JPH0452119B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0452119B2 JPH0452119B2 JP58095099A JP9509983A JPH0452119B2 JP H0452119 B2 JPH0452119 B2 JP H0452119B2 JP 58095099 A JP58095099 A JP 58095099A JP 9509983 A JP9509983 A JP 9509983A JP H0452119 B2 JPH0452119 B2 JP H0452119B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cholesterol
- lcat
- esters
- sample
- lysolecithin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/805—Test papers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
技術分野
本発明はコレステロールエステル及び遊離コレ
ステロールを含む液体中の全コレステロールを分
析するのに有用な方法及び組成物に関する。 従来技術 コレステロールは、血清又は血漿のような生体
水性液体中に、一部遊離の形で一部コレステロー
ルエステルの形で存在している。全コレステロー
ル（即ち、遊離及びエステル化コレステロールか
らのコレステロール寄与和）の公知の定量分析
は、腐蝕性化学薬剤、例えばKOHを使用してコ
レステロールエステルを遊離コレステロールに加
水分解し、次いで溶液中で全遊離コレステロール
を分析する方法を含む。 最近、コレステロール及びコレステロールエス
テルを検知可能な生成物に転化するのに酵素が使
用されている。これらの方法では、通常、コレス
テロールエステルヒドラーゼ酵素とも呼ばれる、
コレステロールエステラーゼ酵素を使用して最初
にコレステロールエステルを遊離のコレステロー
ルに転化せしめている。この方法におけるコレス
テロールエステラーゼ酵素の使用は1975年３月４
日のグツドヒユー等の米国特許第3869349号及び
1976年９月28日のグツドヒユー等の米国特許第
3983005号に記載されている。これらの酵素はコ
レステロールエステルに対して水性媒質に於ける
コレステロールエステルのコレステロールへの加
水分解を促進する特別の活性を示す。「エステラ
ーゼ」及び「エステルヒドラーゼ」なる用語は、
酵素の存在下に水分子がコレステロールエステル
分子のエステル部分と反応する加水分解反応を触
媒する酵素を意味する。 コレステロールエステルのエステラーゼ促進加
水分解の間又は後、遊離コレステロールはコレス
テロン及び過酸化水素に転化し、そして過酸化水
素をパーオキシダーゼの存在下に色素前駆体とカ
ツプリングさせることにより検知する。 発明の目的 本発明第一の目的は、コレステロールエステル
を遊離コレステロールに転化せしめる別の方法を
利用して、コレステロールエステル及び遊離コレ
ステロール含有水性液体（又は流体）中の全コレ
ステロールを分析する別の方法を提供することに
ある。 本発明の第二の目的は、前記方法を実施するた
めの組成物を提供することにある。 発明の構成 本発明に従えば、前記第一の目的は、コレステ
ロールエステル及び遊離コレステロール含有水性
液体中の全コレステロールを分析するに当り、 (a) 前記液体の試料中の実質上すべてのコレステ
ロールエステルをコレステロールに転化せしめ
るのに十分な量のリゾレシチン及びレシチン：
コレステロールアシルトランスフエラーゼ
（LCAT）活性を示す酵素を含む組成物と前記
液体試料とを接触せしめ、 (b) コレステロールエステルへの転化以外の手段
により前記試料からコレステロールを除去し、
そして (c) 前記除去コレステロールの量を分析する工程
を含んで成ることを特徴とするコレステロール
エステル及び遊離コレステロール含有水性液体
中の全コレステロールの分析方法を提供するこ
とにより達成される。 本発明に従えば、前記第二の目的は、 (a) コレステロールエステル及び遊離コレステロ
ール含有水性液体の試料中の実質上すべてのコ
レステロールエステルをコレステロールに転化
せしめるのに十分な量のレシチン：コレステロ
ールアシルトランスフエラーゼ（LCAT）活性
を示す酵素及びリゾレシチンを含む試薬組成物
並びに (b) コレステロールエステルへの転化以外の手段
により前記試薬からコレステロールを除去する
手段 を含んで成るコレステロールエステル及び遊離コ
レステロール含有水性液体中の全コレステロール
分析用組成物を提供することによつて達成され
る。 発明の具体的説明 前記工程(b)に於けるコレステロールの除去は、
例えばコレステロールとコレステロールオキシダ
ーゼとの反応により過酸化水素を生成せしめるな
どの各種の方法によつて実施される。全コレステ
ロールの測定は、例えば前記過酸化水素をパーオ
キシダーゼ−色素カツプル試薬との相互反応によ
り着色色素に転化せしめることによつて実施され
る。 本発明の好ましい態様においては、リゾレシチ
ンはレシチン及びレシチンのリゾレシチンへの転
化を触媒することのできる酵素により補助又は置
換される。レシチンは、追加試薬成分又は人間の
血清のようなある種の液体サンプル中における自
然的存在のいずれによつても供給される。 前述の方法において、十分量のLCAT及びリゾ
レシチンと試料との接触は試料からのコレステロ
ールの除去を伴つておこなわれる。後者の工程が
不存在の場合、又はLCATもしくはリゾレシチン
の存在量が不充分の場合には、コレステロールエ
ステルの遊離コレステロールへの転化があまり進
行しない。従つて、全コレステロール定量分析工
程において、得られる結果は全コレステロールの
真のレベルより小さくなる。 全コレステロールの上に規定したLCATによる
定量方法は、溶液中において、又は実質上乾式
（即ち非液体含有）型の臨床分析素子内において、
実施する。 本発明に係る全コレステロールの定量方法は、
いくつかの好ましい特長を呈する。コレステロー
ルエステラーゼ又はコレステロールエステルヒド
ラーゼを包含する公知の酵素的アプローチに対す
る経済的に魅力ある代替法である。この方法は、
また、コレステロールエステルのコレステロール
への実質上完全な転化を供し、それによつて全コ
レステロールの正確且つ高制度の分析が可能とな
り、分析結果が迅速に得られ、そして溶液分析及
び指触乾燥状態の臨床分析素子への適合性が良好
になる。 本発明の実施に際しては、コレステロールエス
テル及びリゾレシチン源の存在下に、レシチン：
コレステロールアシルトランスフエラーゼ
（LCAT）活性を呈する酵素を使用する。LCAT
酵素はよく知られたコレステロールエステラーゼ
又はコレステロールエステルヒドラーゼ酵素とは
いくつかの点で異なる。コレステロールエステラ
ーゼ又はコレステロールエステルヒドラーゼは、
水が前記反応の間に放出されるアシル基のアクセ
プター分子として作用する水性媒質中において、
コレステロールエステルを加水分解するのに機械
学的に作用する。一方、LCATはコレステロール
エステルを加水分解しない。LCATは、本発明に
おいて使用するように、アシル基のアクセプター
として水よりむしろリゾレシチンの存在を必要と
する。LCATを含有するコレステロールエステル
水溶液中にリゾレシチンが存在しない場合には、
水の存在にも拘わらず、コレステロールへの転化
は起らない。 LCAT酵素源は人の血清又は血漿などである。
血清LCATは、グロムセツトJ.A.のJ.Lipid Res，
９巻、155−167頁（1968）；ガストウE.等の
Scand.J.Clin.Lab.Invest.，38巻、Suppl.150，１
−５頁（1978）；k.キタバタケ等のBioch.et
Biophy，Acta，573巻145−154頁（1979）及び
フイールデイングC.J.，Scand.J.Clin.Lad.
Invest.，33巻，Suppl，137，15−17頁（1974）
に開示のように、単離され、精製され、性化され
る。 好ましいLCATは微生物の培養上層液から得ら
れるものであり、特に、ビブリオナセエ科、並び
にマツクインテイレ，S.，トラスト，T.J.，バツ
クレイ，J.T.のJ.Bacteriol.，139巻，132−136頁
（1979）に開示されているようなスタフイロコツ
カス・アウレウス又はK.バートレツト，M.J.キ
ート及びE.A.マーサー，Photochemistry，13巻，
1107−1113頁（1974）に開示されているようなフ
イコマイセス・ブラケスリーアヌスからの微生物
が好ましい微生物源である。最も好ましいLCAT
はA.T.C.C.（米国メリーランド州ロツクヴイル）
から供給されるアエロモナス・ハイドロフイラ
ATCC9071の培養上層液から得られるものであ
る。 微生物からの血清LCATに関する、及び
GCATに関する上記文献は、コレステロールの
コレステロールエステルへの転化についてのみ適
用可能であるというこれらの酵素の機構を引用し
ている。これらの引用文献には、これらの酵素が
逆様式、即ちコレステロールエステルのコレステ
ロールへの転化に使用して全コレステロールの定
量分析を容易にすることができることは報告され
ていないし、示唆もされていない。 血清中のLCATの量は英国特許第1501561号に
従つて測定される。この反応組成物は、コレステ
ロール及び血清試料からのLCATと共に、界面活
性剤及びレシチンを含む。しかしながら、試料中
のコレステロールエステルは、存在していたとし
ても、遊離のコレステロールにはあまり転化され
ず、そしてそれらの全量は未知のままである。こ
の特許はLCAT及びリゾレシチンを全コレステロ
ールを定量するのに十分な量で使用することを教
えてもいなければ、示唆もしていない。 リゾレシチンと共に試料中の実質上すべてのコ
レステロールエステルをコレステロールに転化せ
しめるのに十分なLCATの量は幾つかの因子に依
存する。そのような量は、試薬−試料混合物（以
下反応混合物と言う）、即ち溶液分析における試
料＋試薬溶液の全容積又は乾式分析素子で実施さ
れる分析における試薬ゾーンに到達されると推定
される試料溶液中のLCATの濃度により好都合に
規定される。従つて、この基準に基づけば、
LCATの濃度は例えば約30〜55国際単位
（IU）／の範囲で変動し、約20単位／の場合
に血清試料に於て好ましい結果が得られる。乾式
分析素子に塗布する場合にはLCAT酵素は被覆中
の起り得る活性の低下を補うために可なり過剰の
量で使用するのが好ましい。好ましい被覆量は
250〜750単位／m2である。（用いるLCAT濃度は
約２×10-5単位／の正常の血清LCAT濃度でシ
ヤープなコントラストを示し、従つて英国特許第
1501561号の反応混合物の濃度より遥かに高い濃
度である。） 本発明のコレステロールエステルのコレステロ
ールへの転化反応工程においてはアシル受容体と
してリゾレシチンの存在が必須である。リゾレシ
チンはシグマケミカルカンパニー（米国ミズリー
州セントルイス）から市販の商品Ｌ−α−リソホ
スフアチジルコリンのような市販品を使用するこ
とができる。或いは、リゾレシチンはホスホリパ
ーゼＡ−２のような加水分解酵素の存在下にレシ
チンを酵素的に脱アシル化することによつても得
ることができる。かかる点からすれば、リゾレシ
チンは高価な物質であるので、本発明に従つて使
用されるエステル試薬組成物はレシチンをレシチ
ンのリゾレシチンへの加水分解を触媒する酵素と
組み合わせて包含することができる。この組合せ
は分析条件下において其の場でリゾレシチンを生
成せしめる。更に、レシチンはコレステロールエ
ステルとリゾレシチンとのコレステロール生成反
応の副生物として生成するものであるから、生成
レシチンはレシチン−加水分解酵素の存在下にリ
ゾレシチンに加水分解して戻すことができる。
（下記反応式参照）。従つて、レシチン−加水分
解酵素の使用による実用的特長は、レシチンの当
初の必要量を減少させることであり、反応式の
過程の十分な量のレシチンが形成される。 所望ならば、少量のリゾレシチンをLCAT−促
進反応の開始を補助するためにレシチン及び加水
分解酵素と一緒に使用することもできる。 反応混合物中の好ましいリゾレシチン濃度は、
0.1〜1.0ミリモル濃度である。リゾレシチンの別
の源を使用した場合には、上記濃度を供すること
のできるようにする。 好ましいレシチン−加水分解酵素はアエロモナ
ス・ハイドロフイラの培養上層液から回収される
ようなホスホリパーゼＡ−２である。レシチン−
加水分解酵素のその他の例はレシチナーゼ及びホ
スフアタイド２−アシルヒドラーゼである。同一
の上層液からLCATも回収されることができるの
で、アエロモナス・ハイドロフイラから回収した
酵素製剤が最も好ましい。この酵素はLCATの量
の１〜10倍量で存在するのが好ましい。 人の血清試料を分析する場合には、当該試料中
に自然に存在するレシチンで、アエロモナス・ハ
イドロフイラの培養上層液から回収されるホスホ
リパーゼＡ−２のようなレシチン−加水分解酵素
の存在下にリゾレシチンの其の場での生成を開始
するのに十分である。従つて、本発明の方法は、 (a) コレステロール、コレステロールエステル及
びレシチンを含む人の血清のような水性の試料
と、試料中の実質上すべてのコレステロールエ
ステルをコレステロールに転化せしめるのに十
分な量のLCAT酵素及びレシチン加水分解酵素
とを接触せしめ、 (b) コレステロールエステルへの転化以外の手段
により前記試料からコレステロールを除去し、
そして (c) 前記除去コレステロールの量を分析すること
によつても実施される。 LCAT及びレシチン−加水分解酵素がともに微
生物アエロモナス・ハイドロフイラに由来するも
のであるのが好ましく、このようにして回収され
た酵素製剤は両方の酵素活性を有する。 コレステロールエステルのコレステロールへの
コレステロールエステルのコレステロールへの
LCAT賦活化転化の場合には、全コレステロール
分析中の試料からコレステロールを除去する工程
が使用される。前述の如く、コレステロールエス
テルの化学量論的（即ち実質上完全な）転化はコ
レステロール除去工程の不存在下には行なえな
い。この目的のために、コレステロールを除去す
る任意の手段が、コレステロールがレシチンと相
互反応してコレステロールエステルを生成して
（前記反応式の逆反応）コレステロールを利用
不可能にしない限り、適当である。従つて、例え
ばコレステロールを適当な物質との錯体化によつ
て物理的に除去することができる。代表的な錯化
剤は、例えば英国ハンプシヤー州ハバント、ホー
ムウエル（P09 1EF）のインダストリアル オ
ポチユニテイー社刊行の「リサーチデイスクロー
ジヤー」137巻、項目13739に記載されているよう
なジギトニンである。錯化後、錯体は例えば濾過
によつて試料から除去することができ、そしてコ
レステロールは、脱錯化して、コレステロールの
化学的除去に関連して前述したようにして定量す
るか、或いは重量分析的に定量する。 或いは、そして好ましくは、コレステロールは
それをコレステロールエステル以外の生成物に化
学的に変化させることによつて除去する。化学的
除去の好ましい態様においては、コレステロール
は、コレステロールと反応して前記生成物に生成
せしめるのに必要な第二の酵素及び試薬（例えば
緩衝剤、活性化剤等）からなる第二の試薬組成物
でもつて酵素的に転化させることによつて前記し
たような生成物が変化せしめる。 コレステロールの除去は、水性液体と液体及び
リゾレシチンとの接触と同時に又は該接触に引き
続き開始される。 コレステロール除去工程において使用される好
ましい第二の酵素はコレステロールオキシダーゼ
である。この酵素は以下の反応式に従つて酸素の
存在下にコレステロールエステルの分解を触媒す
る。 反応式 コレステロールエステル＋酵素→コレステノン ＋過酸化水素 コレステロール オキシダーゼ 上記反応の結果として生成する反応生成物の一
つである過酸化水素は第二の酵素の存在下に第二
の反応試薬を各種の周知技術によつて検知可能な
生成物に転化せしめるのに使用される。。前記し
た各種の周知技術としては、例えばC.T.グツド
ヒユー等の1976年９月28日発行の米国特許第
3983005号に開示のカラー形成性物質をカラー指
示系で着色物に転化せしめるものがある。 本発明の好ましい態様に従えば、コレステロー
ル分析はコレステロールの酵素的酸化によつて生
成する過酸化水素の量を定量する指示組成物を使
用して達成される。酵素的に発生した過酸化水素
を検知する有用な指示組成物は当業界において、
特にグルコース及び尿酸の酵素的検知における指
示組成物として周知である。米国特許第3092465
号及び同第2981606号は本発明の成功裡の実施に
有用な指示組成物を開示している。過酸化水素指
示組成物は、一般には、過酸化活性を有する物
質、好ましくはパーオキシダーゼ、並びに過酸化
水素及び酵素の存在化に色形成又は色変化をする
指示物質を含む。 パーオキシダーゼは過酸化水素が他の物質を酸
化するのを触媒する酵素である。パーオキシダー
ゼは、一般に、鉄ポルフイリンを含む複合蛋白質
である。パーオキシダーゼはわさび、ポテト、い
ちじくの木の樹液及びかぶら（植物パーオキシダ
ーゼ）、ミルク（ラクトパーオキシダーゼ）、並び
に白血球（ベルドパーオキシダーゼ）に存在す
る。或種の合成パーオキシダーゼ、例えばセオレ
ル及びマエリーのActa Chem.Scand.，４巻、
422−434頁（1950）に開示の合成パーオキシダー
ゼも有用である。更に、ヘミン、メトヘモグロビ
ン、オキシヘモグロビン、ヘモグロビン、ヘモク
ロモゲン、アルカリンヘマチン、ヘミン誘導体及
び過酸化作用は又はパーオキシダーゼのような活
性を示す、即ち過酸化水素もしくは他の過酸化物
による別の物質の酸化を触媒する能力を有するそ
の他の化合物も有用である。 酵素ではないが、パーオキシダーゼのような活
性を示すその他の物質は、シリカゲルなどに吸収
させたクロム塩（例えば硫酸クロムカリウム）、
鉄スルホシアネート、鉄タンネート、フエロシア
ン化第一鉄などである。 或いは、指示組成物は、過酸化水素及びパーオ
キシダーゼの存在下に酸化によつて実質的に色変
化は起さないが、酸化された形でカラー形成性も
しくは色変化性物質と反応して化学反応の可視定
量測定種を生じる、一種もしくはそれ以上の物質
を含む。そのようなカラー指示組成物は特に米国
特許第2981606号に詳細に記載されている。後者
のカラー形成性組成物、即ち中間生成物によつて
又はカラーカツプリング反応によつてカラーを生
成するものが本発明の実施に好ましい。 本発明のカラー指示組成物は、好ましくは、 (a) その酸化形態で自己カツプリングする４−メ
トキシ−１−ナフトール、又は (b) １，７−ジヒドロキシナフタレン及び４−ア
ミノアンチピリン（HCI）の組合せ を含む。 本発明は、溶液、即ち試薬成分が試薬水溶液と
して共される「湿式−化学」モードの分析に容易
に適合する。所定割合の試薬溶液を分析すべき血
清の如き水性液体試料と接触せしめる。しかしな
がら、好ましい態様では、試薬成分は乾式素子中
に組み入れる。このような素子は、分析すべき水
性液体と接触するまでは、実質上液体を含まな
い。適当な素子は、一般的な吸収性のデイツプ−
アンド−リード型の素子を含むが、拡散層、一も
しくはそれ以上の試薬層及び任意的な支持体を含
んで成る分析素子が最も好ましい。そのような分
析素子は、例えばプルツイビロウイツ等の米国特
許第3992158号及びグツドヒユー等の同第3983005
号に記載されている。 後記の例においては、以下の物質を使用した。 レシチン：コレステロールアシルトランスフエ
ラーゼ（LCAT）はA.T.C.C.（米国メリーランド
州ロツクヴイル）から入手したアエロモナス・ハ
イドロフイラATCC9071から得た。この酵素はマ
ツクインテイレ，S.，バツクレイ，J.T.，J.
Bacteriol.，135巻、402−407頁（1978）に記載
の方法に従つて精製し、部分的に特性化した（分
子量500000）。 アエロモナス・ハイドロフイラの培養は、１％
グルコース、１％イーストエキス、0.1％
K2HPO4，1.5％アガール（寒天）及び１％
（ｖ／ｖ）塩溶液からなる栄養斜面培地で実施し
た。前記塩溶液は、0.1Nの塩酸中に0.1モル
MgSO4，0.01モルFeSO4，0.01モルNaCl，0.01
モルMnSO4，0.4ミリモルNa2MoO4，0.1ミリモ
ルZnSO4，及び0.6ミリモルCaCl2を溶解させて
使用した。バクテリア培養培地成分は米国ミシガ
ン州デトロイトのデイフコカンパニーより購入
し、アガール（Agar）は英国ロンドンのオツク
スフオードリミデツドより購入した。 コレステロールオキシダーゼ（COD）はスト
レプトマイセス・ビオラセンス及びノカルデイ
ア・コレステロリカムから得た。 パーオキシダーゼはホースラデイシユ（わさ
び）タイプ、152プルプロガリン単位／mg固体
を使用した。その他の成分はウシ血清アルブミ
ン、Ｌ−α−リソホスフアチジルコリン（タイプ
卵黄からのリゾレシチン）及びＮ−２−ヒドロ
キシエチルピペリジン−N′−２−エタンスルホ
ン酸（HEPES）緩衝剤を含む。これらの成分は
シグマケミカルカンパニー（米国ミズリー州セン
トルイス）から得た。 その他のすべての薬剤は米国ニユヨーク州ロチ
エスターのイーストマンコダツクカンパニーから
供給されているものである。 全コレステロール測定用標準曲線の作製 (A) コレステロールエステルの遊離のコレステロ
ールへの転化が完結するのに要する時間は以下の
ようにして求めた。 コレステロールリノレートストツク溶液（6.93
ミリモル濃度）を15％トライトンＸ−100からな
る水溶液に調製して酵素レシチン：コレステロー
ルアシルトランスフエラーゼ（LCAT）の基質と
して作用せしめた。この溶液から各種濃度の基質
（0.35，0.07，1.1及び1.4ミリモル濃度）を調製し
た。各溶液のサンプルを試薬組成物を含む独立の
キユベツトに加え、得られた反応混合物（試薬＋
サンプル）は1.5重量％トライトンＸ−100、
0.462ミリモルリゾレシチン、２×10-2単位
LCAT（この酵素の添加前にキユベツトは37℃で
10分間プレコンデイシヨニングした）及び全量
1.0mlにする0.83mlの緩衝剤試薬を含んでいた。
前記緩衝剤試薬は、PH7.0で50ミリモルHEPESの
緩衝液50ml中に調製した、パーオキシダーゼ1.4
mg、ｏ−ジアニシジン（指示薬）４mg、コレステ
ロールオキシダーゼ12単位及びCaCl2 14mgを含
むものであつた。LCATを除く上記すべての成分
を含むブランクは前記基質と同様に処理した。
430nmでの吸光度の変化を分光光度計において約
40分間監視した。反応は約30分間で実質上完結し
た。このことは吸光度の上昇が認められないこと
により確認された。 (B) 全コレステロールの測定用標準曲線は以下の
ようにして作製した。 各サンプルの（30分後の）全吸光度変化を測定
してコレステリルリノレートの濃度の関数として
プロツトした。これらの濃度はコレステロール濃
度と化学量論的に関連しているので、30分後の吸
光度変化を濃度既知のコレステロールエステルに
対してブロツトして得られた曲線は全コレステロ
ール測定用標準曲線として機能した。 実施例 例 １〜14 本発明方法と対照方法との比較（溶液分析） 上記コレステリルリノレートの終点分析を血清
サンプル中の全コレステロール分析に適用した。
対照分析としてはウオーシントン・エンザイマテ
ツク・コレステロール・キツト（国ニユジヤージ
ー州フリーホールドのWorthington
Biochemical Corp.）を使用した。この分析はコ
レステロールオキシダーゼ反応をパーオキシダー
ゼ反応と結合させるものである。上記(A)において
述べた試薬組成物に記載した成分を含む14本のキ
ユベツトを37℃で10分間プレコンデイシヨニング
した。次に、血清サンプルを添加して各キユベツ
トの最終容積を1.0mlとした。430nmでの30分後
の吸光度の変化を、上記(B)の標準曲線の値と比較
して各サンプル中の全コレステロール濃度
（mmol）を求めた。結果（単位をmmolからmgに
変換した）を第１表に示す。第１表の結果は本発
明方法と対照方法との間の優れた相関関係を示し
ている。
ステロールを含む液体中の全コレステロールを分
析するのに有用な方法及び組成物に関する。 従来技術 コレステロールは、血清又は血漿のような生体
水性液体中に、一部遊離の形で一部コレステロー
ルエステルの形で存在している。全コレステロー
ル（即ち、遊離及びエステル化コレステロールか
らのコレステロール寄与和）の公知の定量分析
は、腐蝕性化学薬剤、例えばKOHを使用してコ
レステロールエステルを遊離コレステロールに加
水分解し、次いで溶液中で全遊離コレステロール
を分析する方法を含む。 最近、コレステロール及びコレステロールエス
テルを検知可能な生成物に転化するのに酵素が使
用されている。これらの方法では、通常、コレス
テロールエステルヒドラーゼ酵素とも呼ばれる、
コレステロールエステラーゼ酵素を使用して最初
にコレステロールエステルを遊離のコレステロー
ルに転化せしめている。この方法におけるコレス
テロールエステラーゼ酵素の使用は1975年３月４
日のグツドヒユー等の米国特許第3869349号及び
1976年９月28日のグツドヒユー等の米国特許第
3983005号に記載されている。これらの酵素はコ
レステロールエステルに対して水性媒質に於ける
コレステロールエステルのコレステロールへの加
水分解を促進する特別の活性を示す。「エステラ
ーゼ」及び「エステルヒドラーゼ」なる用語は、
酵素の存在下に水分子がコレステロールエステル
分子のエステル部分と反応する加水分解反応を触
媒する酵素を意味する。 コレステロールエステルのエステラーゼ促進加
水分解の間又は後、遊離コレステロールはコレス
テロン及び過酸化水素に転化し、そして過酸化水
素をパーオキシダーゼの存在下に色素前駆体とカ
ツプリングさせることにより検知する。 発明の目的 本発明第一の目的は、コレステロールエステル
を遊離コレステロールに転化せしめる別の方法を
利用して、コレステロールエステル及び遊離コレ
ステロール含有水性液体（又は流体）中の全コレ
ステロールを分析する別の方法を提供することに
ある。 本発明の第二の目的は、前記方法を実施するた
めの組成物を提供することにある。 発明の構成 本発明に従えば、前記第一の目的は、コレステ
ロールエステル及び遊離コレステロール含有水性
液体中の全コレステロールを分析するに当り、 (a) 前記液体の試料中の実質上すべてのコレステ
ロールエステルをコレステロールに転化せしめ
るのに十分な量のリゾレシチン及びレシチン：
コレステロールアシルトランスフエラーゼ
（LCAT）活性を示す酵素を含む組成物と前記
液体試料とを接触せしめ、 (b) コレステロールエステルへの転化以外の手段
により前記試料からコレステロールを除去し、
そして (c) 前記除去コレステロールの量を分析する工程
を含んで成ることを特徴とするコレステロール
エステル及び遊離コレステロール含有水性液体
中の全コレステロールの分析方法を提供するこ
とにより達成される。 本発明に従えば、前記第二の目的は、 (a) コレステロールエステル及び遊離コレステロ
ール含有水性液体の試料中の実質上すべてのコ
レステロールエステルをコレステロールに転化
せしめるのに十分な量のレシチン：コレステロ
ールアシルトランスフエラーゼ（LCAT）活性
を示す酵素及びリゾレシチンを含む試薬組成物
並びに (b) コレステロールエステルへの転化以外の手段
により前記試薬からコレステロールを除去する
手段 を含んで成るコレステロールエステル及び遊離コ
レステロール含有水性液体中の全コレステロール
分析用組成物を提供することによつて達成され
る。 発明の具体的説明 前記工程(b)に於けるコレステロールの除去は、
例えばコレステロールとコレステロールオキシダ
ーゼとの反応により過酸化水素を生成せしめるな
どの各種の方法によつて実施される。全コレステ
ロールの測定は、例えば前記過酸化水素をパーオ
キシダーゼ−色素カツプル試薬との相互反応によ
り着色色素に転化せしめることによつて実施され
る。 本発明の好ましい態様においては、リゾレシチ
ンはレシチン及びレシチンのリゾレシチンへの転
化を触媒することのできる酵素により補助又は置
換される。レシチンは、追加試薬成分又は人間の
血清のようなある種の液体サンプル中における自
然的存在のいずれによつても供給される。 前述の方法において、十分量のLCAT及びリゾ
レシチンと試料との接触は試料からのコレステロ
ールの除去を伴つておこなわれる。後者の工程が
不存在の場合、又はLCATもしくはリゾレシチン
の存在量が不充分の場合には、コレステロールエ
ステルの遊離コレステロールへの転化があまり進
行しない。従つて、全コレステロール定量分析工
程において、得られる結果は全コレステロールの
真のレベルより小さくなる。 全コレステロールの上に規定したLCATによる
定量方法は、溶液中において、又は実質上乾式
（即ち非液体含有）型の臨床分析素子内において、
実施する。 本発明に係る全コレステロールの定量方法は、
いくつかの好ましい特長を呈する。コレステロー
ルエステラーゼ又はコレステロールエステルヒド
ラーゼを包含する公知の酵素的アプローチに対す
る経済的に魅力ある代替法である。この方法は、
また、コレステロールエステルのコレステロール
への実質上完全な転化を供し、それによつて全コ
レステロールの正確且つ高制度の分析が可能とな
り、分析結果が迅速に得られ、そして溶液分析及
び指触乾燥状態の臨床分析素子への適合性が良好
になる。 本発明の実施に際しては、コレステロールエス
テル及びリゾレシチン源の存在下に、レシチン：
コレステロールアシルトランスフエラーゼ
（LCAT）活性を呈する酵素を使用する。LCAT
酵素はよく知られたコレステロールエステラーゼ
又はコレステロールエステルヒドラーゼ酵素とは
いくつかの点で異なる。コレステロールエステラ
ーゼ又はコレステロールエステルヒドラーゼは、
水が前記反応の間に放出されるアシル基のアクセ
プター分子として作用する水性媒質中において、
コレステロールエステルを加水分解するのに機械
学的に作用する。一方、LCATはコレステロール
エステルを加水分解しない。LCATは、本発明に
おいて使用するように、アシル基のアクセプター
として水よりむしろリゾレシチンの存在を必要と
する。LCATを含有するコレステロールエステル
水溶液中にリゾレシチンが存在しない場合には、
水の存在にも拘わらず、コレステロールへの転化
は起らない。 LCAT酵素源は人の血清又は血漿などである。
血清LCATは、グロムセツトJ.A.のJ.Lipid Res，
９巻、155−167頁（1968）；ガストウE.等の
Scand.J.Clin.Lab.Invest.，38巻、Suppl.150，１
−５頁（1978）；k.キタバタケ等のBioch.et
Biophy，Acta，573巻145−154頁（1979）及び
フイールデイングC.J.，Scand.J.Clin.Lad.
Invest.，33巻，Suppl，137，15−17頁（1974）
に開示のように、単離され、精製され、性化され
る。 好ましいLCATは微生物の培養上層液から得ら
れるものであり、特に、ビブリオナセエ科、並び
にマツクインテイレ，S.，トラスト，T.J.，バツ
クレイ，J.T.のJ.Bacteriol.，139巻，132−136頁
（1979）に開示されているようなスタフイロコツ
カス・アウレウス又はK.バートレツト，M.J.キ
ート及びE.A.マーサー，Photochemistry，13巻，
1107−1113頁（1974）に開示されているようなフ
イコマイセス・ブラケスリーアヌスからの微生物
が好ましい微生物源である。最も好ましいLCAT
はA.T.C.C.（米国メリーランド州ロツクヴイル）
から供給されるアエロモナス・ハイドロフイラ
ATCC9071の培養上層液から得られるものであ
る。 微生物からの血清LCATに関する、及び
GCATに関する上記文献は、コレステロールの
コレステロールエステルへの転化についてのみ適
用可能であるというこれらの酵素の機構を引用し
ている。これらの引用文献には、これらの酵素が
逆様式、即ちコレステロールエステルのコレステ
ロールへの転化に使用して全コレステロールの定
量分析を容易にすることができることは報告され
ていないし、示唆もされていない。 血清中のLCATの量は英国特許第1501561号に
従つて測定される。この反応組成物は、コレステ
ロール及び血清試料からのLCATと共に、界面活
性剤及びレシチンを含む。しかしながら、試料中
のコレステロールエステルは、存在していたとし
ても、遊離のコレステロールにはあまり転化され
ず、そしてそれらの全量は未知のままである。こ
の特許はLCAT及びリゾレシチンを全コレステロ
ールを定量するのに十分な量で使用することを教
えてもいなければ、示唆もしていない。 リゾレシチンと共に試料中の実質上すべてのコ
レステロールエステルをコレステロールに転化せ
しめるのに十分なLCATの量は幾つかの因子に依
存する。そのような量は、試薬−試料混合物（以
下反応混合物と言う）、即ち溶液分析における試
料＋試薬溶液の全容積又は乾式分析素子で実施さ
れる分析における試薬ゾーンに到達されると推定
される試料溶液中のLCATの濃度により好都合に
規定される。従つて、この基準に基づけば、
LCATの濃度は例えば約30〜55国際単位
（IU）／の範囲で変動し、約20単位／の場合
に血清試料に於て好ましい結果が得られる。乾式
分析素子に塗布する場合にはLCAT酵素は被覆中
の起り得る活性の低下を補うために可なり過剰の
量で使用するのが好ましい。好ましい被覆量は
250〜750単位／m2である。（用いるLCAT濃度は
約２×10-5単位／の正常の血清LCAT濃度でシ
ヤープなコントラストを示し、従つて英国特許第
1501561号の反応混合物の濃度より遥かに高い濃
度である。） 本発明のコレステロールエステルのコレステロ
ールへの転化反応工程においてはアシル受容体と
してリゾレシチンの存在が必須である。リゾレシ
チンはシグマケミカルカンパニー（米国ミズリー
州セントルイス）から市販の商品Ｌ−α−リソホ
スフアチジルコリンのような市販品を使用するこ
とができる。或いは、リゾレシチンはホスホリパ
ーゼＡ−２のような加水分解酵素の存在下にレシ
チンを酵素的に脱アシル化することによつても得
ることができる。かかる点からすれば、リゾレシ
チンは高価な物質であるので、本発明に従つて使
用されるエステル試薬組成物はレシチンをレシチ
ンのリゾレシチンへの加水分解を触媒する酵素と
組み合わせて包含することができる。この組合せ
は分析条件下において其の場でリゾレシチンを生
成せしめる。更に、レシチンはコレステロールエ
ステルとリゾレシチンとのコレステロール生成反
応の副生物として生成するものであるから、生成
レシチンはレシチン−加水分解酵素の存在下にリ
ゾレシチンに加水分解して戻すことができる。
（下記反応式参照）。従つて、レシチン−加水分
解酵素の使用による実用的特長は、レシチンの当
初の必要量を減少させることであり、反応式の
過程の十分な量のレシチンが形成される。 所望ならば、少量のリゾレシチンをLCAT−促
進反応の開始を補助するためにレシチン及び加水
分解酵素と一緒に使用することもできる。 反応混合物中の好ましいリゾレシチン濃度は、
0.1〜1.0ミリモル濃度である。リゾレシチンの別
の源を使用した場合には、上記濃度を供すること
のできるようにする。 好ましいレシチン−加水分解酵素はアエロモナ
ス・ハイドロフイラの培養上層液から回収される
ようなホスホリパーゼＡ−２である。レシチン−
加水分解酵素のその他の例はレシチナーゼ及びホ
スフアタイド２−アシルヒドラーゼである。同一
の上層液からLCATも回収されることができるの
で、アエロモナス・ハイドロフイラから回収した
酵素製剤が最も好ましい。この酵素はLCATの量
の１〜10倍量で存在するのが好ましい。 人の血清試料を分析する場合には、当該試料中
に自然に存在するレシチンで、アエロモナス・ハ
イドロフイラの培養上層液から回収されるホスホ
リパーゼＡ−２のようなレシチン−加水分解酵素
の存在下にリゾレシチンの其の場での生成を開始
するのに十分である。従つて、本発明の方法は、 (a) コレステロール、コレステロールエステル及
びレシチンを含む人の血清のような水性の試料
と、試料中の実質上すべてのコレステロールエ
ステルをコレステロールに転化せしめるのに十
分な量のLCAT酵素及びレシチン加水分解酵素
とを接触せしめ、 (b) コレステロールエステルへの転化以外の手段
により前記試料からコレステロールを除去し、
そして (c) 前記除去コレステロールの量を分析すること
によつても実施される。 LCAT及びレシチン−加水分解酵素がともに微
生物アエロモナス・ハイドロフイラに由来するも
のであるのが好ましく、このようにして回収され
た酵素製剤は両方の酵素活性を有する。 コレステロールエステルのコレステロールへの
コレステロールエステルのコレステロールへの
LCAT賦活化転化の場合には、全コレステロール
分析中の試料からコレステロールを除去する工程
が使用される。前述の如く、コレステロールエス
テルの化学量論的（即ち実質上完全な）転化はコ
レステロール除去工程の不存在下には行なえな
い。この目的のために、コレステロールを除去す
る任意の手段が、コレステロールがレシチンと相
互反応してコレステロールエステルを生成して
（前記反応式の逆反応）コレステロールを利用
不可能にしない限り、適当である。従つて、例え
ばコレステロールを適当な物質との錯体化によつ
て物理的に除去することができる。代表的な錯化
剤は、例えば英国ハンプシヤー州ハバント、ホー
ムウエル（P09 1EF）のインダストリアル オ
ポチユニテイー社刊行の「リサーチデイスクロー
ジヤー」137巻、項目13739に記載されているよう
なジギトニンである。錯化後、錯体は例えば濾過
によつて試料から除去することができ、そしてコ
レステロールは、脱錯化して、コレステロールの
化学的除去に関連して前述したようにして定量す
るか、或いは重量分析的に定量する。 或いは、そして好ましくは、コレステロールは
それをコレステロールエステル以外の生成物に化
学的に変化させることによつて除去する。化学的
除去の好ましい態様においては、コレステロール
は、コレステロールと反応して前記生成物に生成
せしめるのに必要な第二の酵素及び試薬（例えば
緩衝剤、活性化剤等）からなる第二の試薬組成物
でもつて酵素的に転化させることによつて前記し
たような生成物が変化せしめる。 コレステロールの除去は、水性液体と液体及び
リゾレシチンとの接触と同時に又は該接触に引き
続き開始される。 コレステロール除去工程において使用される好
ましい第二の酵素はコレステロールオキシダーゼ
である。この酵素は以下の反応式に従つて酸素の
存在下にコレステロールエステルの分解を触媒す
る。 反応式 コレステロールエステル＋酵素→コレステノン ＋過酸化水素 コレステロール オキシダーゼ 上記反応の結果として生成する反応生成物の一
つである過酸化水素は第二の酵素の存在下に第二
の反応試薬を各種の周知技術によつて検知可能な
生成物に転化せしめるのに使用される。。前記し
た各種の周知技術としては、例えばC.T.グツド
ヒユー等の1976年９月28日発行の米国特許第
3983005号に開示のカラー形成性物質をカラー指
示系で着色物に転化せしめるものがある。 本発明の好ましい態様に従えば、コレステロー
ル分析はコレステロールの酵素的酸化によつて生
成する過酸化水素の量を定量する指示組成物を使
用して達成される。酵素的に発生した過酸化水素
を検知する有用な指示組成物は当業界において、
特にグルコース及び尿酸の酵素的検知における指
示組成物として周知である。米国特許第3092465
号及び同第2981606号は本発明の成功裡の実施に
有用な指示組成物を開示している。過酸化水素指
示組成物は、一般には、過酸化活性を有する物
質、好ましくはパーオキシダーゼ、並びに過酸化
水素及び酵素の存在化に色形成又は色変化をする
指示物質を含む。 パーオキシダーゼは過酸化水素が他の物質を酸
化するのを触媒する酵素である。パーオキシダー
ゼは、一般に、鉄ポルフイリンを含む複合蛋白質
である。パーオキシダーゼはわさび、ポテト、い
ちじくの木の樹液及びかぶら（植物パーオキシダ
ーゼ）、ミルク（ラクトパーオキシダーゼ）、並び
に白血球（ベルドパーオキシダーゼ）に存在す
る。或種の合成パーオキシダーゼ、例えばセオレ
ル及びマエリーのActa Chem.Scand.，４巻、
422−434頁（1950）に開示の合成パーオキシダー
ゼも有用である。更に、ヘミン、メトヘモグロビ
ン、オキシヘモグロビン、ヘモグロビン、ヘモク
ロモゲン、アルカリンヘマチン、ヘミン誘導体及
び過酸化作用は又はパーオキシダーゼのような活
性を示す、即ち過酸化水素もしくは他の過酸化物
による別の物質の酸化を触媒する能力を有するそ
の他の化合物も有用である。 酵素ではないが、パーオキシダーゼのような活
性を示すその他の物質は、シリカゲルなどに吸収
させたクロム塩（例えば硫酸クロムカリウム）、
鉄スルホシアネート、鉄タンネート、フエロシア
ン化第一鉄などである。 或いは、指示組成物は、過酸化水素及びパーオ
キシダーゼの存在下に酸化によつて実質的に色変
化は起さないが、酸化された形でカラー形成性も
しくは色変化性物質と反応して化学反応の可視定
量測定種を生じる、一種もしくはそれ以上の物質
を含む。そのようなカラー指示組成物は特に米国
特許第2981606号に詳細に記載されている。後者
のカラー形成性組成物、即ち中間生成物によつて
又はカラーカツプリング反応によつてカラーを生
成するものが本発明の実施に好ましい。 本発明のカラー指示組成物は、好ましくは、 (a) その酸化形態で自己カツプリングする４−メ
トキシ−１−ナフトール、又は (b) １，７−ジヒドロキシナフタレン及び４−ア
ミノアンチピリン（HCI）の組合せ を含む。 本発明は、溶液、即ち試薬成分が試薬水溶液と
して共される「湿式−化学」モードの分析に容易
に適合する。所定割合の試薬溶液を分析すべき血
清の如き水性液体試料と接触せしめる。しかしな
がら、好ましい態様では、試薬成分は乾式素子中
に組み入れる。このような素子は、分析すべき水
性液体と接触するまでは、実質上液体を含まな
い。適当な素子は、一般的な吸収性のデイツプ−
アンド−リード型の素子を含むが、拡散層、一も
しくはそれ以上の試薬層及び任意的な支持体を含
んで成る分析素子が最も好ましい。そのような分
析素子は、例えばプルツイビロウイツ等の米国特
許第3992158号及びグツドヒユー等の同第3983005
号に記載されている。 後記の例においては、以下の物質を使用した。 レシチン：コレステロールアシルトランスフエ
ラーゼ（LCAT）はA.T.C.C.（米国メリーランド
州ロツクヴイル）から入手したアエロモナス・ハ
イドロフイラATCC9071から得た。この酵素はマ
ツクインテイレ，S.，バツクレイ，J.T.，J.
Bacteriol.，135巻、402−407頁（1978）に記載
の方法に従つて精製し、部分的に特性化した（分
子量500000）。 アエロモナス・ハイドロフイラの培養は、１％
グルコース、１％イーストエキス、0.1％
K2HPO4，1.5％アガール（寒天）及び１％
（ｖ／ｖ）塩溶液からなる栄養斜面培地で実施し
た。前記塩溶液は、0.1Nの塩酸中に0.1モル
MgSO4，0.01モルFeSO4，0.01モルNaCl，0.01
モルMnSO4，0.4ミリモルNa2MoO4，0.1ミリモ
ルZnSO4，及び0.6ミリモルCaCl2を溶解させて
使用した。バクテリア培養培地成分は米国ミシガ
ン州デトロイトのデイフコカンパニーより購入
し、アガール（Agar）は英国ロンドンのオツク
スフオードリミデツドより購入した。 コレステロールオキシダーゼ（COD）はスト
レプトマイセス・ビオラセンス及びノカルデイ
ア・コレステロリカムから得た。 パーオキシダーゼはホースラデイシユ（わさ
び）タイプ、152プルプロガリン単位／mg固体
を使用した。その他の成分はウシ血清アルブミ
ン、Ｌ−α−リソホスフアチジルコリン（タイプ
卵黄からのリゾレシチン）及びＮ−２−ヒドロ
キシエチルピペリジン−N′−２−エタンスルホ
ン酸（HEPES）緩衝剤を含む。これらの成分は
シグマケミカルカンパニー（米国ミズリー州セン
トルイス）から得た。 その他のすべての薬剤は米国ニユヨーク州ロチ
エスターのイーストマンコダツクカンパニーから
供給されているものである。 全コレステロール測定用標準曲線の作製 (A) コレステロールエステルの遊離のコレステロ
ールへの転化が完結するのに要する時間は以下の
ようにして求めた。 コレステロールリノレートストツク溶液（6.93
ミリモル濃度）を15％トライトンＸ−100からな
る水溶液に調製して酵素レシチン：コレステロー
ルアシルトランスフエラーゼ（LCAT）の基質と
して作用せしめた。この溶液から各種濃度の基質
（0.35，0.07，1.1及び1.4ミリモル濃度）を調製し
た。各溶液のサンプルを試薬組成物を含む独立の
キユベツトに加え、得られた反応混合物（試薬＋
サンプル）は1.5重量％トライトンＸ−100、
0.462ミリモルリゾレシチン、２×10-2単位
LCAT（この酵素の添加前にキユベツトは37℃で
10分間プレコンデイシヨニングした）及び全量
1.0mlにする0.83mlの緩衝剤試薬を含んでいた。
前記緩衝剤試薬は、PH7.0で50ミリモルHEPESの
緩衝液50ml中に調製した、パーオキシダーゼ1.4
mg、ｏ−ジアニシジン（指示薬）４mg、コレステ
ロールオキシダーゼ12単位及びCaCl2 14mgを含
むものであつた。LCATを除く上記すべての成分
を含むブランクは前記基質と同様に処理した。
430nmでの吸光度の変化を分光光度計において約
40分間監視した。反応は約30分間で実質上完結し
た。このことは吸光度の上昇が認められないこと
により確認された。 (B) 全コレステロールの測定用標準曲線は以下の
ようにして作製した。 各サンプルの（30分後の）全吸光度変化を測定
してコレステリルリノレートの濃度の関数として
プロツトした。これらの濃度はコレステロール濃
度と化学量論的に関連しているので、30分後の吸
光度変化を濃度既知のコレステロールエステルに
対してブロツトして得られた曲線は全コレステロ
ール測定用標準曲線として機能した。 実施例 例 １〜14 本発明方法と対照方法との比較（溶液分析） 上記コレステリルリノレートの終点分析を血清
サンプル中の全コレステロール分析に適用した。
対照分析としてはウオーシントン・エンザイマテ
ツク・コレステロール・キツト（国ニユジヤージ
ー州フリーホールドのWorthington
Biochemical Corp.）を使用した。この分析はコ
レステロールオキシダーゼ反応をパーオキシダー
ゼ反応と結合させるものである。上記(A)において
述べた試薬組成物に記載した成分を含む14本のキ
ユベツトを37℃で10分間プレコンデイシヨニング
した。次に、血清サンプルを添加して各キユベツ
トの最終容積を1.0mlとした。430nmでの30分後
の吸光度の変化を、上記(B)の標準曲線の値と比較
して各サンプル中の全コレステロール濃度
（mmol）を求めた。結果（単位をmmolからmgに
変換した）を第１表に示す。第１表の結果は本発
明方法と対照方法との間の優れた相関関係を示し
ている。
【表】
【表】
例 15
本発明のLCAT試薬組成物使用の乾式分析素子
以下の構造を有する乾式多層分析素子を製造し
た。
以下の構造を有する乾式多層分析素子を製造し
た。
【表】
【表】
体 レート
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ コレステロールエステル及び遊離コレステロ
ール含有水性液体中の全コレステロールを分析す
るに当り、 (a) 前記液体の試料中の実質上すべてのコレステ
ロールエステルをコレステロールに転化せしめ
るのに十分な量のリゾレシチン及びレシチン：
コレステロールアシルトランスフエラーゼ
（LCAT）活性を示す酵素を含む組成物と前記
液体試料とを接触せしめ、 (b) コレステロールエステルへの転化以外の手段
により前記試料からコレステロールを除去し、
そして (c) 前記除去コレステロールの量を分析する工程
を含んで成ることを特徴とするコレステロール
エステル及び遊離コレステロール含有水性液体
中の全コレステロールの分析方法。 ２ (a) コレステロールエステル及び遊離コレス
テロール含有水性液体の試料中の実質上すべて
のコレステロールエステルをコレステロールに
転化せしめるのに十分な量のレシチン：コレス
テロールアシルトランスフエラーゼ（LCAT）
活性を示す酵素及びリゾレシチンを含む試薬組
成物並びに (b) コレステロールエステルへの転化以外の手段
により前記試薬からコレステロールを除去する
手段 を含んで成るコレステロールエステル及び遊離コ
レステロール含有水性液体中の全コレステロール
分析用組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US383849 | 1982-06-01 | ||
| US06/383,849 US4499184A (en) | 1982-06-01 | 1982-06-01 | Analysis for total cholesterol using lecithin:cholesterol acyl transferase (LCAT) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58216700A JPS58216700A (ja) | 1983-12-16 |
| JPH0452119B2 true JPH0452119B2 (ja) | 1992-08-20 |
Family
ID=23514983
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58095099A Granted JPS58216700A (ja) | 1982-06-01 | 1983-05-31 | レシチン：コレステロールアシルトランスフエラーゼを用いる全コレステロール分析 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4499184A (ja) |
| JP (1) | JPS58216700A (ja) |
| CA (1) | CA1182727A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5049488A (en) * | 1985-11-08 | 1991-09-17 | Genentech, Inc. | Method and nucleic acid for the preparation of lecithin:cholesterol acyltransferase |
| ATE133423T1 (de) * | 1987-05-20 | 1996-02-15 | Rogosin Inst | Rekonstituierte hdl-teilchen und ihre verwendung |
| US5128318A (en) * | 1987-05-20 | 1992-07-07 | The Rogosin Institute | Reconstituted HDL particles and uses thereof |
| KR100400877B1 (ko) * | 2000-10-05 | 2003-10-08 | (주)케이디알 | 항진균제의 검색방법 |
| US20070031914A1 (en) * | 2005-08-05 | 2007-02-08 | Wei Zhu | Devices for analyte assays and methods of use |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2619252C3 (de) * | 1975-05-02 | 1979-06-13 | Nippon Shoji Kaisha, Ltd., Osaka (Japan) | Verfahren zur Messung der Aktivität von Lecithincholesterinacyltransferase und hierfür verwendbare Lecithinsubstratlösung |
-
1982
- 1982-06-01 US US06/383,849 patent/US4499184A/en not_active Expired - Fee Related
- 1982-10-12 CA CA000413204A patent/CA1182727A/en not_active Expired
-
1983
- 1983-05-31 JP JP58095099A patent/JPS58216700A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1182727A (en) | 1985-02-19 |
| JPS58216700A (ja) | 1983-12-16 |
| US4499184A (en) | 1985-02-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Klotzsch et al. | Triglyceride measurements: a review of methods and interferences | |
| Shimizu et al. | Enzymatic microdetermination of serum free fatty acids | |
| US5912139A (en) | Test strip | |
| JP2610074B2 (ja) | 液体中のイオンを測定する方法及びそのための組成物 | |
| CA1136027A (en) | Method for determining a substance in a biological fluid and reagent combination for use in the method | |
| JPH0147152B2 (ja) | ||
| EP0019253B1 (en) | Test device, composition and method for the determination of triglycerides | |
| US4839279A (en) | Method for the quantitative determination of physiological components in biological fluids | |
| EP0116307B1 (en) | Composition, analytical element and method for the quantification of creatine kinase | |
| EP0101046A1 (en) | Methods, compositions and elements for the determination of lipase | |
| JPH0452119B2 (ja) | ||
| EP0657545B1 (en) | Assay method for biological components | |
| US4784945A (en) | Method for determining lipids | |
| EP0089210B1 (en) | Reagent for assaying cholinsterase | |
| US4695539A (en) | Process for quantitative determination of substrate treated with oxidase | |
| JPH0373276B2 (ja) | ||
| JPH1014596A (ja) | 体液中の成分の測定法およびその試薬 | |
| JP4577863B2 (ja) | カルシウムイオン測定用組成物および測定方法 | |
| WO1993013219A1 (fr) | Composition de determination d'ions calcium | |
| CA1202869A (en) | Method for the quantitative measurement of the phosphatidyl glycerol | |
| US5840512A (en) | Method for measurement of ionized calcium | |
| US5268269A (en) | Scleroprotein and scleroprotein hydrolysate containing agent for detection of cholesterol | |
| Kusu et al. | Fluorometric determination of pseudocholinesterase activity in postmortem blood samples | |
| RU1788466C (ru) | Способ определени холестерина | |
| GB2107863A (en) | Colorimetric determination of peroxides |