JPH04505922A - 免疫活性ペプチドおよび抗体ならびに抗アレルギー処置におけるそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫活性ペプチドおよび抗体ならびに 本発明は、普通はヒスタミンその他のメディエータ−（伝達物質）を放出させる 、アレルゲンに結合した細胞結合１ｇＥと細胞との相互作用を抑制することに関 するものである。

先行技術の説明 アレルギー症状は脈管活性アミン（メディエータ−）、注目すべきものはヒスタ ミン、が細胞から周囲の組織および脈管構造内へ放出されることにより引き起こ される。ヒスタミンは普通はマスト細胞および好塩基性白血球（好塩基球）とし て知られる特殊な細胞内に貯蔵される。マスト細胞は動物組織全体に分布し、一 方好塩基球は脈管系内を循環する。これらの細胞は、ヒスタミン放出をトリガー する（ｔｒｉｇｇｅｒ）特別な一連の出来事が起こらない限り、ヒスタミンを細 胞内で製造し、貯蔵する。

アレルギー反応の伝達における免疫グロブリンＥ　（ＩｇＥ）抗体の役割は周知 である。ＩｇＥは複雑な様式のポリペプチド鎖であり、他の免疫グロブリンの場 合と同様に、ジスルフィド結合によって互いにＹ“字構造に結合した２本のＬｍ （ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ）および２本のＨ＠　（ｈｅａｖｙ　Ｃｈａ　ｉｎ） からなる。Ｌ鎖はそれぞれ２ドメイン、すなわち定常部（Ｃ５）と呼ばれる比較 的不変のアミノ酸配列を含むドメインに結合した１個の可変部（ｖＬ）を有する 。

これに対しＨ鎖は、１個の可変部ｆｆ、）　、およびＩｇＥの場合は４個の定常 部（Ｃ１，１１、Ｃ，２、Ｃ，３、Ｃ，４、Ｃ，１、Ｃ，２、Ｃ，３、Ｃ，４と しても知られる）を有する。抗体の２本の′アーム“は抗原の結合に関与し、ポ リペプチド構造が変化する領域を含み、Ｆ　ａｂ’　フラグメント（Ｆｒａｇｍ ｅｎｔ−ａｎｔ　ｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ）またはＦ　（ａｈ’　）　２−− これはジスルフィド結合により互いに結合した２本のＦ、６′　アームを表すｍ −と呼ばれる。抗体の２本の“テイル′または中心軸は一定の、または定常的な ペプチド配列を含み、Ｆｃフラグメント（Ｆｒａｇｍｅｎｔ−ｃｒｙｓｔａｌｌ ｉｎｅ）と呼ばれる。Ｆｃフラグメントは抗体の生物活性部位を含み、抗体が他 の免疫系分子または細胞とそれらのＦｃレセプターに結合することにより連絡す るのを可能にする。Ｆｃレセプターは、免疫グロブリンＦｃ領域内の分子活性部 位に高い親和性および特異性において結合する分子である。Ｆｃレセプターは細 胞の外側細胞膜内に一体の膜蛋白質として存在するか、または血漿その他の体液 中を自由に循環する遊離の″可溶性′分子として存在する場合もある。図面の第 １図は、抗体分子の構造、ならびに抗原結合部位ＣＦａｂ’アーム）、Ｆｃフラ グメント、および細胞結合部位を含む活性部位の位置を示す。

活性部位はそれらの機能に応じて、既に露出しており、従って細胞性レセプター に結合しうる場合もある。あるいはそれらは抗体が抗原に結合するまで隠蔽され ており、結合した時点で抗体の構造が変化し、続いて他の活性部位が露出し、次 いでこれが特異的免疫活性をトリガーさせる場合もある。

生体内においてマスト細胞および好塩基球からのヒスタミンのアレルギー性（免 疫性）放出は普通は下記の状況下でのみ起こりうる。ＩｇＥ分子がそのＦｃ末端 において細胞性Ｆｃレセプターに結合または固着し、これによりＩｇＥ分子がマ スト細胞または好塩基球に固定されなければならない（第２ａ図）。細胞結合■ ｇＥ分子のＦ。′部分が特定の親和性抗原（アレルゲン）により架橋されなけれ ばならない。このような相互作用が起こると（第２ｂ図）、マスト細胞または好 塩基球は自動的に局所環境へのヒスタミンの放出をトリガーし、よく知られたア レルギー症状を発現する。

アレルギーの処置のための通常の方法は、抗ヒスタミン薬による全身療法または 患者を脱感作する試みなど、基礎的なＩｇＥ−マスト細胞／好塩基球の相互作用 自体に対処するのではない方法によるものである。

他の先行技術は、細胞表面のＦｃレセプターに対するＩｇＥ分子の結合を遮断し て、既にＩｇＥが結合している結合部位からＩｇＥを排除しうるポリペプチド鎖 の調製に関するものであった（第３図）。

マスト細胞／好塩基球ヒスタミン放出をもたらす免疫シグナルを与えると考えら れるＩｇＥのＦｃ領域内の“エフェクター′部位の性質を確認するための研究が 行われた。

モデルのヒスタミン放出性ポリペプチドである副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ ）およびメリチンならびにそれらの同族体に関して行われた構造−活性の研究か ら、これら両ポリペプチドに見られる１群の塩基性アミノ酸がラット腹膜マスト 細胞からのヒスタミンの放出を直接トリガーさせるための必須要件であることが 示された［シャサニおよびスタンワース（Ｊａｓａｎｉ、Ｂ、、Ｓｔａｎｗ。

ｒｔｈ、Ｄ、Ｒ，）、Ｉｎｔ、Ａｒｃｈｓ、Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｐｐｌ、１ｍｍ 残基の存在およびＣ−末端カルボン酸残基のアミド化は、このヒスタミン放出ト リガーを促進することが認められた。

これらの所見に基づいて、構造が解明されていたヒトＩｇＥ　［ベニッヒおよび バール−リンダストローム（Ｂｅｎｎｉｃｈ、Ｈ，、Ｂａｈｒ−Ｌｉｎｄａｓ　 ｔｒｏｍ、Ｈ，ｙｏｎ）、Ｐｒｏｇ、［ｍｍｕｎｏｌ、、よ工、ｐｐ、４９−５ ８（１９７８）］のＦｃ頌域が、その基準を満たすアミノ酸配列につき調べられ た。

Ｃ，４ドメイン内の残基４９６−５０６にわたる配列ニーＡｒｇ　−Ｌｙｓ　− Ｔｈｒ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｇｌｙ　−Ｓｅｒ　−Ｇｌｙ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｐｈｅ　 −Ｍａｌ　−Ｐｈｅ（本明細書において配列はすべて普通の様式で、すなわちＮ −末端を左端側、Ｃ−末端を右端側にして読まれる） がこれらの構造要件を最も良く満たすと思われた［スタンワース（Ｓｔａｎｗ。

ｒ　ｔｈ、Ｄ、Ｒ，）　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、ユ８０．ｐｐ、６６５−６ ６８（１９７９）］。その結果、この領域の代表的配列からなる種々の長さのペ プチドが合成され、ラット腹膜マスト細胞からのインビボでのヒスタミン放出を 細胞溶解なしに誘導する効力につき試験された。オクタペプチド（配列４９７− ５０４）、ノナペプチド（配列４９６−５０４）、およびデカペプチド（配列４ ９７−５０６）はすべて０．１００μＭの濃度範囲にわたって用量依存性のヒス タミン放出を示した。

これらの系統的な研究の結果、直接的なマスト細胞トリガーのための、従ってア レルゲンによる架橋の結果トリガーシグナルを与える細胞結合ＩｇＥ抗体分子部 分の必須構造要件の像が描き出された。この構造は“茶間（ｉｎｄｉｆｆｅｒｅ ｎｔ）″残基（たとえばＧｌｙ　−５ｅｒ−Ｇｌｙ）により疎水性Ｃ−末端“テ イル“（たとえばＰｈｅ　−Ｐｈｅ−Ｖａｔ　−Ｐｈｅ−ＮＨｚ）から分離され たＮ−末端（カチオン性）極性へ・ｙド（たとえばＬｙｓ−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ） からなる。（通例どおり、本明細書全体を通して示した最終ＮＨ２基はＣ−末端 カルボン酸基がアミド化されていることを意味する。）ノイロペプチド′物質Ｐ ＃に、有意の著しく類似する一時構造特性が認められた。

Ａｒｇ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｌｙｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇｉｎ　−Ｇｉｎ　−Ｐ　ｈｅ 　−Ｐｈｅ　−Ｇｌｙ　−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ　−ＮＨｚこれはノイロンから放出さ れると隣接マスト細胞に直接に作用し、その結果ヒスタミンを放出させると思わ れる。

スタンワースらは、ヒスタミン（メディエータ−）放出のトリガーに関与する″ 第２レセプター“が細胞表面にあることを示唆した。ＩｇＥのＦｃ領域の活性部 位はＩｇＥかターゲット細胞に結合する部位（細胞結合部位）と別個の″エフェ クタ一部位″を含むと仮定されている。細胞結合１ｇＥが抗原（アレルゲン）に より架橋したのち、この″エフェクタ一部位′　（″′不茶間残基により疎水性 “テイル″から分離された、必要なトリガー配列であるカチオン性“ヘッド′を 含む）により第２機構が活性化される。アレルゲンが細胞結合ＩｇＥ抗体に結合 するとＩｇＥの配座の変化が起こり、ＩｇＥ活性部位が細胞表面膜上に推定され る′第２レセプター′と結合することが示唆された。活性部位内の特異的アミノ 酸配列（″エフェクタ一部位″）によるヒスタミン放出のトリガーは、細胞膜脂 質二重層内へ疎水性″テイル″か挿入され、一方カチオン性″ヘッド″が細胞表 面膜上の推定′第２レセプター″と相互作用することにより起こると考えられた ［スタンワース（Ｓ　ｔ　ａｎ、ｗｏ　ｒ　ｔ　ｈ、Ｄ、Ｒ，）　ら、　Ｍｏ　 ｌ　ｅ　ｃ、Ｉｍｍｕｎｏ　ｌ。

又↓、ｐｐ、２４３−２４７　（１９８４）］。

マスト細胞からのヒスタミン放出機構に関する上記の説明は必ずしも全般的に受 け入れられてはいない。先行技術はマスト細胞および好塩基球へのＩｇＥの結合 を阻止するための“遮断ペプチド″の開発に関するものであった。″抗−結合部 位抗体“の開発によりこの結合部位が解明され、続いて遮断抗ペプチドが開発さ れた［パート（Ｂｕ　ｒ　ｔ、Ｄ、　）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏ ｌ。

ｇｙ、■、ｐｐ、３７９−３８９　（１９８７）］。しがしＩｇＥ抗体はアレル ゲンが存在しなくてもしばしば強固にマスト細胞または好塩基球に結合すること が知られており　［スタン”７−ス（Ｓｔａｎｗｏｒｔｈ、Ｄ、Ｒ，）ら、Ｎａ ｔｕｒｅ、２３３．［）、３１０−３１６　（１９７１）Ｅ、推定″第２レセプ ター″がトリガーされてヒスタミンか放出されるのはアレルゲンが存在する場合 のみである。

従ってＩｇＥがマスト細胞に結合する部位を遮断するだけでは、自由に循環して おり、まだマスト細胞または好塩基球に結合していないＩｇＥ分子のＩｇＥ機能 を抑制するにすぎない。この方法は、細胞結合ＩｇＥが存在する場合には、この ような遮断ペプチドが既に結合しているＩｇＥをも排除しうるちのでない限り不 適当である。この方法はバンパーカーにより採用された。彼は、ヒトＩｇＥのＣ ，２ドメインからのペンタペプチドがヒト皮膚のマスト細胞上のＩｇＥ特異性結 合部位と競合し得たと報告している［バンパーカー（Ｈａｍｂ　ｕ　ｒ　ｇ　ｅ 　ｒ、Ｒ。

Ｎ、）、Ｓｃ　１ｅｎｃｅ、ユ８９．　ｐｐ、３８９−３９０　（１９７５）］ 　、しかしこの結果を他の研究者か確認することはできなかった［ベニッヒ（Ｂ ｅｎｎｉｃｈ、Ｈ，Ｈ，）　ら、Ｉｎｔ、Ａｒｃｈ、Ａｌｌｅ−ｒｇｙ　Ａｐｐ ｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、５３．１）Ｉ）、４５９−４６８　（１９７７）］。

″第２レセプター″仮説の有効性を仮定すると、アナフィラキシ−（ＩｇＥ）抗 体分子上の推定″エフェクタ一部位“と細胞表面のこの″第２レセプター″の相 互作用を阻止する方法が明らかでない。恐らくマスト細胞結合１　ｇ　Ｅ抗体分 子が特異的抗原（アレルゲン）により架橋されるとそれらのＦｃ領域内に配座の 変化が誘導され、これにより″エフェクタ一部位″が″第２レセプター″と近接 並置されると思われる。この状況でこの相互作用を遮断する試みは、推定エフェ クタ一部位の領域における立体障害の問題に遭遇するであろう。

発明の要約 意外にもＩｇＥのＦｃ領域内の″エフェクタ一部位″に対する抗体をインビボで 産生ずることが可能であり、より意外なことにはインビボで誘発（ｅｌｉｃｉｔ ）すること力何能であり、これはＩｇＥが循環系内に既にそのＦｃ領域によりマ スト細胞または好塩基球に結合した状態で存在する場合ですら、細胞結合ＩｇＥ がその特異的アレルゲンに架橋した際にヒスタミンの放出を阻止することが見出 された。

従って本発明は、カチオン性Ｎ−末端ヘッドおよび疎水性Ｃ−末末端テルル含む ヒスタミン放出性ペプチドの残基、ならびに該ペプチドに対する抗体を誘発する ことができ、一方該ペプチドによるヒスタミン放出を抑制する残基からなる（が ら構成される、または、を含む）免疫原を提供する。この定義は各種ポリマー型 および架橋型のペプチド、ならびにそのペプチドに結合したキャリヤーからなる コンジュゲート、すなわち該ペプチドを“非自己″となし、そのヒスタミン放出 機能を受容しうる程低い水準、好ましくはゼロにまで低下させるいずれの形態を も包含する。

本発明の初回使用に際して、ホストは免疫学的に有効な量の上記に定義する免疫 原をホストに投与することによりＩｇＥのＦｃ領域のトリガー配列に対して能動 免疫処置される。上記ペプチドはヒスタミン放出に対するトリガーであるが、そ れら自身はヒスタミン放出を実質的に媒介しない状態で提供しうろことは意外で ある。

本発明は上記に定義したヒスタミン放出性ペプチドに特異的な抗体ドメインから なるリガンドをも包含する。この定義は七ノーおよびポリクローナル抗体、それ らの抗原結合性フラグメント、たとえばＦ、、′またはＦ　（、、’　）　２、 ハイブリッド抗体および１本鎖ドメイン抗体をも包含する。簡略化のため以下に おいてはこのリガンドを呼び表すため番ご抗体“という語を用いる。

本発明の第２回使用に際してホストは、ヒスタミン放出抑制に有効な量の、上記 に定義するヒスタミン放出性ペプチドに特異的な抗体ドメインからなるリガンド をホストに投与することにより、ヒトＩｇＥのＦｃ領域の前記アミノ酸配列に対 して受動免疫処置される。ヒト化された抗体およびＦ、、′フラグメントを調製 しうる極めて好ましいモノクローナル抗体は後″記特許寄託の対象である。

図面の説明 第１図は、抗体の構造ならびにＦｌ、′およびＦ３領域の位置を示す。

第２図は、ＩｇＥ抗体かマスト細胞または好塩基球に結合する部位（２ａ）、お よび細胞結合ＩｇＥ抗体が抗原により架橋してＩｇＥの活性部位内の“エフェク ター領域“を露出し、これが′第２レセプター″に接近しうる様式（２ｂ）を示 す。

第３図は、ＩｇＥが細胞表面Ｆ。レセプターに結合するのを遮断するペプチドの 開発計画を示す。

好ましい形態の説明 本発明は、アレルギー反応に際してマスト細胞または好塩基球からヒスタミン（ メディエータ−）が放出されるのを抑制することを目的とする。このトリガー段 階は、表面結合ＩｇＥを保有するマスト細胞または好塩基球にそのＩｇＥか特異 的である抗原（アレルゲン）が接触した時点て起こる。アレルゲンは表面結合Ｉ ｇＥに結合し、これによりｒｇＥの配座を変化させて′エフェクタ一部位″を露 出させ、これか細胞表面の′第２レセプター″と相互作用してその細胞内に貯蔵 されていたヒスタミンその他のメディエータ−を放出させる。

この抑制は、（１）そのＦ。′領域を通してアレルゲンと結合し、これにより″ エフェクター“部位を露出している細胞結合１ｇＥのＦ、領域の″活性″部位と （２）細胞表面の′第２レセプター″との相互作用に干渉することによりもたら される。　（普通はこれらの″エフェクター″部位と“第２レセプター″との相 互作用により、細胞内に貯蔵されていたヒスタミンが放出されるであろう。）免 疫処置は受動的、すなわち抗ＩｇＥアミノ酸配列抗体の少なくともＦ４．′　フ ラグメントによる予防処置であるか、またはより好ましくは能動的、すなわちホ ストにそれ自身の抗体を誘導させるものである。能動免疫処置はＩｇＥ感作され たマスト細胞または好塩基球からの免疫的にトリガーされたメディエータ−放出 に対して、より有効な長期持続型の保護をもたらすからである。さらに、実験的 に感作された動物（ラット）において抗ペプチド抗体がアレルゲン（卵アルブミ ン）に対するＩｇＥ産生水準を低下させることを示唆する証拠がある。

ヒスタミン放出性ペプチドは、カチオン性Ｎ−末端“ヘット“および疎水性Ｃ− 末端″テイル″を含む。好ましくはＣ−末端テイルはアミド化によりブロックさ れる。Ｎ−末端とＣ−末端は、普通は主として非極性および非疎水性の多数の″ 下関′アミノ酸残基からなる配列により分離されている。Ｎ−末端とＣ−末端は 通常は２−８個のアミノ酸、好ましくは２−６個、より好ましくは３個のアミノ 酸により分離されている。より好ましくはＮ−末端とＣ−末端はＧｌｙ−８ｅｒ 　−ＧＩＹ配列により分離されている。プロリンおよびシスティンは好ましくな い。

ヘッドは要求される細胞膜の“第２レセプター“との相互作用に適切なカチオン 性をもたなければならない。好ましくはそれは間隔を置いた２個のカチオン性ア ミノ酸残基の“ダブル−トップ“、たとえばＬｙｓ−ｘ−Ｌｙｓを含み、ここで Ｘは少な（とも１個の極性または中性アミノ酸残基を表す。′ヘッド′は普通は 最初の１．２または３個のＮ−末端アミノ酸からなる。ティルは推定される脂質 二重層内への侵入に適した疎水性をもつ。それは普通は最後の少なくとも２個の アミノ酸、好ましくは最後の２−６個のアミノ酸からなる。ティルに好ましいア ミノ酸はフェニルアラニンおよびチロシンであるが、長い脂肪族側鎖をもつアミ ノ酸、たとえばバリン、ロイシンまたはイソロイシンも疎水性であると考えられ る。

ヘッドまたはテイルは、主体でなくかつこれにより機能を失わない限り“下関″ アミノ酸をも含みうる。極めて好ましくは、Ｎ−末端ヘッドはＬｙｓ単独、また はＬｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓから構成され、Ｃ−末端テイルは前記ペプチドの最後 の４個のアミノ酸内のＰｈｅ−Ｐｈｅ配列からなる。

詳細には、好ましいペプチドは下記のものを含む　−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ −Ｇｌｙ　−５ｅｒ−Ｇｌｙ−’Ｐｈｅ　−Ｐｈｅ　（１）Ａｒｇ　−Ｌｙｓ− Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ　−５ｅｒ−Ｇｌｙ　−Ｐｈｅ　−Ｐｈｅ　（２）Ｌ ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−ＧＬｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐ ｈｅ　（３）Ｌｙｓ　−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ　−Ｇｌｙ　−Ｓｅｒ　−Ｇｌｙ　− Ｐｈｅ　−Ｐｈｅ　−Ｖａｌ　−Ｐｈｅ　−Ｓｅｒ−ＡｒｇＬｙｓ　−Ｔｈｒ　 −Ｌｙｓ　−Ｇｌｙ　−Ｓｅｒ　−Ｇｌｙ　−Ｐｈｅ　−Ｐｈｅ−Ｖａｌ　（５ ）それらのアミド化誘導体、およびそれらのアミド化または非アミド化ヒスタミ ン放出同族体。デカペプチド（３）が極めて好ましく、そのアミド化誘導体を以 下において“Ｆ３０″と表す。

これらのペプチドはヒスタミンの非細胞溶解性放出を媒介するが、この放出はペ プチドが免疫原性キャリヤー物質にコンシュケートしている場合は抑制される。

好ましくはホストは、免疫原性キャリヤー物質、普通は蛋白質にコンジュゲート した、実質的にヒスタミンの放出を媒介し得ないペプチドを免疫原性抗原するこ とにより″能動″免疫処置される。コンシュゲーションは短い結合用残基、たと えばグルタルアルデヒド、または比較的長い残基、たとえばアミノ酸残基を介し て行うことができ、これによりキャリヤーはペプチドから十分に間隔を置く。こ れらの結合用残基はペプチド残基のＮ−末端ヘッドのカチオン性を妨害してはな らない。ペプチドはそのＣ−末端またはＮ−末端を介してキャリヤーにコンシュ ケートしてもよい。

あるいは免疫原はヒスタミン放出性ペプチドの残基を含む環状ペプチドの形をと ってもよい。環状ペプチドＦ４０につき試験した実施例において証明されるよう に、環化はヒスタミン放出を著しく損なう。このペプチドはＦ２Ｏの非アミド化 分子の各末端にシスティン残基が付加された環状形である。環状ペプチドが適宜 な配座の基本的ヒスタミン放出性ペプチドを保有することを保証するためには若 干の実験か必要であろうが、これは必要に応じてスペース形成用アミノ酸を挿入 する簡単なものである。これらの環状ペプチドにおいては、システィン−システ ィン″橋″残基がここで本発明の免疫原の広い定義の意味に包含される抗体誘発 性残基を構成する。

免疫原は、１分子のペプチド残基がここで本発明の免疫原の広い定義の意味に包 含される“ヒスタミン放出性ペプチドの残基′を構成し、残りの免疫原が上記定 義の意味に包含される抗体誘発残基を構成する高分子ペプチドの形をとることが できる。本明細書の実施例に示すように、２量体化はヒスタミン放出を著しく損 なう。要求される抗体を刺激するのに適した重合度または重合形態を判定するた めには若干の実験か必要であろう。

本発明の免疫原は実質的に非細胞溶解性ヒスタミン放出を媒介し得ないが、Ｉｇ ＥのＦ、ｆＪ域のターゲントアミノ酸配列と強い血清学的交叉反応性を示す抗体 を誘発しうる。

初回！（たとえば０．２−５ｒｒＨ；好ましくは１　ｍ　ｇ　）の免疫原を筋肉 的投与し、次いで１４−２８日後にこれを反復（ブースター）投与する。もちろ ん用量は療法技術分野で周知のとおり、年齢、体重および患者の全般的健康状態 にある程度依存するであろう。

″受動“免疫処置のための抗体の調製は、本発明の免疫原を哺乳動物に投与しく 好ましくはアジュバントを使用）、得られた抗血清を採取することにより実施し うる。長期間にわたって反復注射することにより、力価の向上が得られる。

抗体調製に用いられる動物には特に制限はないが、一般的にはウサギまたはモル モットを用いることが好ましく、ただしウマ、ヤギ、ブタ、ラット、ウシ、ヒツ ジなとも使用しうる。抗体産生に際しては、前記により得た抗原の一定量を生理 的食塩液で適切な濃度に希釈し、得られた希釈液を完全７０インドアジユバント と混合して懸１１ｉｌ液を調製する。この懸濁液を哺乳動物に投与する。たとえ ば上記の懸濁液をウサギに腹腔的投与する（抗原の量に応じて５０−２．５００ μｇ／回）。次いで２週間毎に最高約２−３力月間、好ましくは約１カ月間にわ たって懸濁液を投与して免疫処１を行う。抗体の採取は最終投与ののち１−２週 間経過した免疫処置動物から採血し、血液を遠心分離し、血液から血清を分離す ることにより行われる。

抗体にはヒトおよびネズミ　（ｍｕｒｉｎｅ）モノクローナル抗体が含まれる。

好ましくは異種動物免疫グロブリンに対する不都合な反応を最小限に抑えるため に、キメラヒト−マウス抗体（ヒトＦｃｆＪｉ域およびマウスＦ、、’領域から なる）の代わりにネズミモノクローナル抗体からのＦ。′フラグメント製剤で患 者を処置する。

不ズミモノクローナル抗体は、ケーラーおよびミルスタインの方法（Ｋ６ｈｌｅ ｒ、Ｇ、、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ，、Ｎａｔｕｒｅ　（ｏンドン）２５６．ｐ。

４９５　（１９７５）したとえば過剰免疫処置したマウスの膵臓細胞とマウス骨 髄腫細胞系との融合により調製しうる。

ヒトモノクローナル抗体の形成はこれより若干困難ではあるが、ヒトモノクロー ナル抗体の形成には下記を含めて多数の方法が採用される。

（１）エプスタイン−パルウィルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂ−細胞によるモノクロ ーナル抗体の産生。

（２）Ｂ−リンパ球ハイブリダイゼーションのための細胞系；（３）ヒト−ヒト ハイブリドーマ； （４）ヒト−ヒトハイブリドーマ、および（５）ヒトＸヒト−マウスへテロ／’ ｔイブリトーマ。

ヒトＸヒト−マウスヘテロハイブリドーマが極めて好ましく、これはヒトおよび ネズミ双方の親細胞タイプの好ましい特性を兼ね備えている。ヒトーネズミヘテ ロハイブリトーマ細胞系はＢ細胞融合に適したものとされた（テン、ラム、リエ ラおよびカブラン（Ｔｅｎｇ、Ｎ、　Ｎ、　Ｍ、　、Ｌａｍ、　Ｋ、Ｓ、　、Ｒ ｉｅ　ｒａ。

Ｆ、Ｃ，、Ｋａｐｌａｎ、Ｈ，Ｓ、）、［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、Ｕ、Ｓ、　Ａ、　、旦旦、ｐ、７３０８　（１９８３）］。

ヒト化抗体の構成のために好ましいモノクローナル抗体はブタペスト・トンテイ 特許寄託の対象であり、ユーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・ カルチャーズ（英国ウィルドジャー、サウスバリー、ポートン・ダウン）に１９ ９０年５月３１日に寄託されたものであり、以下ＤＥＣ７Ｂと表示する。

本発明方法に利用する場合、最も簡便には抗体を筋肉内注射によりホストに導入 することができる。ホストに受容しうるちのであり、かつホストに対する不都合 な副作用またはワクチンに対する有害な作用を示さない一般的な液体または固体 ビヒクルをいずれも使用しうる。リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）を生理的ＤＨ。

たとえばｐＨ６，８−７，２、好ましくはｐＨ７，０において、単独で、または 適切なアジュバント、たとえば水酸化アルミニウム系アジュバントと共に、ビヒ クルとして使用しうる。免疫原性抗原の′ａ度は一般に約１２５−１、好ましく は領　５ｍｌの溶剤量において、１回の注射当たり約５０−５００、好ましくは ２００−３００Ｊ１ｇである。初回注射ののち多数回の注射が必要であり、１年 毎に投与することができる。

ここで能動免疫処置に戻るが、″免疫原性キャリヤー物質″という語はここでは 、ホスト動物において独立して免疫原反応を誘発する特性を備え、直接にポリペ プチド中の遊離カルボキシル、アミンまたはヒドロキシル基と免疫原性キャリヤ ー物質上の対応する基との間でペプチド結合またはエステル結合を形成すること により、あるいは通常の２官能性結合基を通じて結合することにより、ポリペプ チドに共有結合しうる物質を含む。このようなキャリヤーの例には下記のものが 含まれる：動物血清のアルブミン、動物血清のグロブリン、動物のチログロブリ ン、動物のヘモグロビン、動物のヘモシアニン（特にキーホール・リンペット（ Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（ＫＬＨ））　、回虫（ａ　ｓ　 ｃ　ａｒｉｓ）から抽出した蛋白質（回虫エキス、たとえば特開昭５６−１６． ４１４号公報、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、、よよよ、ｐｐ、２６０−２６８　（１９７３ ）　、Ｊ。

品）：ポリリジン、ポリグルタミン酸、リシン−グルタミン酸コポリマー、リジ ンまたはオルニチンを含むコポリマーなど。最近、ジフテリアトキソイドまたは 破傷風トキソイドを免疫原性キャリヤー物質として用いてワクチンが製造され［ レポウ（Ｌｅｐｏｗ、Ｍ、Ｌ、）ら、Ｊ、ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓ ｅａ　ｓ　ｅ　ｓ、工ｊ且、ｐｐ、４０２−４０６　（１９８４）；およびコー エン・ビューヘリ−（Ｃｏｅｎ　Ｂｅｕｖｅｒｙ、Ｅ、）、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ 　ａｎｄＩｍｍｕｎｉ　ｔｙ、４０．　ｐｐ、３９−４５　（１９８３）］、こ れらのトキソイド物質もここで使用しうる。他の適切なキャリヤーはたとえば米 国特許第４，５７５．４９５号明細書に記載されており、ワクチン、有機ポリマ ーなどが含まれる。ツヘルクリンの精製蛋白質誘導体（ＰＰＤ）は下記の理由か ら″能動″免疫処置方式に用いるのに特に好ましい＝　（１）それはＴ細胞反応 自体を誘導せず（すなわちそれは事実上’Ｔ細胞ハブテン′である）、シかもそ れは完全プロセス抗原として挙動し、Ｔ細胞によりそのものとして認識される： 　（２）それは結合した認識モードにおいて最も強力なハブテン′キャリヤー“ の１っであることが知られている：および（３）最も重要な点として、それはこ れ以上の試験を行うことなくヒトに使用しうる。

ハブテン−キャリヤー結合剤としては、抗原の調製に際して慣用されるものを広 く使用しうる。

免疫原性キャリヤー物質へのペプチドの共有結合は当技術分野で周知の方法によ り行うことができる。たとえば直接的な共有結合のためには、カルボジイミド、 極めて好ましくはジシクロヘキシルカルボジイミドまたは１−エチル−３−（３ −ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを結合剤として用いることができる 。

グルタルアルデヒドも免疫原性キャリヤー物質へのペプチドの共有結合の手段と して用いられる。

上記においてハブテン、ハブテン−キャリヤー結合剤およびキャリヤーの割合は 適宜定めうるが、キャリヤーをハブテンの重量の約１〜約６倍、好ましくは約１ ＝約５倍の量で用い、ハブテン−キャリヤー結合剤をハブテンのモルの約５−約 １０倍の量で用いることが好ましい。上Ｓ己の反応によりキャリヤーはハブテン −キャリヤー結合剤を介してハブテンに結合し、ペプチド−キャリヤーコンプレ ックスからなる目的の抗原が得られる。

反応終了後、こうして得られた免疫原を透析法、ゲル濾過法、分別沈殿法などの 方法で容易に単離、精製することができる。

本発明に用いられるペプチドは当技術分野で周知の同相法によって容易に合成す ることができる。適切な合成は’Ｔ−ｂｏｃ’または’Ｆ−ｍｏｃ“法により実 施しうる。

環状ペプチドは周知の’Ｆ−ｍｏｃ“法およびポリアミド樹脂を用いて完全目動 化ＬＫＢバイオリンクス装置により固相法で合成される。

以下の実施例は本発明を説明するものである。

“ツイーン（Ｔｗｅ　ｅｎ）“は登録商標である。

実施例１−単離されたラットマスト明胞ミおけるペプチド（Ｆ２Ｏ）−ＫＬＨコ ラット腹膜マスト細胞は、腹膜を低温のＣａ″＋不含ＨＢＴ緩衝液（ヘペス（Ｈ ｅｐｅｓ）緩衝化タイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）−塩溶液）で洗出することにより 調製された。

へベス緩衝化タイロートー塩溶液（×１０濃縮）ＮａＣ１−１３７ｍＭ ＫＣｌ　−２，７ｍＭ ＮａＨｚＰＯ＜、２Ｈ２００，４ｍＭ グルコース　−５，６ｍＭ ＭｇＣｈ、６Ｈ２０−０，５ｍＭ Ｃａ　Ｃｌ　ｚ、２　Ｈ２Ｏ］、ｍＭ　（Ｃａ″“不含ＨＢＴ中には不在）上記 の処方を１リツトルの蒸留水中に調製し、使用時まで一２０℃に貯蔵し、使用時 点で２０°Ｃにおいて０．２Ｍ　ＮａＯＨまたはＯ，ＬＭ　ＨＣＩの添加により １．１０に希釈し、ｐＨ７，４に調整した。

細胞懸濁液を１２０Ｏｒｐｍで５分間遠心分離し、ＨＢＴ−Ｃａ”緩衝液中に再 懸濁し、再度洗浄したのち、最終的に２ｍｌのＨＢＴ−Ｃａ″４緩衝液中に再懸 濁した。少量をアルシアン・ブルーで染色し、計数した。この細胞を精製せずに 使用した。

合成ヒトε−鎖デカペプチド（Ｆ２Ｏと表示）　Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌ ｙ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−ｖａｌ−Ｐｈｅ−ＮＨ２をグルタルアル デヒドによりキャリヤー蛋白質（キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬ Ｈ）、シグマ・ケミカル社、トーセット、プーμ）に結合させた。１０−’−１ ０−’Ｍ　（Ｆ　３０の濃度ンのＦ２Ｏ−ＫＬＨコンジュゲートの系列希釈液１ ００μＩを含有する一連の試験管を用意し、次いでマスト細胞１０５個／ｍｌを 含有するアリコート（１００μｍ）を各試験管に添加した。対照として非コンジ ュゲート形のＦ３０ペプチドを用いて同様な一連の希釈液を調製した。

これらの試験管を３７°Ｃで３０分間インキュベートし１次いで低温のＨＢＴ− Ｃａ”不含緩衝液１ｍｌを各試験管に添加し、２．ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心分 離して反応を停止した。０．２５ｍ１の２Ｍ　ＨＣｌＯ４を入れた対応する１組 の試験管中へ上層液をデカントし、１．２５ｍ１の０．４Ｍ　ＨＣｌＯ４を細胞 ペレットに添加してそれらを細胞溶解した。

マスト細胞から放出されたヒスタミンの％を分光蛍光アッセイ法により測定した 。ペプチドの最大放出能は、それがＫＬＨにコンシュケートした場合、遊離ペプ チドの場合と比較して大幅に低下した。

結果を第１表に示す。

ラットマスト細胞からのヒスタミン放出　％ペプチド（Ｆ２Ｏ）　Ｆ２ＯＦ２Ｏ −ＫＬＨ濃度　の作用下　の作用下 ＯＭ　＜１０　＜１１ ０１０＝　１５　＜１０ ｔｏ”７Ｍ　１０　＜１０ １０−’Ｍ　１５　１１ ０１Ｆ５　５０　１５ １０−’Ｍ　７０　２２ ３種類の合成ヒトε−鎖ペブチト、すなわちアミド化された線状−非コンジュゲ ート形（Ｆ２Ｏ）、これのアミド化された２量体形（Ｆ６７）、および非アミド 化−システィン架橋環形（Ｆ２Ｏ）が、単離されたラットマスト細胞からヒスタ ミン放出を誘導する効力につき、実施例１に記載の方法に従って試験した。第２ 表の結果から分かるように、環形（Ｆ２Ｏ）および２量体形（Ｆ６７）は共に線 形（Ｆ２Ｏ）より明らかに低いヒスタミン放出を示し、ただし最高の試験量（１ ０−３Ｍ）においてはＦ４０ペプチドはＦ３０ペプチドと同程度の活性であった 。

ラットマスト細胞からのヒスタミン放出　％ペプチド　Ｆ２ＯＦ２ＯＦ６７ 濃度　の作用下　の作用下　の作用下 ＯＭ　２０　２０　２０ １０−’Ｍ　２０　２０　２２ １０−１′Ｍ　２０　２０　２０ １０−’Ｍ　４０　２０　２０ １０−３Ｍ　７０　７０　４０ Ｆ３０をＫＬＨまたはツベルクリンの精製蛋白質誘導体（ＰＰＤ）（！！水産お よび食品省（Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｆｉｓｈｅｒ ｉｅｓ　ａｎｄ　Ｆｏｏｄ）、中央獣医学研究所、ウェイブリッジ）に、グルタ ルアルデヒドを結合剤として用いて結合させた。キャリヤー蛋白質（５ｍｇ）お よび合成ペプチド（３ｍｇ）を２１ｍＭのグルタルアルデヒド（１ｍｌ）と共に ４℃で２−３時間インキュベートした。

雌ニューシーラント白兎（３，５ｋｇ、バクステッド・ラビット社）を完全７０ インドアジユバント中のペプチド−キャリヤー蛋白質コンジュゲート（２５０μ ｇ）の皮下注射により免疫処置した。不完全フロイントアシュノくシト中におけ る反復皮下注射を１４および２８日目に実施した。

各注射の１４日後に被験血液を採取し、得られた血清の抗ペプチド抗体活性を直 接および抑制ＥＬＩＳＡ（ハート、ヘイスチングスおよびスタンワース（Ｂｕｒ ｔ、Ｄ、Ｓ、、Ｈａｓｔ　ｉｎｇｓ、Ｇ、Ｚ、、Ｓｔａｎｗｏｒｔｈ、Ｄ、Ｒ， ）。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２３．ｐｐ、１８１−１９１　（ １９８６））により、９６つニル軟質ミクロタイタープレート（ファルコン、オ フスフオート、カウリー）を用いて測定した。各ウェルの光学濃度を４’９２ｎ ｍにおいて（ＯＤ４９２）ＢＢＣマイ゛クロコンピユータ−にインターフェイス した自動プレート読取り機（マルチスキャンＭＣ，フロー・ラボラトリーズ、ス コｙ　）ランド、イルビン）により測定した。

ウサギポリクローナル抗ペプチド（Ｆ２Ｏ）抗血清が示した検体ＥＬＩＳＡ滴定 終末点を第３表に示す。

血清　ＥＬＩＳＡ読み　ＱＤ４９２ 希釈度　ＮＲ５ウサギ　ウサギ　ウサギ　ウサギ未希釈　０．８０５　１．６７ ３　１．８０４　Ｌ、７１０　１．６７５１：５　０．４３４　１．７５１　１ ．８９４　１．８６５　１．７００１：２５　０．１０８　１．８０５　１．９ ４４　０．８９４　１．６５２１：１２５　０．０２３　１．３６７　０．８５ ９　０．１６４　０．４０４１：６２５　ｏ、ｏｏｏ　Ｏ，３０６０，１１００ ，０４２０，０６９１：３１２５　ｏ、ｏｏｏ　Ｏ，０５４０，００３０，０１ ３０，００５ＮＲ６−正常ウサギ血清 ウサギ１および２はペプチド（Ｆ’３０）−ＫＬＨコンシュケートで免疫処！さ れた。

ウサギ３および４はペプチド（Ｆ２Ｏ）−ＰＰＤコンシュケートで免疫処置され た。

ポリクローナル抗ペプチド抗血ｆｆ１（Ｆ２Ｏ）がヒトε−鎖デカペプチド（Ｆ ２Ｏ）　Ｌｙｓ　−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ　−Ｓ　ｅｒ　−ＧＬｙ　−Ｐｈ ｅ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｍａｌ　−Ｐｈｅ　−ＮＲ２と共に供給された場合に、デカ ペプチドのラット腹膜マスト細胞に対する直接ヒスタミン放出作用を抑制する効 力を測定することにより、インビトロアッセイを行った。

アリコート（１５０μｍ、約１０’個の細胞を含有）の精製ラット腹膜マスト細 胞をＣａ”添加へペス緩衝化タイロード液（ＨＢＴ）中において３７°Ｃで１５ 分間、等容量（１００μｌ）のデカペプチド溶Ｍ（１０−’Ｍ）およびウサギ抗 血清（ペプチドＦ３０に対する）（１：４．１：８または１：１６に希釈）の混 合物の存在下にインキュベートした。次いで６５０μｌのＣａ″１不含ＨＢＴ緩 衝液を添加し、懸濁液を遠心分離しく約５００ｇで１０分間）、上層液中へ放出 されたヒスタミンの量を標準自動分光蛍光分析法により測定した。

ペプチド（１０−５Ｍ）誘導ヒスタミン放出の最大抑制（すなわち９０％）は、 ウサギポリクローナル抗−Ｆ３０抗血清の１．４希釈液を用いて得られた（第４ 表に示す）。

第４表 インビトロにおけるポリクローナル 抗−Ｆ３０抗血清によるＦ３０誘導 ヒスタミン放出の抑制 放出ヒスタミン　抑制 正常ウサギ血清　２９．４　０ ポリクローナル抗ペプチド抗血清 希釈度　− （ｉ）ウサギ抗ペプチド（Ｆ２Ｏ）抗血清および感作アレルギー性血清の投与等 容量のウサギ抗ペプチド（Ｆ　３０）抗血清および実験的に卵アルブミンに感作 したラットからの血清の混合物を調製した。アリコートの各種希釈度の混合物（ すなわち未希釈、１・２．１．４．１．８．１・１６および１：３２）を２匹の 雄ウィスターラットに皮肉注射した。４８時間後にそれらを卵アルブミン溶液（ ２０μｇ／ｍｌ）およびエバンスブルー液（１％）の混合物（各０．２５ｍ１） の注射（ｉｎｔｒａｐｅｎａｌ）により攻撃した。動物を１．　５−２．　０時 間口に層殺し、それらの皮膚を剥離して下側から検査した。

青色（ＰＣＡ）反応を測定し、同様に感作ラット血清および正常ウサギ血清の混 合物を注射した２匹の対照動物において生じたものと比較した。第５表のＰＣＡ 得点により示されるように、青色反応がかなり低下した。

箪ｌ青 感作（卵アルブミン）血清を 投与した血清 投与した血清混合物　抗ペプチド　正常の希釈度　抗血清　ウサギ血清 （１１）ウサギ抗ペプチド（Ｆ２Ｏ）抗血清の投与７アレルゲン（卵アルブミン ）１１１．−一甲一饗嶋一１−―ｉ−■■■■■■■−一―−―−−１１１１１ −１１１１■■■−−■■―■１−■−−■―−蜘−攻撃と（ａ）同時、または （ｂ）２分前、または（Ｃ）２分後ラット（ウィスター）に、実験的に卵アルブ ミンに感作したラットからの血清の各種希釈液（未希釈、１．２．１：４．１・ ８または１：１６）を皮肉注射した。４８時間後に、１群（ａ）に等容量−（０ ，２５ｍ１）の卵アルブミン溶液（２０μｇ／ｍり（エバンスブルー液（２％） 中）およびウサギ抗ペプチド（Ｆ２Ｏ）抗血清の混合物（１：　１）を注射しく １ｎｔｒａｐｅｎａｌｌｙ）、他の群（ｂ）には卵アルブミン（２０μｇ／ｍｌ ）およびエノくンスブルー（２％）の混合物（１：　１）０．２５ｍ１を静脈内 注射する２分前に、ウサギ抗ペプチド（Ｆ２Ｏ）抗血清（０，２５ｍ１）を静脈 内注射した。第３群（Ｃ）のラット番ごは類アルブミン（２０μｇ／ｍｌ）およ びエノくンスブルー（２％）の混合物（１１）０．２５ｍ１を静脈内注射した２ 分後に、ウサギ抗ペプチド（Ｆ２Ｏ）抗血清（０゜２５ｍ１）を静脈内注射した 。動物を１．　５−２．　０時間口に層殺し、それらの皮膚を剥離して下側から 検査した。

得られた結果を第６表にまとめる。表中、各部位に観察された青色（ＰＣＡ）反 応の強度が＋／一方式で″採点″された。

実験　類アルブミンに感作したラット血清を注射したプロト　皮膚部位に見られ たＰＣＡ反応コール　希釈度 未希釈　１・２　１°４　１：８　１：Ｌ６ａ５．００　３．００　０．７５　 ０，２５　０．００ｂ　５．３０　４．００　０．７５　領ｏｏ　ｏ、ｏ。

ｃ　６．００　４．７５　２．２５　０，７５　０．００対照　６，００　４． ２５　３，００　１．７５　０．２５対照は抗Ｆ３０ペプチドの代わりにポリク ローナル抗ＦＯ２（γ−鎖）ペプチドを投与したものであった。

これらの数値から認められるように、ウサギ抗ペプチド抗血清を投与することに より（正常ウサギ血清と対比して）各種希釈度の感作血清を注射した部位におい て青色反応の低下がもたらされ、この抑制は攻撃抗原と同時にウサギ抗ペプチド 抗血清を投与された受動感作ラットの場合（ａ群）の方が、予め抗ペプチド抗血 清を投与された場合（ｂＯ）または攻撃抗原の後に抗ペプチド抗血清を投与され た場合（０群）より顕著であった。

実施例５−ＣＦＡおよびＩＦＡをアジュバントとして用いるヒトε−鎖デカベプ ラット群（雄、ウィスター）を、鉤　５ｍｌのニワトリ卵白（蛋白質２００ｍｇ ）および２．５ｍｌの百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ） することによって過感作した（ジャサニおよびスタンワース（Ｊａｓａｎｉ、Ｂ 、。

Ｓｔａｎｗｏｒｔｈ、Ｄ、Ｒ，）、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ ｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、３０．ｐｐ、５５−６８　（１９７９））、その結 果、それらの組織マスト細胞がＩｇＥ抗体により感作され、循環中に高水準の卵 アルブミン特異性１ｇＥ抗体が出現した。

（ｂ）ペプチド免疫処置法 ラット群をそれらの実験的感作（上記の実施例３（ａ）の記載による）の前また は後に、下記のプロトコールに従って合成ペプチドＦ３０−キャリヤー蛋白質コ ンジュゲート（ＫＬＨまたはＰＰＤ）により免疫処置した　まずペプチド−キャ リヤー蛋白質コンジュゲート（１ｍｇ／ｍｌ）を等容量の完全フロインドアシュ パンｌ−（ＣＦＡ）と共に乳化した混合物（２００μｌ）を動物に皮下注射した 。

不完全７０インドアジユバント（ＩＦＡ）と混合したペプチド−キャリヤー蛋白 質コンジュゲートの反復皮下注射を１４および２１日目に行った。

主免疫グロブリンアイソタイプおよびＩｇＧサブクラスに付随する抗ペプチド（ Ｆ２Ｏ）抗体活性をＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫アッセイ）により測定した。

９６ウエル軟質アツセイプレートをＦ３０ペプチドで被覆した。アリコート（１ ２０μｌ）の２．５μＭペプチド溶液を３７℃で１時間インキュベートした。次 いでプレートを０，０５％ＰＢＳ（’Ｊン酸緩衝食塩液）／ツウィーン緩衝液で 洗浄した。アリコー１−’（１００μｌ）の被験ラット血清を１：４希釈液から 開始し、次いで２倍希釈液としてＦ３０ペプチド被覆プレートに添加した。プレ ートを３７℃で１時間インキュベートした。正常ラット血清を対照として用いた 。プレートを０．０５％ＰＢＳ／ツウィーン緩衝液で洗浄した。１００μｌのヤ ギ抗ラットＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡおよび［ｇＥを１・１．０００の希釈度で添 加した。

抗体は０．０５％ＰＢＳ／ツウィーン緩衝液中に希釈された。プレートを３７° Ｃで１時間インキュベートしたのち、前記により洗浄した。ホースラデツイッシ ュペルオキシダーゼで標識したウサギ抗ヤギＩｇＧをＰＢＳ／ツウィーンで１＝ １゜０００に希釈したもののアリコート（１００μｌ）を、プレートに添加し、 ３７℃で１時間インキュベートした。プレートを前記により洗浄し、２０ｍｇの Ｏ−フ二二レンジアミン、２５０μｌのＨ２Ｏ２および５０ｍ１の０．１５Ｍク エン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５，０）からなる基質の１００μｌアリコートを添 加した。

５−１５分間発色させたのち、２５μｌの４　Ｎ　Ｈ２Ｓ　Ｏ＜をすべてのウェ ルに添加することにより酵素発色反応を停止した。各ウェル内容物の光学濃度を タイタレク自動プレート読取り装置により４２９ｎｍで読取った（ＯＤ４９２） 。

代表的結果を第７表に示す。

抗Ｆ３０　ＩｇＧ全量　卵アルブミンによるインビボ最大ＥＬＩＳＡ　攻撃に際 してのワクチン処理ＯＤ　ラットのヒスタミン放出 （ＯＤ４９２）　（ｎｇ／ｍ１） ＣａＢ６　０．０６　３３０ Ａ８９　０．　７５　７０ ＣＢ８９　０．０３　２１１０ Ｂ８９　０．３３　２００ Ａ８９：　実験的感作の前にペプチド−ＫＬＨコンジュゲートで免疫処置したラ ット群 Ｂ８９・　実験的感作の後に免疫処置したラット群ＣＡ３９およびＣＢ８９はそ れぞれ免疫処置していない対照ラット群である。

（ｉｉ）ＩｇＧ抗−卵アルブミン反応 ラットのＩｇＧ抗−卵アルブミン（すなわちアレルゲン）反応を同様にＥＬＩＳ Ａにより測定した。

９６ウエル軟質アツセイブレートをＰＢＳ中の卵アルブミン５μｇ／ｍｌ溶液の アリコート（１２０μｌ）と共に３７℃で１時間インキュベートすることにより 、卵アルブミンで被覆した。プレートを０．０５％ＰＢＳ／ツウィーンで洗浄し たのち、１００μｍの被験ラット血清を１４希釈液から開始し、次いで２倍希釈 液として卵アルブミン被覆プレートに添加した。次いでプレートを３７℃で１時 間インキュベートした。正常ラット血清を対照として用いた。０．０５％ＰＢＳ ／ツウィーンで洗浄したのち、１００μｌのヤギ抗う・ｙ　トＩ　ｇＧ　（Ｆ　 Ｃ）を１：Ｌ　０００　ＰＢＳ／ツウイーンの希釈度でプレートに添加した。次 いでプレートを３７°Ｃで１時間インキュベートした。０．０５％ＰＢＳ／ツウ ィーンで洗浄したのち、アリコート（１００μｍ）のウサギ抗ヤギＩｇＧ／ホー スラデツイッシュベルオキシダーゼをｔ：ｔ、ｏｏｏ　ＰＢＳ／ツウイーンの希 釈度でプレートに添加し、プレートを３７°Ｃで１時間インキュベートした。イ ンキュベーション後にプレートを前記により洗浄した。２０ｍｇの０−フ二二レ ンジアミン、２５０μｍのＨ２０２および５０ｍ１の０．１５Ｍクエン酸−リン 酸緩衝液（ｐＨ５，０）からなる基質のアリコート（１００μｌ）を添加した。

５−１５分間発色させたのち、２５μｌの４　Ｎ　Ｈ２Ｓ　０４をすべてのウェ ルに添加することにより酵素発色反応を停止した。

各ウェル内容物の光学濃度をタイターチク自動プレート読取り装置により４９２ ｎｍで読取った（ＯＤ４９２）。

実験的に卵アルブミンに感作したラットの循環ＩｇＥ抗−卵アルブミン水準に対 してヒトε−鎖デカベブチド（Ｆ　３０）による感作前−または感作後免疫処置 が及ぼす影響を、実験的に感作した対照（ペプチドによる免疫処置を行わないも の）のＩｇＥ抗−卵アルブミン水準に対比して表す代表的結果を第８表に示す。

１・３２　０Ｄ４９２ ＩｇＥ希釈液 ＣＡ３９　０．５４８ Ａ８９　０．２７４ ＣＢ８９　０．７７７ ８８９　０．６４４ Ａ８９　実験的感作の前にＦ２Ｏ−ＫＬＨコンジュゲートで免疫処置したラット 群 ＣＡ３９　免疫処置していない対照 Ｂ８９　実験的感作の後に免疫処置したラット群ＣＢ８９　免疫処置していない 対照 （ｄ）抗ペプチド（Ｆ２Ｏ）抗体産生がラットの過敏状態に及ぼす影響の評価実 験的に卵アルブミンに感作した（上記の実施例５（ａ）に従う）ラットの過敏状 態に対してペプチドによる感作前−または感作後免疫処置（上記（ｂ）章の記載 による）か及ぼす影響を、下記の方法により測定した。対照としての免疫処置し ていないラント群についても同様な実験を行った。

免疫処置群および対照群双方の動物から、卵アルブミン（５ｍｇ）の注射（ｊｎ ｔ　ｒａｐｅｎａ　］）による全身アレルゲン攻撃の前に採血した（尾静脈から ）。

１０分後に動物を層殺し、その時点でさらにそれらの心臓から血液試料を得た。

アレルゲン攻撃の前および後双方の血液試料からの血清中のヒスタミン水準を、 標準自動分光蛍光分析法により測定した７血清の抗体プロフィルはＥＬＩＳＡ（ 上記の実施例５　（Ｃ）に従う）により測定された。

ペプチド−ＫＬＨコンシュケートによるラット！！　（６）の感作前免疫処置に より、平均アレルゲン誘導性血清ヒスタミン水準が実質的に低下する。これはア レルゲン（卵アルブミン）攻撃に反応して対照群が示した平均値３３０ｎｇ／ｍ ｌに対比して、被験動物の血清において記録された平均ヒスタミン水準か７０ｎ ｇ／ｍｌであった第７表の検体データから認められるであろう。

ペプチド−ＫＬＨコンジュゲートによるラット群（６）の感作後免疫処置は、こ れよりはるかに劇的なアレルゲン誘導性ヒスタミン水準低下をもたらした。すな わち対照動物における平均値２１００ｎｇ／ｍｌから被験動物における２００ｎ ｇ／ｍｌへの低下であり、このデータも第７表に示される。

感作前−または感作後にペプチドで免疫処！したラットは、対照ラット群に対比 して著しいＩｇＭおよびＩｇＧ（第５表参照）抗ペプチド抗体反応を示した：し かし有意のＩｇＥ−抗ペブチト抗体反応は示さなかった。全身アレルゲン（卵ア ルブミン）攻撃に対して不都合な反応の徴候を示さず、かつそれらのベースライ ン血清ヒスタミン水準の有意の上昇を示さない後免疫処置うット６匹中５匹は、 それらの血清中に高力値のＩｇＧおよびＩｇＭ抗ペジペプチド２Ｏ）抗体を保有 していた。アレルゲン攻撃後に血清ヒスタミン水準の上昇を示した６匹目の免疫 処置ラットはその循環中に有意量の抗ペプチド抗体を保有しなかった。これらと 著しく対照的に対照（ペプチド免疫処置しなかった）感作ラットのうち２匹は全 身アレルゲン攻撃の２分後に致死的なアナフィラキシ−ショックのため死亡した 。

同様に、卵アルブミン（すなわち実験的アレルゲン）に対する前−および後免疫 処置ラットのＩｇＥ抗体反応を対照群に対比して測定したところ、ペプチドによ る前免疫処置の結果、循環ＩｇＥ−抗卵アルブミン水準の有意の低下か示された （第８表に示す）。

上記と同様に、実験的に感作したラットについて感作前−または感作後ペプチド 免疫処置実験を、ラントε−鎖デカペプチトＦ　４９　（Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ａｓ ｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ　−Ｐｈｅ　−Ｐｈｅ　−１１ｅ 　−Ｐｈｅ−ＮＨ２）　、またはＮ末端リジン残基がグリシンで置換された同族 体（Ｆ５７）を免疫原として用いて行った。

ペプチド（Ｆ４９）−ＰＰＤコンジュゲートによる感作前免疫処置により、平均 アレルゲン誘導性ａ清ヒスタミン水準は、対照群（ペプチド免疫処置しなかった ）が示した平均値３３０ｎｇ／ｍｌに対比してセロに低下し７た；これは第９表 に示される。一方、このペプチド−ＰＰＤコンジュゲートによる感作後免疫処！ は、アレルゲン誘導性血清ヒスタミン水準を対照動物における９５０ｎｇ／ｍｌ から５０　ｎ　ｇ／ｍ　ｌに低下させた。これに対し、実験的に感作したラット をラットε−鎖デカペプチド（Ｆ４９）の同族体（Ｆ５７）で前−または後免疫 処置した場合は、アレルゲン誘導性ヒスタミン放出に有意の影響がなかった（同 様に第７表から明らかである）。

ヒスタミン放出　ｎｇ／ｍｌ 対照Ａ　３００ Ｆ４９Ａ　０ Ｆ５７Ａ　６０６ 対照Ｂ　９５０ Ｆ４９Ｂ　５０ Ｆ５７Ｂ　１１５９ Ａ＝実験的感作前にペプチドで免疫処置Ｂ＝実験的感作後にペプチドで免疫処置 Ｆ４９＝ヒスタミン放出性ラットデカペプチドＦ５７＝非−ヒスタミン放出性ラ ットデカペプチドＦ４７同族体ラット群を実施例５　（ａ）の記載により感作し た。

（ｂ）ペプチド免疫処置法−ＡＩ　（ＯＨ）ｓをアジュバントとして使用感作ラ ット群を合成ペプチド（Ｆ２Ｏ）−キャリヤー蛋白質コンジュゲートにより免疫 処置した（ＰＰＤをコンジュゲートとして使用）。動物にペプチド−ＰＰＤ　（ １ｍｇ／ｍｌ）を等容量のＡｌ（ＯＨ）３アジユノくントに乳化した混合物（２ ００μｌ）を皮下注射した。この処置を１４日目に反復した。３５日目に尾採血 を行い、実施例５（Ｃ）の記載に従ってＥＬｆ　ＳＡにより抗ペプチド抗体全量 を測定した。

結果を第１０表に示す。

ラット　血清希釈度 １　０、ＬＯＯ，２００，４００，５００，５５０，５００，４５０，３０２０ ，４５０，５５０，７０１，００１，１ＯＬＩＯＬ、００　０．７９３　０．６ ０　０，６５　０．８５　０．９０　０．９５　０，７５　０，６５　０．４０ ４　０．６５　０．９５　１，００　１．００　１．００　１．００　０．８（ ）　０．４０５　０．７５　０，９０　０，９５　１．０５　１．４０　１．４ ５　Ｌ５０　１．２０（Ｃ）ペプチド−免疫処置法−ＣＰ−２０，４１６１（脂 質アミン）をアジュバントとして使用 上記（ｂ）に従ってラットの免疫処置を行った。ＣＰ−２０，９６１脂質アミン アジユバントに乳化したペプチド−ＰＰＤコンジュゲート（５００μｌ）を２回 、０および４間接に皮下注射した。３５日目に尾採血を行い、ＥＬＩＳＡにより 抗ペプチド抗体全量を測定した。結果を第１１表に示す。

Ｄ４９２ ラット　血清希釈度 Ｎｏ、　１：２　１：４　１：８　１：１６　１：３２　１：６４　１：１２８ 　１：２５６１　０．０８　０．３６　０，７０　０．８０　０，８０　０．９ ０　０．８０　０．７０２　０．４０　０，７５　０．９０　０，９０　１．０ ０　０．９０　０．８０　０．７０３　０．４５　０，８０　０．８５　０，９ ０　０．８５　０．８０　０．８０　０．７０４　０．７０　０．８０　０．９ ５　１．１０　１，１５　１，１０　０．８５　０．８０５　０．７０　０．８ ５　１．０ＯＬ、２ＯＬ、５０　１，３０　１．２０　０．８０ＢＡＬＢ／ｃマ ウスに、遊離ペプチドＦ３０　（１００μｇ）またはグルタルアルデヒド処理に より蛋白質キャリヤー（ＫＬＨまたはＰＰＤ）にコンジュゲートしたペプチドＦ ３０を等容量の７０インド完全アジユ１１ントに乳化したものを、腹腔内（ｉ、 ｐ、　）注射した。ペプチドまたはペプチドコンジュゲートを７０イント不完全 アジユバントに乳化したものの注射を、１４および２８日目に反復した。２８日 目以後に尾採血した試料を間接ＥＬＩＳＡにより、抗ペプチド抗体の存在につき アッセイした。融合の３日前に、血清抗体価の上昇を示すマウスにさらに１００ μｇのペプチドまたはペプチドコンジュゲート（１００ｍｌ）、等容量のＰＢＳ 　（ｐＨ７，２）中、をブースター注射ｃｉ、ｐ、　）　した。

（Ｂ）融合 過免疫処賀したマウスを頚部脱臼により層殺し、それらの膵臓を摘出し、細胞を 分離して洗浄した。膵臓細胞を対数増殖期の培養物からのマウス骨髄腫細胞系（ Ａｇ、８．６５３またはＮＳＯ／１）と融合させた。ケーラーおよびミルシュタ イン法（Ｋ６ｈｌｅｒ、Ｇ、、Ｍｉ　１ｓｔｅｉｎ、Ｃ，、Ｎａｔｕｒｅ　（ロ ンドン）２５６．ｐｐ、４９５　（１９７５））の変法により、膵臓細胞と骨髄 腫細胞をそれぞれ２１の比率で、４０％ＰＥＧ　（ポリエチレングリコール−分 子量１４５０）を用いて融合させた。融合懸濁液を９６ウエルプレート中に分布 させ、ＨＡＴ　（ヒボキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）を含有する 培地中で培養した。

１０日後にプレートをハイブリドーマの増殖につき検査した。これらの細胞から 分離した上層液を間接ＥＬＩＳＡにより、抗ペプチド抗体の存在につきスクリ目 的の抗体を産生ずるものとして陽性ウェルを同定した時点で、ｌ＼イブリッド細 胞を制限希釈法によりクローニングし、クローンを再開アッセイした。ハイブリ トーマをフラスコ内で培養するか、またはマウス内で増殖させることができる。

ブリスタン（ｐｒｉｓｔａｎｅ）（０，５ｍｌ、ｉ、ｐ、注射）でプライムした ＢＡＬＢ／Ｃマウスに腹水を生じさせ、数日後に１０’−１０”個のハイブリッ ド細胞を注入した。はぼ２−４週間後に腫瘍が形成され、マウスの腹腔に皮下注 射針を挿入することにより、蓄積した腹水を採取した。腹水中のモノクローナル 抗体の濃度を腫瘍の継代培養毎に測定した。これは５−１５ｍｇ／ｍｌである。

（Ｄ）アッセイ 培養物および腹水を間接ＥＬｒＳＡにより、前記実施例５（Ｃ）の記載（ラット 抗ペプチド抗体の検出につき）に従って被覆したミクロタイタープレートを用い て、モノクローナル抗ペプチド（Ｆ２Ｏ）抗体活性につきスクリーニングした。

第２工程は、ベルオキシダーセで１２２したヤギ抗ネズミＩｇＧ（全量）１：１ ゜０００希釈液と共にプレートを３７°Ｃで１時間インキュベートし１次いでそ れらを発現させ、標準法により読取るものであった。

検体ＥＬＩＳＡデータを第１２表に示す。

腹水　ＥＬＩＳＡ読み（ＯＤ４９２） ハイブリッド細胞系 ＤＥＣＩＢ　ＤＥＣ５Ａ　ＤＥＣ６Ｆ　ＤＥＣ７Ｂ　ＤＥＣ４Ｅ１：４０　１． ５９７　１．３２２　１．６９３　１．０６８　１３０５１：８０　１．５６７ 　１．３２７　１．４７３　１．１０２　１．２３５Ｌ：１６０　１．５５７　 １．３９５　１．３２９　１．０８７　１．０９２１：３２０　１．４７５　１ ．２９５　１．２１８　０．９９４　０．９２２１：６４０　１．２６６　１． １９２”１．０２５　０．６４２　０．７１３１：１２８０　１．０１５　０． ８０８　０．９４８　０．２３４　０．５１１１：２５６０　０．６３０　０． ６８１　０．９１０　０．１４０　０．３００上層液　１．３４２　０．９２３ 　１０２０　１．３５５　１０７９（１，４希釈） 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　３年１２月７３日［酊

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．カチオン性Ｎ−末端ヘッドおよび疎水性Ｃ−末端テイルを含むヒスタミン放 出性ペプチドの残基、ならびに該ペプチドに対する抗体を誘発することができ、 一方該ペプチドによるヒスタミン放出を抑制する残基からなる免疫原。
2. ２．Ｃ−末端かアミド化によりブロックされた、請求の範囲第１項に記載の免疫 原。
3. ３．Ｃ−末端テイルがＰｈｅ−Ｐｈｅ配列からなる、請求の範囲第１または２項 に記載の免疫原。
4. ４．Ｎ−末端ヘッドがＬｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ配列からなる、請求の範囲第１、 ２または３項に記載の免疫原。
5. ５．Ｎ−末端ヘッドがＣ−末端テイルから主として非極性かつ非疎水性のアミノ 酸残基２−６個により分離された、請求の範囲第１、２、３または４項に記載の 免疫原。
6. ６．Ｎ−末端ヘッドがＣ−末端テイルからＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ配列により分 離された、請求の範囲第５項に記載の免疫原。
7. ７．ヒスタミン放出性ペプチドの残基が配列：【配列があります】 を有する、請求の範囲第１項に記載の免疫原。
8. ８．ヒスタミン放出性ペプチドの残基が配列：【配列があります】 もしくは 【配列があります】 を有するか、またはそれらのアミド化もしくは非アミド化ヒスタミン放出性同族 体である、請求の範囲第１項に記載の免疫原。
9. ９．１分子のペプチド残基がヒスタミン放出性ペプチドの残基を構成し、残りが 抗体誘発性残基を構成する高分子ペプチドの形である、請求の範囲第１、２、３ 、４、５、６、７または８項に記載の免疫原。
10. １０．抗体誘発性残基がヒスタミン放出性ペプチドのコンジュゲートの残基から なる、請求の範囲第１、２、３、４、５、６、７または８項に記載の免疫原。
11. １１．抗アレルギー処置に用いられる、請求の範囲第１、２、３、４、５、６、 ７、８、９または１０項に記載の免疫原。
12. １２．請求の範囲第１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０項に記載の 免疫原およびアジュバントからなる、アレルギー処置用組成物。
13. １３．請求の範囲第１、２、３、４、５、６、７または８項に記載のヒスタミン 放出性ペプチドに特異的な抗体ドメインからなり、該抗体ドメインがヒスタミン 放出に関するトリガーシグナルを構成するＩｇＥのＨ鎖上のアミノ酸配列とも反 応性であるリガンド。
14. １４．モノクローナル抗体の形である、請求の範囲第１３項に記載のリガンド。
15. １５．抗体のＦａｂ′フラグメントの形である、請求の範囲第１４項に記載のリ ガンド。
16. １６．抗体のＦ（ａｂ′）２フラグメントの形である、請求の範囲第１５項に記 載のリガンド。
17. １７．抗アレルギー処置に用いられる、請求の範囲第１３、１４、１５または１ ６項に記載のリガンド。