JPH04505807A - モノクローナル抗体の抗原に対する結合特異性を定量するための免疫検定法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 モノクローナル抗体の抗原に対する結合特異性を定量するための免疫検定法 本発明はモノクローナル抗体の抗原に対する結合特異性を定量するための免疫検 定法（イムノアッセイ）であり、それによって検定の感度を高めるための免疫検 定法である１本発明はエピトープの性質を明らかにすることによりエピトープを コードしているペプチドを提供する。

エピトープペプチドを添加又は添加しないで抗体の抗原物質に対する結合を比較 する試験で抗体結合の特異性の定量が可能になる。

免疫検定は広範囲の診断及び分析用に日常的に用いられている。モノクローナル 抗体が比較的最近使えるようになり、特定の抗原標的に焦点を絞る、免疫検定の 能力は著しく高められた。しかしながら、抗体結合がこれらの検定の１つで見出 される場合、この結合が非特異的即ちエピトープ特異抗体−抗原結合に起因しな いことは起こり得ることであり、従って虚偽の陽性結果を生じる。

飼犬ば以前の報告（モッテ（Ｍｏｔｔｊ）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　１．　第１３８巻 （１９８７年）３３３２〜３３３８頁及びハーグレープ（Ｈａｒｇｒａｖｅ）等 、Ｅｘｐ、Ｅｙｅ　Ｒｅｓ、第４２巻（１９８６年１３６３〜３７３頁）はペプ チド阻害実験を用いて特定の抗原に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の正確 なエピトープ特異性を定量する免疫学的検定を記載している。しかしながら非特 異的結合（即ち一虚偽の陽性”）の測定を用い、ＭＡｂの抗原に対する結合特異 性を評価するためにエピトープ部位を含む特定のペプチドを使用することをこれ らの報告は開示しておらず示唆もない、従って見出される結合のエピトープ特異 性を測定することによってモノクローナル抗体免疫検定の能力を高めることがで きることは望ましいことである。このような定量は検定の感度を高めることにも 役立つ。

本発明はこの要求に向けられており、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ又は免疫組織化 学的染色のような実際上のいずれの免疫検定法にも適用できる０本方法は検定の 使用者が観察された結合の特異性を確かめることを可能にし。

エピトープをコードしているペプチドがわかっているモノクローナル抗体を使用 する免疫検定の能力を高める。

従って本発明は ａ）試験物質の１部分をまずモノクローナル抗体と接触させ、得られた混合液を 装置して抗体を試験物質に存在する有効な抗原に結合することを促進し、抗体の 試験物質に対する結合を試験し、 ｂ）抗体の試験物質のはじめの１部分に対する結合が示された場合には、予め抗 原における抗体エピトープをコードしているペプチドの、抗体のエピトープ結合 部位を実質的に全部ふさぐに十分な過剰量と装置したモノクローナル抗体と、試 験物質の第２部分を接触させ、得られた混合液を装置して抗体と試験物質の有す る有効な抗原との結合を促進し、抗体の試験物質に対する結合を試験し、 Ｃ）試験物質に対する抗体の結合１回目と２回目の結果を比較して抗体結合の特 異性を定量する段階を包含している、モノクローナル抗体の抗原に対する結合特 異性を定量するための免疫検定法を提供する。

本発明は特定の抗体／抗原系に関して記載されるが、以下の記述が幅広い応用を 持つ本発明の一般方法の範囲を限定するものではないことは理解されるべきであ る。

図１はクローンｐｃＨＰ１によってコードされたＰ−糖タンパク質の２１１アミ ノ酸残基ポリペプチドから誘導される２０５個のオーバーラツプするヘキサペプ チドの図式的説明である。また３つのグラフはＥＬＩＳＡによって発色させた、 Ｐ−糖タンパク質に対する３種の異なったモノクローナル抗体（Ｃ２１９，Ｃ４ ９４及びＣ３２）の存在下での種々のへキサペプチドの光学密度（吸光度）を表 わすものである。

図２はＰ−糖タンパク質（ハムスター１）ｇＰ２）上の、３種のモノクローナル 抗体Ｃ２１９、Ｃ４９４及びＣ３２のエピトープの位置を図式的に示す、また１ ２個の推定トランスメンブランドメイン番号１−６及び１”−６゛も示される。

提案された２つのＡＴＰ−結合ドメインＡ及びＢは斜線の四角で示される。３種 のモノクローナル抗体によって認識される位置とそのアミノ酸配列（エピトープ ）は矢印で示される。ペプチドの番号は図１のへキサペプチドに対応する。ＥＬ ＩＳＡからの吸光度シグナルは個々の抗体により最高吸光度を表わす５十の相対 値として示される。

図３はハムスター、ヒト及びマウスにおけるＰ−糖タンパク遺伝子ファミリーの 中でのＣ２１９、Ｃ４９４及びＣ３２結合可能配列の比較を示す８図２に示した Ｐ−糖タンパク質の縦列繰り返しくタンデムリピート）はＣ−及びＮ−末端ドメ インを意味する。ハムスター、ヒト及びマウスにおける異種遺伝子部分の可能な 抗体結合配列はハムスターの番号系に基づいて分類されている。括弧内の記号は 各々の遺伝子部分に与えられた呼称に対応する。各エピトープの太文字のアミノ 酸は抗体結合に重要な残基の位置を示す。

図４はペプチド類縁体の結合配列に対する抗体結合の比較を示す、Ｃ２１９、Ｃ ４９４及びＣ３２に対する異種ペプチド類縁体の結合を試験した。４０５〜６３ ００ｍの基質吸光度値は図２のように十記号に変換されている０文献に見られる 種の起源とＰ−糖タンパク遺伝子ファミリーの遺伝子部分は括弧内に示される。

太文字のアミノ酸は類縁体と抗体結合配列間で異なるアミノ酸を表わす。

図５８からｆはハムスターの正常組織に関してＰ−糖タンパク質イソ型（アイソ フオーム）のエピトープ特異的染色を示す０図５ａはＣ４９４ｍＡｂで染色した 上行性結腸を示し、図５ｂはペプチドＫＰＮＴＬＥＧＮＶＫＣの存在下での同一 系を示す。図５０はＣ３２ｍＡｂで染色した副腎を示し、ｅ５ｄはペプチドＧＤ ＮＳＲＶＶＳＱＤＥ　Ｉ　ＥＲＡＡＣの存在下での同一系を示す。図５ｅはＣ２ １９ｍＡｂで染色した胸壁の骨格筋を示し、図５ではペブｆ）’ＶＶＱＥＡＬＤ ＫＡＲＥＧＲＴＣの存在下での同一系を示す。

多剤耐性腫瘍細胞の悪性化進行中の発育は癌の化学療法治療において非応答の原 因となる主な要因であると考えられる。Ｗ４Ｐ−糖タンパク＊（相対質量、Ｍｒ 、１７０．０００）の発現の増加は試験管内において多剤耐性細胞に見出される 最も一致した変化であり、遺伝子トランスファーの研究によって多剤耐性（ＭＤ Ｒ）を引き起こすことが示されている。ｐ−ｍタンパク質（Ｐｇｐ）は１２個の 可能なトランスメンブランドメインを含むタンデムリピートと推定細胞質ＡＴＰ 結合部位から構成される（図２参照）、Ｐ−環タンパク質のエネルギー依存性汲 み出しポンプとしての役割は多くの膜結合輸送タンパク質、最も顕著には細菌輸 送タンパク質、溶血素Ｂにに対する一次配列との構造類似性から提示されている （ゲルラッハ（Ｇｅｒｌａｃｈ）、　Ｊ、Ｈ，等、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ） 第３２４巻４８５〜４８９　（１９８６年）、グロス（Ｇｒｏｓ）、Ｐｏ等、セ ル（Ｃｅｌｌ〕、第４７巻３７１〜３８ｏ頁（１９８６年）〕、Ｐ−糖タンパク 質の存在は種々のヒト悪性腫瘍において証明されている。しかしながら、Ｐ−環 タンパク質が化学療法に対する非応答を予言するものであるか否かは重要な問題 であり、更に関連の研究を必要とする（リング（Ｌｉｎｇ）、Ｖ、Ｊ、Ｎａｔ、 Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ。

第８１１！８４〜８５頁（１９８９年））、Ｐ−環タンパク質は大腸、副腎、腎 臓、肝臓及び脳を含む正常組織のいくつかにも見出される。異なる組織でＰｇｐ が発現することから、通常の解毒と親油性分子の輸送に役割を果たしているとい う推測が導かれている。

最近のデータは、　Ｐ−環タンパク質がげつ歯頚では３遺伝子フアミリー及びヒ トでは２遺伝子フアミリーによってコードされることを示している（Ｎｇ、Ｗ、 Ｆ、等Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、第９巻１２２４〜１２３２頁（１９８９年 ）、異なる遺伝子ファミリー即ちイソ型の間でアミノ酸配列を比較すると類似の 全体構造を示している（エンディコツト（Ｅｎｄｉｃｏｔｔ）、Ｊ。

Ａｏ等　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、第７巻４０７５〜４０８１頁（１９８７ 年））、シかしながら、全長ＣＤＮＡを用いるトランスフェクションの研究はＰ ｇｐイソ型のあるものだけが他の薬剤感受性細胞にＭＤＲ表現型を与えることを 示唆している。クラスＩ及びＩＩイソ型は薬剤耐性に直接関係しているがクラス ＩＩＩイソ型の機能はしられていない（上記Ｎｇ）。

ＰｇＰ発現の免疫組織化学的染色は１個の細胞の局在化と偏った分布の検出の利 点を有する。しかしながら。

今までに用いられたモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は分化遺伝子発現の問題に 向けることはできなかった０本発明に関して３種のＰ−糖タンパク質−特異的モ ツクローナル抗体のエピトープは１個のアミノ酸のレベルまで位置が決定してい る。モノクローナル抗体Ｃ４９４は遺伝子特異的であり、ハムスター及びヒトの クラスエイソ型にのみ存在する配列に結合する。モノクローナル抗体Ｃ３２はハ ムスタークラス■及びＩＩ型に保存されている配列を認識する。対照的にモノク ローナル抗体Ｃ２１９は今までに確認された全てのＰｇＰイソ型に見られる高度 に保存されたアミノ酸配列を認識する０本発明によれば免疫組織化学的研究にお けるこれらの抗体のエピトープ特異染色は特異的ペプチドとの競合により確認さ れた。このような試薬を用いてハムスター正常組織のＰｇｐ発現を試験すると結 腸上皮細胞は偏ってクラスエイソ型を主として発現し、副腎皮質細胞はクラスＩ Ｉイソ型を主として発現するが骨格筋繊維はわずかな％しかＰ−糖タンパク質、 クラスＩＩＩイソ型を発現しないことが見出された。この筋におけるイソ型の分 布は予期されず、以前には同定されていない筋繊維の特殊サブセットの存在を示 唆する。

エピトープ地図作成 ３種のモノクローナル抗体Ｃ２１９、Ｃ３２及びＣ４９４のエピトープ配列はゲ イセン（Ｇｅｙｓｅｎ）及び共同研究者らによって考案された合成的手法を用い て決定した（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ米国、第８１巻、３９９８ 〜４００２頁（１９８４年））、Ｃ−末端細胞質ドメインからの２１１全アミノ 酸断片にわたるオーバラップしたヘキサペプチド（すでに全３種のｍＡｂ結合部 位を含むことが示されている（リオーダン（Ｒｉｏｒｄａｎ）、Ｊ、Ｒ，等、ネ ーチャー第３１６巻、８１７〜８１９頁（１９８５年）））はポリプロピレンビ ンで合成した（材料及び方法参照）、各ビンは順次配列中に前の最後の５残基と 次のアミノ酸を含有した（ｌｌｉｉ！１２）、約２５０ペプチドのライブラリー を各モノクローナル抗体を用いてＥＬｒＳＡによりスクリーニングして結合配列 を決定した。Ｃ２１９ｍＡｂが２つのペプチド（１９８及び１９９）と反応し、 これらのペプチドだけが試験したペプチドから強いシグナルを生じた。モノクロ ーナル抗体Ｃ４９４は４連続ペプチドと反応してＣ２１９ｍＡｂより強いシグナ ルを得た。対照的に合成ヘキサペプチドに結合するＣ　３２　ｍ　Ａ　ｂでは２ 本以上のピークが現われた。抗体Ｃ３２のペプチド１１９、　Ｉ２０及び１２５ 〜１２９に対する結合は他の２つの抗体に見られるよりも弱いシグナルを生じた が再現性がありバックグラウンドレベル以上で有意であった。

図２に表示される結果は３種のモノクローナル抗体の、できた合成ペプチドに対 する結合として得られたＥＬＩＳＡシグナルの相対強度を示す。アミノ酸の枠を 移動させて連続的エピトープの境界を定義し、結合に決定的なアミノ酸のいくつ かを同定する。例えば抗体Ｃ２１９は抗原認識に必要な２つの決定的なアミノ酸 を表わすＶａ１５０６及びａ　ｓ　ｐ　”’を有するアミノ酸配列（１文字コー ド）ＶＱＥＡＬＤに強く結合した。Ｃ４９４ｍＡｂは決定的な残基としてｔ　ｈ 　ｒ　”３及びｇ　ｌ　ｕ　３２５を有するアミノ酸配列ＫＰＮＴＬＥＧＮＶを 含む４つのへキサペプチドに結合した。この検定を用いると結合する抗体に関係 するヘキサペプチドの数の差は所定の抗体によって認識されるエピトープの大き さと与えられたエピトープ中の決定的なアミノ酸間の残基の数（距離）に関係す るらしい、Ｃ３２ｍＡｂ結合ドメインはその結合第１ドメインのａ　Ｓｐ　４２ −７及びνａ１４３１及び第２ドメインのｇｌｕ４３６及びｇｌ　、　４３８の 、結合に関与する４個の重要なアミノ酸を含む１３個のアミノ酸（ＧＤＮＳＲＶ ＶＳＱＤＥＩＥＲ）のつながりをカバーする。

図１におけるＣ３２ｍＡｂに見られる弱いシグナルはエピトープのプローブに用 いられた合成へキサペプチドのサイズが小さいためであった。Ｃ４９４ｍＡｂで 観察されるものに匹敵するＥＬＩＳＡシグナルは、　１３個のアミノ酸（ＧＤＮ ＳＲＶＶＳＱＤＥＩＥＲ）（７）完全配列をビンで合成した場合Ｃ３２ｍＡｂに おいても得られた（結果は示されていない）。しかしながら、Ｃ２１９及びＣ４ ９４エピトープに対しては、ペプチド配列を同様に伸張してもシグナルの増大を 生じなかった。

モノクローナル抗体の遺伝子特異プローブとしての同定図１の抗原ペプチドのア ミノ酸配列を図２に示されるＰ−糖タンパク質の全構造に配置した。抗体Ｃ２１ ９は提示されたＡＴＰ結合ドメインのＢ位置の共通配列から６残基離れたアミノ 酸配列に結合する。Ｃ２１９部位ｂの相同アミノ酸配列はＰｇｌ）のＮ−末端側 の半分にも見られる。Ｃ４９４ｍＡｂによって認識されるエピトープはＣ２１９ に対してＡＴＰ結合ドメインの反対側にある。

Ｃ３２モノクローナル抗体は想定されたＡＴＰ結合ドメインＡ及びＢの間に位置 する領域に結合する。しかしながら、ｐｇｐのＮ−末端側の半分はＣ４９４又は Ｃ３２エピトープに相同な配列を含まない。

図３はハムスター、ヒト及びマウスから現在までに確認されたＰｇｐ遺伝子ファ ミリーの異なるメンバー間の抗体結合領域の比較を示す、Ｃ２１９部位は全Ｐｇ Ｐイソ型のＣ−及びＮ一端側半分の両方に保存される。Ｃ２１９エピトープ配列 が全ての哨乳類Ｐ−糖タンパク質に保存されるという知見は、細胞系及び腫瘍組 織におけるＰ−糖タンパク質のレベルを定量するための免疫学的プローブとして この抗体の有用性を示している。更にそのうえＣ２１９のエピトープがＰ−糖タ ンパク質分子の両半分、異なる遺伝子メンバー及び異なった種に見られることか ら、進化の歴史を通して保存されているに違いない、　Ｐ−糖タンパク質、特に ＡＴＰ結合ドメインに構造上非常に類似している細菌輸送タンパク質溶血素Ｂが この特定のエピトープを含まないことは興味深いことである。従ってＰ−糖タン パク質中のこのエピトープ配列はこれらの高度な相同タンパク質問の機能相違を 表わすことができる。

Ｃ４９４エピトープはヒト（ｍｄｒｌ）及びハムスター（ｐｇｐｌ）クラスＩ遺 伝子産物にのみ見られる。モノクローナル抗体Ｃ４９４は、他のＰｇｉ）イソ型 の類似配列では決定的なアミノ酸（ｔ　ｈ　ｒ　””）が置換されているため、 他のＰｇｐイソ型を認識しない、この知見は抗体Ｃ４９４の特異性を示し、クラ スエ遺伝子特異的プローブとしての用途を立証する。インビトロトランスフェク ション研究はヒトクラスエ遺伝子（ｍｄｒｌ）が種々の細胞にＭＤＲを与えるこ とができることを証明している。従ってＣ４９４抗体による陽性染色はヒト組織 においてＭＤＲ表現型を発現する細胞を診断することができ　る。

Ｐｇｐ遺伝子ファミリーの他のメンバーのＣ３２ｍＡｂ結合部位類似配列の比較 により、ハムスタークラスＩ及び１工分子がこのモノクローナル抗体に必要なア ミノ酸配列を有することが明らかである。この配列は決定的なアミノ酸（Ｖａ１ ４３εに対しｇｌ　Ｉ４３８）が今までに確認された他のＰ−糖タンパク質のも のと異なる６　従ってこの抗体は、ハムスタークラスエ及びＩＩイソ型に非常に 強く結合するが、ハムスタークラスＩＩＩイソ型及びヒト及びマウスのＰｇｐイ ソ型には弱くしか結合しないことが予想される。

図４は異なるｐｇｐイソ型からの類似ペプチド配列を用いて行われたＥＬ　Ｉ　 ＳＡ試験での相対シグナルを挙げる。Ｎ−末端側半分におけるＣ２１９ｍＡｂの ペプチド配列ＶＱＡＡＬＤに対する結合は１個のアミノ酸置換（ｇ１ｕ！、０８ がａｌａ置換）によりＣ−末端半分のエピトープ配列ＶＱＥＡＬＤに見られるよ りも強い、ヒトクラスＩ　ｐｇＰイソ型のＮ−末端側半分のｇｌｕ５０８をｖａ ｌに置き換えると抗体に対する結合が低下した（図４）、インビトロ発現系から 得られたＮ−末端側ＡＴＰ結合ドメインを含むタンパク質断片がＣ２１９抗体と 免疫沈降する能力（エンディコツト（Ｅｎｄｆｃｏｔｔ）、ジョージス（Ｇｅｏ ｒｇｅｓ）及びリング（Ｌｉｎｇ）の未発表の所見〕は合成ペプチドを用いて見 られる結果を更に確証する。

更に、Ｃ２１９エピトープ配列からスタートし順に各残基を他の１９個の遺伝的 にコードされたアミノ酸の１つで置き換えた一連の合成へキサペプチド類縁体を 用い、モノクローナル抗体Ｃ２１９の特異性を研究した（結果は他の所で詳述す る）、例えばＣ２１９エピトープ配列（ＶＱＥＡＬＤ）の３番目の位置は結合が 大して減ることな（ｖａｌ、ａｌａ又はａｓｐのような多くの置換を許容するこ とができると思われる。しかしながら、ｈｉ＄、　ｇｌｙ、　ｌｙｓ又はｐｒｏ のような他のアミノ酸による置換は抗体との結合が最小になるか又は全く結合し なくなる。Ｃ２１９エピトープ配列（ＶＱＥＡＬＤ）と類似のアミノ酸配列をシ ーンバンクデータベースにより探求すると、　ミオシン重鎮（ラット心筋）中に アミノ酸配列ＶＱＨＥＬＤが及びＤＮＡポリメラーゼ（バクテリオファージＴ４ ）中に配列ＶＱＥＡＬＥが存在することを示した。これらの配列はこのようなア ミノ酸置換は抗体に結合するペプチドとはならず、抗体Ｃ２１９によって認識さ れない０分子量標ｒｓ（アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））ミックスで用いら れるミオシン重鎮タンパク質はウェスタンプロット分析によりＣ２１９ｍＡｂで 染色されなかった。

Ｃ４９４エピトープのペプチド類似体結合のＥＬＩＳへの結果から、決定的なア ミノ酸（ｔ　ｈ　ｒ　”３）がクラスＩＩハムスター（ｐｇｐ２）ではｔｒｐに 、クラス　ＩＩＩハムスター（ｐｇｐ３）及びヒト（ｍｄｒ３）ではＩｙＳに置 換されると抗体認識が完全に消失することを示した。これらの結果はモノクロー ナル抗体Ｃ４９４がヒト（ｍｄｒｌ）及びハムスター（ｐｇｐｌ）Ｐ−糖タンパ ク質エイソ型の発現に特異的な免疫学的プローブであることを確証する（図４） 、Ｃ３２ｍＡｂ結合ドメインの部分的類似体が同じ抗体結合ドメインの残りがＰ ｇｐ遺伝子ファミリーの異なるメンバーに保存されていることから合成された。

図４で表示した値はＣ３２ｍＡｂのこのペプチドに対する結合に関する１個の決 定的なアミノ酸置換の効果を示す（例えば１ｇ１ｕ４３８をｖａｌで置換したも のは抗体を結合しない）、従ってモノクローナル抗体Ｃ３２はハムスター正常組 織及び■■産物に最も強く他のｐｇｐイソ型に非常に弱く結合することになる。

上記の結論と一致して前述の結果はハムスターＰ−糖タンパク質がウェスタンプ ロット法を用いてマウス及びヒトよりＣ３２ｍＡｂに強（結合することを証明し ている。

免疫組織化学的染色 ハムスター正常組織の免疫組織化学研究を行い、各組織の連続切片を３種のｍＡ ｂの各々と、各々のエピトープ配列を含むペプチドの存在下あるいは非存在下で 装置した。ｐｇｐに対するモノクローナル抗体による特異染色は、　１００倍モ ル過剰量の抗体エピトープを含むペプチドと競合して完全に消失することができ る染色として定義した。この方法はエピトープ特異的染色を陽性に検出すること を可能にし、ネガティブコントロールとして一無関係”な抗体を用いる通常の免 疫組織化学的染色とは著しく異なる。

全３種の抗体による非競合性がしばしば見出された。

特にこれには精嚢の上皮細胞の強い膜染色、結腸上皮細胞の明瞭な染色及び肝細 胞の細胞質内染色が含まれる。

このような染色はバラトープドメインを含む以外の領域を介して抗体と非特異的 相互作用することによるらしい。

従って競合検定におけるペプチドの使用が免疫ＭＡ＊化学方法の特異性及び感度 を高めることになることは明白である。

エピトープのマツピング研究は、　３種のハムスターＰｇｐイソ型の各々の発現 からｍ　Ａ　ｂパネルとの反応性に３種の異なったパターンが生じることを予想 させる（表Ｉ）、Ｃ４９４ｍＡｂ単独（図５ａ）及びＣ４９４ｍＡｂエピトープ を含むペプチド存在下での腸組織切片の染色は結腸上皮細胞のルミナール面に遊 離ペプチドを添加した場合消失する強いシグナルを示した。同様の染色はＣ２１ ９及びＣ３２ｍＡｂに見出される（結果は示されていない）、この染色パターン はＰｇｐｌイソ型の優位発現と一致する（表工参照）、免疫組織化学的染色はク ラスｒイン型が結腸上皮細胞膜に偏った分布を有することを示す、このＰｇｌ） イソ型発現のパターンは恐らく毒性分子の能動的排出のための膜輸送機能と一致 する。

表　１ ＰｇＰイソ型のエピトープ分布 Ｐ−糖タンパク質イソ型　エピトープ クラス　Ｃ２１９ｍＡｂ　Ｃ３２ｍＡｂ　Ｃ４９４ｍＡｂＩＩＩ　（ハムスター Ｐｇｐ３１　＋　−１１１（ヒトｍｄｒ３１＋−− 第５Ｃ図及び第５ｄ図は各々エピトープの非存在下、存在下での副腎組織切片の Ｃ３２ｍＡｂによる染色を示す。副腎皮質細胞の細胞膜はＣ３２及びＣ２１９ｍ Ａｂのみで染色され、クラスＩＩＰ　ｇ　Ｐイソ型の優位発現を示す（表■参照 〕、副腎にＳ＋ブるＰ−糖タンパク質発現に関する以前の報告では、Ｐｇｐがコ ルチコステロイドの輸送に関係する可能性が高くなった。この研究ではステロイ ド産生束状帯及び網状帯におけるＰｇｌ）の検出は上記仮説と一致する。しかし ながらステロイド系を産生ずることも知られている糸球体帯の皮質細胞はＰ−糖 タンパク質の検出可能レベルを表わさずこれはＰｇｌ）がステロイド系を分泌す るための一般機序ではなく、特殊皮質細胞の分化の標識であることを示唆する。

ここで記載した免疫組織化学的手法は半定量的であることから、クラスＩパター ンの染色を示す組織が非常に低いレベルの他の２つのイソ型を発現する場合に定 量することは不可能であった。同様にクラスＩＩ染色パターンを示す組織はクラ スＩＩＩイソ型を低レベルで発現している可能性もある。

ハムスター骨格筋の連続切片をＣ２１９ｍＡｂと製置しく図５ｅ）、約５％の筋 繊維が染色された。これらの染色シグナルはＣ２１９ｍＡｂエピトープを含有す るペプチドの存在下で完全に消失した（図５ｆ）、骨格筋のＣ３２又はＣ４９４ による染色はエピトープ特異染色を示さなかった。この染色パターンはクラスＴ ＩＩイソ型発現だけに特異的である（表Ｉ）、クラスＩＩＩイソ型の発現はマウ ス筋組織のノーザンプロット分析（ｍ　ｄ　ｒ　２陽性）及びヒト筋組織のウェ スタンプロット分析（Ｃ２１９陽性及びＣ４９４陰性）で以前に見出されている 。しかしながらクラスＩＩＩイソ型の発現がここで示されるように筋繊維のサブ セットに局在することはこれらの研究では定量することができなかった０種々の 場所（胸壁、を量弁、横隔膜、腿及び前腹壁）からの骨格筋は２種の異なったタ イプの繊維を示し、繊維の大部分は検出量のＰｇＰは存在しないが繊維の１０％ 以下は高レベルのクラスＩＩＩイソ型を発現する。イソ型の筋繊維内の分布は原 形質膜染色のパッチ領域に加え、かなり規則的な粗い横組パターンをとる。Ｐｇ ｐを骨格筋繊維の細胞下構造での存在場所を特定するには超微細構造の研究が必 要となるが、それは膜成分例えばＴ膜成分のようである。クラスＩＩＩイソ型が 筋繊維のサブセットにのみ発現する知見は意外であった。クラスＩＩＩＰｇｌ） イソ型を発現する筋繊維が以前には認識されなかった特殊機能を行なうことは推 測できる。例えばある骨格筋繊維の複合膜系を越えて代謝物質のエネルギー依存 性輸送に関係しているかも知れない。

検討： ヘキサペプチドを用いる競合実験によりＰ−糖タンパク質に対する３種の異なっ たモノクローナル抗体のエピトープを正確に位置決定した。モノクローナル抗体 は、各々数残基はなれて位置する重要なアミノ酸からなる“連続したーエピトー プに結合することを示した。これらの全てのエピトープがこのタイプを有する事 実はこれらの抗体の最初のスクリーニングによるものである（ドツトプロットア ッセイにおけるＳＤＳ変性タンパク質）。

しかしながら、これらの全てのｍＡｂはＰ−糖タンパク質の未変性体に結合する ことができる。このマツピング手法はこの方法で得られた他のｍＡｂのエピトー プを定義するのに適用できると思われる。

正常組織及び細胞系におけるＰ−糖タンパク質の発現は種々の生物化学手法を用 いて分析されている。組織の免疫組織化学的染色は偏った発現を検、出する利点 並びに正常及び腫瘍両細胞を含有する組織切片中のＰ−糖タンパク質を同時に可 視化できる利点を有する。しかしながら、いずれの免疫組織化学的検出検定にお いても高レベルの染色特異性は感度を高める努力と妥協しなければならない。こ の研究では高レベルの染色特異性及び感度は競合免疫組織化学的検定においてモ ノクローナル抗体とエピトープ特異的ペプチドとの併用により達成されている０ 例えば前で指摘した通り非競合性染色が多くの組織にしばしば見出され、これは 非特異的相互作用によるものと推測された。筋組織において筋繊維のサブセット のＣ２１９ｍＡｂによる染色は予期されず、これははじめにはｍＡｂのミオシン による交差反応性によるものと推測された（チーバウト（Ｔｈ１ｅｂａｕｔ）　 、　Ｆ、等、Ｊ、　Ｈｉｓｔｏ。

＆　Ｃｙｔｏ、第３７巻、１５９〜１６４頁（１９８９年））。

しかしながら、本研究ではエピトープ特異的ペプチドを競合免疫組織化学的分析 に用い、この染色が筋繊維のサブセットにクラスＩＩＩ　Ｐ　ｇ　Ｐイソ型が存 在することによると考えられることを示した。正常組織及び腫瘍試料におけるＰ −糖タンパク質発現の免疫組織化学的研究は以前からこの膜糖タンパク質の細胞 局在化を洞察していたが、　Ｐｇｐイソ型の何クラスがタンパク質レベルで発現 するかを区別することは可能ではなかった。ここで述べたエピトープマツピング 研究の結果は、Ｃ２１９、Ｃ３２及びＣ４９４で表わされるｍ　Ａ　ｂの３クラ スを正常及び腫瘍組織におけるＰｇＰイソ型の発現のパターンを決定するために 組合わせて使用することができることを示唆する。これはＰ−糖タンパク質と癌 化学療法に対する患者の応答との相関を調査するための研究に応用することがで きる。

材料及び方法 誘導体化したプラスチックビン及びポリプロピレントレーをケンブリッジリサー チバイオケミカルス（バレーストリーム、Ｎ、Ｙ、）から入手した。　Ｆｍｏｃ アミノ酸の活性エステルをミリケン（ミリポ乙　ベッドフォード、ＭＡ）から入 手した。ガラス蒸留ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）をアナケミア（モントリオ ール）から購入し、４Ａモレキユラーシーブ上で４℃において２〜３週間保持し た。アミン含有量をジニトロフルオロベンゼン検定によってモニターした。試薬 ブランクに比較した場合３８１ｎｍの吸光度０．１０以下を示すＤＭＦのみを合 成に使用した。試薬グレードジクロロメタン（ＤＣＭ）及びメタノール（ＭｅＯ Ｈ）をＢＤＨケミカルス（モントリオール）から購入し精製せずに用いた。他の 供給者は次の通りである：フィッシャーサイエンティフィク（トロント、オンタ リオ）からピペリジン、　アブライドバイオシステムス（フォスターシティ−１ Ａ）からＰＡＭ樹脂、　ＩＡＦバイオケミカルス（モントリオール、ケベック） からＢＯＣアミノ酸、アルドリッチケミカル社（ミルつオーキー、ＷＩ）からジ シクロヘキシルカルボジイミド （サウスブレーンフィールド、ＮＪ）から一連のグレードトリフルオロ酢酸（Ｔ ＦＡ）及びジイソプロピルエチルア　ミ　ン。

プラスチックビンによる固相ペプチド合成オーバラップしたヘキサペプチドを前 述のポリエチレンビンで合成した（ゲイセン、Ｈ．　Ｍ．　等（前出））。

ペプチドをビンで９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護ア ミノ酸を用いてＣからＮ末端方向に構築した。簡単に言えばプラスチックビンを 各々のビンの先端が９６ウエルボリブロビレンプレートの個々のウェルに浸漬す るのに適したパターンでポリプロピレンブロック支持体上に配列した。ビンをＦ ｍｏｃ−ｂ−アラニン基で終わる非脱離性の１５原子長鎖スペーサーで誘導体化 した。合成の全工程を室温で行なった。ビンブロックを居初に２０％（ｖ／Ｖ） ピペリジン／ＤＭＦ浴に３０分間浸漬してＦｍｏｃ基を除去し遊離末端アミノ基 を生成した。次いでビンを次の工程で循環させた・ＤＭＦ洗浄（２回、２分）、 メタノール洗浄（３回、２分）、ビンを１５分間風乾、ＤＭＦに浸漬（５分）、 ティッシュペーパーでゆるやかに液を吸い取った。次いで既製のＦｍｏｃアミノ 酸の活性エステル（セリン及びトレオニンはオキソベンゾトリアジン、他の全て のアミノ酸はペンタフルオロフェニルエステル）（３０ｍＭ）を１−ヒドロキシ ベンゾトリアゾールを含有するＤＭＦ（３０ｍＭ）に溶解した．次いで溶液を９ ６ウエルボリブロビレンプレートの適当なウェルに直ちに分配した。

ビンの先端を各ウェルに置くことによってカップリング工程を開始した。ビンブ ロックとポ１ノプロピレンプレートをプラスチックトレーに注意して入れて密封 し、カップリング反応を一晩進行させておいた。次いでＦｍｏｃ脱保護及び次の 工程を全てのへキサペプチドが完了するまで繰り返した．完全ペプチドの最終Ｆ ｍｏｃ基を上述の通り除去し、得られた遊離アミノ基をアセチル化した（ＤＭＦ ＋酢酸無水物ニジイソプロピルエチルアミン５０　：　５　：　１　（ｖ／ｖ／ ｖ）、９０分）、ビンをトリ２ルオロ酢酸：フェノール：エタンジチオール９５ ：２．５＋２．５（ｖ／ｖ／ｖ）に４時間浸漬することによって全ペプチドの側 鎖保護基を同時に切断した．ビンを連続的にジクロロメタン（２分、２回）で洗 浄、５％ＤＩＥＡ／ＤＣＭ　（５分、　２回）で中和，ジクロロメタンで１回洗 浄（５分）、風乾１５分）、水で２分間湿らせメタノールに一晩浸漬した。　残 りの微量溶媒を真空下で蒸発させ、ブロックを乾燥剤の存在下室温でプラスチッ ク容器に貯蔵した．アミノ酸分析を１０個のビンについて行なった。ビン１個に 対するペプチド置換は２〜４ナノモル値の範囲にある。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡ 固体支持体ポリプロピレンビンに結合したペプチドをリン酸緩衝食塩水ｐＨ７． ４（ＰＢＳ）中で室温において３０分間温浸した。次いでビンを阻止緩衝液（Ｐ ＢＳ中１％Ｗ　／　Ｖオボアルブミン、　１％Ｗ　／　Ｖウシ血清アルブミン（ ＢＳＡ）、　０．１％ｖ／ｖトウィーン）に１時間浸漬して抗体の非特異的吸着 を減少させた。また９６ウエルＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートのウェルをＰＢＳに溶解 した遊離ペプチドの溶液で被覆した。プレートを室温で一晩装置し．ＰＢＳで１ 回洗浄した。全ての未反応部位を３％ＢＳＡ溶液で遮断した．ビンを一次抗体溶 液（被覆緩衝液に溶解した０．　５〜２．０Ｍｇ／ｍ　ｌ　）を含有するウェル 中で４℃において一晩装置した。パーオキシダーゼ複合ヤギ抗マウス抗体と１時 間温置した後、　ビンを０。

０５％（ｖ／ｖ））ウィーン２０を含有するＰＢＳ溶液で４回洗浄した．ビンを １Ｍクエン酸中アジノージ−３−エチルベンズチアジンスルホネート（ＡＢＴＳ ）の新しく調製した溶液ｐＨ４．０と３０分間温浸しることによって抗体のペプ チドに対する結合を検出した。発色の測定はミクロプレートリーダー（ＥＬ３０ バイオチック機器）を用いて４０５〜６３０ｎｍで行なった。ビンを１％硫酸ド デシルナトリウム（ＳＤＳ）と０．１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノールを 含有する０．１Ｍ　Ｉ／ン酸ナナトリウム溶液中６５℃において３０分間音波処 理してビンに結合した抗体を固体支持体がら取り除いた。ビンを加温蒸留水（５ ０〜６０℃）ですすぎ、最後に煮沸メタノールで洗浄した。

免疫組織化学的染色 正常な成体チャイニーズハムスターを二酸化炭素箱で殺した。殺してから１時間 以内に臓器と組織を４℃で取り出し、　ドライアイスで冷却したインペンタン中 で凍結した．凍結切片（８μｍ）を切り出し冷却アセトン（４℃で１０分）で固 定し、次いでアビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ複合体手法を用いてＰｇｐ を染色した。

−次抗体（Ｃ２１９、Ｃ３２又ハＣ　４　９　４　）を１％ＢＳＡ／Ｐ　Ｂ　Ｓ 中ｌＯμｇ　／　ｍ　１で使用した．組織切片を一次抗体と温置する１時間前に 抗体溶液を１０倍モル過剰量の抗体エビローブをコードしているペプチドあるい は無関係なペプチドと前部室した．この十分な過剰量のペプチドは競合結合検定 に基づいており，この検定はニトロセルロースフィルターに固定したＰｇｌ）を ｍＡｂエピトープをコードしているペプチドあるいは無関係ベブチドが段階的濃 度で存在する状態で各ｍ　Ａ　ｂと反応させた。

−次抗体とペプチド及び組織中に存在するＰｇＰとの競合結合を加湿室において 室温で１時間進行させた。切片をＰＢＳで洗浄し、製造業者の指示書に従ってビ オチン化ウマ−抗マウス抗体及びアビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ複合体 （ベクターラボラトリーズ、バーリンガム、ＣＡ）と連続して装置した。抗体の 組織に対する結合は３．３゛　−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（１ ｍ　ｇ　／　ｍ　１、シグマ）及び過酸化水素（０，００３％）と５分装置して 検出した０組織をヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、バーマウントに取付け た。

図１ Ｃ２１９ｍＡｂ　５＞、Ｅ＠３’ｊ クフ又　烏　エエ、エエエ　ＶＶＱＥＡＬＤ　＋＋Ｃ４９４ｍＡｂ　ｎ＠＆７’ ｊ Ｃ３２ｍＡｂ　長Ｇ暑’Ｃ，−プ゛」 図４ 図５５ 図５Ｃ 図５ｄ 図５ｅ 図５ｆ 国際調査報告 ””””””＝””””ＰＣＴ／ＣＡ９０１００１７９１＋＋Ｉｌ＋Ｍ＋＋＊ａ ＋−Ａｓ−−自一一「１ｍｈＩＩＬｐＣＴ／ＣＡ９０１０Ｏ１７９ＳＡ　３７３ ４２

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．抗体のエピトープが１個のアミノ酸レベルまで位置決定され、抗体の結合に 決定的なアミノ酸とこのようなアミノ酸の正しい配列が決定されている、モノク ローナル抗体の抗原に対する結合特異性を定量するための免疫検定法であって； 試験物質の第１部分をモノクローナル抗体と接触させ、得られた混合液を温置し て抗体が試験物質が有する有効な抗原に対して結合することを促進し、抗体の試 験物質に対する結合を試験し、 抗体の試験物質の第１部分に対する結合が示される場合には、試験物質の第２部 分を、正しい配列で抗体の結合に決定的なアミノ酸を有する抗原として位置決定 された抗体エピトープをコードしているペプチドの少なくとも過剰量と前温置し たモノクローナル抗体と接触させ、該過剰量がエピトープの実質的に全抗体結合 部位を十分占有する量であり、得られた混合液を温置して抗体と試験物質が有す る有効な抗原との結合を促進し、抗体の試験物質に対する結合を試験し、 抗体の試験物質の第１及び第２部分に対する結合の結果を比較して抗体結合の特 異性を定量することを特徴とするイムノアッセイ法。
2. ２．免疫検定がＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ又は免疫組織化学的染色である請求項１記載 の免疫検定法。
3. ３．モノクローナル抗体がＰ−糖タンパク質に対して特異的である請求項１記載 の免疫検定法。
4. ４．モノクローナル抗体がＣ２１９、Ｃ４９４又はＣ３２である請求項３記載の 免疫検定法。
5. ５．免疫検定が免疫組織化学的染色である請求項３記載の免疫検定法。
6. ６．モノクローナル抗体がＣ２１９であり、抗体エピトープをコードしているペ プチドが配列ＶＱＥＡＬＤを包含している請求項３記載の免疫方法。
7. ７．モノクローナル抗体がＣ４９４であり、抗体エピトープをコードしているペ プチドが配列ＮＴＬＥＧを包含している請求項３記載の免疫方法。
8. ８．モノクローナル抗体がＣ３２であり、抗体エピトープをコードしているペプ チドが配列ＧＤＮＳＲＶＶＳＱＤＥＩＥを包含している請求項３記載の免疫検定 法。