JPH04505966A - 酵素電気化学的センサー電極およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素電気化学的センサー電極およびその製法発明の背景 本発明は概して酵素電気化学的センサーに関する。さらに詳しくは、酵素電極に 関する。本発明は、アメリカ合衆国エネルギー省（ｔｈｅ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎ ｔ　ｏｆ　Ｅｎｅｒｇｙ）との契約（契約番号シー７４０５−ＥＮＧ−１８’） の結果である。

酵素電極は、触媒素子（ｃａｔａｌｙｚｉｎｇ　ｅｌｅｓｅｎｔ）どして酵素を 従来の電極上に含む装置の一種である。該酵素は、電極に隣接して配置され、選 ばれた物質との反応で触媒作用を与える。その反応において、電気的に活性な種 が生成され（または消費され）、電極により検知され、電極に隣接した選ばれた 物質の量と機能的に関連した信号を生ずる。そのようなセンサーの潜在的に可能 な医学への応用においては、身体環境（ｂｏｄｙ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）に 含まれた種々の少量の物質を測定することができる。そのような物質には、ブド ウ糖、尿素、尿酸、トリグリセライド、アミノ酸、乳酸などが含まれる。ブドウ 糖の濃度は、種々の身体の状態、たとえば糖尿病の指標としてとくに重要であり 、ブドウ糖センサーは、正常でない状態を正常化するような他の装置と結合され てもよい。

例として、酵素グルコースオキシダーゼ（ｅｎｚｙｍｅｇｌｕｃｏｓｅ　ｏｘｉ ｄａｓｅ）は、ブドウ糖と酸素との反応で触媒作用を示し、グルコン酸と過酸化 水素を生ずる。過酸化水通酸化水素の量を決定することができる。それによって 、酵素に隣接する物質中のブドウ糖の濃度がわかる。従来、測定されるべき物質 の通過に適した重合体の膜の間に酵素を包み込むことにより、該酵素を適切な膜 の孔空間内に含めることにより、または該酵素が含まれた膜を形成することによ り、選ばれた酵素は、試料物質に隣接して保持されている。

参考までにここに含めた１９８３年１１月１５日にディー　オラジオ（Ｄ’０ｒ ａｚｉｏ）らにイッシュ−（Ｉｓｓｕｅ）された米国特許第４．４１５．８８８ 号明細書には、ひとつの層に酵素が組み込まれた多層膜を形成するために酢酸セ ルロースおよび酢酸セルロースの共重合体を用いることが示されている。その中 では、従来技術の多数の不利益が論じられている：セロファン膜は酵素に隣接し た妨害する高分子量の物質を通す；薄いフィルター膜は妨害する物質の通過を妨 げつるが、電極の感応性を維持するのに薄すぎて実用的でないであろう；積層構 造では、層をたがいに結合するために酵素に粘着性が要求され、そして層剥離し ゃすい；はんの少量の酵素を載置すること（ｌｏａｄｉｎｇ）のみが可能である 。前記特許、６６６に示されたセンサーは、酵素を固定化し、そして膜中に含ま れる酵素のより高い載置を可能にするためにグルコースオキシダーゼがその層の うちのひとつに含まれる酢酸セルロースの２層膜を形成することにより、これら の問題を解決することを試みている。より高密度の酢酸セルロースの外側の層は 、試料と接触し、妨害物質の通過を妨げるように形成される。酵素を含有した酢 酸セルロース層は、実質的に一体れる。第１の層では約１〜１０ミクロンの膜厚 が、第２の層では約４０〜８０ミクロンの膜厚がえられる。護膜は、検知のため の電解槽の電極の近傍で、過酸化水素を発生させるための酸素を含有した電解液 を有するポーラログラフの中に配置される。外側の層もまた、膜中の酸素の消耗 から起こる非線形信号を排除するために酵素に隣接したブドウ糖の流動を制限す るのに必要である。

ブドウ糖の濃度変化に対してすばやく対応するために、電極に隣接した、薄い、 すなわち、約１０ミクロン未満の厚さの層中に酸素を設けることが望ましいてあ ろう。従来技術の電極もまた、酵素反応の維持のために隣接する酸素源を必要と し、それゆえ局部的な酸素濃度に対して鋭敏である。また、インビボで用いられ るためにはセンサーを形成するいかなる物質も、安定でかつ生体適合性を有しな ければならないことに注意するべきである。さらに、アスコルビン酸や尿酸のよ うな血液環境中の他の酸化しうる物質からの妨害を最小にするのが望ましい。

グルコースオキシダーゼとともに用いるための保護膜としてパーフルオロスルホ ン酸重合体、とくにナフィオン（Ｎａｒｉｏｎ）　（デュポン社（Ｄｕ　Ｐｏｎ ｔ　ＣｏＢａｎｙ　）の登録商標）を用いることは、ここに参考までに含まれる ／％リソン　（Ｈａｒｒｌｓｏｎ）らの「キャラクタリゼイション・オブ・パー フルオロスルホニツク・アシッド・ポリマー・コーチイド・エンザイム・エレク トローズ・アンド・ア・ミニアチュライズド・インテグレイテド・ポテンシオス タット・フォア・グルコース・アナリシス・イン・ホール・ブラッド（Ｃｈａｒ ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｒＰｅｒｆｌｕｏｒｏｓｕｌｆ’ｏｎｉｃ＾ａｉ ｄ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｃｏａｔｅｄ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ　ａ ｎｄ　ａＭｊｎｉａｔｕｒｌｚｅｄ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｐｏｔｅｎｔｉｏ ｓｔａｔ　ｆｏｒ　ＧｌｕｃｏｓｅＡｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｗｈｏｌｅ　Ｂｌ ｏｏｄ　）　Ｊ　６０巻、アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌ、Ｃｈｅｒ Ａ、）　、１９番２００２〜２００７頁（１９８８年１０月１日）中に示されて いる。酵素が被覆されたイオン感応性電界効果型トランジスター（Ｅｎｚｙｍｅ −ｃｏａｔｅｄｌｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｆｉｅｌｄ　ｅｆｆｅｃｔ　ｔｒ ａｎｓｆｓｔｏｒｓ（ＩＳＦＥＴ））は、酵素層上に、酵素分圧に対する感度を 減じ、充分な電気化学的性能を与え、すなわちブドウ糖に対して半透過性で、酵 素層を保護し、生体適合性を有し、かつ再現可能な結果かえられたナフィオンで 被覆され、半透膜が形成されていた。厚さ１．７　ミクロンのナフィオン層を有 する装置は、全血サンプル中で、ナフィオン層が電極の周囲のガラスシュラウド から分離する前の約６日間、首尾よく作動した。厚さ１．７　ミクロンのナフィ オンは、１．２ＩＩＭの低いブドウ糖濃度で信号の応答を与えた。しかしながら 、線形の応答は２８５Ｍ！でのブドウ糖濃度のみでえられ、応答時間は５〜１７ 秒間であった。ハリソンらも、ナフィオンの付着に伴う問題について言及してい る。さらに、ナフィオンカバー中のあらゆる開口部が、試験中の物質に酵素をさ らし、酵素の劣化をまねくことになるであろう。

本発明は、従来技術のこれらのおよびその他の問題に取り組み、改良された酵素 電気化学的センサーを提供するものである。

本発明のひとつの目的は、酵素が試験中に物質から劣化を受けないマトリックス 中で、センサーの電極に隣接する適切な酵素を提供することである。

本発明の別の目的は、向上した応答時間を有する酵素の薄層を提供することであ る。

さらに別の目的は、試験される物質中の望ましくない酸化しうる成分からの妨害 を排除するマトリックス中に酵素を提供することである。

本発明の別の目的は、膜に近傍の酸素分圧に対する感度が非常に減じられた電気 化学的センサーを提供することである。

本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴は、一部は以下に開示され、そし て一部は以下の実施例で当業者に明らかになるかまたは本発明の実施により知ら れつる。本発明の目的および利点は、とくに添付の特許請求の範囲で指摘された 手段および組み合せによって実現され、達成されうる。

発明の概要 前記のおよび他の目的を達成するために、そして本発明の目的にしたがって、こ こで具体化され、広く記載されたように、本発明の装置は、パースルホン酸重合 体中に、過酸化水素を生成する選ばれた物質と酸素との間の反応で触媒作用を与 えるのに有効な分散された酵素を有する、前記の導電体上の薄い被膜（ｃｏａｔ 　Ｉ　ｎｇ）を有する電気化学的センサー電極からなりうる。ある特定の実施態 様においては、分散された酵素を有するパーフルオロスルホン酸重合体は、該導 電体上に、選ばれた物質を含む溶液と接触して１層の被膜を形成する。

本発明の別の特徴づけにおいて、電気化学的センサー電極は、パーフルオロスル ホン酸イオノマーおよびあらかじめ定められた物質の濃度を測定するため選ばれ た酵素を含有するキャスティング（ｃａｓｔｉｎｇ）溶液からつくられる。該パ ーフルオロスルホン酸イオノマーは、酵素に影響を与えないｐＨに中和されたア ルコール溶液中に供給される。つぎに、あらかじめ定められた物質の予想される 濃度に対して望ましい感度とするのに有効な量の酵素をイオノマー溶液に添加す る。酵素を有するイオノマー溶液をつぎに導電体へ適用し、電気化学的センサー 電極を形成する。

図面の簡単な説明 添付の図面は、明細書に組み入れられ、その一部をなすものであり、本発明の実 施態様を説明し、明細書の記載とともに本発明の詳細な説明するものである。図 面に図１は、本発明における電気化学センサーの概略図である。

図２は、本発明による電気化学センサーの出力の安定性を示すグラフである。

図３は、本発明による電気化学センサーの１実施態様のブドウ糖濃度の範囲に対 する応答出力のグラフである。

発明の詳細な説明 本発明にしたがって、パーフルオロスルホン酸イオノマーおよび酵素のキャステ ィング溶液を調製し、電極の導電体を該溶液で被覆し、該酵素を含むフィルムを 、該酵素により触媒作用が及ぼされる酸素との反応を行なう選ばれた物質の濃度 の変化に対して望ましい応答時間を有し、あらかじめ選ばれた感度をうるのに必 要な量の酵素を提供する厚さで形成する。一体化されたフィルムは、酵素の劣化 の懸念なしに膜としてキャスト（ｃａｓｔ）されるかまたは直接電極の導電体の 表面上にキャストされうる。

形成されたパーフルオロスルホン酸重合体は酵素用の不溶性で生体適合性を有す るマトリックスを提供し、そして該酵素は、インビボまたはインビトロの環境か らの細菌による劣化に対して保護される。さらに、該酵素は、その電極構造の中 で連続して使用しうる状態にある。該パーフルオロスルホン酸重合体は、またつ ぎに酵素の近傍で信号発生のための過酸化水素の生成を促進するのに有効な多量 の酸素を溶解する。

ある特定の実施態様においては、パーフルオロスルホン酸イオノマーおよびグル コースオキシダーゼを用いてブドウ糖感応性電極を形成した。パーフルオロスル ホン酸イオノマー、ナフィオンは、典型的には５重量％ナフィオンの、アルコー ル／水の混合溶液の溶液として市販されている。該ナフィオン溶液をリン酸塩緩 衝液（ｐＨ−７）を添加することにより、実質的な量、たとえば１０倍に希釈し 、グルコースオキシダーゼを該緩衝液に添加した。

つぎにえられた溶液を、平板状の電極に局部的に適用することによって、または メツシュおよびワイヤーで浸漬塗装を行なうことによって、電極に適用すること ができる。３ミクロンまたはそれ以下の典型的な層厚で充分で成するべく調製さ れた酵素被膜は、従来技術の電気化学的センサー電極よりも改良された性能特性 を与える。該電極は、電極の導電体上に活性なナフィオン−酵素材料の単一層の みを必要とし、容易につくることができる。

えられた薄い被膜はブドウ糖の添加に対して迅速な応答時間（２〜４秒間以下） を与え、飽和前の広い範囲のブドウ糖濃度（少なくとも１〜ＩＩＯＩＭ）に応答 する。パーフルオロスルホネートもまたサンプル中の水の存在下で解離する。生 成した負に荷電したイオンは、アスコルベートやウレートのような妨害アニオン を排除すると信じられている。さらに、該複合材料は、きわめて安定であり、長 期間にわたって実質的な、そしてほぼ一定の性能を示す。該酵素触媒を含有する ナフィオンマトリックスにおける酸素の高い溶解性はまた応答を安定化し、低酸 素環境下または高いブドウ糖濃度を含む応用のもとて電極の使用に対して潜在的 な利益を供するものである。後述する実施例１によって形成されたキャスティン グ混合物（２０μｇ）を白金の回転する円板状の電極（面積−〇。

５８１ｃＪ）に適用し、約８０分間空気乾燥した。えられた被膜にはナフィオン １００μｇあたり酵素約４μｇが含まれている。

実施例１ １、市販の５％ナフィオン溶液（ツルージョン・チクノロシーズ（Ｓｏｌｕｔｉ ｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を水を用いて１０倍に希釈する。

２、溶液をＮａＯＨおよびリン酸塩緩衝液でｐＨ−７，２に調整する。

３．希釈されたナフィオン溶液にグルコースオキシダーゼを添加する（ナフィオ ン溶液２．５ｍｌにｌｏｎ＋ｇ／ｍｌグルコースオキシダーゼ５０μｇを加えた ）。

４、電極構造にキャスティング混合物を適用する。

パーフルオロスルホン酸（ナフィオン）は水中で解離し、酵素を変性させる強酸 性溶液を生ずるということが認められるだろう。本発明にしたがって、酵素をパ ーフルオロスルホン酸溶液中に混入する前に酸性溶液を実質的に中和することに より酵素活性が維持される。いったん酵素を加えてキャスティング溶液が形成さ れれば、その混合物をただちに導電性電極の構造に適用し、硬化させて電気化学 的センサー複合電極を形成する。驚くべきことに、該複合電極中の酵素活性は、 つぎに該酵素を含有するパーフルオロスルホン酸重合体マトリックス中で維持さ れる。

さて、図１に言及すると、電気化学的センサーアセン触し、上述したような電気 的に活性な物質を生じる。

前記のように組み立てられたセンサー電極の応答をリン酸塩緩衝液へのブドウ糖 の添加に対して測定した。応答は、リン酸塩緩衝液中のグルコースオキシダーゼ の０．１１３Ｍの濃度増加に対して測定された。応答時間は、ブドウ糖注入時点 からより高く、安定した状態の電流に達するまでにかかる時間と定義される。こ の応答時間は、約３ミクロンの厚さのナフィオン−グルコースオキシダーゼ層を 有するテストセンサーでは典型的には２〜４秒間であった。１〜１０ミクロンの 層厚で適切な性能が与えられる。さらに、図１に示すように、該センサーは５０ 日を超えるテスト期間の終わりまで安定な性能を示した。

該電極には概して初期の高レベルの電極性能が見られ、そのあとテスト期間中酵 素活性の一般的な持続を示す実質的に一定した性能が見られた。

図２は、ブドウ糖の連続添加に対する酵素センサーの典型的な応答を示す。電極 で測定される電流は、１ａＭから１１３１Ｍまでのブドウ糖濃度においてよく応 答し、段階的に増加している。このブドウ糖濃度の範囲は、他の公知のブドウ糖 のセンサーで達成可能なブドウ糖範囲よりも実質的に広く、パーフルオロスルホ ン酸マトリックスが該酵素の近傍で適切な酸素供給源を維持する能力があること を示している。図２は、またアルゴンガスをブドウ糖が添付されているリン酸塩 緩衝液を通してバブリングすることにより、その系から酸素をパージ（ｐｕｒｇ ｉｎｇ）することに対する電極の応答を示している。処理の１時間後、電極の電 流はなお初期値の４０％であり、ナフィオン中の酸素の保持の効果と同時に試験 媒体中の局部酸素濃度に対する減少した感応性を示している。

気化学的センサーを、ヒト血清サンプル中でも試験した。

血清へのブドウ糖の添加に対するセンサーの応答は、リン酸塩緩衝液で測定した 応答と同様であった。２１１Ｍブドウ糖の添加は、２〜４秒間の応答時間で容易 に測定された。

図２および３に示される電極の性能は、実施例１の手順にしたがって形成された センサーを用いてえられたものであるが、広い範囲の同等のキャスティング溶液 の混合物を用いることができる。例として、アルコール含量のセンサー活性に対 する効果を、ナフィオンおよび酵素の含量を一定に保ちながら、種々の割合の５ ％ナフィオることにより測定した。満足しうる活性を有するセンサーは、アルコ ールを４０重量％まで含むキャスティング溶液に対してえられた。しかし、アル コールの限界濃度は測定することができなかった。

ナフィオン１ｇあたり４．２０および１００ｍｇのグルコースオキシダーゼの酵 素載置量（Ｉｏａｄｉｎｇ）がブドウ糖の変化に適度に応答することがわかった 。表Ａは、溶液中ブドウ糖１６ｉＨに対するセンサーの応答を示している。セン サーの感度（電流／載置量（ｌｏａｄｉｎｇ）比）は比較的一定していることが わかる。

表　Ａ ｌｌ１ｇグルコースオキシダーゼ ７ｇナフィオン　電流（μ）　感度 ４　０．７０　０．１７５ ２０　４．０　０．２０ １００　１９．８　０．１９８ 酵素フイルムの性能における影響を測定するために、グルコースオキシダーゼを 含有しないナフィオンの保護層を電気化学的センサーの電極構造に加えた。該ナ フィオン層からの電気化学的センサーの電極の応答時間への影響は観測されなか ったが、センサー活性において約７５％の減少があった。保護ナフィオンフィル ムは、厚さ１μｍの酵素フィルム上で、厚さ約１μｍであ゛った。

本発明は酵素グルコースオキシダーゼでの使用に限定されるものではないことも また認められるであろう。他の多くの酵素が特異的な物質と反応し、そのような 特異的な物質の存在と機能的に関連した電気的信号を生じる過酸化水素を生じる 。適当な酵素には、ガラクトースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、乳酸 オキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼおよびコレステロールオキシダーゼが含ま れる。電気化学的センサーにおける使用に対するこれらの酵素の相対的な当量は 、１９８９年１月３日にニイヤマ（Ｎｉｌｙａｓａ）らにイッシューされたここ に参考としてあげる米国特許第４．７９５，７０７号明細書に示されている。特 異的な物質の存在下で過酸化水素を生ずるそのような酵素は、本発明にしたがっ て、パーフルオロスルホン酸重合体中に含まれ、安定し、感度がよい電気化学的 センサーの電極を形成しうる。

前記本発明の種々の実施態様は、例示および説明を目的として示されたものであ る。開示されたまさにそのものに本発明が限定されることを意図したものではな く、前記の教示に照らせば、明らかに多くの変更および変動が可能である。実施 例は、本発明の原理の最良の説明およびその実際の応用のために選ばれ、開示さ れたものであり、その実際の応用によって他の当業者はその企図する特定の使用 に適した種々の実施態様において、そして種々の変更で本発明をもつともよく利 用することができる。本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によって定められる ことを意図している。

調製からの時間 電　流（マイクロアンペアン 発明の要約 パーフルオロスルホン酸イオノマーおよび選ばれた酵素を含有するマトリックス （２８）で被覆された導電体く２６）から電気化学的センサー電極が形成される 。選ばれた酵素は、導電体で検知される電気化学的に活性な化合物を生成する、 溶液中のあらかじめ定められた物質と酸素との間の反応に触媒作用を与える。生 成したパーフルオロスルホン酸重合体は、金属の導体上で薄い被覆のみが要求さ れる、長命の酵素活性のために該酵素に対して安定したマトリックスを提供する 。該重合体は、また妨害物質が酵素に接触するのを有利に排斥し、試料中の酸素 が消耗している状態にある量感知能力を維持するために多量の酸素を含有する。

ある特定の実施態様においては、グルコースオキシダーゼをパーフルオロスルホ ン酸イオノマーと混合し、ブドウ糖検知用の電極を形成する。

国際調査報告 ｍｌ＠−１１６１１，わ、灯！δ頭１０７１３６

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．導電体、および パーフルオロスルホン酸重合体中に、前記導電体で検知するための過酸化水素を 生ずる、選ばれた物質と酸素との間の反応で触媒作用を与えるのに有効な分散さ れた酵素を有する該重合体の、前記導電体上の薄い被膜 からなる電気化学的センサー電極。
2. ２．前記酵素がグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、アルコー ルオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼおよびコレステロー ルオキシダーゼよりなる群から選ばれたものである請求項１記載の電気化学的セ ンサー電極。
3. ３．前記被膜が１〜１０ミクロンの厚さのものである請求項１記載の電気化学的 センサー電極。
4. ４．本質的に、導電体、および パーフルオロスルホン酸重合体中に前記導電体で検知するための過酸化水素を生 ずる、選ばれた物質と酸素との間の反応で触媒作用を与えるのに有効な分散され た酵素を有する該重合体の、前記導電体上の薄い被膜からなる電気化学的センサ ー電極。
5. ５．前記酵素がグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、アルコー ルオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼおよびコレステロー ルオキシダーゼよりなる群から選ばれたものである請求項４記載の電気化学的セ ンサー電極。
6. ６．導電体を設け； アルコール溶液中にパーフルオロスルホン酸イオノマーを備え； 酵素に影響を与えないｐＨを形成するように前記溶液を中和し、； あらかじめ定められた物質の濃度に対して望ましい感度を与えるのに有効な量の 酵素を前記イオノマー溶液に加え；そして 前記酸素を有する前記イオノマー溶液を前記導電体に適用する ステップからなる、あらかじめ定められた物質の濃度を決めるために選ばれた酵 素を用いる電気化学的センサー電極の製造法。
7. ７．前記酵素がグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、アルコー ルオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼおよびコレステロー ルオキシダーゼよりなる群から選ばれたものである請求項６記載の方法。
8. ８．前記酵素を有する前記イオノマー溶液を前記導電体上に適用し、厚さ１〜１ ０ミクロンの被膜を形成する請求項６記載の方法。
9. ９．前記酵素がグルコースオキシダーゼであり、前記有効量が４〜１００ｍｇグ ルコースオキシダーゼ／ｇパーフルオロスルホン酸イオノマーである請求項７記 載の方法。