬＤ−Ｍ抗体）と混合し、次いで、同容量のイソムンーＬＤ溶液Ｂ（ポリマー結合ロバ抗−ヤギ免疫グロブリン）で免疫沈降して、Ｍ−サブユニット含有ＬＤイソ酵素を全て除去した。次いで、上記ＱＡＥ陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによってＬＤＸをＬＤＩと分離した。

ＬＤＩは該カラム上に保持され、ＬＤＸはＩＱ当たり塩化ナトリウム１４０ミリモルを含有する緩衝液Ａで別々に溶離された。

ＬＤＩ、ＬＤ５およびＬＤＸの個々の画分を、ストレプトキナーゼと混合する前に、リン酸緩衝生理食塩水（リン酸ナトリウム１０ミリモル、ｐＨ７，２、および塩化ナトリウム１４９ミリモル／リットル）に対して透析した（下記参照）。

分子サイズ分は用のゲル濾過を、リン酸緩衝生理食塩水で平衡化したセファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−２００カラム（ベッド容量７５ｍ１．高さ５５ｃｍ、流速約４５ｍ１／時間）を用いて行った。

１ｍｌづつの画分を収集した。

実施例１血清中のストレプトキナーゼとＬＤイソ酵素との相互作用５種すべてのＬＤイソ酵素を含有するプールした血清（９倍容量）を１容量のストレプトキナーゼ（最終濃度１５０００国際単位／ｍｌ）と混合し、室温にて１時間インキュベートし、次いで電気泳動に付し、ＬＤ活性について展開した。この操作は、主要Ｍ−サブユニット含有イソ酵素（ＬＤ３、ＬＤ４およびＬＤ６）の完全な除去と共に、イソ酵素パターンの著しい変形をもたらした。多量のＬＤ活性が適用原点にて残存しており、不溶性沈澱物の形成を示唆する（図ＩＡ、レーンｂ）。３種の異なる各々のストレプトキナーゼ調製物はＬＤイソ酵素に対して同一の効果を示した。２種の医薬調製物もまた内因性ＬＤ活性がなかった（図ＩＡ、レーンＣ）。対照として、血清と別々に混合して同様の濃度とした、これらのストレプトキナーゼ調製物中の安定化成分は、ＬＤとの相互作用を示さなかった。さらにストレプトキナーゼおよびヒト血清被験体の混合物を電気泳動に付し、クレアチンキナーゼイソ酵素について、および染色しうるタンパク全体について評価した。ストレプトキナーゼの添加に由来するクレアチンキナーゼイソ酵素または主要血清タンパクの電気泳動移動において全（変化がなかった。これらの知見により、ストレプトキナーゼがヒトＬＤを全く不活化することなく、特異的かつ有意にヒトＬＤと相互作用するということが確立された。

実施例２個々のＬＤイソ酵素と混合したストレプトキナーゼ半精製ＬＤＩまたはＬＤ５　（９倍容量）を１容量のストレプトキナーゼ（終濃度１５０００１Ｕ／ｍｌ）と混合し、電気泳動分析に付して、結合がＬＤのＨまたはＭサブユニットに対して特異的であるか否かを測定した。ストレプトキナーゼをＬＤＩ（Ｈ−四量体）に添加することでイソ酵素の移動度は変化せず（図ＬＡ、レーンｅ）、ストレプトキナーゼとＨサブユニットが相互作用しないことが示された。対照的に、ストレプトキナーゼのＬＤ５への添加は、イソ酵素の電気泳動移動のおいて大きな変化をもたらしく図ＩＡ、レーンｇ）、ストレプトキナーゼとＭサブユニットの間の実質的相互作用を示した。ストレプトキナーゼと半精製ヒ１−ＬＤＸとの混合物は、ＬＤサブユニットＣとストレプトキナーゼとの相互作用を全く示さなかった（図ＩＢ、レーンｄ）。かくして、ストレプトキナーゼとヒトＬＤとの相互作用はＭサブユニット単独に対して特異的であつた。

抗ストレプト牛ナーゼ抗体を含有する血清（９部）を、電気泳動前に種々の濃度のストレプトキナーゼ（１部）と混合した場合、ＬＤ−ストレプトキナーゼ−抗ストレプトキナーゼ抗体複合体の形成を示す、適用原点でのＬＤ活性の用量−依存沈殿があった（図２）。

ストレプトキナーゼの各濃度にて、ＬＤのＭ−サブユニット含有イソ酵素の優先的除去があった。最高濃度のストレプトキナーゼにおいては（図２、レーンｂ）、多量のＬＤ−ストレプトキナーゼ−抗ストレプトキナーゼ抗体複合体による物理的障害の存在のため、全被験体がゲルに侵入できないようであった。

実施例４複合体のサイズ分は血清中に形成されたＬＤ−ストレプトキナーゼ−抗ストレプト牛ナーゼ抗体複合体を、セファデックスＧ−２００を用いるゲル濾過により評価した。血清−ストレプトキナーゼ混合物をクロマトグラフィーに付すことにより得られた画分を電気泳動法によりＬＤイソ酵素含量について分析した。複合体（図３、レーンａ　 −ｃの電気泳動原点にて沈澱）は、ボイド容量の後であるが、正常な四量体ＬＤイソ酵素の前に溶出した（図３、レーンｄ　％　？　）。この結果は、ＬＤ（四量体分子サイズ、１４０ｋＤａ）とストレプトキナーゼ（４７ｋＤａ）との相互作用により高分子塊複合体が生成され、ストレプトキナーゼがＬＤをより小さな非移動形に単に分解しないことを示した。種々の数のＭサブユニットを含有するＬＤ２〜ＬＤ５の存在下では、ストレプトキナーゼで形成された複合体は不均質であり、カラムに捕捉され、この分析で検出されない非常に高質量の複合体がいくらか伴うようである。

実施例５ウロキナーゼおよび組織プラスミノーゲン活性化因子の効果ストレプトキナーゼの如くプラスミノーゲンの同一部位に結合する他のフィブリン溶解剤であるウロキナーゼおよびＴＰＡを血清に加え、ＬＤへの結合性について試験した。該フィブリン溶解剤は、ストレプトキナーゼに用いたと同様の条件下で、ＬＤといずれの相互作用も示さなかった。

プラスミノーゲンおよびＬＤ配列の比較ストレプトキナーゼが結合するプラスミノーゲン領域は、その塩基におけるシスティン−システィン結合により集団となったアミノ酸の小ループからなる（アミノ酸残基５５７〜５６５）（コレン・ディー（Ｃｏｌｌｅｎ、Ｄ、）　、トａンボシス・アンド・ヘモスタシス（Ｔ　ｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔ、　）±３ニア　〜８９　（１９８０））、既知のＬＤ配列の研究［イベントフ・ダブリニ（Ｅ　ｖｅｎｔｏｆｆ、　Ｗ、）ら、プロシーディンゲス・サブ・ナシヌナル・アカデミ−・サブ・サイエンシス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ’、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ　７４　：　２６７７　：　８１（１９７７）；ツジボ・エッチ（Ｔ　５ｕｊｉｂｏ、　Ｈ、）ら、ヨーロピアン・ジャーナル・サブ・バイオケミストリー（Ｅ　ｕｒ、　Ｊ　、　Ｂ　１ｏｃｈｅｉ、　）Ｊ、Ｌ、）ら、プロシーディンゲス・サブ・ナショナル・アカデミ−・サブ・サイエンシス　ＵＳＡ　８４：５３１１〜１５（１９８７）コにより、ＬＤ　（ヒトサブユニットＬＤ−Ｍについての番号付けに従うとアミノ酸残基１５３〜１６２）とブラスミ／−ゲンのストレプトキナーゼ結合部位との間にて単一の相同領域が明らかにされた（表１）。この領域内では、アミノ酸残基１５６〜１６２はヒトＬＤ−ＭおよびＬＤ−Ｃ（ＬＤＸのサブユニット）、ブタＬＤ−ＭおよびＬＤ−Ｈ，およびニワトリＬＤ−ＭおよびＬＤ−Ｈにおいて完全に保存されている（ヒトＬＤ−Ｈについての配列データは入手できなかった）。これら動物源のＬＤも結合について試験し、ストレプトキナーゼがすべての３種（ヒト、ブタおよびチキン）からのＬＤ−Ｍと強く相互作用することが判明した。

しかしながら、この研究で用いた実験条件下では、ストレプトキナーゼはこれらのいずれの種からのＬＤ−Ｈとも結合しなかった。

表１ブラスミ／−ゲン（残基５５７〜５６５）とＬＤサブユニ、ト（残基１５２〜１６２）の間の相同領域におけるアミノ酸配列の比較ヒトプラス　ヒト　ブタ　ニワトリミノーゲン　ＬＤ−Ｍ　ＬＤ−ＣＬＤ−Ｍ　ＬＤ−ＨＬＤ−Ｍ　ＬＤ−１（Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　５ｅｒＬｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ５５７−Ｃｙｓ　１５２−ＰｈｅＬｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　ＬｅｕＰｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　’Ｖａｔ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ−Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　ＨｉｓＡｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　ＡｒｇＶａｌ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　ＶａＬ　ＶａｌＶａｔ　Ｈｅ’　ｌｌｅ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　ｌ１ｅＧｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ−Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　５ｅｒＧｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ５６５−Ｃｙｓ　１６２−Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　ＣｙｓＶａｌ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　ＡｓｎＡｉａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＨｉｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　’Ａｓｐ　ＡｓｐＢｂ　Ｂ　ＮＢ’　Ｂ　ＮＢ　Ｂ　ＮＢ上記すべてのアミノ酸はヒトプラスミノーゲンのストレプトキナーゼ結合領域と相同性を示す。

イソロイシン６はバリンと同等であると考えられる。Ｂｂ：ストレプトキナーゼに結合、ＮＢ１′：ストレプトキナーゼに結合せずヒトＬＤ−ＣおよびブタＬＤ −Ｈは、いずれもストレプトキナーゼと相互作用せず、アミノ酸残基１５２．１５４および１５５でヒ）ＬＤ−Ｍの配列と異なる配列を有する。１５２位のフェニルアラニンは３種のすべての結合体に共通するのに対し、非結合体の場合はすべて１５２位にロイシンを有する。この知見は、１５２位のフェニルアラニンが、恐らくは（非結合体におけるロイシンと比較して）比較的バルキーでかつプラスミノーゲン５５７位のシスティンにいくらか相同するために、ストレプトキナーゼ結合につき重要であることを示唆する。

１５４位において、リシンは両結合体および１の非結合体（他の非結合体であるブタＬＤ−Ｈは１５４位にバリンを有する）に共通し、この位置のアミノ酸はストレプトキナーゼ相互作用に臨界的でないことを示唆する。１５５位において、１つの非結合体はスレオニン（ヒトＬＤ−Ｃ）を有し、他のものは、結合体におけるアスパラギンと比較して、正に荷電したヒスチジン（ブタＬＤ−Ｈ）を有する。これらの差異（ブタＬＤ−ＨおよびチキンＬＤ−Ｈ）は１５４位（リシン）および１５５位（ヒスチジン）で同一のアミノ酸を有していない。しかしながら、５５７−システィンから５６５−システィンまでの９個のアミノ酸残基のプラスミノーゲン配列と比較すると、ＬＤ−Ｍにおける相同ストレッチが１５２−フェニルアラニンから１６２−システィンまでの１１個の連続残基に伸びている。

プラスミノーゲンにおいて、２個のシスティンの結合は、恐らく、密なコンフｔメーシ目ンの５５７ないし５６５のループを保持する。

同様のコンフｔメーシ曹ンは、ジスルフィド結合と一緒になっていないわずかに長いペプチドループのより緩やかな結合によって、ＬＤ−Ｍで生じるであろう。

ペプチド結合角の同様の方向を保持しつつ、そのステムに対して該ループ先端（アルギニン−バリン−イソロイシン／バリン）において同一の向きを達成するには、一方の余分なアミノ酸（１６０−セリン）を、該ループの他方にアミノ酸をさらに挿入することによって、バランスをとらなくてはならない。

かくして、１５５位のアミノ酸の要件は、特異的側基を付与するよりもむしろスペースを占めることにあるかもしれない。これらの知見は、全体として、ストレプトキナーゼ結合の認識ユニ２トが、はぼＰ　ｈｅ／Ｃｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｌ　ｙｓ−いずれかのアミノ酸／無−Ａ　ｒｇ− Ｖ　ａｌ−Ｉ　ｌｅ／Ｖ　ａｌ−Ｇ　ｌｙ−いずれかのアミノ酸／無−〇　ｔｙ −ｃ　ＹＳであることを示唆する（すなわち、１１個すべてのアミノ酸配列であるか、または４および９の残基のない配列であるかのいずれかである）。

ストレプトキナーゼによる結合は、分子の各半分がセリンプロテアーゼの構造に相同し、内部重複しているため、２価であるかもしれない（ジャクソン・ケー・ダブリュ（Ｊ　ａｃｋｓｏｎ、　Ｋ、Ｗ、　）　＋　バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）旺：６６２０−５（１９８２））。

ストレプトキナーゼに上の可能な各結合部位は、セリンおよびアスパラギン酸を有するが、セリンプロテアーゼの活性部位に特徴的なヒスチジンを有しない。２価のストレプトキナーゼと四量体ＬＤとの相互作用は、非常に長い鎖または複合体のマトリックスの形成を可能とするであろう。かかる大複合体は、電気泳動での適用点に残ったままの沈殿物に一致する（図２）。患者においては、これらの巨大複合体は免疫系の細胞により補食され、それによりＬＤ−Ｍに対する自己免疫応答の誘発を強化し得る。１価に過ぎないプラスミノーゲンおよび他の分子種もまた、（鎖ターミネータ−として）マトリックスにおいて関係しており、かくして、外来性イムノゲン、ストレプトキナーゼと一緒に該免疫系に提供し得る。

ＬＤおよびプラスミノーゲン双方におけるこの結合配列の発生は、これらの２種のタンパクが他に有意な相同性を有しておらず、さもなければ恐らくは非類縁であるため偶然である。プラスミノーゲンは、細胞外にて作用する凝固機構のセリンプロテアーゼであり、ＬＤは実質的にすべての細胞で発現される細胞内オキシドレダクターゼである。この配列の部分Ａ　ｒｇ−１１ｅ−Ｖ　ａｌ−Ｇ　１ｙ −Ｇ　ｌｙは、真核生物のセリンプロテアーゼプロトロンビン、血液凝固因子ＩＸ、ＸおよびＸ【、カリクレイン、トリプシ／−ゲン、キモトリプシノーゲンおよびエラスターゼにおいて、ならびに細菌トリプシンにおいても保存されている（ダイホノフ・エム・オー（ＤａｙｈｏｆＴ、Ｍ、Ｏ，）　。

メリーランド州、シルバー・スプリング、タンパクの配列および構造のアトラス、５巻、　５ｕｐｐ１．３　：ザ・ナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファウンデーション（１９７８）；ヨシタケ・ニス（Ｙ　ｏｇｈｉｔａｋｅ、　Ｓ　、　）ら、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２４：３７３６〜５０　（１９８５）；フジカワ・ケー（Ｆ　ｕｊ　ｉｋａ＊ａ。

Ｋ、）ら、バイオケミストリー　２５：２４１７〜２４（１９８６））。

この保存配列におけるアルギニンーイソロイシン結合はこれらの分子を活性形に変換するための共通な切断部位である。

抗ストレプトキナーゼ抗体とストレプトキナーゼＬＤとの結合活性の検出４匹のニコージランド（Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ）白色ウサギに、第０８目および第２８８目にストレプトキナーゼを注射し、該動物の血清中に、ストレプトキナーゼに対する抗体を生じさせた。該血清を１５０００ＩＵ／ｍｌストレプトキナーゼと混合し、前記のようにＬＤ’ｌ気泳動に付すことにより、予備免疫および免疫血清被験体を抗ストレプトキナーゼ抗体の存在について試験した（図４）。試験した予備免疫被験体はいずれも該ゲルの原点でＬＤ沈殿または残存を示さなかった。しかしながら、第４０８目で抗ストレプトキナーゼ抗体を有するウサギからの被験体はすべて、ストレプトキナーゼをその血清試料に添加した後、ゲルの原点にて強力なＬＤ沈殿を有した。Ｍサブユニットを有するＬＤイソ酵素はすべて、その移動の変化により証明されるようにストレプトキナーゼと結合するが、ストレプトキナーゼ単独では電気泳動原点にて沈殿するような非常に大きな複合体は得られなかった。予備免疫被験体ｓＡまたはｓＢのいずれも電気泳動原点でＬＤ活性を示さなかった。免疫ｓＡおよびｓＢ被験体は共に該原点にてかなりのＬＤ活性を示した。

実施例７ヒト血清中の抗ストレプトキナーゼ抗体の検出４３人の患者から血清被験体を採取し、ストレプトキナーゼの添加およびＬＤ検出法により抗ストレプトキナーゼ抗体の存在についての検定に用いた。ストレプトキナーゼ（カビキナーゼ・カビヴイトラム争インフーポレイション（Ｋ　ａｂｉｋｉｎａｓｅ、　Ｋ　ａｂｉｖｉｔｒｕａ＋、　Ｉ　ｎｃ、　）１部を、１５０００ＩＵ／ｍ＋の最終ストレプトキナーゼ濃度まで血清９部と混合し、１時間インキュベートし、パラゴンＬＤＧｅｌ電気泳動系（ベックマン（Ｂ　ｅｃｋｍａｎ）　）の製造業者の指示に従って電気泳動に付した。また、ヒタチ（Ｈｉｔａｃｈｉ）　７３７系（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　）を用い、ストレプトキナーゼ添加の前後において、これらの血清被験体における全ＬＤ活性を測定した。１７人の患者からの被験体は、電気泳動原点に残ったままのＬＤ活性の重バンド（沈殿）を示した（図５）。すべての被験体は、いくらかのＬＤイソ酵素の移動において変化を示した。

該原点でのＬＤの沈殿を含む試料はまた、全ＬＤ活性の実質的喪失を示した。平均６０％の原活性が保持された。ゲル原点で沈殿を有しないこれらの試料はほとんどＬ’Ｄ活性を喪失しなかった（９５％の活性が保持された）（表２）。

これらの結果は、抗ストレプトキナーゼ抗体のストレプトキナーゼ−ＬＤ複合体への結合および該複合体の検出が血清中における抗ストレプト牛ナーゼ抗体の存在を予測するのに用いることができることを示す。

第２表ストレプトキナーゼの添加後における血清中でのＬＤ活性の検定ＬＤ沈殿を有する外来患者保持された活性平均＝　６０％第　２　表（続き）ＬＤ沈殿を有する外来患者工ΣとＺ上土ニュ！■　ストレプトキナーゼ後　もとの活性の％１９９　１９９　ｔｏ。

保持された活性平均＝９５％実施例８乳酸デヒドロゲナーゼイソ酵素５のストレプトキナーゼ依存性阻害剤ストレプトキナーゼ（ＳＴＫ）の添加により、い（つかの血清被験体において乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ：ＥＣ１，１，１，２７）活性が顕著に減少した（クリニカル・ケミストリー（Ｃ１ｉｎ、　Ｃｈｅｗ、　。

３５　：　１１１９（１９８９））。この例に記載されているごとく、この現象は、血清被験体中において特異的な杭抜合体抗体である抗ストレプトキナーゼ抗体の存在による。頻度を研究し、この現象を部分的に特徴付けるために、血清または血漿被験体を１５，０ＯＯＩＵ／ＬＳＴＫ（カビン牛ナーゼ、カビピトラム（Ｋａｂｉｎｋｉｎａｓｅ。

Ｋａｂｉｖｉｔｒｕｍ））の添加前後におけるＬＤ活性の差につきスクリーニングした（ヒタチ（Ｈｉｔａｃｈｉ）　７３７　：ベーリンガー・マンハイム・ダイアグノスティックス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））。

１７８被験体のうち、７体（４％）がＳＴＫの添加によって８０％を超える阻害を示した（平均＝８９％）。これらの被験体に添加した精製ＬＤ５は、ＬＤ５活性と抗ストレプトキナーゼ抗体の存在との間に化学量論的関係を示した。ＬＤ５を直接にしたセフアゾ、クス８・Ｇ−２００ゲル濾過、ＱＡＥ−セファデックス８・クロマトグラフィーおよびＤＥＡＥ　ＨＰＬＣによって精製して２８０Ｕ／ｍｇの特異的活性を有する生成物が得られた。この物質を使用まで４℃で貯蔵した。好時期の研究において、阻害は急速に起こり、大部分は５分以内に完了した。増大した量の精製ＬＤ５を平板培養し、ボランティアの血液提供者からの固定容量の血漿に添加し、最初の阻害はもとの活性の９０％であった。２０　（Ａ）　、３０　（Ｂ）　、および５０　（Ｃ）ｍｃＬの血漿容量は、各々、さらに阻害する能力が尽くされる（プラトー）以前に、８０　（Ａ）　、ｌ　２７　（Ｂ）および２１７　（Ｃ）　ｕ／ＬのＬＤ５を阻害した。以下の異なる血漿濃度を示した比は、異なる混合物においてＬＤ５活性を阻害した最大の比とほとんど同一であった：血漿濃度比：　Ａ／Ｂ＝、６７、Ａ／Ｃ＝、　４０、Ｂ／Ｃ＝、　６０最大阻害比　Ａ／Ｂ　＝、　６３、Ａ／Ｃ＝、３７、Ｂ／Ｃ＝、　５９このデータは、ＳＴＫによるＬＤ５の阻害は、患者の血清中の抗ストレプトキナーゼ抗体の存在によって化学量論的に媒介されることを示す。該データのスカチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）プロ／ト解析により、２．５ｘｌＯ″Ｌ１モル親和性定数が得られる。

実施例９抗−ストレプトキナーゼ抗体の検出についての新しい方法抗−ストレプトキナーゼ抗体（抗−３ＴＫ）はかなりの個人間の力価の差を示し、最も高いものは急性心筋梗塞についてのストレプトキナーゼ（Ｓ　Ｔ　Ｋ）フィブリン溶解療法を中和できる。フィブリン溶解薬剤のガイド的選択に対する高力節杭−３ＴＫの検出について３つの方法が開発された。これらは、２つの襟準的な方法（エライザおよびフィブリン溶解中ｆａ）　、およびＳＴＫがＬＤサブユニットＭに結合しくクリニカル・ケミストリー（Ｃ１ｉｎ、Ｃｈｅｍ、）、３５　：６９　（１９Ｂ９）　）および抗−３ＴＫはさらに電気泳動パターンを変化させる（クリニカル・ケミストリー（ＣＩ　ｉｎ、　ＣｈｅＩｌｌ、）、３５：１１１９（１９８９））という観察に基づいた、迅速検出用の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ、：　ＥＣ１，１，１，２７）イソ酵素電気泳動を使用する１の方法を含む。エライザ法については、１μｇ　ＳＴＫ／ウェルでコートしたマイクロタイタープレートを希釈した検体と共にインキュベートし、次いでアルカリ性ホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧと共にインキュベートして、ｐ−ニトロフェニルホスフェートでの発色（４０５ｎｍ）前に被験体中に存在するいずれかの（ｇＧへの該抗−１ｇＧの結合を可能とする。陽性値は血漿につき＞０．０６であり、血清につき＞Ｏ，ＯＳであった。線維素溶解中和は、ＳＴＫを血漿と混合し、次いで１３％クエン加血漿を含有する１％アガロースプレート中のウェルに添加することによって行つた。拡散の後、ゲルを０　、０５　Ｍ　Ｃａ　ＣＱ　２に浸漬した。溶解ゾーンにおける還元は陽性の結果であった。ＬＤイソ酵素パターンの変化については（ＬＤ−３ＴＫ）　、電気泳動の前にＳＴＫを添加した。

陽性の結果はもとの箇所における密なＬＤバンド、ＬＤ２およびＬＤ３の間における幅広のバンド、またはＬＤ活性における顕著な減少であった。フィブリン溶解アッセイは、エライザの有効性を確立するエライザに概略一致したことを示した。６ｏの患者の検体のうち、４３は一致し、１７はエライザおよび５ＴＫ−ＬＤの間で不一致であった。５ＴＫ−ＬＤによる６の偽陰性のうち４は高いＬｐ（ａ）濃＆を有していた。１１の偽陰性のうち１０は血漿検体であった。Ｌｐ（ａ）はＳＴＫにつき競合することによって干渉しかねないにも拘わらず、５ＴＫ− ＬＤによる抗−８ＴＫの検出はエライザとよく相関し、好ましい被験体は血清である。５ＴＫ−ＬＤアプローチの強みは、迅速な測定が臨床利用に必要である急な状況で使用できるその能力である。

特別の具体例を参照して本発明の詳細な説明してきたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、種々の変形および修飾を施すことができるのは当業者に明らかであろう。

ＦＩＧ、　１４ＦＩＧ、　１Ｂ −■・　−■― ＦＪＧ、２一一−１■−・Ｉ− ＦＩＧ、　３ＦｊＧ、４予備免疫　免疫国際調査報告ｌＩＩ＋＋＋ｎ＠１ｌｅＩＩａｌ　Ａｏ＠１１【峰”ＮＯｒ／ＩＩＳ９０１０３０８０

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）被験体をストレプトキナーゼを含む溶液と接触させ；（ｂ）該ストレプトキナーゼをして、ＬＤサブユニットおよび抗ストレプトキナーゼ抗体との複合体を形成せしめ；（ｃ）該ＬＤ、ストレプトキナーゼ、および抗ストレプトキナーゼ抗体の間の該複合体を検出し；（ｄ）該複合体の存在または不存在から該抗−ストレプトキナーゼ抗体の存在または不存在を判定することを特徴とするストレプトキナーゼに対し親和性を有するＬＤサブユニットを含む被験体中の抗ストレプトキナーゼ抗体の検出方法。
２．（ａ）ストレプトキナーゼを被験体に添加し；（ｂ）該ストレプトキナーゼに対し親和性を有する該被験体中のＬＤサブユニットに該ストレプトキナーゼを結合させ；（ｃ）該被験体中のＬＤのイソ酵素パターンを検出し；次いで（ｄ）該イソ酵素のパターンによって該抗ストレプトキナーゼ抗体の存在または不存在を判定することを特徴とする被験体中の抗ストレプトキナーゼ抗体の検出方法。
３．該ＬＤサブユニットがサブユニットＭである請求項１または２記載の方法。
４．該方法がさらに該被験体を電気泳動に付すことよりなる請求項１または２記載の方法。
５．該方法がさらに該被験体をカラムクロマトグラフィーに付すことよりなる請求項１または２記載の方法。
６．該方法がさらにＬＤの酵素活性を検出することよりなる請求項１または２記載の方法。
７．該被験体が血清である請求項１または２記載の方法。
８．該血清がヒト血清である請求項７記載の方法。
９．該抗ストレプトキナーゼ抗体がストレプトキナーゼを認識する請求項１または２記載の方法。
１０．該抗ストレプトキナーゼ抗体がストレプトキナーゼともう１つのタンパク質との間の複合体を認識する請求項１または２記載の方法。
１１．核タンパク質がストレプトキナーゼ結合配列を含有する請求項１０記載の方法。
１２．ストレプトキナーゼ結合配列を含有する該タンパク質が、乳酸デヒドロキナーゼ、プラスミノーゲン、プラスミンおよびＬｐ（ａ）よりなる群から選択される請求項１１記載の方法。
１３．該タンパク質が少なくとも１つのＭサブユニットを含有する乳酸デヒドロキナーゼである請求項１２記載の方法。
１４．接近した狭い１個または２個の容器を受け入れる部屋に区分されたキャリアー、およびさらにａ．ストレプトキナーゼを含む第１の容器手段；およびｂ．ＬＤの存在を測定するための検出システムよりなることを特徴とする被験体中の抗ストレプトキナーゼ抗体検出用キット。
１５．該検出システムが、ＬＤについての酵素アッセイからなる第２の容器手段よりなる請求項１４記載のキット。
１６．該酵素アッセイがゲル上でＬＤをアッセイするのに適合した請求項１５記載のキット。