JPH04505853A - 触媒抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 触　媒　抗　体 本発明は触媒抗体に関するものである。触媒は化学反応を促進するが、それ自体 永久的化学変化を進行しない。触媒は反応の活性化エネルギーを低下させること により、化学反応の促進を達成する。

酵素は蛋白質よりなる触媒であり、生体細胞により生成される。

酵素は基質に結合し、それらの化学反応を触媒する。１９４８年、ポーリング（ Ｐａｕｌｉｎｇ、）　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｓｔ：１９４８；３ ６　５１〜５８）は、結合部位の表面配置か反応物又は生成物に相補的でなく、 むしろ一時的な存在で、反応経路に不安定な種に、相補的であるので、酵素が反 応を触媒できると示唆した。彼はこの一時的な種を、反応の活性化複合体とした が、現在一般にこの種は遷移状態と呼ばれている。１９６９年に、ジエンクス（ Ｊｅｎｃｋｓ）　（Ｃａｔａｌｙｓｊｓ　ｉｎ　Ｃｈｅ＋＋＋１ｓｔｒｙ　ａｎ ｄ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：１９６９　；　ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、　ｐ。

２８８）は、若し酵素活性部位と遷移状態の間の相補性が触媒作用用に貢献する なら、そのような結合部位を組立てることにより、触媒をえることが可能である べきであると提案した。更に、特定の抗体が、殆んどいかなる有機分子（ハブテ ン（ｈａｐｔｅｎ）に対しても、生じえることが知られている（Ｌａｎｄｓｔｅ ｉｅｎｅｒ　：　’ゴｈｅ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｅｒｏｌｏｇｉ ｃａｌ　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ”　；　１９４７．　Ｈａｒｖａｒｄ　Ｕｎｉｖｅ ｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ）ので、彼は、そのような触媒の結合部位がハブテンに対 する抗体を生じさせることによりえられえると提案した。ハブテンは化学反応の 遷移状態に類似している。こ−で、そのようなハブテンは、遷移状態類似物と呼 ばれている。これら（Ｒａｓｏ　ａｎｄＳｔｏｌｌａｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ　：　１９７５　：　１４．５９１〜５９９　）及び他（Ｒｏｙｅｒ。

Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｃａｔａｌｙｓｉｓ　＋　１９８０　：　２９．　ｐ 、２３３　）の方法によるポリクロン（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）触媒抗体をえる 最初の試みは成功しなかった。

抗体は、あるヘプテンと化学量論的に反応すると報じられている。（Ｋｏｈｅｎ 、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ：　１９８０　：　１１１．４２７）　。これら の抗体は、遷移状態類物に対して生じさせられない。それらは反応物に対して生 じさせられていると考えられ、それら結合部位に運よく密接に位置した親核的残 金を通して反応すると推定されている。

単一クロン触媒抗体の生成は、同時に２つの群により、１９８８年に記載された 。リーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）による１群は、ホスホネート（ｐｈｏｓｐｈｏｎａ ｔｅ）遷移状態類似物に対する抗体を生じさせることによりエステル加水分解を 触媒した単一クロン抗体を製造した。

（Ｌｅｒｎｅｒ、　５ｃｉｅｎｃｅ：　１９８６　：　２３４．１５７０〜１５ ７３）　ａこの研究を記している特許及び出願は、公告されている（１９８７． 　ＵＳ　４６５９５６７及び１９８８．　ＥＰ−Ａ−０２６０９３９”）。又、 この研究の記載は、ポリクロン抗体にも関連しているが、実際の実験例は記載さ れていない。

シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｘ）による他の群は、リン酸エステル遷移状態に結合し た単一クロン抗体による炭酸エステル加水分解の触媒作用を記した（Ｔｈｕｌｔ ｚ、　５ｃｉｅｎｃｅ　＋　１９８６　；　２３４．１５７０−１５７３）、こ の例において、単一クロン抗体は、合成免疫原を経て生成されなかったが、ある リン酸エステル化合物に結合すると１９７１年初めて記された骨髄腫蛋白質（癌 の生成物）であった（Ｌｅｏｎ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋１ｓｔｒｙ　：　１９７ １　：　１０．１４２４）　ｏシユルツが炭酸エステル加水分解を触媒するため 単一クロン抗体をデザインし、製造したとき、彼は、リーナーの群がしたように 、合成ホスホネート遷移状態類似物を使用した（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、 　：　１９８７　：　１０９　、２１７４）　、又シュルツは、ポリクロン触媒 抗体を発生することができなかったと記している（Ｓｃｉｅｎｃｅ　：　１９８ ８　：　２４０　ｐ、４２８）。

現在、数種の単一クロン抗体が、加水分解又は他のアシル転移反応を触媒すると 述べられている（Ｓｃｉｅｎｃｅ　：１９８８　；　２４ｉ　ｐ、１１８８及び それに記された文献）。それらの全てはホスホネート遷移状態類似物に対して生 じさせられている。ポリクロン触媒抗体の製造に成功した群は、いまだ論証され ていない。シュルツ及びその他による論が、上に記されている。一つの群（Ｇｒ ｅｅｎら、Ｊ、　Ｃ，Ｓ。

Ｃｈａｍ、　’Ｃｏｍｍ、　：　１９８８．１０６　）は、光化学反応において 型として作用し、生成物分配に影響しているポリクロン抗体調合剤を記した。

然しなから、それらの抗体は、遷移状態に対して生じさせられなかったが、反応 生成物に対して生じさせられた。更に、触媒作用は主張されなかったそして反応 は速度的に解析されなかった。他の群（ｒｇｅｎ　Ｉｎｃ、、　１９８５．　Ｗ ｏ　８５１０２４１４）は、単一クロン触媒抗体が、反応物、反応中間体、又は 反応物類似物、生成物又は反応中間体により誘導できると主張した。然しなから 、この特許に与えられたデーターは、ポリクロン抗血清に関連し、遷移状態類似 物に対し生じさせられなかった。代りに、これらの抗血清は、反応物及び生成物 類似物との免疫によりえられた。大変濃縮された抗体調整物が、化学反応をもた らすため使用された。触媒作用が主張されたけれども、速度論解析により論証さ れなかった。特に、存在するデーターは、触媒作用又はコーン（Ｋｏｈｅｎ）に より以前に記されたことに類似である化学量論的反応の間を区別していない。

単一クロン触媒抗体の使用は、単一クロン抗体の製造が、癌細胞の使用にともな われる安全性疑問とともに、ねずみ骨髄腫細胞のような癌細胞の使用を含むとい う不利を有している。遷移状態類似物に対して生じたポリクロン触媒抗体を使用 することは利点があるであろう。これらは単一クロン抗体の使用のように、単一 クロン抗体にともなわれる安全性に関するような疑問をもたないからである。又 ポリクロン抗体の製造は、単一クロン抗体の製造より単純で廉価である。

現発明の第一の様相により、ポリクロン触媒抗体が提供されている。好ましくは 、これらポリクロン抗体は一般式Ｉのリン酸エステルに対し生じさせられている 。

ニーでＲ及びＲ１の各々は共に、一般式Ｉのリン酸エステルに免疫原性を与える 基を示している。更に好ましくは、これらのポリクロン抗体は、炭酸エステルの 加水分解作用を触媒できる。

Ｒ及びＲ１加水分解することが望まれている炭酸エステルに類似であるよう選択 されるであろう。

Ｒ及びＲ１のいずれか又は両者は、別々に或は共に、免疫原の一部を包含してい る。Ｒ及びＲ’の１つが免疫原の一部であるとき、他は免疫原の一部でないであ ろう。免疫原の部分は一般式■のリン酸エステルに免疫原性を与える部分である 。

Ｒ及び／又はＲ１は、ヒドロカルビル（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｙ　ｌ）基を包含す る。それは任意に置換されており、免疫原部分自身、リン酸エステル基と免疫原 部分との間の結合であろう。或はＲ及びＲ’のいずれか１つは、免疫原でないヒ ドロカルビル基を包含するであろう。例えば、任意の置換基は、ハロゲン原子（ 特にフッ素、塩素及び臭素原子）及びＣ，−Ｃ，アルコキシ、Ｃｘ−Ｃｓアルカ ノイル、ニトロ、アミノ、モノ又はジー（ＣＩ−、）アルキルアミノ、ヒドロキ シ或はトリフルオロメチル基から選ばれるであろう。

ヒドロカルビル基は、好ましくはＣＩ　Ｃｔ。アルキル基、更に好ましくはＣ， −Ｃ，アルキル基である。或はアリール又はアルキルアリール基、更に好ましく はＣ０−Ｃ，アルキルＣ１又はＣ１゜アリールグループ、特にフェニル基、ベン ジル基又はナフチル基である。ある実施態様において、ヒドロカルビル基はニト ロフェノール基又は他の効果的なヘプテンを包含することが好ましい。一般式Ｉ のリン酸エステルの免疫原性を増加するであろうからであろう。

Ｒ及び／又はＲ１の１つ又は両者は、中位の大きさのリング（ｒｉｎｇ）、例え ばアリール基、アリールアルキル基（ベンジルのような）、シクロアルキル（シ クロヘキシルのような）又は複素環リング（それらのリングのいずれもが任意に 上記のように置換されるであろう）を包含するであろう。こ＼でリングは、（ｉ ）　分子に剛性の度合を与え、 （ｉｉ）　抗体二基質認知及び抗体二基質相互作用における結合に１つ以上の重 要な特徴を提供している。

抗体二基質認知及び相互作用のため、剛性又は特徴の重要性のいずれかを量化す ることは可能ではないけれとも、当業者はそのような基をしばしば５０〜４００ の範囲で分子量を育する（しかし必然的でない）と認識するであろう。当業者が 認識するであろうように、基が小さくなると、抗体二基質認知及び相互作用のた めの重要な特徴を与えるため、更に剛性で電子にとむことが要求される。

ある実施態様において、免疫原の部分はアミド基、ジアゾ基、ジ−サルフィド基 又はイミン基により結合されている。

特に好ましいリン酸エステルは式■及び式■により示される。

こ−にＫＬＨはかぎ穴に入るヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔｈａ ｅｍｏｃｙａｎ　ｉｎ）を示している。

ある実施態様において、免疫原部分は、例えば、かぎ穴に入るヘモシアニン（Ｋ ＬＨ）のような蛋白質担体、エデスチン（ｅｄｅｓｔｉｎ）、チログロブリン（ ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、人血清アルブミ ン（Ｈ３Ａ）のようなアルブミンを含んでいる。特に、免疫原部分がかぎ穴に入 るヘモシアニン（ＫＬＨ）を含むことが好まれる。

本発明の第２の様相により、一般式Ｉのリン酸エステルを提供されている。

ニーてＲ及びＲ１の各々は、一般式Ｉのリン酸エステルに免疫原性を与える基を 示し、炭酸エステルの加水分解を触媒できる抗リン酸エステル抗体が生しさせら れえることに対抗している。

第２の様相の好ましい特徴は、第１の様相のためのようなものである。

本発明の第３の様々により、一般式１のリン酸エステルへの前駆物質を提供され ている。その前駆物質は、一般式■により示されこ＼で、Ｒ２及びＲ３は夫々ヒ ドロカルビル基を示し、それは、前駆物質が免疫原部分に結合されるとき、式Ｉ のリン酸エステルが生成されるであろうように任意に置換されている。

Ｒ２及びＲ２において、ヒドロカルビル基は独立に、好ましくはＣ，−Ｃ２゜ア ルキル基、更に好ましくは、Ｃ１−、アルキル基：又はアリール或はアルキルア リール基、更に好ましくはＣ，−Ｃ，アルキルＣ６又はＣ＋ｏアリール基、特に フェニル基、ベンジル基又はナフチル基である。ある実施態様で、ヒドロカルビ ル基はニトロフェノール基、或は他の効果的なハブテンを含むことが好まれる。

例えば、任意の置換基はハロゲン原子（特にフッ素、塩素及び臭素原子）及びＣ ，−Ｃ，アルコキシ、Ｃ＝　Ｃｓアルカノイル、カルボキン、アルキルカルボキ シ、ニトロ、アミノ、モノ又はジー（Ｃ。

−４）アルキルアミノ、ヒドロキシ又はトリフルオロメチル基から選ばれるであ ろう。

置換基Ｒ３及びＲ４のいずれか又は両者は、一般式■のリン酸エステルを免疫原 部に結合することを容易にする結合部を含むであろう。例えば、その様な結合部 は蛋白質又は他の免疫原部と直接共有結合或は他の結合を生成しうるであろう、 或は適切な結合を生成するよう一つ又は他の種と反応しえるであろう。

特に好ましい前駆物質は４−ニトロフェニル４′−カルボキシメチルフェニルリ ン酸リスチルである。

ヘプテンに対するポリクロン抗体生成の方法は、当業者に周知である。例えば、 羊、兎、ヤギ、或はいずれか別の適当な動物が、ある期間免疫原リン酸リスチル で皮下的に免疫にされるであろう。

後に動物は血をとられ、血清が分離され、抗体が単離される。

本発明の第３の様相による前駆物質は、抗体結合の検出ができるように、標識で 標識づけられえる。これはチェ・ツクされる第１の様式による抗体の特異性に能 力を授ける。

このようにして、本発明の第４の様相により、一般式■のリン酸エステルを与え られる。

こ＼で、Ｒ４及びＲ５は、夫々ヒドロカルビル基好ましくはＲ２及びＲ３に定義 されたものに対応しているヒドロカルビル基を含んでいる。Ｒ４及びＲ５のいず れか又は両者は、抗体結合の検出かできる標識を含んでいる。例えば、標識はフ ルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ　ｉｎ）のような蛍光を発する標識であろう 、或は抗体に結合されたとき、一般式■のリン酸エステルの選択的検出を可能に する他の標識であろう。

本発明の第１の様相において記したように、好ましい特徴において一般式■のリ ン酸エステルは、一般式Ｉのリン酸エステルの免疫原性を増加するため、ニトロ フェノール基或は他の効果的なハプテンを含んでいる。標識としてニトロフェノ ール又は他の標識基の使用により、更に目的が満されるであろう。式■のリン酸 エステルへの炭酸エステル類似物の加水分解において、標識基は遊離され、次に 生じる触媒反応の進行を可能にしている。

このようにして、本発明の第５の様相により、それらは一般式■の炭酸エステル を与えられている。

こ−で、Ｒ１及びＲ７はヒドロカルビル基を示し、それは任意に置換されており 、Ｒ６及びＲ７のいずれか又は両者は、標識基が炭酸エステルの加水分解におい て遊離され、引続いての加水分解の進行を可能にしている１つ以上の標識基を含 んでいる。

特に好ましい標識基はニトロフェノール基である。

理論により結合されることなしに、トリボニル（ｔｒｉｇｏｎｙｌ）炭酸エステ ルの加水分解か概要■に示されたように、不安定な４面体の遷移状態をとおして 進行すると信しられている。

特表千４−５０５８５３　（４） 概要Ｉ 下記の一般式Ｖで示された４面体リン酸エステルは、この４面体遷移状態の安定 な類似物である。更に、リン酸エステルは、ホスホネート又はホスホンアミデー トのような他の類似物よりも炭酸エステル加水分解遷移状態の密接な類似物であ る。

（こ＼でＲ及びＲ１は、一般式Ｉに定義されたものである。）それ故、リン酸エ ステルに対して生じた抗体は、対応する炭酸エステルの加水分解を特異的に触媒 すべきである。類似物ではあるが、全くおなしに対応している炭酸エステルでな い物の加水分解の触媒作用が、少くともある場合に、観察されるであろうけれど も、そのような抗体は完全に関係のない炭酸エステルの加水分解を触媒するとは 期待されない。然しなから、特異性は一般に発明による抗体の特徴であり、選択 的に加水分解が望まれている炭酸エステルが、望まれた炭酸エステルへのリン酸 エステル類似体の選択により指定されえる。更に特定の触媒加水分解反応が、抗 体が優先的にこの化合物に結合するのて最初のリン酸エステルにより阻止される へきである。このようにして、リン酸エステルは炭酸エステル加水分解反応の制 御をする炭酸エステル加水分解の阻害剤として使用されえる。

本発明のより良き理解と利益は、説明に与えられた次の特定の例で明かである 例１．リン酸エステル免疫原■の合成（概要３）（ａ）４−ニトロフェニル−４ ′−メトキシ−カルボニルメチルフェニルホスフェイト（Ｉ）の調製 メチル４−ヒドロキシフェニルアセテート（３００ｍｇ、１．８　ｍｍｏｌ）の アセトニトリル（２ｍｌ）への溶液が、０°Ｃて、ピリジン（４ｍｌ）中４−ニ トロフェニルホスホロンジクロリゾイト（５１２ｍｇ、　２ｍｍｏりの攪拌溶液 に滴下された。混合物はこの温度で３０分攪拌され、それから水（８００ミクロ リッター）か添加され、反応は２時間で室温になった。溶媒は減圧下に除去され 、残金は重曹水溶液（０，５Ｍ、１５ｍ１）に溶かされ、ジエチルエーテルで抽 出された（２ｘ１５ｍｌ）。水溶液はＨＣｊ７で酸性にされ、エチルアセテート で抽出された（３Ｘ２５ｍｌ）。エチルアセテート抽出液は、−緒にして脱水さ れ、減圧下に濃縮されて粗生成物（５５０ｍｇ、７５％）を黄色油としてえた（ Ｒｆｏ、５、展開溶媒ＣＨ２Ｃｊ？　２　：　ＭｅＯＨ３，１）。これはフラッ シュクロマトグラフィー（溶離溶媒ＣＨ２Ｃｌ！ｚ　：　ＭｅＯＨ３：　ｌ）に より純化され、無色油として生成物（Ｉ）をえた。

ＩＲｎｕ　ａｎ−’（ｎｅａｔ）　３５００　（ｂ）　１７２５　（ｓ）’ＨＮ ＭＲ２５０ＭＨｚ、　（ｄ、　ＤＭＳＯ）。

デルタ（ｄｅｌｔａ）　３．３２　（３Ｈ，Ｓ、ＣＨ３）。

３．５９　（２Ｈ，Ｓ、ＣＨ２）。

７．４０　（２ｈ、ｄ、Ｊ　９．２Ｈｚ、　ＨＡｏｆ　ＡＢｑ、　Ａｒ−Ｎ０□ ）８．１７　（２Ｈ，ｄ、Ｊ　９．２Ｈｚ、　Ｈａ　ｏｆ　ＡＢｑ、　Ａｒ−Ｎ ０２）（ｂ）４−ニトロフェニル−４′＝（カルボキシメチル）フェニルホスフ ェイト（ＩＩ）の調製 ＮａＯＨ水溶液（ＩＭ、５００ミクロリツター）がテトラヒドロフラン（３ｍｌ ）及び水（２ｍｌ）中４−ニトロフェールー４′−メトキシカルボニルメチルフ ェニルホスフェイト（Ｉ）（１８０ｍｇ、０、４９　ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に添 加された。５分後、ＮａＯＨ水溶液（１Ｍ、５００ミクロリツター）が更に添加 され、室温で１時間反応は攪拌された。それから、混合物はＨＣＡで酸性にされ 、エチルアセテートで抽出された（３ｘ２０ｍｌ）。エチルアセテート抽出液は 一緒にして脱水され、減圧下に濃縮され、粗生成物（Ｒｆｏ、　７０、展開溶媒 ＣＨ２ＣＪ２２　：ＭｅＯＨ：Ａｃ０Ｈ５０：　５０　：　１）を淡い褐色固体 としてえた（１４０ｍｇ）。エチルアセテート二石油スピリットからの再結晶は 白色結晶として純品を与えた（５０ｍｇ、２９％）。

’ＨＮＭＲ２５０ＭＨｚ　（ＤＪ） デルタ（ｄｅｌｔａ）　３．５４　（２Ｈ，Ｓ、ＣＨ２Ｃ０２）。

６．９９　（２Ｈ，ｄ、Ｊ　８．５Ｈｚ、　ＨＡｏｆ　ＡＢｑ、酢ＣＨｚＣＯ２ ）７．１０　（２Ｈ，ｄ、Ｊ　８．５Ｈｚ、　Ｈａ　ｏｆ　ＡＢｑ、　ＡｒＣＨ ｚＣＯｚ）７．１８　（２Ｈ，ｄｊ　９．３Ｈｚ、　ＨＡｏｆ　ＡＢｑ、　Ａｒ Ｎ０ｚ）８．０８　（２Ｈ，ｄ、Ｊ　９．３Ｈｚ、　Ｈ，ｏｆ　ＡＢｑ、　Ａｒ Ｎ０□）（Ｃ）　免疫原（ＩＩ）の調製 エチルジメチルアミノプロピルカーポジイミド（ＥＤＣ）　（１００ｍｇ、０． ５２　ｍｍｏｌ）が、水（１４ｍｌ）及びピリジン（１００ｍｌ）中４−ニトロ フェニル４′−カルボキシメチルフェニルホスフエイト（ＩＩ）　（４５ｍｇ、 ０．１３ｍｍｏｌ）　、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（１００ｍｇ、　０．８ ７ｍｍｏｌ）及びかぎ穴に入るヘモシアニン（ＫＬＨ）　（１００ｍｇ）の攪拌 溶液に５時間で分割しなから添加された。反応は更に１６時間室温で攪拌され、 ３日間じゃ口からの流水に透析された。レテネイト（ｒｅｔｅｎａｔｅ）は凍結 乾燥され、灰色がかった白色粉として免疫原（Ｉ［）をえた（５０ｍｇ）。

（Ｉ［） （Ｉ［Ｉ） 例２．抗体の生成 ３頭の成熟雌羊（淘２７０．２７１及び２７２）が、フロイントの完全アジュバ ント（３ｍｇ）の油エマルジヨン中水（１ｍｌ）中に上記免疫原の４ｍｇで皮下 及び訪中に夫々免疫された。これが免疫原の２ｍｇ及びフロイト不完全アジュバ ントがそれから使用されたことを除いて４週間隔で繰返された。各々の再免疫後 ２週間で動物は頚動脈から血がとられ、血は１晩かためられ、遠心され、血清が 分離され、−２０°Ｃで貯えられた。

髭、蛍光標識化合物（ＩＸ）の合成（概要４）（ａ）４−アミノフェニルブタノ ール（Ｖ）の調製塩化１（ｎ）２水塩（６，０ｇ、２６．６　ｍｍｏｌ、５．２ 　ｅｇ）が濃塩酸（ｌｏｍｌ）に溶かされ、溶液は０℃に冷却された。冷攪拌溶 液に４−二トロフェニルブタノール（０，８６６ｍ１．１．０　ｇ、　５．１３ ｍｍｏｌ）か添加され、混合物か９０分、０″Ｃで攪拌された。この終りに、エ チルアセテート（５０ｍｌ）が混合物に添加され、えられた２相混合物の水相か 固体重曹の注意深い添加により（ｐＨ８〜９に）塩基性にされた。相が分離され 、有機相はそのま−にして、水相はエチルアセテートで更に２回抽出された（２ Ｘ５０ｍｌ）。有機相は一緒にされて硫酸マグネシウムで脱水され、溶媒が減圧 下に除去され、黄褐色固体残金がエチルアセテート／軽油から結晶化され、黄色 結晶として生成物５５０ｍｇ（６５％）をえた。

（ｂ）４−（４’−クロロアセトミドフェニル）ブタノール（ＶＩ）の調製 ４−アミノフェニルブタノール（Ｖ）　（１０ｇ、　６．０６ｍｍｏｌ）が塩化 メチレン（４ｍｌ）ピリジン（２ｍｌ）の混合物に溶かされ、溶液がＯ″Ｃに冷 却された。冷攪拌溶液に、０″Ｃに冷却されている塩化メチレン（２ｍｌ）中ク ロルアセチルクロリド（１，５ｍｌ、　２７３Ｂ、７８．８　ｍｍｏｌ、３．　 ｌ　ｅｇ）の溶液が滴下された。溶液はオレンジ色になり、ピリジン塩酸塩の量 か沈降した。反応は１５分で完成した（Ｔ　Ｌ　Ｃ，ＥｔｏＡｃ　／ＭｅＯＨ１ ０：　１　）。

上でえられた冷攪拌溶液にトリエチルアミン／水のｌ：１混合物（１０ｍｌ）が 添加され、後充分なメタノール（８ｍｌ）を添加して溶液を均質に保持した。溶 液を室温に温めて、１晩環境温度で攪拌した。全溶媒か減圧下に除去され、残金 がジクロロメタンで繰返し共沸された。それから固体残金は水（３０＋ｎｌ）と エチルアセテート（３０ｍｌ）の間で分配された。水相は２回エチルアセテート で抽出され（２ｘ３０ｍｌ）、有機相か一緒にされて減圧下に濃縮され、メタノ ールで共沸した。それから残金かエチルアセテートから結晶化され、薄い黄色の 結晶として生成物（ＶＩ）をえた（７７０Ｂ、５３％）。

（Ｃ）　保護された誘導体（■）の調製モノ−保護された材料（ｍｏｎｏ−ｐｒ ｏｔｅｃｔｅｄ　ｍａｔｉｎａｌ）　（ＶＩ）　（２００Ｂ、　０．８３　ｍｍ ｏｌ）がピリジン及びアセトニトリル２：Ｉの混合物（１４ｍｌ）に溶かされ、 溶液は０°Ｃに冷却され、冷攪拌溶液に、ｐ−ニトロフェニルホルフォルジクロ リデイト（６００ｍｇ、２．３４ｍｍｏｌ、　２．８　ｅｇ）が添加され、１時 間、０°Ｃで連続的に攪拌された。

上記冷攪拌溶液に、水（２ｍｌ）を添加した。黄白色固体がすぐに沈降しはじめ た。混合物は室温に温められ、３時間、環境温度で連続攪拌された。終了後全溶 媒か減圧下に除去され、残金か重曹水溶液（２５ｍｌ）とエーテル（２５ｍｌ） との間で分配された。

水相がエーテル（２５ｍｌ）で洗浄され、有機相は廃棄された。水相は濃８ＣＩ ！の注意深い滴下により（ｐＨ１〜２に）酸性にされ、５回エチルアセテートで 抽出された（５Ｘ３０ｍｌ）。有機抽出相は一緒にして減圧下に濃縮され、シリ カ上でフラッシュカラムクロマトグラフィか行われ（傾斜溶離法、スタートＥｔ ＯＡｃ　／ＩＪｅＯＨ１０，１メタノールをＥｔＯＡｃ　／ＭｅＯＨに増加３二 ｌ）、灰色がかった白色固体として生成物７８５ｍｇ（５０％）をえた。

（ｄ）（■）をえる脱保護 保護されたリン酸エステル（■）　（１４０ｍｇ、　０．３２ｍａ＋ｏｌ）及び チオ尿素かメタノール（３ｍｌ）に溶解され、溶液は３時間還流された。終了後 Ｔ　Ｌ　Ｃ（ＣＨ２Ｃｊ’　ｔ　／　Ｍｅｎ）１３　：　ｌ　）は、反応が完了 したことを示した。それから溶媒が減圧下に除去され、残金に傾斜溶離法（スタ ー）ＣＨ２（Ｊ’　ｘ　／ＭｅＯＨ５：　１、終了ＣＨｚＣＩ！２　／　ＩＪｅ ＯＨ３，１）でシリカ上フラッシュカラムクロマトグラフィが行われた。黄色油 として生成物（■）８０ｍｇ（７０％）をえた。

（ｅ）　蛍光標識化合物（ＩＸ）の調製上記リン酸エステル■（３，６ｍｇ、　 ０．０５　ｍｍｏｌ）のメタノール（２ｍｌ）及びトリエチルアミン（２００ミ クロリツター）の溶液にフルロセインイソシアネートアイソマ−（ｆｌｕｒｏｓ ｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏ−ｃｙａｎａｔｅ　ｉｓｏｍｅｒ）　Ｉ　（３，９ｍｇ ｌｏ、　０１　ｍｒｎｏｌ）が添加され、室温で１時間攪拌された。揮発物が減 圧下に除去され、残金をエタノールで共沸した（５Ｘ５ｍｌ）。生成物はＴＬＣ で単離された（展開溶媒ジクロルメタン・メタノール：酢酸７５：２５：ｌ）。

黄色固体として純化標識化合物（ＩＸ）をえた。（上記溶媒系でＲｆＯ，７５） 概要４ ↓ ↓ ↓ ↓ 例４．蛍光分極抗体希釈曲線 蛍光標識化合物をメタノールに溶解し、えられた溶液の濃度か分光光度的に定置 され、重曹緩衝液（ｐＨ９，０，５０ｍｍｏｌａｒ）において４９２ｎｍで８． ７８ＸＩＯ’１ｍｏｌ−’ａｎ〜１のモル吸光係数と推定された。この溶液の一 部がアジ化ソーダ（０，１％Ｗ／Ｖ）及び牛ガンマーグロブリン（０，１％、Ｗ ／Ｖ））を含むリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７，５、ｋ　５０　ｍｍｏｌａｒ）で希 釈され、標識化合物濃度３０ｍｍｏｌＩ！−’の貯蔵溶液をえた。

抗血清（５００ミクロリツター）が（上記）リン酸塩緩衝溶液（４，５ｍ１）に 溶かされ、１・１０の初希釈液をえた。これから希釈液が調製され、１：１０か らｌニア６８０の範囲の抗体希釈液をえた。

各抗体希釈液（１ｍｌ）が室温で１時間、標識物質の上記溶液（５００ミクロリ ツター）と培養され、各チューブの蛍光分極が測定された天然存在量は抗体希釈 液（１ｍｌ）をリン酸塩緩衝液（５００ミクロリツター）で培養することにより 各希釈液にえられ、これらの読が標識化合物でえられた値から減ぜられた。抗体 希釈曲線は、抗体希釈液に対しえられた蛍光分極をプロットすることにより構成 された。

抗体希釈曲線は、免疫表に２８週各羊（２７０，２７１及び２７２）かえられた 抗血清のため組立てられた。これら抗血清の力価は各々に１　：４０００、ｌ： ２０００及びｌ：２０００であった。

例５．羊２７１からのＩｇＧの純化 無水の硫酸ナトリウム（１８０ｍｇ）が、うずまき攪拌子羊２７１からの血清（ １ｍｌ）に添加された。えられた懸濁液はゆるやかに３０分混合され、遠心分離 （１０分、３０００ｒｐｍ、２５°Ｃ）され、上澄液は廃棄のため吸引された。

沈降したＩｇＧは洗浄（２Ｘ２ｍｌ＋８％Ｎａ２Ｓ０４Ｗ／Ｖ）され、リン酸塩 緩衝溶液（２ｍｌ、ｐＨ７，５，５０ｍｍｏｌａｒ）に溶かされた。えられた溶 液（２ｍｌ）か蛋白質Ｇセファロース４ファスト’７０−（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ 　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ）”カラム（５ｍＬ　Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ）でクロマトグラフィーされ、溶離液が分光光度的に（２８０ｎｍ）か んしされた。吸着したＩｇＥはグリシン塩酸緩衝溶液（ｐＨ２，７，０，１Ｍ） で溶離され、溶離液は重曹水溶液（ＩＭ、０．１ｍ１）を含むチューブに分画（ ２ｍｌ）　して集められた。ＩｇＧを含む分画はプールされ、ｐＨ８，０のリン 酸塩溶離緩衝溶液５０ｍＭで、セファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ）０２５カラ ム（３２３ｘ３．２ａｎ）でのクロマトグラフィーにより、緩衝溶液か交換され た。

例６．対照羊からのＩｇＧの純化 免疫されていない羊からのＩｇＧが上記のように純化され、対照として使用され た。

例７．基質の合成 アセトニトリル（２ｍｌ）中ｐ−ヒドロキシフェニルアセティツクアシッド（１ ５２ｍｇ５１　ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシサクシンイミド（１３０ｍｇ、２ ｍｍｏｌ）の溶液にエチル、ジメチルアミノプロピルカルポジイミド（９９０ｍ ｇ、１　ｍｍｏｌ）が添加された。反応は１時間、室温で攪拌された。その後、 ＴＬＣでのかんしく展開溶媒クロロホルム：メタノール６．１）は反応が不完全 であることを示した。別にカルボジイミドの等量が添加され、攪拌が続けられた 。１５分後、ＴＬＣの結果は活性化エステルの完全な生成を示した。そしてブチ ルアミン（１５０ミクロリツター、過剰）かそれから添加された。反応は室温で １時間攪拌され、エチルアセテート（５０ｍｌ）で希釈され、重曹水（０，５Ｍ 、２０ｍ１）で洗浄され、希塩酸（ＬＭ、２０ｍ１）で洗浄され、減圧下に濃縮 された。

残金はフラッシュクロマトグラフィ（溶離溶媒エチルアセテートシクロヘキサン ９：１）により純化され、純品ｐ−ヒドロキシ−フェニルアセトアミドブタン（ １１０ｍｇ、　５３％、エチルアセテートでＲｆＯ，７５）をえた。このｐ−ヒ ドロキシフェニルアセトアミドブタンの一部（９２ｍｇ、　０．４４　ｍｍｏｌ ）がアセトニトリル（２ｍｌ）に溶かされ、えられた溶液にトリエチルアミン（ ９２ミクロリツター、０．６６　ｍｍｏｌ）及びｐ−ニトロフェニルクロロホー メイト（９８，５ｍｇ、　０．４４ｍｍｏｌ）が添加された。反応混合物は室温 で１時間攪拌され、揮発物が減圧下に除去され、残金がエチルアセテート（５ｍ ｌ）に溶かされ、濾過され、濾液が減圧下に蒸発され、白色固体として粗生成物 をえたプレパレーテイブ（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＴＬＣによる純化（展開溶 媒エチルアセテート：シクロヘキサン２：１、Ｒｆｏ、４２）で純物質をえた。

エチルアセテート：シクロヘキサンｌ：１からの再結晶で白色結晶（３０ｍｇ、 １８％）をえた。融点１１７°−１１９℃。

例８．加水分解実験−羊２７１！ｇＧ アセトニトリルにおける基質の貯蔵溶液、約０．３ｍＭか調製され、その濃度が 分光光学的に重曹緩衝溶液（ｐＨ８，０，５０ｎＭ）における加水分解により定 量され、ニトロフェルレートのため分子吸光係数１８１８２１ｍｏｌ　−’ａｎ −’と推定された。

リン酸塩緩衝溶液（ｐＨ８，０，５０ｍＭ）における羊２７１からの純化１ｇＧ の貯蔵溶液が調製され、その濃度か分光光度的に定量され、ＩｇＧのため分子吸 光係数２　Ｘ　１０　’　１　ｍｏｌ　−’ａｍ−’と推定された。この溶液の 濃度が、それからリン酸塩緩衝溶液（ｐＩ（８，０，５０ｍＭ）での希釈により ０．２ミクロＭに調整された。

ＩｇＧ溶液（３ｍｌ）に、２５℃で充分量の基質溶液か添加され、０．５ミクロ モル±−１の基質濃度とした。えられた溶液は攪拌され、二トロフェル−トの遊 離をかんしすることにより、初期反応速度か分光光学的に定量された。０．５か ら２０ｍＭの範囲の基質濃度に、これが２回繰返され、結果を表−１に示した。

表−１基質の加水分解を触媒した羊２７１１ｇＧＯ０５１，１１１，１８ ０，７５１，４５１，３７ １、Ｑ　１．５８　１．５２ １．５　１．８６　１．８３ １．７５　１．８６　１．８０ ２．０　２．１３　２．１２ ２．５　２．２２　２．２４ ３．０　２．２４　２．３０ ３．５　２．５８　２．４２ ４．０　２．５７　２．６８ ５　２、７８　２．９２ ６　３．１２　２．９５ Ｂ　３．４２　３．２２ １０　３．５１　３．５５ １２　３．４０　４．０４ １４　３．４８　３．５１ １６　４．１２　３．９４ ２０　４．８３　４．１７ これらの結果は式 により記される。こ＼で飽和できる触媒加水分解反応が基質の天然存在の加水分 解に重ねられている。

上記データーのための一定の相対誤差構造を推定している重みつき非線型最小２ 乗法回帰分析は、次の値を与えている。

Ｖｍａｘ＝２．６４　ｎｍｏｌ　ｌ　−’　ｓ−’Ｋｍ　＝０．７５　ｍ１ｃｒ ｏ　ｍｏｌ　１−’Ｋｌ　＝９．３Ｘ１０〜５３−１ 例９　加水分解実験一対照羊ＩｇＧ 非免疫化羊からの純化１ｇＧ溶液（５０ｍＭリン酸塩緩衝溶液ｐＨ８，０中０． ２ミクロＭＩｇＧ）が基質溶液に添加され、２から２０ミクロＭの基質濃度の範 囲をえた。基質の加水分解の初期速度か上記のように定量された。結果か表−２ に示されている。

表−２ 基質濃度　初期速度 ｍ１ｃｒｏ　Ｍ　ｎｍｏｌ　１−’　ｓ−’２、０　０．２８ ４、　ＯＯ，６２ ６、００，９０ ８，８１，３２ １０，０１，４８ １２、０２，０５ １４、０２，０５ １６，０２，２０ ２０、０２，４７ これらの結果は式 初期速度＝に、［Ｓ］ によって記され、このデーターのための線型最小２乗回帰分析はＫｌ＝１２．７ Ｘ　１０−’　Ｓ−’ を与え、上に定量した羊２７１からのＩｇＧのための自然存在加水分解の速度定 数の値とよく一致している。

発明の他の実施態様は、こ−に開示された発明の実際及び明細書の考察から当業 者に明らかであろう。明細書及び例は典型と考えられ、発明の精神の領域は、以 下のクレーム及び均等物により示されている。

国際調査報告

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）ポリクロン触媒抗体。
2. （２）炭酸エステルの加水分解を触媒できるポリクロン抗体。
3. （３）一般式Ｉのリン酸エステルに対し生じさせられるポリクロン抗体。 ▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ こゝで、Ｒ及びＲ１の夫々は、一般式Ｉのリン酸エステルに共に免疫原を与える 基を示している。
4. （４）一般式Ｉのリン酸エステル ▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ こゝで、Ｒ及びＲ１のそれぞれは、炭酸エステルの加水分解を触媒しえる抗リン 酸エステル抗体が生じさせられえることに対し一般式Ｉのリン酸エステルに免疫 原を共に与える基を示している。
5. （５）請求の範囲４の一般式Ｉのリン酸エステルへの前駆物質、こ、で前駆物質 は一般式ＩＩによって示される。 ▲数式、化学式、表等があります▼ こゝで、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ任意に置換されているヒドロカルビル基を示 し、前駆物質が免疫原に結合されるとき、式Ｉのリン酸エステルが生成されるで あろう。
6. （６）一般式ＩＩＩのリン酸エステル ▲数式、化学式、表等があります▼ こゝで、Ｒ４及びＲ５は夫々ヒドロカルビル基を含み、Ｒ４及びＲ５のいずれか 又は両者が抗体結合の検出可能な標識を含んでいる。
7. （７）Ｒ４及びＲ５がＲ２及びＲ３に定義された基に対応しているヒドロカルビ ル基である請求の範囲６のリン酸リステル。
8. （８）一般式ＩＶの炭酸エステル ▲数式、化学式、表等があります▼ こゝでＲ６及びＲ７は任意に置換されているヒドロカルビル基を示し、Ｒ６及び Ｒ７のいずれか又は両者は、標識基が炭酸エステルの加水分解において遊離され 、加水分解工程が引続き進行しうる１つ以上の標識基を含んでいる。