JPH04506077A - Ｈｔｌｖ―１感染の診断、治療及び予防接種のためのペプチドとその誘導抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＴＬＶ−１感染の診断、治療及び予防接種のためのペプチドとその誘導抗体 発明の背景 本発明は、免疫学的に重要なＨＴＬＶ−１タンパク質の抗原部位に対応する配列 のペプチドに関する。これらのペプチドは）ＩＴＬＶ−１に対する抗体の有無を 検出するための診断薬として有用であり、また動物および人間のＨＴＬＶ−１に 対する抗体を誘発するための方法と組成中の免疫原としても有用である。

人間Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）の病因作用因子は、）ＩＴＬＶ−１（ヒ トＴ細胞リンパ栄養ウィルス１型）として認定されている。例えば、Ｓａｒｎｇ ａｄｈａｒａｎ他による〈ヒトＴ細胞白血病ウィルス＞　（Ｂ、Ｎ、Ｆｉｅｌｄ ｓ他編“ウィルス学”（１９１１５年）の１３４５−１３７１ページ）に記述さ れている。このウィルスが最も流行している世界の地域は日本の南部にある入用 で、ここでは２人口の略１５％がこれに感染している。最近では。

熱帯性痙性不全対麻痺（ＴＳＰ）と呼ばれる熱帯性麻痺もまた）ＩＴＬＶ−１の 感染を伴っている。これについては、Ｒｏｄｇｅｒｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ他著の論 文＜）ＩＴＬＶ−１とＨＴＬＶ−ＩＩＩ並びに熱帯性痙性麻痺＞　（Ｌａｎｃｅ ｔ、　ＩＩ、　１２４７頁、１９８５年）およびＶｅｒｎａｎｔ他著の論文くヒ トＴ細胞白血病ウィルス１型を伴う地方病性熱帯痙性不完全対麻痺＝２５例の臨 床血清疫学的研究〉（神経学年報２１号、１２３頁、１９８７年）に報告されて いる。

熱帯においてＴＳＰは、西洋世界における多発硬化症候群と同様の規模と重要性 を有していることが、Ｍａｒｘの論文〈神経病と連鎖した白血病ウィルス〉（サ イエンス、２３６号、１０５９−１０６１頁、１９８７年）で報告されている。

ＨＴＬＶ−１とヒトＴ細胞すンパ栄養つィルスエエ型（ＨＴＬＶ−２）は、Ｔリ ンパ球への向性およびリンパ増殖性症患との相互関係を共有する腫瘍レトロウィ ルス家族の抗原的に関係した成員である。

）ＩＴＬＶ−２と）ＩＴＬＶ−１の相同度のために血清学的な研究ではＨＴＬＶ −１とＨＴＬＶ−２による感染を区別することが出来ない。

ＨＴＬＶ−１とＨＴＬシー２を明確に分別するためには、ウィルスの単離および ／または分子の同定を要する。ＨＴＬＶ−２は人間の病気を必ず伴ったものでは ないが、これまではＨＴＬシー１感染と考えられていた静脈内薬物の乱用者（Ｉ ＶＤＡｓ）が今日ではＨＴＬＶ−２感染であることが判明している。現在）ＩＴ ＬＶ−２感染は静脈内薬物乱用者の間では全く普通であると考えられている。Ｔ ｅｄｄｅｒ他著の論文く英国内のエイズ、拡大リンパ節疾患およびエイズの危険 のある被検者におけるＨＴＬ？１およびＨＴＬＶ−２感染の低罹患率＞　（Ｌａ ｎｃｅｔ、　２号、’１２５−１２８頁）、Ｒｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｔｔ他著の 論文〈エイズ流行地からの静脈内薬物乱用者におけるＨＴＬＶ−１，）ＩＴＬＶ −ＩＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩＩに対する抗体の罹患率＞　（Ｊ、Ａ、Ｍ、Ａ　２ ５５号、３１３３−３１３７頁）に記述がある。

Ｈ，ＴＬＶ−２とエイズとの連合を考えると、ウィルスの単離はことさら困難で あり危険である。従って、ウィルスの単、離と取扱いを含む再分別をしないでＨ ＴＬＶ−１とＨＴＬＶ−２の感染を区別出来れば有益であろう。ＨＴＬＶ−１を 容易に検出でき、ＨＴＬＶ−１による感染をＨＴＬＶ−２による感染から区別出 来る自動化血液スクリーニングテストフォーマットもまた非感染血液を供給する ために極めて重要である。

）ＩＴＬＶ−１感染の検出方法は、通常、血液、血清および血液由来生成物中に 存在するＨＴＬＶ−１抗原に対する抗体を検出し計量することによりウィルスへ の被曝を測定する。かような分析法はＡＴＬおよびＴＳＰの診断を助け、血液と 血液製剤をスクリーニングしＨＴＬＶ−１にすでに被曝しているか否かを調べて さらなる感染を阻止するのに使用できる。

）ＩＴＬＶ−１による感染を診断しＨＴＬＶ−１への被曝判別するために現在行 われている試みには、被検試料中のＨＴＬＶ−１免疫原酸分に対する抗体の存在 を検出する酸素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）が含まれている。その他の方 法では、ウェスタンブロッティング法を用いて被検試料中の１（ＴＬＶ−１の特 異性抗体を検出している。

ＥＬＥＳＡおよびウェスタンブロッティング法の他に、一般に、放射性標識免疫 測定法だけに限らないほとんどの公知の免疫学的検定法、並びに裏薬試験法また は間接免疫蛍光検査法を、特異性試薬を用いたＨＴＬＶ−２およびその抗体の検 出法として利用できる。

これらの検定法の抗原源としては）！ＴＬＶ−１感染Ｔ細胞線より得た抗原タン パク質と組替えＤＮＡ技法により生産した抗原を含むことが出来るが、これだけ に限定されるものではない。

これらの抗原発生源から得た抗原を使用するには、しかし、重大な障害が存在す る。

連続細胞線におけるＨＴＬＶ−１の生産はそれ自体、研究者がウィルスに感染す る危険があるために、高度危険（Ｐ３汚染物質）の実験室内で実施しなければな らない。Ｔ細胞由来ＨＴＬＶ−１抗原を使用するとＥＬＩＳＡ試験において偽陰 性および偽陽性の結果が多分生じ得る。例えば、エイズウィルスへの被曝を測定 する場合に、細胞線から得た完全なウィルスＨＴＬＶ−１抗原を用いたＥＬＩＳ Ａ試験では偽陰性および偽陽性の結果が報告された筈であるＩ　Ｇｕｒｔｌｅｒ 達の論文く抗ＬＡＶ／ＨＴＬＶ−ＩＩＩのスクリーニング用布板ＥＬＩＳＡキッ トの感度と特異性〉（雑誌“ウィルス学の方法”１５号、１１−２３頁、１９８ ７年）にも報告されている。電気的にプロットして完全なウィルス抗原を使用し た１（ＴＬＶ−１検出のためのウェスタンプロティング分析法は、ＥＬＩＳＡ試 験に比しより大きい特異性を提供するであろうが、しかし、より多くの手間と時 間を要する。さらに。

）ＩＴＬＶ−１の生産細胞は人間に由来するものであるから、これらの細胞線か ら得たウィルス抗原試料は徹底的に純化しなければ、　ＨＬＡ抗原のような正常 細胞性抗原に汚染されＥＬＩＳＡ試験において偽陽性反応を惹起す。

細胞線から得たウィルス抗原を完全に純化すると、免疫的に重要なタンパク質の 免疫原性または別の不活性抗原を多分破壊し、そのために偽陰性反応が生じる。

さらに１反応混合物中に存在する他の抗原および抗体による反応阻止のために抗 体がその特異抗原と反応出来ない立体障害が原因で、生ウイルス誘導抗原を用い た偽陰性反応が生じ得る。また、生ウィルスより単離したタンパク質は、全ウィ ルスまたはウィルス遺伝物質に汚染される恐れがあるためにワクチンには不適当 である。

ＨＴＬＶ−１を検出するＥＬＩＳＡ試験には、また、細菌中のＨＴＬＶ−１ゲノ ムの部分をクローニングすることにより生産された遺伝的に重要なウィルスタン パク質を用いることが出来る。）ＩＴＬＶ−’１の完全なヌクレオチド配列が、 ５ｅｉｋｉ他の著になる論文くヒト成人Ｔ細胞白血病ウィルス：白血病細胞ＤＮ Ａ中に蓄積されたプロウィルスゲノムの完全なヌクレオチド配列〉（米国科学ア カデミ−会報８０号、３６１８−３６２２頁、１９８３年）で報告されている。

これらのウィルス外膜糖タンパク質と核タンパク質は、ＨＴＬＶ−１のｅｎｖ遺 伝子とｇａｇ遺伝子でそれぞれ暗号化されており、明らかに、　）ＩＴＬＶ−１ 感染患者の血清中の抗体により認識された抗原である。

ウィルスの外膜と核に在る遺伝的に重要なＨＴＬＶ−１抗原は。

細菌、酵母菌またはワクチニアのような種々の発現システムにおいてＨＴＬＶ− １ゲノムの部分をクローニングすることにより調製できる。かような組替え抗原 は、ＨＴＬＶ−１タンパク質についてなされたように１診断に使用でき、また、 潜在性ワクチン組成として使用できる。　Ｃａｂｒａｄｉｌｌａ他著の論文く細 菌で合成したｅｎｖポリペプチドを有する、ヒトエイズ・レトロウィルスに対す る抗体の血清診断法〉（バイオテクノロジー、４号、１２８−１３３頁、１９８ ６年）　、Ｃｈａｎｇ他著の論文く組替え型大腸菌由来ウィルス抗原ペプチドヒ トを用いた免疫測定法でのヒトＴ細胞リンパ栄養ウィルスＩＩＩ　（）ＩＴＬＶ −ＩＩＩ）の検出〉（バイオテクノロジー、３号、９０５−９０９頁、１９８５ 年）、Ｐｕｔｎｅｙ他著の論文〈大腸菌−ウィルス外膜の産出断片−に対する抗 体を中性化するＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＶＡ＞　（サイエンス。

２３４号、１３９２−１３９５頁、１９８６年）　、　Ｋｉｅｎｙ他著の論文く 組替え型ワクチニアウィルスから発現したエイズウィルスｅｎシタンパク質〉（ バイオテクノロジー、４号、７９０−７９５頁、１９８６年）に記述されている 。しかしながら、組替えＤＮＡ法により生産した）ＩＴＬＶ−１抗原は、ＨＴＬ Ｖ−１抗原試料を汚染し得る発現システムの抗原抗体の反応性によりＥＬＩＳＡ 試験において偽陽性反応が生じるのを避けるために、徹底的に精製しなければな らない。また、精製中にＨＴＬＶ−１抗原が変性すると重要な抗原活性が損なわ れる。

ワクチンの場合、細菌または酵母菌から精製した組替え型タンパク質もしばしば 細菌または酵母菌タンパク質によって汚染される。これらの不純物はたとえ極小 量であっても有害反応を惹起し得る。

組替え技術によって生産したＨＴＬＶ−１抗原はウィルス感染細胞培養から得た 抗原よりも改良されてはいるが、組替え認タンパク質もまだ可能な限り正確な診 断を与え得る試薬は提供出来ていない。病気の本性から正確な結果を必要とする ために、　ＨＴＬＶ−１の診断においては１００％の正確さと特異性を獲得し得 る他の試薬を開発しなければならない。

タンパク質は、特異性抗体のための結合部よりなるタンパり質部位であるエピト ープと抗原決定基を多数含んでいる。

一般に、タンパク質は５乃至１０個のエピトープを含んでおり、各々のエピトー プは６乃至８個のアミノ酸を持つ配列より成る。エピトープは、６乃至８個のア ミノ酸が線形配列で並んでいる連続型またはエピトープを形成するアミノ酸がタ ンパク質の３次元折畳み構造により群集する不連続型のいずれでもあり得る。１ つのエピトープが比較的小数のアミノ酸より構成されていても、抗体に対するそ の反応性はエピトープを囲むタンパク質中のアミノ酸によって左右される。

タンバンク質のエピトープまたは抗原部位の地図作成を目的とした複数の研究が 、関連タンパク質の種々の部位に対応する合成ペプチドを用いて進められた。例 えば、Ｌｅｒｎｅｒ他著の論文〈合成ワクチンの発展〉（免疫疾患の生物学：病 院実習本、ディクソン・フィフシャー社編、３３１−３３８頁、１９８３年）並 びにＬｅｒｎｅｒ著の論文く生物学及び医学における前決定特異性抗体〉（パ最 新の免疫学誌、３６：１．１９８４年）が挙げられる。エピトープは、タンパク 質表面に発見されるアミノ酸残基に多分相当する親水性配列中に発見出来る。タ ンパク質の折畳みモデルに基づく幾っがの予測法が開発されている。かような方 法は、エピトープを生産する免疫系プロセスタンパク質の抗原提示細胞が、タン パク質表面上で発見されたエピトープと必ずしも対応しないために、用途が制限 されている。免疫系が反応し抗体が生み出すのは、これらの処理されたエピトー プに対してであり、従って、ペプチド配列が免疫系により実際に認識されたエピ トープを示しているがを先験的に予知することは不可能である。かような処理さ れたエピトープを示すペプチドは、診断目的には極めて有用になるであろう。

通常略１００個またはそれ以上のアミノ酸長さを持つ組替えペプチドはひだを形 成し、無傷タンパク質の三次構造を模擬する三次構造を生みだして不連続エピト ープの形成を許す。

しかしながら、線形内部エピトープは分子中に隠れ、特異性抗体に接近不能とな り得る。

エピトープ地図の研究における有用性に加え１合成ペプチドは、タンパク質の主 要抗原決定基を包有するならば、ワクチンと診断試薬を含む免疫原性組成として の潜在能力を有する。ペプチドは特異性抗体の生産と反応において幾つかの利点 を有している。ペプチドの正確な配列は、タンパク質のアミノは配列により実際 に決定されるか或いはタンパク質のＤＮＡ配列暗号から予見されるように、アミ ノ酸の配列から選択することが可能である。特異合成ペアチドを使用すれば、特 異性抗体の生産または検定の際に全長のペプチドを使用する必要がなくなる。さ らに、メリフィールドとコツカーズの同相ペプチド合成法であれば、関連合成ペ プチドをほぼ無制限な数量を化学的に生産できる０例えば、Ｅｒ１ｃｋｓｏｎと Ｍｅｒｒｉｆｉｅｄｌの論文く固相ペプチドの合成〉（タンパク質、第３版、　 １９７６年、第２巻、第３章、アカデミツク・プレス社刊、ニューヨーク）に記 述されている。自動ペプチド合成装置の利用によりかような技術が一層の進歩を 遂げている。

タンパク質のどの部位が免疫優性であるかを決定するのに種々の判定基準を用い ることが出来るが、そのような部位に対応するペプチドは、大規模なスクリーニ ングや診断において常に有用であるとは限らず、例えば、ペプチドがタンパク質 と反応する抗体により認識される正しい間隔位置になければ抗原性は失われる。

さらに、ＨＴＬＶ−１と）ＩＴＬＶ−２に関し特に顕著であるが、これらの２つ のウィルスグループの各々に重要な遺伝的変異性を含んでおり、ウィルス血清型 を数多いものにしている。これは、スクリーニングと診断並びにワクチンの調製 に使用するペプチドを誘導するタンパク質部位の選択に重大な制限を課している 。

最近、ＨＴＬＶ−１からの表面糖タンパク質ｇｐ１２０とｇＰ４１の種々の免疫 優性部位に対応する免疫的に反応性なペプチドと、２つのウィルスのｅｎν遺伝 子で暗号表示されるＨＩＶ−２の対応タンパク質が合成され、ＨＩシー１または ＨＩＶ−２に感染した個体からの血清と略１００％の効率で反応を示している。

抗体の存在を検出する検定法においてかようなペプチドを使用すれば、偽陽性ま たは偽陰性の反応は生じない。

）ＩＴＬＶ−１の免疫的に重要なタンパク質から誘導したペプチドを用いてＨＴ ＬＶ−１感染の診断に対し同様なアプローチをすることは、特にウィルスが地方 病性であると思われる世界の地域においては極めて有用であろう。

最近の幾つかの出版物がすでに、ＨＴＬＶ−１の抗原タンパク質に対応する選択 合成ペプチドの免疫反応性を示すデータを提示している。成る研究において、幾 つかのＨＴＬＶ−１のｇａｇペプチドが合成された。　Ｐａ１ｋｅｒ達によれば くヒトＴ細胞リンパ栄養ウィルス１型（）ＩＴＬＶ−１）　Ｐ核タンパク質のＣ 末端部位が人間の免疫原性であり、ＨＴＬＶ−１特異性エピトープを含んでいる 〉（“免疫学”誌、１３６号２３９３−２３９７頁、１９８６年）。

ＨＴＬＶ−１のｐ１９タンパク質のＣ末端に対応する”５ｐ−７１”と命名され たｇａｇペプチドの１つは、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ　：放射同位元素標 識免疫定量法）において９人中８人のＨＴＬ？１患者の血清と反応したことが判 明した。　５Ｐ−７１のアミノ酸配列は、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐ ｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕである。　Ｃｏｐｅｌ ａｎｄ達は、論文くヒトＴ細胞白血病ウィルス１型の外被タンパク質：合成ペプ チドに対する抗血清での特性付けと天然エピトープの同定〉（“免疫学”誌。

１３７号２９４５−２９５１頁、１９８６年）において、）ＩＴＬＶ−１のｅｎ ｖ遺伝子により暗号表示されるタンパク質生成物部位に対応する３つの付加ＨＴ Ｌシー１ペプチドを合成した。これらのペプチドの中、５ｐ−７０は、主表面糖 タンパク質ｐｇ４６のＣ末端付近に位置しており、抗原活性は有していたが、Ｈ ＴＬＶ−１陽性患者１２人の中の４人の血清にのみ反応した。ペプチド５ｐ−７ ０は、塩基対６０６６−６０９８を包囲するＨＴＬＶ−１ゲノムのヌクレオチド 配列により符号化され、　Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−５ｅｒ− Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−ＮＨ，のアミノ酸配列を有している 。

ＨＴＬＶ−１感染患者の血清と１００％の効率で反応するｇｐ４６のようなＨＴ ＬＶ−１の免疫的に重要なタンパク質部位に対応するペプチドは、診断法に、ま たＨＴＬＶ−１に対応する抗体の生産を誘発する潜在性免疫原組成として直ちに 使用されるであろう。

図面の説明 第１図は、ＨＴＬＶ陽性抗血清に対する本発明のペプチドの反応性を示す棒グラ フである。糖タンパク質ｇｐ４６とｇｐ２１のアミノ酸配列に沿ったペプチドの 相対位置並びに個々のペプチドに対し反応するＨＴＬＶ−１サンプル（Ｎ＝７１ ）の比率を示している。潜在性グリコジル化部位には星印をつけて示しである。

第２図は、）ＩＴＬＶ−１のｇａｇ遺伝子符号化タンパク質（ｇｐ１５、ｇＰ１ ９およびｇｐ２４）のエピトープ地図作成結果を示している。

Ｘ軸上の数字は個別へキサペプチドの最初のアミノ酸（アミノ末端）のアミノ酸 番号を示す。Ｙ軸は、ＨＴＬＶ−１に陽性な２つのプール血清により各ペプチド について得た対応光学濃の読み値を示す。

発明の要約 本発明は、ＨＴＬＶ−１のｇａｇタンパク質とＨＴＬＶ−１のｅｎＶタンパク質 に対応する９つの新しい合成ペプチドを提供する。

これらのペプチドは単独または組合せで、他の分子と連結または非連結の状態で 、ＨＴＬＶ−１感染を検出する選択的診断法、ＨＴＬＶ−１感染に対する免疫法 並びに多クローン抗体と単一クローン抗体の生産に用いて有益である。

発明の詳細な説明 前記の新しいペプチドは、ＨＴＬＶ−１ウィルス感染または該ウィルスとの事前 接触の診断試験によく使用でき、また人間を含む動物の体内でのＨＴＬＶ−１に 対する抗体の生産を誘発する組成内免疫原として有用である。本発明により取込 まれたペプチドは、アミノ酸配列を含むオリゴペプチドより成り、該アミノ酸配 列はＨＴＬＶ−１の特異抗体と反応する連続（線形）エピトープよりなる配列を 含んでいる。

エピトープに対応するペプチドを検出するために１８から２６までのアミノ酸残 基を持つ３５の異なるペプチドが合成これらのペプチドのアミノ酸の配列を第１ 表に示しである。これらのペプチドは５つ以上のアミノ酸残基で互いに重複し、 ｅｎｖ遺伝子翻訳生成物（２１のｇｐ４６ペプチドと１４のｇｐ２１ペプチド） を完全に包含している。アミノ酸配列は、予測アミノ酸配列より得た。５ｅｉｋ ｉ他の論文くヒト成人Ｔ細胞白血病ウィルス：白血病細胞ＤＮＡに蓄積されたプ ロウィルスゲノムの完全なヌクレオチド）　（１９８３年、米国科学アカデミ− 会報８０号、３６１８−３６２２頁）に報告されている。これらのペプチドの中 の４つは以前に得られた（Ａ−ＨＴＬＶ−１，Ｂ−ＨＴＬＶ−１，Ｃ−ＨＴＬＶ −１，Ｄ−ＨＴＬＶ−１）　（Ｗｏ　８９１０８６６４参照）。

Ｊ−」−一表 ）ＩＴＬＶ−１よ番　し；ペプチド、びニＨＴＶＬ−１ニ・　るペプチドの ペプチドＬＬＬｊＩＬ　ヱ主ｆｆｌ五１　反夏土五五ユニー ｇａｇ−Ｌ　１ユ２−１３０　’ロ５ＤＰＱ工ＰＰＰＹＶＥＰτ入ＰＱＶＬ　７ ４／８１ｇａ（Ｊ−２Ｌ３１−１５０　７９２”ＪＨＧＡＰＰ番ＲＰＷＱＦＫＤ Ｌ　Ｏ１５ｇａｇ−３４１−６１ＹＤｒｒ、Ｑλｇ二ＡＱＦＤＰＴＡＫＤ　０７ ６ｇとｇ−４２０６−２２６つＳＬ工Ｓ＝入ＥτＲＧ：ＴＧ’ｎＪＰＬＡＧ？　 Ｏ／６ｇａｇ−５２６５−２８１Ｓ工ＬＯＧＬＥＱＰＹ：’ＡＦＶＥＲＬ　１／ ！τ　１９０−２ｉ２　Ｌ：＋ＰＨ５ＮＬＤＨ工＝ＰＳＺＦＷＫ５凰ＬＴ　８４ ／９７０　８９−１１０　ＭＧ２ＹＡＮＧＧＣＮ”ｆｓλ５−（ＳＤ？Ｃ３Ｔ− ３８／９Ｌυ　２０８−２３０　ＧｉＣＬＬＴＬＶＱＬＴＬＯ５ＴＭＹＴＣ工Ｖ ＣＸＤ　３２　／　６７Ｖ　２３９−２６エ　■ＩＳＰ？ＪＶＳＶＰＳ：５ＳＳ ＴＰ！、ＬＹｐｓＬＡ　［１１７９１Ｘ　２９１−３１３　Ｎ５ＬＺ！、ＰＰＦ ＳＬＳｉ’ＶＰＴＬＧＳＲ５Ｒ，”ＬＡ　７６／９７ＢＥ　３６３−３１！　５ 　℃９ＫＹＬｕＣＡＣＹＡＡＱ　ＮＲ，”ＬＧＬＤＬＬ　２９　／　９　ＬｈＨ １９０−２０９ＬＬＰＨ５ｍ二）Ｃ”：’Ｓ工ＰＷ：＜５Ｋ　３９／９１人Ａ　 ３４５−３６７　Ｓ−＝茹ＮつＫＤ工５ＱＬＴＱＡ：ＶにＮＨＸＮ　３０／１３ １ＧＧ　４６６−４８１１　ＱスＬアＳＩＲ■つ茸ＳＬ工ΩＥＳＳＬ　５５／９ Ｌ’ＶＨ：６３−’ＬＢ５　ＬＬＶＤＡＰσＯＰフ「Ｌ’ＪＴ二５ＱＬＰＰ　Ｏ ／６ｐｒｏｔ　Ｌ　上−Ｌ７　：、５ＴＰＫＬｊｓ’ＲＧＱ７−ＴＳＳアル　Ｏ ／６ｐｒｏｔ　２　４０−６２　Ｌ’ｔＦＶ工にλＱＶＤＴＱＴＳ１ｎにτ：＝ λＬ乙　０／６ｐｒｏｔ　３　フ５−９９　７ＳＳＮＴＰＬＸＮＴＳＶ’ＬＧλ ＧＧＱＴＱＤＨ；！Ｔ　ｏ／６ＶＡ　３６１３−３９０　−−に二ＡＱＹＡＡＯ ）＋’ＲＲＧ：ＪＬＬＦＷＣＯＧ　Ｏ／３３）ＬＡ　３９５−４１７　ＡＬＯＥ ＱＣＬＦアＮＺ　τＮｓ　茨Ｘ”−Ｑ　＝三Ｐ　Ｏ／６ＶＢ　２５０−２１！Ｚ 　ＬＡｕＡＰＨＬＴ！、；ＦＮＷＴ３Ｅ（ＴｈＰＱＺＱ　Ｏ／３３）０３　２８ ６−３１０　５ＳＰＣＤＪＳＬ工Ｌ；ＰＦＳＬＳ；ＶアＴＬＧＳＲ５９／３３Ｈ Ｃ２３４−２５５−け愼ＭＹＳアＮＶＳ■５ｓｓｓτＰＬＬ　８／３３ＶＣ２１ ０−２３２ＬＬＴＬＶＱＬＴＬＣ５で）ｒＣｒＣ：ＶＣ二ＤＲＡ　５／３３人　 ３８１−４０４　Ｇ：ｊＬ！ｊ’ＷＥＱＧ；ＬＣ（Ａ−！ＱＥＣ（Ｃ７ＬＮ　５ ７／９７Ｂ　２７３−２９５　罰！ゴｏｐλ二に？ＴＤＮロ宿Ｓ工ＺＬ　５４／ ９７Ｃ２２３−２４２”ＴＣ：ＶＣ：〕ｐｗＬＳＴＷＨ’ＬＹ？　７９　／　９ ７Ｄ　工１６−１４０　ＧＣＱＳｉＪＴ（）ｒ−λＶＳＳｌ■５ＯＦＤＶＮ　Ｏ ／１７１　低吸光度値 ２　当該タンパク質の遺伝子内アミノ象の相対位置Ｅ　３５−５７　ＳＹＦ、Ｓ クロＪＰＡＱＰＶＣ５ＷＴＬＤｒ、ＬＡＬ　Ｏ／１７Ｈ２１７６うＪ９　工＝ｓ ｏｙｐ’υＪＰＬ−分恥■コＨ工　３／６τ２　１９１−２１２　′ＬＬＳ７ｄ ＳＮＬＭＸＴ、ｕｓ工ＰＷＫｓＫＬ７Ｔ　３／６Ｌ　２０−４０　Ｇ：）ＹＳア ＳＣＣτＬτ工ＧＶＳＳＹＭ５に２　２／６７Ｌｌ　２０−４０　ＧＤＹＳＦＳ Ｃ；τＬＴｍＧＶＳ票ＳＫＰ　Ｏ／　６！ｕ　１５４−１７６　ＦＳＫＣＧＦＳ ＦＳＬＬＶＤＡＰＧＹＤＰＩＷＦ’、　Ｏ／６Ｖｌ　２３９−２６”　■ｚｓｐ ＊５ｖｐｓ’ｐｓｓτ？ＬＬＹ？ＳＴ、Ａ　４／６Ｆ　５５−７７　ＬλＬＳＡ ＤＱＡＬＱＰＰＣＰＮＬＶＳＹＳＥＹ’Ａ　２／１７Ｇ　Ｌ　０３−　Ｌ　２５ 　５ＹＳＤＰＣ５Ｌ２Ｃ１：’ＹＬＧＣＱ　５ＷＴＣ？ＹＴ　Ｏ／　Ｌ７Ｈエフ 　６−　工９９　′ＬＹｒ’Ｅ２Ｓ　Ｑ　ＬＰＰＴＡＰＰ　ＬＬＰＦ、Ｓ酬二Ｍ ＝　７：Ｌ／９７エ　３５２−３７４　Ｘ：）二５ＯＬＴＱ入工ＶＫＮＫ＜ＩＮ ＬＬ２ｃ：λＱＹ　２／Ｌ７：　３６２−３８４　■―ｘでζＬにスＱＹＡＡＱ ＮＲＲＧＬＤＬ　ｉ／Ｌ７Ｎ　７：Ｌ−９４ＶＳＹＳＳτシｔＴ”Ｓ　：”Ｌｒ 　ｒＨ’ｔｆＴ　Ｌ−…λＯ／　Ｌ　７Ｐ　ＬＯ７−１２９ＰＣ５Ｌ２ＣＣ：’ ＹＬＧＣＱＳＷＴＣ：ＩＹＴＧＡＶｓ　Ｏ／Ｌ７０　１３６−４５８　ＱＦｌｖ ！１ｒＦ＋′ＣＰＶ’；ＲｕＪＺＮＬｒ”：ＦＳＫＣＧ　Ｏ／’、７ＲＬＡ４− １７６　ＦＳＸＣ；ＴアＦＳＬＬＶＤＡＰＧ”ＤＰ二ｈ？！＋　０１５Ｓ　Ｌ７ ２−１９４　７Ｚ’ｄ’Ｆ　ＬＮτＥＰＳＱＬ？？＝λ？ＰＬ二２五Ｓ　Ｏ／Ｚ ７Ｗ　２　Ｅ　７−２７９　”：’　Ｓ　Ｌ；’Ｊ−ｉＡ７Ｅ＝７　’：；Ｆ’ ＮＩＣＭ工Ｐ　Ｏ／　６Ｙ　３０９−３３’、　：’ＪＲＲＡＶＰＶ入％−＃Ｌ ＶＳＡＬλＭＧＡＧＶλ　工／７３Ｚ　３２７−３４９　ＧＡＧ”／ＡＧＧ：？ Ｇ：Ｍ、Ｓ　ＬＡ５Ｇｊ５ＬＬＥＥ　Ｏ／６ｃｃ　ａｏｏ−＜２２　口ｙＨ工τ ＮＳ　ｙｐ”乙ＱＥ’Ｐア−ＥＮＲ５／６７フＤ　４１Ｂ−４４０ＰＬＥＮＲＶ ’ＬＴＧＷＧＬＮＩ（ＤＬＧ７−５ＱＷ入ＲＱ／：ユ工１−２５　ＭＧＫＦ’Ｌ Ａ？＝：ＴＱＦＣＰ！、：ＬＧ：）ＹＳＰＳＣＯ／６本１本字文字記号下記のア ミノ酸残基を示す。

アラニン　Ａ　ロイシン　Ｌ アルギニン　Ｒリジン　Ｋ アスパラギン　Ｎ　メチオニン　Ｍ アスパラギン酸　Ｄｏ　フェニルアラニン　Ｆシスティン　Ｓ　プロリン　Ｐ グルタミン酸　Ｅ　セリン　Ｓ グルタミン　Ｑ　トレオニン　Ｔ グリシン　Ｇ　トリプトファン　Ｗ ヒスチジン　Ｈチロシン　Ｙ イソロイシン　エ　バリン　Ｖ ３５の異なるペプチドをマイクロタイタ・プレートの井戸（Ｗａｌｌｓ）に結着 させ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＩＡ）によりＨＴＬＶ−１陽性患者から得た ６つの血清との反応性にっきスクリーニングを実施した。血清サンプルの１つ以 上と陽性反応を示した１１のペプチドを次に６５の追加ＨＴＬＶ−１陽性血清サ ンプルでさらに試験した。ペプチドのアミノ酸配列と、各ペプチドと反応したＨ ＴＬＶ−１陽性血清のフラクションを第１表に示す。

試験結果は、ｅｎｖタンパク質に三つの高い免疫原部位があることを示している 。第一の部位はＨ−ＨＴＬＶ−１（アミノ酸１７６から１９９まで）とＪ−ＨＴ ＬＶ−１（７ミ／＠１９０から２１２まテ）ノペプチドで限定されるアミノ酸残 基１７６から２１２までの間であり、第二ノ部位はＣ−ＨＴＬＶ−１（アミノ酸 ２２３から２３４まで）とＶ−ＨＴＬｖ−１（アミノ酸２３９から２６１まで） のペプチドで限定されるアミノ酸残基２２３から２６１までの間であり、第三の 部位はＢ−ＨＴＬＶ−１（アミノ酸２７３から２９５まで）とＸ−ＨＴＬＶ−１ （アミノ酸２９１から３１３まで）のペプチドで限定されるアミノ酸残基２７３ から３１３までの間である−　ｇｐ４６のアミノ末端基の半分から得た１つのペ プチド（０−）ＩＴＬＶ−１アミノ酸８９から１１０まで）はＨＴＬＶ−１陽性 血清と陽性の反応をする。

最近、アミノ酸残基２７４から３９２まで（逐次配列中のｇＰ４６／ｇｐ２１の 番号）に対応するペプチドがＨＴＬＶ−１陽性血清の１８％と反応した。Ｐａ１ ｋｅｒの他の論文（ｅｎν暗号化合成ペプチドおよびｇＰ４６に対する単クロー ン抗体によるヒトＴ細胞白血病つィルスエ型（ＨＴＬＶ−１）　ｇｐ４６とｇｐ ２１ノ外被糖タンパクの免疫原部位地図の作成〉（″免疫学”誌、１４２号、９ ７１−９７８頁、１９８９年）に報告されている。他の研究者はｇｐ２１内のエ ピトープに対応するペプチドの発見に失敗した（ＣＯＦ２−１ａｎｄ他、１９８ ６年）。

ｇｐ２１が免疫原性でないことを示す従来の研究とは反対に、本発明のｇＰ２１ 配列由来のペプチドはＨＴＬＶ−１陽性の抗血清と陽性の反応をする４つのペプ チドを生みだした。本発明は。

ヒトにおいて免疫原性のエピトープを含有するｇｐ２１内の２つの部位を明らか にした（第１図）、アミノ酸３４５−４０４に対応するｇＰ２１のアミノ末端基 の半分の１部位が、ＡＡ−）ＩＴＬＶ−１（７ミ／　ｆｉ３４５カラ３６７）　 、　ＢＢ−ＨＴＬＶ−１（７ミ／　ｆｉ３６３カら３８５）およびＡ−ＨＴＬＶ −１（７ミ／　＠３８１から４０４）（７）３−）（７）ペプチドによって決定 された。１つのエピトープを含むもう１つの部位は、ペプチドＧＧ−ＨＴＬＶ− １（７ミ／　ｒａ４６６カラ４８８）　１’規定されるｇＰ２１のカルボキシ末 端であった。興味深いことに、アミノ酸４０４から４０６のｇｐ２１内の潜在Ｎ 結合糖タンパク質部位のみを含むペプチドは、試験したＨＴＬＶ−１陽性ヒト血 清のいずれとも反応性を示さなかった。

第１図のペプチドは、バイオシステムを応用した４３０Ａ型ペプチド合成装置を 用いて合成した。ペプチドは固相から分離し、保護側鎖をフッ素水素で除去した 。ファルマシアの方法（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ、スエーデン） に従い５ＰＤＰを用いてペプチドをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合させた 。５ＰＤＰとの反応を促進させるために、最初のペプチド配列に対しシスティン をＣ末端に付加した。ペプチドＢＳＡ複合体をつぎにマイクロタイタブレート（ ＮＵＮＣ、デンマーク）に載せた。ペプチドに対する血清の反応性を５０分の１ の希釈度で間接ＥＬＩＳＡ法により試験した。５つの陰性対照値の平均値＋６Ｓ Ｄ以上の吸収度を示した血清をペプチドと陽性反応をするものとみなした。糖タ ンパク質のアミノ酸配列に沿ったペプチドの相対位置と個々のペプチドと反応し た）ＩＴＬＶ−１血清（ｎ＝７１）の比率を得た。ＨＴＬＶ−１陽性血清中の抗 体と結合した４つの反応性ｇｐ２１ペプチドと７つのｇｐ４６ペプチドのみを指 定した。可能な糖鎖形成部位に星印を付けて示しである。

Ｃｏｐｅｒａｎｄ　（１９８６年）およびＰａｒｋｅｒ　（１９８９年）達が記 述したｅｎジペプチドの位置を確認した。

ＨＴＬＶ−１ｇａｇ遺伝子生産物のエピトープを決定するために別の系列のペプ チドを合成した。異なるスクリーニング戦略を用いて前記の方法と比較した。完 全なｇａｇ遺伝子生産物を含み、５つのアミノ酸残基で互いに重なり合っている ヘキソンペプチドを、Ｇｅｙｓｅｎ達が論文く単一アミノ酸分解までのエピトー プに対するウィルス抗原用ペプチド合成の利用〉（米国科学アカデミ−会報８１ 号、３９９８−４００２頁、　１９８４年）に記載しているように、ポリエチレ ン製の棒上で合成した。ペプチド合成のためのフレームは、新しい各ペプチド毎 に１個のアミノ酸Ｃ末端だけ移動させた（各個別ペプチド１毎に模写をした）。

次に、防御を解除したが末だ前記の棒に付着しているペプチドにつきＥＩＡ試験 を実施した。全ての３つのｇａｇ暗号化タンパク質に残反応した２つのプール血 清を用いてペプチドを試験した。各血清の最終希釈度は１００分の１であった。

得られた試験結果を第２図に示しである。試験結果によれば、５つのペプチド（ １７から２１のアミノ機長）が合成され、前記のごとくマイクロタイタブレート 上に塗布された。）ＩＴＬＶ陽性血清をペプチドに対し試験した際、１つのペプ チドが強く反応した（　Ｇａｇ−１−ＨＴＬＶ−１）　、　Ｘ軸上の番号は各々 のへキサペプチドの最初の（Ｎ末端基）アミノ酸に対するアミノ酸座標である。

Ｙ軸はＨＴＬＶ−１陽性血清のプールに対する各ペプチドの吸光度を示す。

この発明は、かように免疫的に反応性のペプチドと、）ＩＴＬＶ−１のｅｎν遺 伝子により暗号化された外被糖タンパク質部位に対応し、ペプチドの抗原特性に 重大な影響を与えない機能的に同等な上記ペプチドの変種を包含している。

これらのペプチドは、公知の固相ペプチド合成技法により合成したａ　Ｍｅｒｒ ｉｆｉｅｄとＢａｒａｎｙ著くペプチド：分析、合成、生物学）　（１９８０年 、第１巻第１章、ＧｒｏｓｓとＭｅｉｎｅｎｈｏｆｅｒ編、アカデミ−プレス社 刊、ニューヨーク）に記載されている。また、この合成により、当初のタンパク 質配列に対応しない１つまたは２つのアミノ酸をペプチドのアミノまたはカルボ キシル末端に付加させることが出来る。かような追加アミノ酸はペプチドを互い に、或いは大きな担体タンパク質に、或いは固体支持体に結合させるのに役立ち 。この目的のために有用なアミノ酸は、チロシン、リジン、グルタミン酸、アス パラギン酸、システィンおよびそれらの誘導体であるが。

但し、それらだけに限定するものではない。付加タンパク質一時変異技術は、例 えば、ＮＨ，−アセチル化またはＣｏｏ）ｌ−末端基アミド化のように、ペプチ ドを他のタンパク質またはペプチド分子または支持体に結合させるための追加手 段を提供するのに使用できる。

これらペプチドの類似体および相同体もまた含まれている。

類似体は、本ペプチドと機能的に同等であるが天然でなく生じたアミノ酸を含む ペプチドである。相同体は、保存的に置き換えたアミノ酸を有するかまたはＨＴ ＬＶ−１のいずれか他の隔離集団のゲノムで暗号化されたペプチドに対応するペ プチドである。保存的アミノ酸置換体は、グリシン、アラニン、バリン、イソロ イシン、ロイシン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、ト レオニン、リシン、アルギニン、フェニルアラニンおよびチロシンを含むが、そ れらだけに限定するものではない。本発明により取り込まれたペプチドは、ＨＴ ＬＶ−１抗体と反応し得る少なくとも１つの連続（線形）エピトープを含有する 各アミノ酸配列よりなる。下記に示す完全なアミノ酸配列よりも少ない内容のか ようなペプチド誘導体は、ＨＴＬＶ−１に対し特異性を示す抗体により認識され た線形エピトープを少なくとも１つ含むことを条件として本発明の実施態様とし た。かようなアミノ酸配列を含む″ペプチド”の用語は、類似体、相同体および それらの誘導体を含んでいる。

ＨＴＬＶ−１タンパク質に対応する新しいペプチドについて以下に説明する。ア ミノ酸残基の番号付けについては、５ｅｉｋｉ達によりく米国科学アカデミ−会 報８０号、３６１８−３６２２頁、１９８３年〉にすでに記述されている。アミ ノ酸の省略表示は次の通りである。Ａｌａ　（アラニン）　、　Ａｒｇ　（アル ギニン）　、　Ａｓｎ（アスパラギン）　、　Ａｓｐ　（アスパラギン酸）　、 　Ｃｙｓ　（システィン）　、Ｇｌｎ　（グルタミン）　、　Ｇｌｕ　（グルタ ミン酸）　、　Ｇｌｙ　（グリシン、Ｈｉｓ　（ヒスチジン）　、Ｉｌｒ　（イ ソロイシン）　、　Ｌｅｕ（ロイシン）　、Ｌｙｓ　（リジン）　、Ｎｅｔ　（ メチオニン）　、　Ｐｈｅ（フェニルアラニン）　、　Ｐｒｏ　（プロリン）　 、Ｓｅｔ　（セリン）。

Ｔｈｒ（トレオニン）、Ｔｒｐ（トリプトファン）　、Ｔｙｒ　（チロシン）　 、　Ｖａｌ　（バリン）。

ペプチド　Ｉ−）ＩＴＬＶ−１ Ｘ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−１１ｅ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａ　 ｌａ−１１ｅ−ｖａ　１−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ａ　ｓｎ−Ｌｕｅ −Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ａ　１ａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｙ−Ｚ　。

とそれらの類似体および相同体である。Ｘはこのペプチドのアミノ末端基ＮＨ２ グループまたはこのペプチドのアミノ末端基ＮＨ，グループに結合した１個の付 加アミノ酸のいずれかであり、この付加アミノ酸は核ペプチドのペプチド、タン パク質または他の支持体への結合を促進するために選択されたものである。Ｙは 欠落しているかまたはシスティン残基であり、Ｚはヒドロキシルグループまたは アミノグループである。

ペプチドＩ−）ＩＴＬＶ−１は、Ｉ−ＨＴＬＶ−１のｅｖｎタンパク質から誘導 されたものである。

Ｘが水素、Ｙがシスティン残基、ＺがヒドロキシルグループであるペプチドＩ− ＨＴＬＶ−１がとくに好ましい。

ペプチド　ＡＡ−ＨＴＬＶ−１ Ｘ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓ ｐ−１１ｅ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｕｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｖａ ｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｙ−Ｚ。

とそれらの類似体および相同体である。Ｘ、ＹおよびＺは前記と同じ定義である 。

ペプチドＡＡ−ＨＴＬＶ−１はＨＴＬＶ−１のｅｎｖタンパク質から誘導された ものである。Ｘが水素、Ｙがシスティン残基、Ｚがヒドロキシルグループである ペプチドＡＡ−ＨＴＬＶ−１がとくに好ましい。

ペプチド　ＢＢ−ＨＴＬＶ−１ Ｘ−Ｌｙｓ−Ａ　ｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌｙ　ｓ−Ａ　ｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙ　 ｓ−１１ｅ−Ａ　１ａ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａ　１ａ−Ａ　１ａ−Ｇ　ｌｎ−Ａ　 ｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｕｅ−Ａ　５ｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｙ−Ｚ　 。

とそれらの類似体および相同体である。Ｘ、Ｙおよび２は前記と同じ定義である 。

ペプチドＢＢ−ＨＴＬＶ−１は）ＩＴＬＶ−１のｅｎｖタンパク質から誘導され たものである。Ｘが水素、Ｙがシスティン残基、２がヒドロキシルグループであ るペプチドＢＢ−ＨＴＬＶ−１がとくに好ましい。

ペプチド　ＧＧ−ＨＴＬＶ−１ Ｘ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａ　ｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｖ ａ　１−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔ　ｙ　ｒ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉ　 ｌｅ−Ｌｙ　５−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｙ−Ｚ　。

とそれらの類似体および相同体である。Ｘ、ＹおよびＺは前記と同じ定義である 。

ペプチドＧＧ−ＨＴＬＶ−１はＨＴＬＶ−１のｅｎｖタンパク質から誘導された ものである。Ｘが水素、Ｙがシスティン残基、Ｚがヒドロキシルグループである ペプチドＧＧ−ＨＴＬＶ−１がとくに好ましい。

ペプチド　０−ＨＴＬＶ−１ Ｘ−Ｔｈｒ−Ｌｙ　５−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａ　ｓｎ−Ａｒｇ−Ａ　５ｎ−Ｇ　１ ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−５ｅ ｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｙ−Ｚ。

とそれらの類似体および相同体である。Ｘ、Ｙおよび２は前記と同じ定義である 。

ペプチド０−ＨＴＬＶ−１は１（ＴＬＶ−１のｅｎｖタンパク質から誘導された ものである。Ｘが水素、Ｙがシスティン残基、２がヒドロキシルグループである ペプチド０−１（ＴＬＶ−１がとくに好ましい。

ペプチド　Ｔ−ＨＴＬＶ−１ Ｘ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｈｉ ｓ−Ｉ　ｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−５ｅｔ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌ ｙｓ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｙ−Ｚ　。

とそれらの類似体および相同体である。Ｘ、ＹおよびＺは前記と同じ定義である 。

ペプチドＴ−ＨＴＬＶ−１はＨＴＬＶ−１のｅｎｖタンパク質から誘導されたも のである。Ｘが水素、Ｙがシスティン残基、Ｚがヒドロキシルグループであるペ プチドＴ−ＨＴＬＶ−１がとくに好ましい。

ペプチド　Ｖ−ＨＴＬＶ−１ Ｘ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａ　５ｎ−Ｖ　ａ　ｌ−５ｅ ｒ−Ｖａ　１−　Ｐｒｏ−５ｅｒ−５ｅｒ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ− Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｌｅｒ−Ａ　ｌａ−Ｙ−２。

とそれらの類似体および相同体である。Ｘ、ＹおよびＺは前記と同じ定義である 。

ペプチドＶ−ＨＴＬＶ−１はＨＴＬＶ−１のｅｎｖタンパク質から誘導されたも のである。Ｘが水素、Ｙがシスティン残基、Ｚがヒドロキシルグループであるペ プチドＶ−ＨＴＬシー１がとくに好ましい。

ペプチド　Ｘ−ＨＴＬＶ−１ Ｘ−Ａ　５ｎ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉ　１ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ− ３ｅｒ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ −３ｅｒ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａ　ｌａ−Ｙ−Ｚ　。

とそれらの類似体および相同体である。Ｘ、ＹおよびＺは前記と同じ定義である 。

ペプチドＸ−ＨＴＬＶ−１はＨＴＬＶ−１のｅｎｖタンパク質から誘導されたも のである。Ｘが水素、Ｙがシスティン残基、２がヒドロキシルグループであるペ プチドＸ−ＨＴＬＶ−１がとくに好ましい。

ペプチド　ＧＡＧ−ＨＴＬＶ−１ Ｘ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒ ｏ−Ｔｙｒ−シａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａ ｌ−Ｌｕｅ−Ｙ−２゜とそれらの類似体および相同体である。Ｘ、ＹおよびＺは 前記と同じ定義である。

ペプチドＧＡＧ−ＨＴＬＶ−１は）ＩＴＬＶ−１ｆ７）　ｇａｇ　９　”／バク 質から誘導されたものである。Ｘが水素、Ｙがシスティン残基、２がヒドロキシ ルグループであるペプチドＧＡＧ−１−ＨＴＬＶ−１がとくに好ましい。

これらのペプチドは、ＨＴＬＶ−１またはＨＴＬＶ−１を伴う抗原に対する抗体 の検出方法において単独または組合せて使用できる。抗体は血清、他の体液、組 織サンプルおよびＨＴＬＶ−１に対する抗体を含有出来るその他のサンプルを含 むが、但し、それだけに限定されず生物学的サンプル中にも発見できる。

特に、Ｈ−ＨＴＬＶ−１，０−ＨＴＬＶ−１およびＴ−ＨＴＬＶ−１は、１（Ｔ ＬＶ−１感染をＨＴＬＶ−２感染と区別するために使用できる。本発明は、血液 と血液由来生成物を高い信頼性と特異性をもってスクリーニングするのに有益で ある。これらのペプチドはまた、ＨＴＬＶ−１による感染を防止するためにワク チンとしても使用できる。本発明はまた、ペプチドを特異的に認識する単クロー ン及び多クローン抗体を提供する。

サンプル中のＨＴＬＶ−１特異性抗体の存在を検出するためにペプチドを使用す る方法は、サンプルを少なくとも１つのペプチドに、サンプル中に存在し得るＨ ＴＬＶ−１に対するいずれかの抗体とペプチドとの間に免疫複合体が形成される 条件下で接触させることを含む。もし、サンプル中にＨＴＬＶ−１に対する抗体 があれば、その存在を示す免疫複合体が形成され、これを次に適当な手段で検出 し測定する。

かような検出方法には、放射性同位元素標準免疫定量法（ＲＩＡ）　、　闇素結 合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）　−ウエスタンブロッテング法等の同質性およ び異質性結合免疫測定が含まれるが、但し、それらだけに限定されるものではな い。さらに、新しいペプチドを用いた分析実験記録により、競合および非競合結 合測定法が実施可能である。スクリーニング法は迅速で効率よく、多量のサンプ ルを同時にスクリーニング出来る。

前記ペプチドを標識（信号発生）するか非標識とするかは測定法のタイプによる 。ペプチドに結合できる標識は、当業技術において公知である酵素、放射性核種 ５発蛍光物質１色原体物質、補因子、ビオチン／アビジンおよび磁粉を含むがそ れらだけに限定するものではない。

前記ペプチドは、当業技術において公知であるいずれの手段を用いて、他のペプ チド、固体支持体および担体タンパク質に結合出来る。固体支持体には、ポリス チレンまたはポリビニール製マイクロタイタブレート、ガラス管またはガラス玉 並びに、紙、セルローズ、セルローズ誘導品、シリカ等のクロマトグラフ用支持 体が含まれるが、これらにのみ限るものではない。担体タンパク質には、ウシ血 清アルブミン（ＢＳＡ）およびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が 含まれるがこれらにのみ限定されるものではない。

患者の血清および血液ならびに血液由来生成物を大規模かつ臨床的にスクリーニ ングする場合、特に好ましい分析技術はＥＬＩＳＡ、凝集技法およびウェスタン ブロッティング技法であり、ＥＬＩＳＡ試験は速度が早く、多量のサンプルを同 時に試験でき自動化が容易である点で特に好ましい。前記のペプチドを採用した ＥＬＩＳＡ試験は他のウィルスを検出するための現行試験法に基づいている。こ れらの分析法において試薬として使用するために１本発明によるペプチドはマイ クロタイタの滴定弁の内面に都合よく固着する。ペプチドは疎水性相互作用によ りマイクロタイタの滴定弁に直接固定出来、またはＢＳＡのような当業技術にお いて公知の手段で担体タンパク質に共有結合的に付着出来、滴定弁を被覆する複 合体を形成する。一般に、前記ペプチドは略１〜１００μ／ｍｌの範囲の濃度で 使用した。

但し、この濃度範囲は制限的なものではなく５例えば、分析を成功させるために 、５００μ／＋＋＋１のペプチドを必要とすることも有り得る。通常、これらの ペプチドは１０〜１００μ／ｍｌの範囲の濃度で被覆に用いられる。

体液および組織サンプルに限定しないがそれらを含む試料を次に前記ペプチドを 塗被した滴定弁に加える。この時、試料中にＨＴＬＶ−１に対する抗体が存在す れば、免疫複合体が形成される。信号発生手段を加えて、複合体形成の検出に役 立てることが出来る。検出可能な信号は、ＨＴＬＶ−１に特異な抗体が試料中に ある場合に発生する。凝集検定法は、日本において一般に用いられている。ラテ ックスまたは赤血球のいずれもこの技法に使用できる。凝集検定に使用される方 法は血液のスクリーニング技術においてよく知られている。

本発明のペプチドを処方して組成物に入れ免疫原として使用することも可能であ る。これらの免疫原は動物およびヒトの体内でのＨＴＬＶ−１に対する抗体の生 産を誘発するのに使用できる。生産された抗体は、単クローンまたは多クローン 型のいずれでもあり得る。かような組成物を調製するために。

前記ペプチドの少なくとも１つを免疫的に有効な量を、人間を含む動物への投与 に適し生理的に受け入れられる担体と混合する。前記ペプチドは仲間同士互いに 、他のペプチドに、担体タンパク質或いは他の担体に共有結合的に付着し、リポ ソームまたは他の小胞中に取り込まれるか、或いは、ワクチン技術において公知 のように抗原性の補強物質または吸収性物質と複合させることができる。代わり に、前記ペプチドを前記のように複合化物にせず、人間を含む動物への投与に適 した通常生理食塩溶液または緩衛化合物のような生理的に受け入れられる担体と 単に混合する。ワクチンおよび抗体を生産、精製し特徴付ける方法は、当業技術 において公知であるので詳述しない。

抗体を誘発するための全ての免疫原組成と共に、本発明による前記ペプチドの免 疫的に有効な量を経験的に決定しなければならない。考慮すべきファクターは、 未変性ペプチドの免疫原性、ペプチドが抗原性補強物質或いは担体タンパク質或 いは他の担体と複合するのかまたは混合するのが、静脈内、筋肉内、皮下等の組 成物の投与経路並びに投与すべき免疫置数である。かようなファクターは、ワク チン技術において公知であり、免疫学者の技術の範囲内で不必要な実験をせずに かような決定を十分なし得る。

本発明は、また、前記ペプチドに応答し発生しそれらのペプチドを認識する抗体 を含んでいる。かような抗体は多クローン抗体でもまたは単クローン抗体でもあ り得る。抗体の生産方法は当業技術においてはよく知られている。

以下、本発明の実施例につき詳述する。担し、記述例は、いずれにせよ１本発明 の範囲を限定するものではない。

何−１ アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の４ ３０Ａ型ペプチド合成装置（Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を全て のペプチドの合成に使用した。各合成には、ペプチドインターナショナル社（Ｐ ｅｐｔｉｄｅｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ケンタラキー州ルイスビル市） 製のＰ−メチルベンジルヒドリルアミンの同相支持樹脂を用いた。４３０Ａ型ペ プチド合成装置のユーザ用マニュアル（アプライドバイオシステムズ社刊、１９ ８６年）に従ってペプチドを合成した。

合成に使用する全てのアミノ酸は、α−ＮＨ２基を保護するｔ−ブチルカルボ二 基（ｔ−Ｂｏｃ）を含んでおり、スイスのノヴアビオケム株式会社（Ｎｏｖａｂ ｉｏｃｈｅｍ　ＡＧ）から入手した。反応性側鎖基を持つアミノ酸は、不必要で 望ましくない側鎖反応を防ぐために追加保護基を含んでいた。全てのペプチドの 合成に使用した個々の保護されたアミノ酸を第２表に示す。

個別の合成が終了後、合成ペプチドから保護基を除去し、排除剤として１０％の アニソールと１０％のジメチルスルフィドを組み合せる無水フッ化水素酸（ＨＦ ）を用いて０℃の温度で前記ペプチドを処理して固体支持から引き離した。分離 後、サンプル中のＨＦをＮ２ガスでパージし、さらに０℃の温度の真空中で全て のＨＦ残分を除去した。トリフルオル酢酸（ＴＦＡ）処理してペプチドを樹脂か ら抽出し、ＴＨＦを室温で蒸発させて除去した。ＴＦＡ除去後、ペプチドを沈殿 させ、無水エーテルで洗浄した。

特異性測定に使用する前に、必要ならば、逆相高性能液体クロマトグラフ（）Ｉ ＰＬＣ）を用いペプチドをさらに精製することが可能である。かような精製に特 に適したカラムは、逆相バイダックＲＣ−１８製カラム（Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｈ ａｓｅ　Ｖｙｄａｋ　ＲＣ−１８Ｃｏｌｕｍｎ）で、水（ＴＦＡ）−アセトニト リル（ＴＦＡ）の勾配を用いてペプチドを溶離する。

碧−」Ｌ−艮 ペプチド八　に　したアミノ Ｂｏａ−Ｇよｎ−０Ｈ Ｂｏａ−Ｐｈａ−Ｏｆ（ ＢＯＣ−Ｐｒｏ−ＯＨ Ｔｏｓ＝トシルまたはＰトルエンスルホン酸ｏＢｚｌ　”ベンジルオキシ ｐＭｅｏＢｚｌ＝＝　ｐメチルベンジルオキシ２−Ｃ１−Ｚ　＝カルボベンゾキ シ塩化物２−Ｂｒ−Ｚ　＝カルボベンゾキシ臭化物創ニー４ 下記の実験はマイクロタイタブレートの井戸の塗被を容易にするためにウシ血清 アルバミン（ＢＳＡ　）に結合させたペプチドを用いて実施した。

２００枚のペプチド塗被マイクロタイタブレートを生産するために、下記のプロ トコールを用いた。

ウシ血清アルバミン（ＢＳＡ）　０．１５ｇのアリコツト（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅ ｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、フラクションＶ）を３ｍｌの結合緩衝液（０，２ＭＮａ 　ＰＯ４，ｐＨ８，５）中で溶解させる。このＢＳＡ溶液を３等分し、各溶液を ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ、　ＩＪｐＰｓａｌａ、スエーデ ン）に入れ、１　、５ｍｌの結合緩衝液を加え、２．０ｍｌの結合緩衝液で溶離 する。プール溶離サンプルのＢＳ濃度は、２８０ｎｍにおける溶液の吸光度を測 定して計算する。Ａ２．、。（０，１％ＢＳＡ）＝０．６７Ｉ０１／ｍｇ。回収 率は、大体８０−９０％である。

Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ビリジルヂチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ、 Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を次にエタノール中で溶解し最終濃度を５−４０ｍＭにす る。５ＰＤＰの濃度は、ファルマシアファインケミカル社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 　Ｆｉｎｅ　ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の５ＰＤＰパンフレツトに従って反応性エス テルを測定して決定する。各ＢＳＡ当量に対し１０の５ＰＤＰ当量を加えて先に 準備したＢＳＡに、２−ピリジルジスルフィド残基を導入する。５ＰＤＰ溶液は 、ＢＳＡ溶液をかき回しながら加える。混合物を室温で１５−３０分間温置型る 。

反応しない余分の５ＰＤＰを除去するために、ピリジルジスルフィドとＢＳＡの 混合物を６等分に分割し、各混合物をＰＤ−１０カラムに入れる。カラムを平衡 させ、生成物を１０％の酢酸水溶液で溶離させる。置換度は、ファルマシアファ インケミカル社の５ＰＤＰパンフレツトに従って測定する。ＢＳＡの回収量は、 大体９０−１２０ｍｇであり、置換度は、６−８の範囲で、略７である。

ペプチド溶液は、２５ｍｇのペプチドとＩ　ＢＳＡ当量に対し７ペプチド当量に なるような量のピリジルジスルフィド・ＢＳＡ溶液を混合して調製する。混合液 を室温で１８−４８時間間温置型る。Ｇ−２５セフアデツクス（Ｓｅｐｈａｄｅ ｘ　Ｇ−２５、ファルマシアＬＫＢ社製）を充填し１０％酢酸水溶液で平衡させ たカラム（２，０ｃｍ２．８０−８０−１Ｏ０に反応混合液を流して遊離した２ −チオピリドンを除去する。生成物を１０％酢酸水溶液で溶離する。次にＡ２８ ０が０．５より大きいフランクジョンを集めてプールする。プール量は略３０３ ０−４Ｏである。プールフランクジョンを４℃の温度で保管する。数カ月間安定 である。

次に、ペプチド・ＢＳＡの共役液を塗被緩衝液（５０ｍＭ　ＮａＣ０，。

０．１５８　ＮａＣ１，ｐＨ９，５）で６０ｍｇ／ｍｌになるまで希釈する。溶 液のｐＨ値をチェックし、１−５ＭのＮａＣ１で９．５に調節する。

塗被緩衝液に希釈したペプチド・ＢＳＡ混合物の１００μｌアリコツトをマイク ロタイタブレート（Ｎｕｎｃ、高結合形、カタログＮｏ、４−６８６６７）の各 井戸に入れる。プレートを室温で１５分間温置型る。温度後、井戸から液を吸引 する。（０，２２ミクロンのフィルターでろ過した）無菌食塩加リン酸緩衝液（ ＰＢＳ。

１０ｍＭ　ＮａＰＯ４，Ｏ，１５Ｍ　ＮａＣ１，ｐＨ７，２）中の３％ＢＳＡの ２００μｍアリコツトを各井戸に加える。プレートを覆い１６時間３７℃で温度 する。

置型後、液を井戸から吸引する。マイクロタイタブレートを安全キャビネットに 入れて約３時間空気乾燥させる。

上記プレートは、閉鎖容器、例えば密閉アルミニウムバンクに入れ、＋４℃また は一２０℃の温度で長期間保存出来る。

前記ペプチドをＥＬＩＳＡ試験に使用し、免疫反応性を測定した。全てのペプチ ドは、ＨＴＬＶ−２の抗体に陽性な血清サンプル、ＨＴＬＶ−１ノ抗体に陽性な 血清サンプル、ＨＴＬＶ−１とＨＴＬＶ−２の抗体に陽性を血清サンプルおよび ＨＴＬＶ−１／ＨＴＬＶ−２に陰性である１０人の供血者の血清に対し、平行し てＥＬＩＳＡ試験を行った。ＰＣＴ特許公報１ｌＯ８９−０８６６４にすでに記 述されているＨＴＬＶ−１ペプチドに対する血清試験も実施した。

マイクロタイタブレートは例２に記述の如く準備された。

保管されていたプレートの場合は、先ず室温にまで戻し１次に洗浄緩衝液（ＰＢ Ｓ中にＴｗｅｅｎ２０を０．０５％）に１０分間予備浸漬させる。この子儂浸漬 溶液を使用前に井戸から吸引する。

血清サンプルを各々血清希釈溶液（洗浄緩衝液中ＢＳＡ　１％）に１＝５０に希 釈する。希釈血清の１００μｍアリコツトを各井戸に入れ、プレートを加湿器に 入れ９０分間３７℃の温度に温度する。温度後、各プレートを３回洗浄緩衝液で 洗浄する。

抗ヒト免疫グロブリンＧ　（ＩｇＧ）共役体（Ｊａｃｋｓｏｎ、　Ｌａｂａｓｓ ｃ。

社、　ａｒｔ、　Ｎｏ１Ｏ，４９９９９９９，１０９−０５６−００３、アルカ リホスファターゼ）を０．５ｍｌの水（Ｈ２Ｏ）に溶解し、アリコツトに分割し 、冷凍する。冷凍アリコツトを解凍し、血清希釈緩衝液で１：５００に希釈する 。１００μｍのアリコツトを各井戸に加える。

プレートを加湿室内で９０分間３７℃の温度に温度する。温度後、各プレートを ３回洗浄緩衝液で洗浄する。アルカリホスファターゼ基質（Ｓｉｇｍａ　＋錠剤 ）を基質希釈緩衝液（５０ｍＭ　Ｎａ２Ｃｏ３゜１ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ）で希釈し 最終濃度を１ｍｇ／ｍｌにする。２００　μｍのアリコツトを各井戸に加える。

プレートを室温で約３５分間置型する。もし望むなら、　３ＭのＮａＯＨを１０ ０μｍ各井戸に加えて反応を停止させることが可能である。

ペプチドと結合した抗体の量を決定するために、プレートを４０５ｎｍで読みと る。吸光度が高ければ高いほど、結合抗体の量も多い。

何−土 ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２血゛による原ペプチドのＥＬＩＳＡ Ａ−ＨＴＬＶ−１、ＡＡ−ＨＴＬＶ−１、Ｂ−ＨＴＬＶ−１、Ｃ−ＨＴＬＶ−１ 、ＨＨ−ＨＴＬＶ−１、Ｖ−ＨＴＬＶ−１およびＸ−ＨＴＬＶ−１と相同な’Ｈ ＴＬＶ−２からの誘導ペプチドを第１例に記述の方法により生産した。ＨＴＬＶ −２ペプチドは１９８９年１１月１３日出願の米国特許出願番号０７／４３４， ２３９に記載されている。ＨＴＬＶ−２のアミノ酸配列は、Ｓｈｉｍｉｔｏｈｎ ｏが１９８５年に論文〈ヒトＴ細胞白血病つィルスＩＩ型感染クローンの完全な ヌクレオチド配列：タンパク質分解酵素用のオープンリーディングフレーム〉（ 米国科学アカデミ−会報８３号３１０１−３１０５頁に掲載）記述しているヌク レオチド配列より誘導した。

このグループのペプチド相同ペプチドを、　ＨＴＬＶ−２を認識しＨＴＬシー１ とＨＴＬＶ−２を区別し交差反応性である抗体を検出する特殊なペプチド能力を 決定するために、第２例および第３例に記述せる方法で患者の血清を用いて試験 した。

このスクリーニングテストに用いた血清サンプルは、ＰＣＲ分析によりＨＴＬＶ −２に関し陽性であることを予め認識したものであった。

ＨＴ−２０１−ＨＴ−２２０と命名したこれらの血清は、セロロジカルズ社（Ｓ ｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ、、Ｐｅｎ５ａｃｏｌａ、　Ｆｌａ、）より入 手した。

これまでの研究者は、ウェスタン法、ＥＬＥＳＡ、蛍光抗体法のいずれの測定法 においても、抗体がこれらの血清内のＨＴＬＶ−１または）ＩＴＬＶ−２のいず れに対し特異であるかを区別することが出来なかった。

第３表はＥＬＩＳＡ試験で得た結果を示している。陽性の対照サンプルには、） ＩＴＬＶ−１とＨＴＬＶ−２の両方に対し陰性である血清を用いＮＣ−１および ＮＣ−２と表記しである。）ＩＴＬＶ−１に陽性な血清はＨＴＬＶ−１と表記し 、患者の血清ＨＴ−２０１−ＨＴ−２２０は２０１−２２０と表記しである。試 験結果は４０５ｎｍでの吸光度の読み値である。

第３表に示した試験結果から明らかなように、Ｈ−ＨＴＬＶ−２，０−）ＩＴＬ Ｖ−２、Ｔ−ＨＴＬＶ−２、Ｔ−ＨＴＬＶ−２およびＧａｇ−１−１１ＴＬＶ− ２が）ＩＴＬＶ−２感染患者の血清と強く反応する。全てのペプチドは血清ＨＴ −２１８およびＨＴ−２１９とは不十分にしか反応しない。以前のＥＬＩＳＡ試 験では、これらの血清は、含有する）ＩＴＬＶ−２特異性抗体のレベルが低かっ たために弱い陽性であると判断されていた。ところが、驚くべきことに、ｌ＋Ｔ ＬＶ−２ペプチドはＨＴＬＶ−２感染患者の血清とよく反応し、ＨＴＬＶ−２感 染患者の血清中に存在する抗体とは不十分にしか反応しない。Ｇａｇ−１−）！ ＴＬＶ−２ペプチドは他の３つのペプチドはど特異性ではない。

残りのペプチドが大多数の患者の血清中の１（ＴＬＶ−２に対する抗体を検出出 来なかったのは意外である。これらのペプチドは）ＩＴＬＶ−１エピトープに相 当し、それゆえＨＴＬＶ−２抗体とよく反応することが予期された。

１（ＴＬＶ−１ペプチドの特異性をよりよく決定するために、　ＥＬＩＳＡ試験 を第３例の記述の如〈実施した。ペプチドＨ−ＨＴＬＶ−１，０−ＨＴＬＶ−１ およびＴ−）ＩＴＬＶ−１を、ＨＴＬＶ−１とＨＴＬＶ−２（７）両方に陽性な 血清に対して試験し、Ｈ−）ＩＴＬＶ−２，０−ＨＴＬＶ−２、Ｔ−ＨＴＬＶ− ２と比較した。患者の血清は、ニューヨーク州ニーネル大学のりｉｌｌｉａｍ　 Ｈａｌｌ博士から入手した。得られた結果を第４表に示す。２ａ、２ｂ、２ｃ、 ２ｄ、２ｅおよび２ｆで示す血清は、５人の異なる患者から得たもので、ポリメ ラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の分析測定では１（ＴＬＶ−２に陽性であり、また、ヒ ト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）には陽性であった。血清１ａ、ｌｂ、ｌｃ、ｌｄ 、ｌｅおよび１ｆは、５人の異なる患者から得たもので、ＰＣＲ分析測定では） ＩＴＬＶ−１に陽性であった。血清患者１ａ、ｌｂおよび１ｃは成人Ｔ細胞白血 病であり、患者１ｄ、ｌｅおよび１ｆはＨＩＶに対し陽性である。血清ＮＬ−１ とＮＬ−２は、ＨＴＬＶ−１とＨＴＬＶ−２（７）どちらにも感染していない患 者から得た陰性の対照サンプル血清である。

第４表に記載の数字は、２試験の平均値であり、４０５ｎｍにおける吸光度の読 み値である。

試験結果は、前記ペプチドにより得られた特異性が高いレベルであることを示し ている。

前記の結果より明かなように、ここに記述した新しい合成ペプチドは、ＨＴＬＶ −１のｅｎｖおよびｇａｇ遺伝子により暗号化されるタンパク質部位に対応し、 ＨＴＬＶ−１に対する抗体の存在を検出する方法にとリュニークな試薬を確かに 提供するものである。また、ペプチドＨＴＬＶ−２はＨＴＬＶ−１を確認する抗 体とＨＴＬＶ−２を確認する抗体をはっきりと判別する。

２つのペプチドは１つのペプチドに比較し、より高度数の血清陽性度または感度 を徨供するので、場合によっては、分析試験に少なくとも２つのペプチドを使用 することが適当であるといえる。即ち、これは、偽陰性反応の頻度を減少させる ことを意味している。

５Ｐ７０　５Ｐ７４　５Ｐ６５ Ｃｏｐｅｌａｎｄ他　１９８６年 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）１、特許出願の表示 国際出願番号　ＰＣＴ／５Ｅ９０１００４０７２、発明の名称 ＨＴＬＶ−１感染の診断、治療及び 予防接種のためのペプチドとその誘導抗体３、特許出願人 住　所　スイス、シーエイチー６３００　ラージ、ヴアーレルストラーセ　４３ 氏　名（名称）　ヴイロヴアル　ソシエテ　アノニム国　籍　スイス ４、代理人 住　所　〒２３１　横浜市中区不老町１−２−１中央第６関内ビル１００１ １９９１年９月３０日 ６、添付書類の目録 された　・の １゜ ａ　）Ｖａ　１−　Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａ　１−５ｅ ｒ−Ｖａ　１−Ｐｒｏ−５ｅｒ−３ｅｒ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｔｈ　ｒ−Ｐｒｏ− Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａ　１ａ−０）１　ｒｂ ）Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ −Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ａｓｐ −Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−ＯＨ。

ｃ　）Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｈｉ　５−５ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ− Ｈｉｓ−Ｉ　１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ −Ｌｙ　５−５ｅｒ−Ｌｙ　５−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＯＨ。

ｄ　）Ａ　５ｎ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉ　１ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ −５ｅｒ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌ ｙ−５ｅｒ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａ　１ａ−ＯＨ。

ｅ　）Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｖａ　１−Ａｓｐ−Ｌｙｓ− Ａ　ｓｐ−Ｉ　１ｅ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−１１ ｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−ＯＨ、又はｆ　）Ｇｌ ｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−）１ｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａ　ｌ− Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉ　１ｅ−Ｌｙｓ −Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−０）１　。

のアミノ酸配列および前記配列の類似及び相同配列を有するペプチドグループよ り選択されたことを特徴とするペプチド。

２、キャリヤとの連結を促進するために選択された付加アミノ酸より成るアミノ 酸末端を有しており、またアミノ基、ヒドロキシ基、システィン残基、システィ ン基、アミノ基が付随したシスティン残基およびヒドロキシ基が付随したシステ ィン残基より成るグループより選択されたカルボキシ末端を有することを特徴と する請求項の第１項によるペプチド。

３、アミノ酸配列 ａ　）Ｖａ　１−　Ｌｅｕ−Ｔ　ｙｒ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａ　５ｎ−Ｖａ　ｌ− ５ｅｒ−Ｖａ　１−Ｐｒｏ−５ｅｒ−５ｅｒ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ −Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ。

ｂ　）Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａ　５ｎ−Ｇｌｙ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−３ｅｒ− Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ。

ｃ）Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−）１ｉｓ−３ｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−） １ｉｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−５ｅｔ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ− Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ。

ｄ　）Ａ　ｓ　ｎ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉ　ｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈ ｅ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−５ａｒ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇ ｌｙ−５ｅｒ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ　。

ｅ　）Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｖａ　１−Ａ　５ｐ−Ｌｙｓ −Ａｓｐ−１１ｅ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−１１ｅ −Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ。

ｆ　）Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｖ ａ　１−　Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ −Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−５ｅｒ−Ｌｅｕ　。

および前記配列の類似及び相同配列の範囲内に存在し、ＨＴＬＶ−１に対し特異 性な抗体により認識された少なくとも１個のエピトープを有する少なくとも１個 のペプチドとサンプルを、該サンプル中に）ＩＴＬＶ−１に対する抗体が存在す れば該抗体と前記ペプチドの間に免疫原性複合体が形成される条件下で接触させ ることと、前記サンプル中のＨＴＬＶ−１抗体の存在を決定するために前記免疫 原複合体がもしあれば検出することとより成る。生物試料中の）ＩＴＬＶ−１に 対する抗体の検出方法。

４、前記のペプチドがキャリヤとの連結を促進するために選択された付加アミノ 酸より成るアミノ酸末端を有し、またアミノ基、ヒドロキシ基、システィン残基 、システィン基、アミノ基が付随したシスティン残基およびヒドロキシ基が付随 したシスティン残基より成るグループより選択されたカルボキシ末端を有するこ とを特徴とする請求項の第３項による方法。

５６請求項目の第３項または第４項に記載の前記配列範囲内にあり、ＨＴＬ？　 １　に対し特異性な抗体により認識された少なくとも１個のエピトープをそれぞ れ有する少なくとも２個のペプチドをサンプルに、該サンプル中にＨＴＬＶ−１ に対する抗体が存在すれば該抗体と前記ペプチドの間に免疫原性複合体が形成さ れる条件下で接触させることと、前記サンプル中のＨＴＬＶ−１抗体の存在を決 定するために前記免疫原複合体がもしあれば測定することにより成る、生物試料 中のＨＴＬＶ−１に対する抗体の検出方法。

ａ）Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａ　５ｎ−Ｖａ　１−５ｅｒ −Ｖａ　１−　Ｐｒｏ−５ｅｒ−５ｅｒ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌ ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ。

ｂ　）Ｔｈｒ−Ｌｙ　５−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａ　ｓｎ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ −Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−３ｅｒ −Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−Ｌｅｕ。

ｃ　）Ｌｅ　ｕ−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ−）１１ｓ−５ｅｒ−Ａ　５ｎ−Ｌｅｕ−Ａ 　ｓｐ−Ｈｉ　ｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｕ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−１１ｅ−Ｐｒ ｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ。

ｄ　）Ａ　５ｎ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ− ３ｅｒ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａ　ｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ −５ｅｒ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ。

ｅ）Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈ１ｓ−Ｇｌｕ−Ｖａ　１−Ａ　ｓｐ−Ｌｙｓ− Ａ　ｓｐ−Ｉ　１ｅ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−１１ ｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ　、又はｆ　）Ｇ　ｌｎ −Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａ　１−　Ａ ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｐ ｒｏ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−３ｅｒ−Ｌｅｕ　。

のアミノ酸配列および前記配列の類似及び相同配列を有するペプチドグループよ り選択されたことを特徴とするペプチド。

７、キャリヤとの連結を促進するために選択された付加アミノ酸より成るアミノ 酸末端を有しており、アミノ基、ヒドロキシ基、システィン残基、システィン基 、アミノ基が付随したシスティン残基およびヒドロキシ基が付随したシスティン 残基より成るグループより選択されたカルボキシ末端を有することを特徴とする 請求項の第６項による組成。

８、請求項の第６項または第７項に記載の前記配列範囲内にあり、ＨＴＬＶ−１ に対し特異性な抗体により認識された少なくとも１個のエピトープをそれぞれ有 する少なくとも２個のペプチドと、該ペプチドに対し受容であるキャリヤとより 成る組成。

国際調査報告 Ｉ帥…岨−６１＋−１＾−＋ｄｍｋ　ＰＣＴ／ＳＥ　９０１００４０７１−一一 −Ｉｃｅ−１１＆ＰＣＴ／ＳＥ　９０１００４０７−針鴫噛１１＄１＾ｅｓｈ＋ ａ−＾−・　ＰＣＴ／５Ｅ９０／閣４０７国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＴＬＶ−１に対し特異性な抗体により認識された少なくとも１個のエピト ープを有し、該エピトープがアミノ酸配列：ａ）【配列があります】 ｂ）【配列があります】 ｃ）【配列があります】 ｄ）【配列があります】 ｅ）【配列があります】 ｆ）【配列があります】 ｇ）【配列があります】 ｈ）【配列があります】 または ｉ）【配列があります】 および前記配列の類似及び相同配列範囲内に存在するペプチド。
2. ２．キャリヤとの連結を促進するために選択された付加アミノ酸より成るアミノ 酸末端を有しており、またアミノ基、ヒドロキシ基、システイン残基、システイ ン基、アミノ基が付随したシステイン残基およびヒドロキシ基が付随したシステ イン残基より成るグループより選択されたカルボキシ末端を有することを特徴と する請求項の第１項によるペプチド。
3. ３． ａ）【配列があります】 ｂ）【配列があります】 ｃ）【配列があります】 ｄ）【配列があります】 ｅ）【配列があります】 ｆ）【配列があります】 ｇ）【配列があります】 ｈ）【配列があります】 または ｉ）【配列があります】 のアミノ酸配列および前記配列の類似及び相同配列を有するペプチドグループよ り選択されたことを特徴とする、請求項の第１項または第２項によるペプチド。
4. ４．キャリヤとの連結を促進するために選択された付加アミノ酸より成るアミノ 酸末端を有しており、アミノ基、ヒドロキシ基、システイン残基、システイン基 、アミノ基が付随したシステイン残基およびヒドロキシ基が付随したシステイン 残基より成るグループより選択されたカルボキシ末端を有することを特徴とする 請求項の第３項によるペプチド。
5. ５．アミノ酸配列 ａ）【配列があります】 ｂ）【配列があります】 ｃ）【配列があります】 ｄ）【配列があります】 ｅ）【配列があります】 ｆ）【配列があります】 ｇ）【配列があります】 ｈ）【配列があります】 または ｉ）【配列があります】 および前記配列の類似及び相同配列の範囲内に存在し、ＨＴＬＶ−１に対し特異 性な抗体により認識された少なくとも１個のエピトープを有する少なくとも１個 のペプチドとサンプルを、該サンプル中にＨＴＬＶ−１に対する抗体が存在すれ ば該抗体と前記ペプチドの間に免疫原性複合体が形成される条件下で接触させる ことと、前記サンプル中のＨＴＬＶ−１抗体の存在を決定するために前記免疫原 複合体がもしあれば検出することとより成る、生物試料中のＨＴＬＶ−１に対す る抗体の検出方法。
6. ６．前記のペプチドがキャリヤとの連結を促進するために選択された付加アミノ 酸より成るアミノ酸末端を有し、またアミノ基、ヒドロキシ基、システイン残基 、システイン基、アミノ基が付随したシステイン残基およびヒドロキシ基が付随 したシステイン残基より成るグループより選択されたカルボキシ末端を有するこ とを特徴とする請求項の第５項による方法。
7. ７．請求項目の第５項または第６項に記載の前記配列範囲内にあり、ＨＴＬＶ− １に対し特異性な抗体により認識された少なくとも１個のエピトープをそれぞれ 有する少なくとも２個のペプチドをサンプルに、該サンプル中にＨＴＬＶ−１に 対する抗体が存在すれば該抗体と前記ペプチドの間に免疫原性複合体が形成され る条件下で接触させることと、前記サンプル中のＨＴＬＶ−１抗体の存在を決定 するために前記免疫原複合体がもしあれば測定することにより成る、生物試料中 のＨＴＬＶ−１に対する抗体の検出方法。
8. ８．アミノ酸配列 ａ）【配列があります】 ｂ）【配列があります】 ｃ）【配列があります】 ｄ）【配列があります】 ｅ）【配列があります】 ｆ）【配列があります】 ｇ）【配列があります】 ｈ）【配列があります】 または ｉ）【配列があります】 および前記配列の類似及び相同配列の範囲内に存在し、ＨＴＬＶ−１に対し特異 性な抗体により認識された少なくとも１個のエピトープを有する少なくとも１個 のペプチドと、該ペプチドに対し生理的に受容であるキャリアとより成る組成。
9. ９．キャリヤとの連結を促進するために選択された付加アミノ酸より成るアミノ 酸末端を有しており、アミノ基、ヒドロキシ基、システイン残基、システイン基 、アミノ基が付随したシステイン残基およびヒドロキシ基が付随したシステイン 残基より成るグループより選択されたカルボキシ末端を有することを特徴とする 請求項の第８項による組成。
10. １０．請求項の第８項または第９項に記載の前記配列範囲内にあり、ＨＴＬＶ− １に対し特異性な抗体により認識された少なくとも１個のエピトープをそれぞれ 有する少なくとも２個のペプチドと、該ペプチドに対し受容であるキャリヤとよ り成る組成。