JPH04506064A

JPH04506064A - プラスモディウムの環状スポロゾイトタンパク質の反復配列欠損アナログ

Info

Publication number: JPH04506064A
Application number: JP2506475A
Authority: JP
Inventors: バー，フィリップ　ジェイ．; バサースト，イアン　シー．; ギブソン，ヘレン　エル．
Original assignee: カイロン　コーポレイション
Priority date: 1989-04-11
Filing date: 1990-04-11
Publication date: 1992-10-22
Also published as: EP0467965A1; AP134A; CA2051432A1; PT93721A; EP0392820A3; WO1990011775A1; ZA902741B; NZ233255A; EP0392820A2; AU5524290A; AP9000176A0; EP0467965A4; IL94063A0; AU635265B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】プラスモディウムの　スポロゾイトタンパク　の反′配夕１λ１ニニニエ１亙立豆本発明は分子生物学および生化学の分野に属する。さらに詳しくは、本発明は、野生型タンパク質の反復配列を１つあるいはそれ以上欠損しているプラスモデイウムの環状スポロゾイト（ＣＳ）タンパク質の免疫原性アナログに関する。

！！マラリアはプラスモディウム属寄生体の感染により引き起こされる、衰弱させる疾病であり、蚊に刺されることによって伝染する。蚊が刺すと、蚊の唾液腺に存在する、寄生体の分化した形であるスポロゾイトが、宿主の血流に浸入する。

スポロゾイトは、最終的に一次標的細胞、例えば、肝細胞に入る。ヒトに感染する主なプラスモデイウムの種はＰ、ｆａｌＣｉ凹二徂およびｐ、　ｖｔｖａｘである。他の種、例えば、Ｐ、　ｏｖａｌｅおよびＰｆｆｉａｌａｒｉｅがヒトに感染する頻度はより低い。他の寄生体の種もまた他の哺乳類に感染し、例えば、誓言類に感染するし」ヒ」加りがある。

マラリアに対するサブユニットワクチンを生産するためにこれまでに相当な努力がなされてきた。この仕事のかなりの部分がニニーヨーク大学（ＮＹＵ）の研究者らによってなされ、スポロゾイトの表面を覆うＣＳタンパク質に焦点がおかれてきた。ＮＹＵはＣＳタンパク質の技術に関する一連の特許出願を出願している。

彼らの最初の特許である、米国特許第４，４４６，９１７号には、スポロゾイト溶解産物から精製したＰ−４４（Ｐはプラスモディウムを表し、４４は推定分子量を牛ロダルトン単位で表している）と呼ばれるスポロゾイトタンパク質のあるクラスが記載されている。

ＷＯ３４１０２９２２には、比較的短いエピトープ配列の縦列反復からなるＣＳタンパク質の免疫的優性領域の同定、およびこのようなエピトープの反復から構成されるペプチドの合成が記載されている。ＷＯ３６１００９１１には、Ｌユ註ムニ圧眼のＣＳタンパク質の反復エピトープ配列の同定および特徴づけ、そしてそれらの縦列反復から構成されるペプチドの合成が記載されている。同様に、ＷＯ３７１００５３３には、Ｐ、　ｖｉｖａｘのＣＳタンパク質の反復エピトープ配列の同定および特徴づけが記載されている。この特許出願は、このＣＳタンパク質の他の断片が縦列反復と共に含まれ得ることを示唆している一方、タンパク質の免疫原性が反復したエピトープの存在に依存していることを明確に教示している。フランキング（側面隣接）領域を含有するペプチドの例は挙げられていない。

ＷＯ３６１０１７２１は、ＣＳタンパク質の縦列反復エピトープの両側に存在する、電荷をもつ特定の領域が免疫原性であることを教示している。これらの領域の配列に相当するペプチドが合成され、抗−Ｃ５抗体と結合することが示された。これらの合成ペプチドの結合体がテスト動物中に抗−Ｃ８抗体を誘導すると報告された。

ＮＹＵと本発明の譲受人とが共有する、米国特許出願第０３２３２７号には、Ｐ、ｖｉｖａｘのＣＳタンパク質の免疫原性アナログが記述されている。このアナログは、野生型分子の縦列反復の全領域およびこの反復配列の両側にある側面隣接配列の選択された部分から構成されている。このポリペプチドは、前述のＮＹＵの特許／特許出願の出願人らが調製したペプチドより優れた免疫原性を示した。

Ｅｉｃｈｉｎｇｅｒら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９８６）　６：３９６５−３９７２、ｄｅ　ｌａ　Ｃｒｕｚら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐａｒａｓｔｔｏｌｏｇｙ　（１９８８）　２８：３Ｌ−３８、およびＲｏ＋１ｅｒｏら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ８９　（１９８９）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ｐｐ、３３５−３４０が、Ｐ、−二幻徂ブラスモディウムのＣＳタンパク質に関するこれまでの文献の全てをもってしても、どの構築物が人体においてマラリアに対して防御を行うインビボの反応を与えるかはまだ不明である。この点に関して、反復領域が非常に免疫優性であるために、スポロゾイト中和における縦列反復以外の領域に対する免疫応答の役割は深く評価されていない。

及朋ヱ」１玉本発明は、反復領域の側面隣接領域のエピトープに対して、反復領域の免疫優性を減少させると、スポロゾイト中和活性を質的に促進するという概念に基づく。

従って、本発明は、プラスモチイウムＣＳタンパク質の免疫原性アナログ、このようなタンパク質を作成するための組換えポリヌクレオチドおよび形質転換された宿主、およびこのようなタンパク質を免疫原として用いるワクチン組成物に向けられている。このプラスモチイウムＣＳツノ免疫原ノ免疫原性アナログは、野生型ＣＳタンパク質の反復エピトープを１つあるいはそれ以上欠損しているが、野生型ＣＳタンパク質の各非反復の側面隣接領域からの非反復側面隣接エピトープを少なくとも１つ有する。

さらに詳細には、本発明の一面は、プラスモチイウムＣＳタンパク質の免疫原性アナログであり、このアナログは以下の領域を包含する：（ａ）野生型プラスモチイウムＣＳタンパク質の反復配列の少なくとも２回繰り返しから構成される内部領域あるいはドメインであるが、その反復配列の繰り返し回数が野生型プラスモチイウムＣＳタンパク質に存在する繰り返し回数より少ない、領域あるいはドメイン；（ｂ）内部領域の側面に隣接するアミノ末端領域あるいはドメインであって、野生型プラスモチイウムＣＳタンパク質の非反復アミノ末端側面隣接領域の少なくとも１つのエピトープに相当するアミノ酸配列を有する、領域あるいはドメイン；および（Ｃ）内部領域の側面に隣接するカルボキシル末端領域あるいはドメインであって、野生型プラスモチイウムＣＳタンパク質の非反復カルボキシル末端側面隣接領域の少なくとも１つのエピトープに相当するアミノ酸配列を有する、領域あるいはドメイン。

本発明の他の面は、前述のプラスモチイウムＣＳタンパク質アナログをコードする組換えポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを宿主細胞内で発現させる発現ベクターであって、宿主細胞内でＤＮＡを発現させ得るＤＮＡに、作動可能に連結したＤＮＡを含有する発現ベクター、およびこのようなベクターで形質転換され、このようなアナログを生産し得る宿主細胞である。。

さらに、本発明の他の面は、ＣＳタンパク質の免疫原性アナログを含有するワクチン、およびこのようなワクチンを免疫感作してマラリアから個体を防御する方法である。

殴ｉユ１虱工塁玉図面において：ｌ５ＵＩは、１７．　ｖｆｖａｘのＣＳタンパク質アナログ、Ｖｉｖａｘ３のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列を示す。

図２は、図１に示されているＤＮＡ配列の構築に用いられたオリゴマーおよび連結反応の概略を示す。

図３は、プラスミドｐＢｓ１００の略図である。

図４は、プラスミドｐＢｓ２４．　１の略図である。

図５は、ｐ、　ｖｉｖａＸのＣＳタンパク質アナログ、Ｖｉｖａｘ３．１のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列を示す。

図６は、図５に示されているＤＮＡ配列の構築に用いられたオリゴマーおよび連結反応の概略を示す。

図７は、プラスミドｐＡＢ　１２５の略図である。

図８は、Ｌコ創μ±ａｒｕｍのＣＳタンパク質アナログ、Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ３のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列を示す。

図９は、図８に示されているＤＮＡ配列の構築に用いられるオリゴマーおよび連結反応の概略を示す。

図１０は、ＬコニＪ上ａｒｕｍのＯＳタンパク質アナログ、ＦａＩＣｉｐａｒｕｍ４のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列を示す。

図１１は、Ｐ、　融」１虹のＣＳタンパク質アナログ、Ｂｅｒｇｈｅｊ３のアミノ酸配列およびそれをフードするＤｎａ配列を示す。

図１２は、図１１のＤＮＡ配列の構築に用いられたオリゴマーおよび連結反応の概略を示す。

（以下　余白）発註を　するための形態１．　Ｕ五用語「野生型プラスモチイウムＣＳタンパク質の反復配列」とは、野生型プラスモディウムＯＳタンパク質の中央の免疫優性領域あるいはドメインに存在する反復しているアミノ酸配列、およびこれらの反復配列の、免疫原性を損なわない改変を意味する。Ｐ、　ｖｉｖａｘおよびＰ、　ｆａｌｃｉ　ａｒｕｍの野生型反復配列が上記のＮＹＵの特許出願に記載されている。Ｐ、　ｂｅｒ眩虹の野生型反復配列が、Ｅｉｃｈｉｎｇｅｒら、前出、に述べられている。

例えば、ｐ、　ｖｉｖａｘの反復配列はＡｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ／Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙであり、Ｐ、　ｆａｌｃ’　ａｒｕｍの反復配列はＡｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰｒｏおよびＡｓｎ−Ｖａ　１−Ａｓｐ−Ｐｒｏであり、モしてＬ」但■担江の反復配列はＰｒｏ−Ｐｒｏ／Ａ　１ａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ／Ａ　１ａ−Ａｓｎ−Ａｓｐである。

用語「野生型プラスモダイウムＣＳタンパク賃の非反復側面隣接アミノ領域」とは、このタンパク質のアミノ末端からこのタンパク質の反復配列領域に至るタンパク質の一部を意味する。同様に、用語「野生型プラスモチイウムＣＳタンパク質の非反復側面隣接カルボキシル領域」とは、このタンパク質のカルボキシル末端からこのタンパク質の反復配列領域に至るタンパク質の一部を意味する。

タンパク質のアミノ酸配列を説明するための、本明細書の用語「内部」とは、そのタンパク質の末端アミノ酸を含まない配列を意味する。

「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「培養細胞」、および原核微生物あるいは単細胞として培養した真核細胞株を定義するこのような他の用語は互換可能に用いられる。そしてこれらの用語は、組換えベクターあるいは他のトランスファーＤＮＡの受容細胞として用いられ得るか、あるいは用いられている細胞を意味し、そしてトランスフェクトされた元の細胞の子孫を包含する。１個の親細胞からの子孫が、偶発的あるいは人為的な突然変異によって、元の親と形態的あるいはゲノムまたは全ＤＮＡにおいて、必ずしも完全に一致しないと理解される。例えば、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列が存在するといった適切な性質で特徴づけられる、親と充分に似ているその親細胞の子孫は、この定義が意図する子孫に含まれ、上記の用語の範囲内である。

「レプリコン」とは、例えば、プラスミド、染色体、ウィルスのような細胞内で自律的なポリヌクレオチド複製単位として働（任意の遺伝的因子である。

「ベクター」とは、他のポリヌクレオチド断片が連結しているレプリコンであり、その連結した断片の複製および／あるいは発現をもたらす。

「制御配列」とは、連結しているコーディング配列を発現させるのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。このような制御配列の性質は宿主生物によって異なっている。原核生物では、このような制御配列には、一般にプロモーター、リポソーム結合部位、およびターミネータ−が含まれ、真核生物では、このような制御配列には、一般にプロモーター、ターミネータ−１およびある場合はエンハンサ−が含まれる。

用語「制御配列」は、発現にその存在が必要である全ての成分の最小限度が含まれることが意図され、そしてリーダー配列のようにその存在が有利である付加的成分をも含み得る。

「作動可能に連結した」とは、そのように述べられた成分が、意図された挙動通り機能し得る関係に並置されることを示す。コーディング配列と「作動可能に連結した」制御配列は、コーディング配列の発現がこの制御配列に適合する条件下で達成されるように連結される。

本明細書中の、本発明のアナログを説明する用語「免疫原性」とは、体液性応答および／あるいは細胞性応答を誘導することにより、プラスモディウムのスポロゾイト中和を引き起こす能力を意味する。用語「中和」とは、感染の症状および／あるいはマラリアの症状を引き起こし得ない状態を意味する。

本明細書での「形質転換」とは、例えば、直接取り込み、形質導入、あるいはｆ −交配のような導入方法には無関係に、外来のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することを表す。

外来ポリヌクレオチドは例えばプラスミドのような非組み込みベクター、として保持され得るか、あるいは代わりに宿主のゲノムに組み込まれ得る。

本明細書の用語「処置」とは、予防および／あるいは治療を意味する。

本明細書の用語「個体」とは、一種あるいはそれ以上のプラスモディウムの種の感染に感受性である動物を表し、これらに限定されないが、霊長類およびヒトを含む。

１、ＣＳタンパク　アナログの、徴づけ上記に述べられたように、本発明のアナログを従来のＣＳタンパク質アナログと区別する特徴は、本発明のアナログが野生型タンパク質に存在する反復配列の１つあるいはそれ以上を欠損しているが、野生型タンパク質の両側面隣接領域のエピトープ配列を保持することである。

野生型Ｐ、　ｖｉｖａｘｃ　Ｓタンパク質は３７３個のアミノ酸から構成されており、１〜２２位のアミノ酸からのＮ末端疎水性リーダー配列を持つ（本明細書では、全てのアミノ酸の範囲は前の数字と後ろの数字を含み、野生型Ｐ、　ｖｉｖａｘｃ　Ｓタンパク質のアミノ酸番号は図５に示されているＶｉｖａｘ３．１配列に対応している）。縦列反復は１９回あり、９２位のアミノ酸から始まり、２６３位のアミノ酸に至る。この反復配列の前には、７７〜９１位のアミノ酸から成る領域Ｉと呼ばれる保存領域がある。Ｃ末端領域は３５６〜３７３位のアミノ酸のトランスメンブレン配列で終わり、３０６〜３１８位のアミノ酸の領域ＩＩと呼ばれる保存領域をも含む。反復配列のうち９回はＡｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ −Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ａ　１ａ−Ｇｌｙ配列（配列ｒＡＪと名付けた）であり、そして１０回はＡｓｐ−Ａｒｇ−Ａｔａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ配列（配列ｒＢＪと名付けた）である。

同様に、Ｐ、　ｆａｌｃｉ　ａｒｕｍのＣＳタンパク質は４１２個のアミノ酸から構成されている。Ｎ末端疎水性リーダー配列はアミノ酸１位から４２位に至り、領域Ｉは１０７〜１２３位（アミノ酸１０７位および１２３位を含む）のアミノ酸部分に位置する（Ｐ、　ｆａｌ±１仏■のＣＳタンパク質のアミノ酸番号は図８に示されるＦａｌｃ３配列に対応する）。このタンパク質には４１回の反復配列があり、その４回はＡｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ配列（配列「Ａ」）であり、残りはＡｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ配列（配列「Ｂ」）である。Ｐ、　ｆａｌｃｉ　ａｒｕｍのＣＳタンパク質の領域ＩＩは３４４〜３５６位のアミノ酸に位置し、トランスメンブレン配列は３９１〜４１２位のアミノ酸である。

Ｅｉｃｈｉｎｇｅｒら、前出、の報告した（ｄｅ　Ｉａ　Ｃｒｕｚら、前出、によって訂正された）野生型Ｐ、　ｂｅｒ■虹のＣＳタンパク質は３３９個のアミノ酸からなる。縦列反復は１３回あり、９３位のアミノ酸で始まり、１９６位のアミノ酸で終わる。反復配列のうち５回はＰｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ配列（配列ｒＡＪと名付けた）、２回はＰｒｏ− Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ配列、および６回はＰｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ配列（配列Ｂと名付けた）である。領域Ｉはおよそ８２位のアミノ酸から９２位のアミノ酸に至る。領域１１は２７２位のアミノ酸から２８６位のアミノ酸に至る。Ｎ末端疎水性リーダー配列は１位のアミノ酸から２３位のアミノ酸を含む。

本発明のアナログは、野生型ＣＳタンパク質の反復配列を少なくとも２個含有し、好ましくは、両方の型の反復配列が存在する。可能な範囲内で、アナログ中の配列Ａ対配列Ｂの比が保存されており、分布（すなわち、２つの型の反復配列の相対位置付け）も保存されている。この点に関して、Ｐ、　ｖ旦の配列Ａは一連の縦列反復のＮ末端側に集中している。

同様のことは、Ｐ、　ｆａｌｃｉ　ａｒｕｍおよび乙−立罎」九ムータンパク質の場合にも当てはまる。従って、本発明のＰ、　ｖｉｖａｘアナログにおいて、２〜１８回の反復、好ましくは２〜１０回の反復があり、配列Ａと配列Ｂの反復はほぼ同数で、配列Ａは一連の配列のＮ末端部分に集中して位置している。同様に、Ｐ、　ｆａｌ山田！アナログは２〜４０回の反復、好ましくは２〜２０回の反復を含み、Ａ対日の比率は約１：　１０〜３：　１０である。

Ｌ」扛肢ムアナログは２〜１２回の反復を含む。

Ｎ末端側面隣接領域は典型的には領域■を含み、随意に疎水リーダーまでの付加的な側面隣接配列を含む。すなわち、ｐ、　ｖｉｖａｘアナログのＮ末端側面隣接領域は典型的には、Ｌ１皿の野生型ＣＳタンパク質の少なくとも７７〜９１位のアミノ酸を含有し、随意に２３〜７６位のアミノ酸の全部分あるいは一部を含有する。好ましくは、２３〜９１位のアミノ酸からなる。同様に、Ｐ、　ｆａｌｃｉ　ａｒｕｍアナログのＮ末端側面隣接領域は、Ｐ、　ｆａｌｃｆ　ａｒｕｍの野生型ＣＳタンパク質の少なくとも１０７〜１２３位のアミノ酸を含有し、随意に４３〜１０６位のアミノ酸の全部あるいは一部を含有する。好ましくは４３〜１２３位のアミノ酸からなる。Ｌ−亘Ｊ」ユｕ、アナログの場合、Ｎ末端側面隣接領域は、典型的には少なくとも８２〜９２位のアミノ酸を含有する。

Ｃ末端側面隣接領域は典型的には野生型配列の反復配列の後ろから領域ＩＩに至る配列を含み、随意に領域ＩＩの後ろかラドランスメンブレン配列までの配列の全部あるいは一部を含有する。すなわち、Ｐ、　ｖｉｖａｘアナログのＣ末端側面隣接領域は典型的には、野生型タンパク質の少なくとも２６４〜３１８位のアミノ酸を含有し、随意に３１９〜３５５位のアミノ酸の全部あるいは一部を含有する。好ましくは、野生型タンパク質の２６４〜３３５位のアミノ酸からなる。

Ｐ、　ｆａｔ山二二アナログの対応するＣ末端領域は、少なくとも２８９〜３５６位のアミノ酸を有し、随意に３５７〜３９２位のアミノ酸配列の全部あるいは一部を含有する。

アナログのＮ末端およびＣ末端領域は、対応する野生型Ｃ８配列あるいはそれらのフラグメントのアミノ酸配列とは、１つあるいはそれ以上の置換、付加、および／あるいは欠失（「欠失」とは、末端を短縮するより、内部の残基を除去することを意味する）が与えられることによって異なり得るが、それぞれの領域がなおエピトープを少なくとも１つ有する条件である。通常、１つの領域当たり１０より多い改変はなく、１つの領域当たり５より多い改変がないことが好ましい。

本発明のＰ、　ｖｉｖａｘ、　Ｐ、　ｆａｌｃｉ　ａｒｕｍ、およびＬ」肛珪虹のＣＳタンパク質アナログは以下の式で表され得る：Ｘ−（Ａ、＋Ｂ、）−Ｙここで、　（、Ａ　、　Ｂ　、ｌ）は内部縦列反復領域を表し、Ａは野生型ＣＳタンパク質の反復配列の１つを表し、Ｂは他の反復配列を表し、ｎおよびｍは正の整数であり、ｎとｍの合計は野生型ＣＳタンパク質の反復配列数より小さく、ＸはＮ末端側面隣接配列を表し、野生型ＣＳタンパク質のＮ末端側面隣接領域のエピトープ配列の少なくとも１つを定義し、モしてＹはＣ末端側面隣接配列を表し、野生型ＣＳタン１＜り質のＣ側面Ｒ接ｆａ域のエピトープ配列の少なくとも１つを定義する。

ｐ、　ｖｉｖａｘアナログの場合、Ｘは野生型タンパク質の少なくとも７７〜９１位のアミノ酸を表し、モしてＹは野生型タンパク質の少な（とも２６４〜３１８位のアミノ酸を表す。一方、Ｐ、　ｆａｌｃｉ　ａｒｕｍアナログでは、又は野生型タンパク質の少なくとも１０７〜１２３位のアミノ酸を表し、モしてＹは野生型タンパク質の少なくとも２８９〜３５６位のアミノ酸を表す。

ＣＳタンパク　アナログの　のための、　え　二および汰本発明のＣＳタンパク質アナログは、組換えＤＮＡ技術によって生産される。野生型反復配列および側面隣接配列の既知アミノ酸配列に基づき、アナログをコードする合成遺伝子をインビトロで調製し得る。調製は、その遺伝子の適当なオリゴヌクレオチドフラグメントを合成し、リン酸化し、それらのフラグメントを共に連結することによってなされる。特定の宿主での発現において、ＤＮＡが発現される特定の宿主に好まれるコドンをもつ合成りＮＡ配列を設計することが望ましい。

アナログをコードする合成りＮＡを任意の適切なレプリコンにクローン化してクローニングベクターを作製し得る。多数のクローニングベクターは当業者に知られており、適切なりローニングベクターの選択は任意である。クローニングベクターおよびこれらが形質転換し得る宿主細胞の例には、バクテリオファージラムダ（Ｅ、　Ｃｏ１ｔ）、ｐ　ＢＨ３２２（Ｅ、　ｃ。

１ｉ）、ｐ　ＡＣＹＣｌ　７７　（Ｅ、　ｃｏｌｉ）、ｐＫＴ２３０　（グラム陰性バクテリア）、ｐＭＥ　２９０　（Ｅ、　ｃｏｌｉでないグラム陰性バクテリア）、ｐ　ＨＶ　１４　（Ｅ、　ｃｏｌｔおよびＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌ江）、ｐＢＤ９（■吐址旦）、ｐＩＪ６１　（江組吐姐区荘）、ｐ　Ｕ　Ｃ８Ｃ３ｔｒｅ　ｔｏ＋ＩＩｃｅｓ）、アクチアファージｐｈ　ｉ　Ｃ３１（Ｓｔｒｅ　ｔｏｎ　ｃｅｓ）、Ｙ　Ｉ　ｐ　５　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ）、ＹＣｐ１９（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ）、ＹＥｐ２４およびＹ　Ｅ　ｐ　１３　（Ｓａｃｃｈａｒ姐区ｕ）、およびウシパピローマウィルス（哺乳類細胞）が含まれる。

ＣＳタンパク質アナログをコードするポリヌクレオチド配列は、この配列を適切なレプリコンに挿入することにより発現ベクターを作製し、得られた発現ベクターを適合する宿主に導入して発現される。

発現ベクターの作製において、ｃＳタンパク質アナログをコードする配列を適当な制御配列と共にベクターに位置づける。制御配列に対するコーディング配列の位置および方向は、コーディング配列が制御配列の制御下で転写されるようにされる。すなわち、プロモーターがコーディング配列由来のｍＲＮＡの転写を制御し、そしてリポソームがリポソーム結合部位に結合して翻訳のプロセスを開始し、そして翻訳を終わらせる終止コドンが転写終結コドンの上流にある。酵母発現ベクターは好ましい。酵母ベクターの制御配列には、解糖系酵素の合成のためのプロモーター（Ｈｅ５ｓら、Ｊ　Ａｄｖ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ　（１９６８）７：１４９、Ｈｏ１ｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９７８）１７：４９００）が含まれる。さらに、当該分野での既知のプロモーターには、３− ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　（１９８０）　２５５：２０７３）が含まれる。生育条件および／あるいは遺伝的背景によって制御される、ざらに宵利な転写制御を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２　（ＡＤＨ２）、イソサイトクロームｃ１酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、アルファ因子系、およびマルトースおよびガラクトース利用に関スる酵素、のプロモーター領域である。転写終結配列は；−ディング配列の３′末端にあることが望ましい。このようなターミネータ−は酵母由来の遺伝子のコーディング配列の後ろの３′非翻訳領域内に存在する。

レプリコンに挿入する前に、アナログをコードする配列を改変することは、選択した発現系によっては、好ましいかあるいは必要である。例えば、ある場合では、制御配列に適切な方向で連結され得るように、すなわち、リーディングフレームを保持するために、その配列を改変することが必要であり得る。ある場合では、例えば、宿主生物からポリペプチドを分泌させ、続いて分泌シグナルの切断を引き起こすような配列である酵母アルファ因子のリーダー配列を加えることが望まれ得る。クローニングを用いたヌクレオチド配列の改変の技術は、当業者に公知である。これらには、例えば、Ｂａ上３１のような制限酵素を用いて、欠失したヌクレオチドを置き換えるためのアダプターとして用いる化学的に合成したオリゴヌクレオチドである過剰ヌクレオチドを除去することが含まれる。

必要に応じて改変された、アナログをコードする配列は、ベクターに挿入する前に制御配列に連結され得る。あるいは、コーディング配列は、既に制御配列および適当な制限部位を有する発現ベクターに、直接クローン化され得る。酵母中でこのアナログを発現させるには、制御配列は必ずコーディング配列と異種である。このアナログ遺伝子をを髄動物由来細胞株で発現させる場合、その特定の細胞株によって、制御配列は異種あるいは同種のいずれかであり得る。

用いられる宿主細胞によって、形質転換はその細胞に適する標準の技術を用いて行われる。酵母への形質転換はＢｅｇｇｓ。

Ｊ、Ｄ、、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７８）　２７５：１０４−１０９、あるいは旧ｎｎｅｎ、　Ａ、、ら。

Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（ＩＩＳＡ）　（１９７８）　７５：１９２９の方法に従ッテ行われ得る。

次に、ＣＳタンパク質アナログ遺伝子が発現でき、そして、適切ならば、成熟タンパク質にプロセシングできるような条件下で、形質転換された細胞を培養する。この遺伝子は異種の生物／細胞で発現させるため、得られたタンパク質は、蚊に存在する時に連結している他のタンパク質を含まない。次に、このように合成された組換えＣＳタンパク質アナログを宿主細胞から単離し、精製する。培地にアナログを分泌する発現系なら、アナログは直接培地から単離される。組換えアナログが分泌されないなら、細胞溶解産物から単離される。

適当な生育条件および回収方法の選択は、当該分野の範囲内である。精製に関しては、例えば前述のＮＹＵ特許出願を参照。

ワクチンワクチンは、スポロゾイト中和活性を有する、あるいは他の機構によってマラリアを回復するかあるいは防御する、前述の組換えプラスモチイウムＣＳタンパク質アナログから調製され得る。免疫原性ポリペプチドを活性成分として含有するワクチンの調合は当業者に公知である。このようなワクチンは典型的には水溶液あるいは懸濁液のいずれかの注射可能な形態；注射の前に液体に溶解するあるいは懸濁するのに適する固形としても調製され得る。この調製物は乳化され得るか、あるいはリポソームで包まれるタンパク質であり得る。

活性免疫原性成分は、薬学的に許容され得、そして活性成分と適合する賦形剤あるいは担体としばしば混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロ−ル、エタノール、その他、およびそれらの組合せである。

注射可能な調合物中のアナログの濃度は、通常０．２〜５　ｍ　ｇ／　ｍ　１の範囲内である。さらに、所望ならば、ワクチンは、例えば、湿潤剤あるいは乳化剤、ｐＨ緩衝物質、および／あるいはアジュバントのようなワクチンの効能を高める補助物質を少量含み得る。効果的なアジュバントの例として、以下の化合物が含まれるが、これらに制限されるものではない：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−し−トレオニルーＤ−イングルタミン（ｔ　ｈ　ｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−７セチルーノルームラミルーし一アラニルーＤ−イソグルタミン（ＣＧＰ　１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ばれる）Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イングルタミニルーＬ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ　１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、およびバクテリアから抽出した３つの成分であるモノホスホリルリピドＡ、トレハロースシミコール酸および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋　Ｔ　Ｄ　Ｍ　＋　ＣＷ　Ｓ　）を、２％スクアレン／トゥイーン８０乳化剤に入れたものを含有するＲ　Ｉ　Ｂ　１．アジュバントの効果は、様々なアジュバントからも構成されるワクチン中の免疫原の投与によって生じた免疫原に対する抗体量を測定して決定され得る。

ワクチンは従来、非経口的に、例えば、静脈、皮下あるいは筋向のいずれか、の注射によって投与されている。さらに、他の投与形態に適する調合物には、廃剤、および場合によって、経口用調合物およびリポソーム、が含まれる。廃剤の、従来の結合剤および担体には、例えば、ポリアルカレンゲリコールあるいはトリグリセリドが含まれる。このような廃剤は、アナログを０．５％〜１０％重量の範囲で、好ましくは１％〜２％含有する混合物から形成され得る。経口用調合物は、例えば、製薬縁のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、およびその他の通常使用される賦形剤、を含む。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、放出を維持する調合物あるいは粉末の形態をとり、アナログを１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％含有する。

アナログは、中性あるいは塩の形でワクチンの中に調合され得る。薬学的に許容され得る塩は、酸を付加した塩（ペプチドの遊離アミン基と共に形成した）を含み、そしてそれは塩酸あるいはリン酸のような無機酸、または酢酸、シニウ酸、酒石酸、マレイン酸、およびその他のような有機酸と共に形成される。遊離のカルボキシル基と共に形成された塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、あるいは水酸化鉄のような無機塩基、および例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロ力イン、およびその他の有機塩基、にも由来し得る。

ワクチンは処方の調合物に適合する方法で、そして予防上および／あるいは治療上に有効な量で投与される。一般に１回の投与当たりのアナログの量は５〜２５０マイクログラムの範囲であり、投与する量は、治療する被験体、抗体を合成するその個体の免疫系の能力、および所望される予防の程度に依存する。投与に必要な活性成分の正確な量は、医者の判断により、各個体に特有であり得る。

ワクチンは１回投与、あるいは好ましくは複数回の投与スケジュールで与えられ得る。複数回の投与スケジュールは、−次ワクチン注射過程を、１〜１０回に分けて投与した後、免疫応答を保持するために、およびあるいはそれを強化するために必要な時間間隔で与えられる他の投与が行われる。例えば、第２投与を１〜４ケ月で、そして必要ならば、次を数カ月後に投与する。

（以下　余白）実Ｊｌ凱以下の実施例は本発明のアナログおよびそれらの調製方法をさらに例示する。この実施例はいかなる方法によっても本発明を限定することを意図しない。

Ｖｉｖａｘ３　ベクターＶｉｖａｘ３は、Ｐ、　ｖｉｖａＸの野生型ＣＳタンパク質の２３位〜９１位のアミノ酸（ここで、９１位のＧｌｙがＡｒｇに置換している）、次いで、単一のＡ配列（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌ　ａ−Ａｓｐ−ＧＩ　Ｙ−Ｇｌ　ｎ−Ｐｒｏ−Ａｌ　ａ−Ｇｌ　ｙ）、次いで、単一のＢ配列（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｔ　ａ−Ａｌ　ａ　−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｔｙ）、次いで、二重の野生型ＣＳタンパク質の２６４位〜３３５位のアミノ酸（ここで、２７７位と２７８位の間にＧ１７が付加され、２９０位のＧｌｕがＡｌａに置換し、３００位のＶａｔがＬｅＵに置換し、３０１位のＡｒｇがＧｌｕに置換し、そして、３０２位のＡｌａが”ｒｈｒに置換している）からなるＰ、ｖｉｖａＸＣＳタンパク質のアナログである。このＶｉｖａｘ３のアミノ酸配列およびＤＮＡコード配列を図１に示す。

図２に示された２２個の合成オ□リゴマーを、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製のＤＮＡ合成装置３８０Ａによって作成した。これらのオリゴヌクレオチドをリン酸化し、そして沸騰させて室温までゆっくりと冷却することにより、アニーリングした。次いで、それ工らを連結してＶｉｖａｘ３をコードするＤＮＡ配列を泡立てた（図２の略図を参照）。

Ｖｉｖａｘ３の全長の遺伝子を７％のアクリルアミドゲルから切り出し、そしてＮｃｏＩおよび５ａｌＩで消化しておいたプラスミドルＢｓ１００中にクローン化した。ｐＢｓｌｏｏは、略図で図３に描かれており、インフレームでＡ　Ｄ　Ｈ２−ＧＡＰＤＨハイブリッドプロモーターおよびＧＡＰＤＨターミネータ−を含んでいる。このプロモーター、Ｖｉｖａｘ３をコードするＤＮＡ配列、およびこのターミネータ−を含むＢａｍＨＩ／Ｓａ　ｌ　Ｉ断片を、このクローニングベクターから単離し、そしてプラスミドｐＢＳ２４．１に挿入して、酵母の細胞内で発現させるための発現ベクターｐＢＳ２４ｖｉｖａＸ３を得た。ｐＢ３２４．１の概要を図４に示す。

Ｖｉｖａｘ３．１発　ベクターＶｆｖａｘ３．１は、野生型の配列の側面の隣接領域において上記で記載されたアミノ酸の改変を有しないことを除いて、Ｖｉｖａｘ３と同様のＰ、ｖｉｖａｘＣＳタンパク質のアナログである。このｖｉｖａｘ３．１のアミノ酸配列およびＤＮＡコード配列を図５に示す。

Ｖｉｖａｘ３．１をコードする遺伝子を、図６に示されたオリゴマーおよびライゲージコンの概略を用いて、上記のように調製した。この遺伝子をＸｂａｌおよび５ａｌＩで消化しておいたプラスミドｐＡＢ　１２５中にクローン化した。ｐＡＢ１２５は、略図で図７に描かれており、インフレームでＡＤＨ２−ＧＡＰＤＨハイブリッドプロモーター、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉ■ａｅａ因子リーダーおよび α因子ターミネータ−を含んでいる。このプロモーター、α因子リーダー、Ｖｆｖａｘ３．１遺伝子、およびターミネータ−を含むＢａｍＨＩ／５ａｌＩ断片を、クローニングベクターから単離し、そしてプラスミドｐＢ３２４．１中に挿入して、酵母で分泌発現する発現ベクターｐＢｓ２４ｖｉｖａｘ３．１を得た。

Ｆａｌｃｉ　ａｒｕｍ３発　ベクターＦａｌｃｆｐａｒｕｍ（Ｆａｔｅ）３は、Ｐ、ｆａｌｃｉ　ａｒｕｍの野生型ＣＳタンパク質の４３位〜１２３位のアミノ酸、次いで、４つの繰り返し配列（３つのＢ配列、すなわち、−Ａｓｎ−Ａｔ　ａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−および１つのＡ配列、すなわち、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏが、ＢＡＢ　Ｈのパターンである）、次いで、この野生型のタンパク質の２８９位〜３７４位のアミノ酸からなるＰ、ｆａｌｃｉ　ａｒｕｍＣＳタンパク質のアナログである。Ｆａ　ｌ　ｃ３のアミノ酸配列およびＤＮＡコード配列を図８に示す。

Ｆａ　ｌ　ｃ３をコードする遺伝子をオリゴマーから合成しく図９を参照）、ｐＡＢ１２５中にクローン化し、そして得られたＡ　Ｄ　Ｈ２／　Ｇ　Ａ　Ｐ　Ｄ　Ｈａ因子ＦａｌＣ３構築物をｐＢ３２４．１中にクローン化して、酵母で）” ａｌｃ３を分泌発現する発現ベクターｐＢＳ２４　ｆ　ａ　ｌ　ｃ３を得た。

Ｆａｌｃｉ　ａｒｕｍ４　ベクターＦａ　１　ｃ４は、Ｆａｔｅ３より短いＮ末端側面隣接領域およびＦａ　１　ｃ３より長いＣ末端側面隣接領域を有する以外は、Ｆａｔｅ３と同様の配列を有するＣＳタンパク質のアナログである。このＦａｔｅ４をコードするアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を図１０に示す。図示したように、この配列は、Ｌハ江ユ肛■ の野生型ＯＳタンパク質配列の６８位〜１２３位のアミノ酸、４つの繰り返し配列、およびこの野生型の配列の２８９位〜３９２位のアミノ酸を含む。この配列のＮ末端に付加されたアミノ酸は、α因子リーダー配列の一部である。

図１０に示されたＦａ　ｌ　ｃ４の配列をコードするＤＮＡを合成し、上記のようにｐＡＢ　１２５およびｐＢＳ２４．１中にクローン化して、酵母で分泌発現する発現ベクターｐＢＳＢｅｒ　ｈｅｉ３　ベクターＢｅｒｇｈｅｉ３は、Ｎ末端およびＣ末端の側面隣接領域、およびＬ］！■上堕、Ｃ８遺伝子において見られる８個のアミノ酸の連なった繰り返しの１３個のうちの２個のみを含む合成遺伝子である。このアミノ酸の繰り返しの後の１６０Ｐ繰り返しもまた除去される。この遺伝子の配列およびそれによってコードされるアミノ酸を図１１に示す。

このように、この構築物は６３位のＧｌｙから開始し、第１のＰＰＰＰＮＰＮＤの繰り返しから１００位のアミノ酸で終了するまで続く。Ｅｉｃｈｉｎｇｅｒらによって初めに発表された６９位〜７４位のアミノ酸、ＰＭＬＲＲＫをｄｅＩａ　Ｃｒｕｚらの「正しい」配列、ＡＤＡＰＥＧに変更していることに注目すべきである。この第２の繰り返しのＰＡＰＰＮＡＮＤはこの配列中にさらに見い出される第１の繰り返しの誘導体である。次いで、このカルボキシ末端は２３９位のＧｌｙから３１８位のＳｅｔまで続（。図１２に示されるように、この遺伝子は、２０個の４８量体および２個の２８量体からなり、この遺伝子をアニーリングする長い重複を促進している。酵母の好ましいコドンを可能な場所で用い、Ｎｃｏｌおよび５ａｌＩ部位をそれぞれ５′開始コドンおよび３′終止コドンに取り込ませた。

各オリゴマーをリン酸化し、リガーゼ緩衝液にそれらをプールし、次いで、１００℃で解離し、そして室温まで冷却させることによって、この遺伝子を組み立てた。リガーゼおよびＡＴＰを加え、そして次いで、ライゲージコンした遺伝子を７ガロースゲル電気泳動法によって精製された制限酵素Ｎｃｏｌおよび５ａｉｌで切断した。

この遺伝子は、内部発現のためにＡＤＨ２−ＧＡＰＤＨ酵母の調節可能なプロモーター上で発現されるように消化される（上記を参照）。Ｂｅｒｇｈｅｉ３はまた、α因子ＡＤＨ２リーダー／プロモーター配列を含むベクターであるｐＡＢ１２５中にクローン化することにより、分泌経路で発現させ得る（上記を参照）。

ＣＳタンパク　アナログ発　ベクターによる　の２　転Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ１１株ＡＢＩＩＯ（Ｍａｔ、１ｅｕ２−０４、またはＬｅｕ２−３およびＩｅｕ２−１１２の両方、ト匹旦、ｈｊｓ４−５８０．　ｃｉ　ｒ’　）を、ＨｉｎｎｅｎらのＰｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃ　ｉ　（ＵＳＡ）７５：　１９２９−１９３３　（１９７８）に従って、これらの発現ベクター（Ｆａ　ｌ　ｃ４構築物以外）で形質転換した。ＡＤＨ２７ＧＡＰＥ節ベクターを含む単一の形質転換体のコロニーを２　ｍ　ｌの１ｅｕ−（ロイシン欠如）選択培地で、後期対数増殖期あるいは、静止期まで増殖した。

このようなベクターを含む酵母のみがこの培地で増殖する。

次いで、培養物を１％のグルコースを添加したＹＥＰ　（１ｗ／Ｖ％の酵母抽出物、２　ｗ　／　ｖ％のペプトン）およびで１：２０　（ｖ／ｖ）に希釈し、そして、この培地中で飽和状態まで（約３６時間）増殖させた。細胞をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）の存在下で溶解し、そしてこの溶解産物を遠心分離によって精製した。

精製された溶解産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供した（Ｌａｅｍｍｌ　＋、英国、Ｎａｔｕｒｅ　（１９７０）２７７：　６８０）。クマーシーブルーでの着色の後、適当な大きさのバンドをｐ、ｖｉｖａｘプラスミドおよびＰ、ｆａｌｃｉ　ａｒｕｍプラスミドを含む形質転換体由来の抽出物で観察した。

これらのバンドはそれぞれの発現ベクターで形質転換された細胞中で発見され、一方、コントロールのプラスミドを含む細胞の抽出物には存在しなかった。

このバンドの同一性を確認するために、このタンパク質はまたウェスタン分析に供した。上記のように調製された、精製された酵母の溶解産物をポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行い（Ｌａｅｍｍｘｉ、前出）、続いてタンパク質をニトロセルロースフィルターにエレクトロブロノティンクシた（Ｔｏｗｂ　ｉ　ｎら、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉ（ＵＳＡ）（１９７９）７６：　３４５０）。このフィルターをＰＢＳ中の１％（ＢＳＡ）で１時間ブレインキュベートし、続いて、野生型のＣＳタンパク質に対する抗体で４℃で１２時間処理した。このフィルターを１％のＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、そしてワサビダイコンペルオキシダーゼと結合した二次ヒツジ抗マウス抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒ　ｉ　ｅ　ｓ、リッチモンド、カリフォルニア州）を加えた。最後に、このフィルターをワサビダイコンペルオキシダーゼ発色ｔｔ、１１　（Ｂ　ｉ　ｏ−Ｒａ　ｄ、リ・７チモンド、カリフォルニア州）でインキュベートした。このウェスタン分析はこれらのタンパク質がこれらの抗体と反応することを示した。

細　におけるＣＳタンパク　アナログの　°１およ乏１１形質転換体を選択培地（Ｌｅｕ−またはＵｒａ−のいずれか）において増殖させてプラスミドのコピー数を増加し、そして高濃度のグルコース（８％）において増殖させて発現を抑圧させ、保った。

次いで、この酵母をＹＥＰ中で２％のグルコース（細胞内発現のためのリッチ培地）に４８時間移した（発現は２４時間で見られる）。

酵母を濾過または遠心分離によってこの培地から分離し、そしてこの酵母を適当な緩衝液中で破壊した。タンパク質の精製は、等量の水で希釈し、そしてｐＨ８，０に調整した後、選択灼熱沈澱反応から開始した（１００℃で２０分間；これは精製工程としてだけでなく、プロテアーゼ阻害工程としても働く）。この沈澱物を濾過または遠心分離によって取り除いた。

この上清中のＯＳタンパク質アナログを陽イオン交換体に基づくイオン交換クロマトグラフィーで、ｐＨ４，０に下げて吸着させることによって、さらに精製した。ｐ）１５．０でこのカラムを洗浄した後、塩グラジェントを、ｃＳタンパク質アナログを含むこのタンパク質の選択的除去のために、用いる。このアナログを集め、濃縮し、そしてサイズ選別クロマトグラフィーにかける。

精製されたＣＳタンパク質を濃縮し、そして透析濾過した。

それを−８０°Ｃで凍結または凍結乾燥のいずれかで保存し、そして密封したバイアル中で湿気のない状態で保存した。

°１１　におけるＣＳタンパク　アナログの　１およびＪ［形質転換体を選択培地（Ｌｅｕ−またはＵｒａ−のいずれか）で増殖させてプラスミドコピー数を増加させ、そして高濃度のグルコース（８％）中で増殖させて発現の抑制を保った。

次いで、この酵母を酵母分泌物培地（低タンパク質）の２％のグルコース中に移し、９０時間増殖させる（発現は３６時間で見られるが、９０時間行うとこの培地においてＣＳタンパク質アナログの蓄積がおこる）。

酵母を濾過または遠心分離によりこの培地から除去し、その上澄みを保存し、そして（ＮａＯＨを用いて）ｐＨ８，０に調整する。タンパク質の精製を選択灼熱沈殿反応から開始する（１００°Ｃで２０分間行うと、精製工程としてだけでなく、プロテアーゼ阻害工程としてもまた働く）。この沈澱物を濾過または遠心分離によって除去する。

この上澄みから得られたアナログの精製を上記のように行う。

本発明を実施するための上記で記載の形態の新しい改変は、分子生物学、生化学、免疫学、そして関連する分野において当業者に自明であり、本発明の範囲中にあることを意図する。

ＦＩＧ、　１１　ＮＣ０Ｉ、５４　Ｎ）［ＥＩ。

９３　ＸＢＡＸ。

１８４　ＸＨＯ工、　２３２　ＦＶ’Ｕ’２゜２５１田ｕ１烏２６１瑯工、２８６ジＣ２゜３８４　ＨＧ工Ｅ２．　３９３　ＫＰＮＩ。

４８８９山工。

Ｖｉｖ久ｙ３のＴ；めの（トρ９Ｐノゴトクレオ千ＦＶ工ｖａｘ　３ＦＩＧ、　２ＦＩＧ、　５１　ＮＣ０Ｘ、　５４　Ｎ１４ＥＸ。

９３　Ｘ１１ｋＮ。

４８５５ＡＬＩ。

■１°Ｖ久ｘ、３．Ｉ　の仁りつ金銭′オ９コ°メクレイテドＦＩＧ、　６ＦＩＧ　７ＦＩＧ、　８１　ＮＣ０Ｘ、９　ＫＰＨｌ。

２６６　ＢＡＭＨＬ５５７　ＳＡＬ工。

ＦへＩｔ３ｑ７二句つ令へ゛ス９ゴヌフレイナドＦＩＧ、　９ＦＩＧ、ｌｌ５０９５ＡＬＩ。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．プラスモディウム環状スポロゾイト（ＣＳ）タンパク質の免疫原性アナログであって、野生型ＣＳタンパク質の反復エピトープの１つあるいはそれ以上が欠損しているが、野生型ＣＳタンパク質の各々の非反復側面隣接領域由来の非反復側面隣接エピトープを少なくとも１つ有する、アナログ。
２．プラスモディウム環状スポロゾイト（ＣＳ）タンパク質の免疫原性アナログであって、（ａ）野生型プラスモディウムＣＳタンパク質のある反復配列の少なくとも２回繰り返しから構成される内部領域であるが、該配列の繰り返し回数が野生型プラスモディウムＣＳタンパク質に存在する繰り返し回数より少ない、内部領域、（ｂ）野生型プラスモディウムＣＳタンパク質の非反復アミノ末端側面隣接領域の少なくとも１つのエピトープに相当するアミノ酸配列を有する、内部領域の側面に隣接するアミノ末端領域；および（ｃ）野生型プラスモディウムＣＳタンパク質の非反復カルボキシル末端側面隣接領域の少なくとも１つのエピトープに相当するアミノ酸配列を有する、内部領域の側面に隣接するカルボキシル末端領域、を含む、アナログ。
３．前記野生型プラスモディウムＣＳタンパク質が、Ｐ．ｖｉｖａｘのＣＳタンパク質である、請求項２に記載のアナログ。
４．請求項３に記載のアナログであって、前記内部領域がｐ．ｖｉｖａｘの野生型ＣＳタンパク質の両方の型の反復配列を含有し、該反復配列の２〜１８回繰り返しが存在し、前記アミノ末端領域がＰ．ｖｉｖａｘの野生型ＣＳタンパク質の少なくとも２３〜７６位のアミノ酸を含有し、そして前記カルボキシル末端領域がＰ．ｖｉｖａｘの野生型ＣＳタンパク質の少なくとも２６４〜３１８位のアミノ酸を含有する、アナログ。
５．請求項３に記載のアナログであって、前記内部領域がＰ．ｖｉｖａｘの野生型ＣＳタンパク質の両方の型の反復配列を含有し、該反復配列の２〜１０回繰り返しが存在し、前記アミノ末端領域がＰ．ｖｉｖａｘの野生型ＣＳタンパク質の少なくとも２３〜９１位のアミノ酸を含有し、そして前記カルボキシル末端領域がＰ．ｖｉｖａｘの野生型ＣＳタンパク質の少なくとも２６４〜３３５位のアミノ酸を含有する、アナログ。
６．前記アナログが、図１あるいは図５に示されているアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のアナログ。
７．前記野生型プラスモディウムＣＳタンパク質が、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＣＳタンパク質である、請求項２に記載のアナログ。
８．請求項７に記載のアナログであって、前記内部領域がＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍの野生型ＣＳタンパク質の両方の型の反復配列を含有し、該反復配列の２〜４０回繰り返しが存在し、前記アミノ末端領域がＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの野生型ＣＳタンパク質の少なくとも１０７〜１２３位のアミノ酸を含有し、および前記カルボキシル末端領域がＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍの野生型ＣＳタンパク質の少なくとも２８９〜３５６位のアミノ酸を含有する、アナログ。
９．請求項７に記載のアナログであって、前記内部領域がｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍの野生型ＣＳタンパク質の両方の型の反復配列を含有し、該反復配列の２〜２０回繰り返しが存在し、前記アミノ末端領域がＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの野生型ＣＳタンパク質の少なくとも６８〜１２３位のアミノ酸を含有し、および前記カルボキシル末端領域がＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの野生型ＣＳタンパク質の少なくとも２８９〜３７４位のアミノ酸を含有する、アナログ。
１０．前記アナログが、図８あるいは図１０に示されているアミノ酸配列を有する、請求項７に記載のアナログ。
１１．前記野生型プラスモディウムＣＳタンパク質が、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉのＣＳタンパク質である、請求項２に記載のアナログ。
１２．請求項１１に記載のアナログであって、前記内部領域がＰ．ｂｅｒｇｈｅｉの野生型ＣＳタンパク質の両方の型の反復配列を含有し、該反復配列の２〜１２回繰り返しが存在する、アナログ。
１３．前記アナログが、図１１に示されているアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載のアナログ。
１４．請求項２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、あるいは１３に記載のアナログをコードするＤＮＡ配列。
１５．細胞内でプラスモディウムのＣＳタンパク質アナログを発現させる発現ベクターであって、請求項１４に記載のＤＮＡ、および該ＤＮＡと作動可能に連結し、該細胞内で該ＤＮＡの発現を起こすのに有効である発現の制御配列を包含する、発現ベクター。
１６．請求項１５に記載のベクターを含有し、前記ＤＮＡにコードされるタンパク質を生産し得る、組換え細胞。
１７．プラスモディウムのＣＳタンパク質アナログを生産する方法であって、前記ＤＮＡにコードされるタンパク質の生産を可能にする条件下で、請求項１６に記載の細胞を増殖させる工程を包含する、方法。
１８．マラリアワクチンの組成物であって、薬学的に許容され得る担体と混合した請求項２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２あるいは１３に記載のアナログの免疫原性量を含有する、組成物。