JPH0453386B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ この発明は、全血または全血から誘導して特別
に製造された対照および較正物質におけるヘモグ
ロビン（Hb）の総濃度測定に関するものであり、
さらに詳しくはこのような測定を実施する際に有
用で、シアニドイオンのような有毒物質を用いな
い方法および試薬組成物に関するものである。 ［先行技術］ ヘモグロビンの総濃度の測定値は全血の酸素運
搬力を示すものである。総ヘモグロビンの測定に
用いる基準的および最も一般的な方法はシアンメ
トヘモグロビン法である。この方法の場合、赤血
球のヘモグロビン、オキシヘモグロビンおよびカ
ルボキシヘモグロビン中のヘムの第１鉄イオン
（Fe（））を、フエリシアン化物により第２鉄
（Fe）状態に酸化してメトヘモグロブリンを形
成させる。次に、メトヘモグロブリンをイオン化
シアニドと結合させてシアンメトヘモグロビンを
製造し、これを540nmで測光法により測定する。
別の背景資料としては、ヘンリーら（編集者）に
よるクリニカル・ケミストリー（Clinical
Chemaistry）、ハーパー・アンド・ロウ・ヘイガ
ースタウン、メリーランド（1974）、第1131頁、
ドラブキン、ジヤーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、112巻51頁
（1935）、およびバン・カンペンおよびツイリスト
ルス、アドバンシーズ・イン・クリニカル・ケミ
ストリー（Advances in Clinical Chemistry）、
８巻141〜187頁が挙げられる。 ハミルの米国特許第3874852号は、PH値９のア
ルカリ性水溶液中にイオン性シアニドを含有す
る、ヘモグロビン測定用試薬を開示している。こ
の試薬にはフエリシアン化物は存在しない。むし
ろ、大気中酸素によりヘムを第２鉄状態に酸化す
る。次いで第２鉄を含むヘモグロビン種がシアン
イオンと結合してクロモゲンを生成するが、これ
を測定することによりヘモグロビンを定量する。 また、レデイスら、米国特許第4286963号は、
全血中のリンパ球および骨髄白血球の両者および
ヘモグロビンを測定するための試薬を開示してい
る。この試薬は、酸性緩衝液（PH3.5〜5.0）中に
表面活性第４級アンモニウム塩、フエニルまたは
フエノキシアルカノール、およびポリアルコース
を含有しているが、イオン性シアニドは含有して
いない。ここでは、イオン性シアニドの欠如は望
ましくなく、ヘモグロビンとの反応により形成し
たクロモゲンが不安定となるとを示唆している。
レデイスらの推察によると、イオン性シアニドが
試薬中に存在する場合、試薬は緩衝シアニドを含
有させるためアルカリ性のPH値にすることにより
満足すべきヘモグロビン誘導体を得るようにすべ
きである。 オシロら、クリニカル・バイオケミストリー
（Clin.Biochem.）15巻83頁（1982）は、中性緩衝
液（PH7.2）中に、ドデシル硫酸ナトリウムまた
は等量でラウリル硫酸ナトリウム（SLS）（アニ
オン性界面活性剤）およびトリトン（Triton）
Ｘ−100（非イオン性界面活性剤）を含有してなる
ヘモグロビン測定用試薬の使用について教示して
いる。赤血球はSLSにより溶解する。トリトンＸ
−100が存在すると、SLSは５℃以下の温度では
沈殿しない。反応は５〜10分以内に完了して539
および572nmに吸収極大を有する緑色のクロモゲ
ンが生成し、この色の深度がヘモグロビン含有量
を示すものである。 ツアンデル、ラングおよびボルグら、クリニ
カ・シミカ・アクタ（Clin.Chem.Acta）第136巻
（1984年）でもまた、強アルカリ性媒質である
0.1N−NaOHにトリトンＸ−100のような非イオ
ン性界面活性剤を溶かしたものからなる試薬を用
いる総ヘモグロビン濃度測定方法を開示してい
る。この反応は１〜２分以内に完了し、緑色クロ
モゲンが575nmに吸収極大値および600nmに肩を
有するものとして形成される。ツアルデルらは特
に、非イオン性界面活性剤の代わりにカチオン性
またはアニオン性界面活性剤を用いると、この方
法は機能しないと記載している。 高処理量の現行自動化血液学的測定系に対して
は、回転率の高い方法、例えば完了時間が30秒未
満の方法を用いる必要がある。ヘモグロビンの定
量については、従来技術ではこのような急速な回
転は高PH値、高シアニド濃度のシアニド含有試薬
を用いることによつてのみ可能であつた。そのた
め、試薬は毒性が高く、イオン性シアニドが塩基
推進加水分解を受けてホルムアミドとホルメート
を生ずるため安定性が悪い。したがつて、試薬に
余分のシアニドを加えて加水分解による損失を相
殺しなければならない。それ故、回転率が高くシ
アニドの使用を必要としないヘモグロビン測定法
の開発が望まれた。 上記の従来法はイオン性シアニド、フエリシア
ニドまたは非イオン性界面活性剤の使用を必要と
する。従来法の欠点の１つは、クロモゲン生成完
了時間が実質的に30秒を越えることである。 また、環境に関する理由から、分析用試薬のい
かなるタイプに対してもイオン性シアニドの存在
は極めて不都合である。反応混合物または廃液の
投棄に際しては、イオン性シアニド濃度を規定限
度内まで減少させるための特別な処理を必要とす
る。逆に、もし限度を超えていると、廃液の投棄
に特別な手段を必要とし、コストが高くなる。イ
オン性シアニドその他の毒性物質が廃液中に存在
しないならば、明らかに廃液の投棄は極めて単純
化される。 ［発明の記載］ この発明によると、イオン性シアニドを含ま
ず、従来法より短時間、例えば30秒未満でヘモグ
ロビン測定が可能であり、現在の自動化機器測定
に特に適する、新規測定法および試薬組成物が提
供される。この発明の測定法および試薬組成物を
用いると、例えば高濃度の一酸化炭素にさらされ
た患者の血液に見られるカルボキシヘモグロビン
のような種々の形態のヘモグロビンを含む血液試
料の分析が従来法より特に早く、イオン性シアニ
ドの存在による毒性から解放される。測定を行な
う血液試料には、新鮮な全血と、特別に調製した
対照と、血液学的分析器の標定に用いる全血由来
の検量液が含まれる。 この発明は、アセトンを含有する溶液またはイ
オン性界面活性剤の溶液の有効量を含有し、PH値
がヘモグロビンを変性させ、また上記ヘモグロビ
ン中のヘム鉄分を酸化して、吸収極大が可視領域
内にある酸化ヘム生成物を形成するのに充分な程
度塩基性であり、血液標本中のヘモグロビン総濃
度測定に用いる、新規なシアニドを含まない組成
物に関するものである。好ましくは溶液は水溶液
である。この発明はまた、血液試料中の赤血球を
上記記載の組成物で処理して酸化ヘム生成物を形
成し、上記生成物の吸光度を測定し、それからヘ
モグロビン濃度を計算することからなるヘモグロ
ビン濃度測定法にも関している。 反応生成物は、はつきりした緑色をしており、
全く安定している。反応生成物の可視吸収スペク
トルは、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウ
ムまたは同等に臭化セチルトリメチルアンモニウ
ム（CTAB）のような界面活性剤をアルカリ側
のPH値で含む溶媒に溶かしたヘミンクロリドの公
知のスペクトルと重り合うことが分かつた。これ
は、水素イオンが、中央で配位結合している第２
鉄イオンの軸結合のリガンドである第２鉄プロト
ポリフイリン誘導体であると同定された（シン
プリシオおよびシユウエンゼン著、バイオケミス
トリー（Biochem.）12巻、（1973年）1923頁）。
同じ反応生成物は、全血中の天然ヘモグロビン、
メトヘモグロビン溶液またはヘミンクロリド溶液
のいずれかでも形成される。 全血中の天然ヘモグロビンをこの発明の新規溶
媒組成物と反応させると、界面活性剤が赤血球を
すばやく溶解し、それによつてヘモグロビンが放
出され、細胞破片とある種の血液試料にみられる
脂肪性血漿の高脂肪分を効果的にそして完全に乳
化する。溶媒が試料から生じる濁りのあらゆる原
因物を完全に分散するので、側光前に濾過や濃縮
を必要としない。 そして、明確な役割を果たすアルカリおよび界
面活性剤でヘモグロビンを変性させる。塩基は、
静電的相互作用（塩架橋）を基本的に排除するこ
とによつてヘモグロビンの４次構造を変性するだ
けのアルカリ側PHを提供する。界面活性剤は、蛋
白の内部疎水部位と相互作用することでヘモグロ
ビンを変性し、ヘムを露出する。アルカリおよび
界面活性剤の組み合せによる変性は各々の成分の
みで行うより早い速度で起る。変性は、グロビン
の疎水性内部との非共有結合性相互作用からヘム
（各ヘモグロビンが４つのヘムを持つ）を離す。
ヘムは界面活性剤のミセルに抽出され、そこで空
気中の酸素との接触がヘム鉄の酸化を迅速に行な
い第２鉄状（Fe）にする。次いで、起る第２
鉄ヘムと水酸化物イオンの反応により、水酸化物
イオンが生じる第２鉄イオンの軸のリガンドであ
る反応生成物がもたらされる。生じる反応生成物
は、反応試料を室温で保存した場合に数週間の間
吸収スペクトルが維持されることによつて立証さ
れるように、きわめて安定である。 さらに効果的にするために、この組成物は、血
液試料のアルカリ度を増すべきである。組成物中
のイオン性界面活性剤は塩基の役を果たすことが
できる。代りになるものとして、界面活性剤とは
独立に強塩基またはアセトンを組成物中に含ん
で、反応に必要なPH値を与えてもよい。少なくと
もPH値を約11.3にすることが好ましい。PH値は
13.7より大きいことが特に好ましい。 一般に、この組成物のイオン性界面活性剤は、
アルキル疎水性長鎖および極性先端基を含まなけ
ればならない。アルキル基は主鎖に10〜20個の炭
素原子、および総量で30個以内の炭素原子を含む
ことができる。アルキル基は主鎖に12〜18個の炭
素原子、および総量で24個以内の炭素原子を含ん
でいることが好ましい。特に、アルキル鎖が12〜
18個の炭素を含んでおり分枝鎖のないことが好ま
しい。C₁₂−C₁₈アルキル基の例としては、ラウリ
ル（またはドデシル）、ミリスチル（またはテト
ラデシル）、ステアリル（またはオクタデシル）
またはセチル（ヘキサデシル）が包含される。 界面活性剤のアルキル炭化水素長鎖は先端基に
結合する。先端基は、カチオン性、アニオン性ま
たは両性であつてよい。アルキル炭化水素長鎖は
共有結合で先端基と結合する。先端基に結合する
１個以上のアルキル基があつてよい。これらのア
ルキル基は同じであつても異つていてもよい。そ
れらは直鎖であつても分枝鎖であつてもよく、１
〜20個の炭素原子を含む。好ましくは、それらは
１〜６個の炭素を含んでいる低級アルキル基であ
る。そのような基は、メチル、エチル、プロピ
ル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、アミ
ル、イソアミル、ヘキシル等を含む。 この発明の化合物は、１個あるいはそれ以上の
不斉炭素原子を含んでいてもよく、ラセル体また
は必要に応じて活性型として存在してもよい。こ
れらの化合物は全て、この発明の範囲内にある。 イオン性界面活性剤には４つの異つた型があ
る。上で述べたように、界面活性剤の１つの型は
塩基の役目を果してよく、存在しうるいかなる他
の塩とも独立に必要なPHを与えることができる。
必要なPHを与えるのに適している界面活性剤は式 ［式中、R₁はC₁₂−C₁₈アルキル，R₂，R₃およ
びR₄は同一でも異つていてもよく、各々独立に
アルキルである］ で示されるアルキルアンモニウムヒドロキシドを
含む。 R₂，R₃およびR₄は低級アルキルであることが
好ましい。特に好まれるイオン性界面活性剤は
C₁₂−C₁₈アルキルトリメチルアンモニウムヒドロ
キシドである。このようなイオン性界面活性剤の
例は、オクタデシルトリメチルアンモニウムヒド
ロキシドまたは同等なものとしてステアリルトリ
メチルアンモニウムヒドロキシド、ドデシルトリ
メチルアンモニウムヒドロキシドまたは同等なも
のとしてラウリルトリメチルアンモニウムヒドロ
キシド、テトラデシルトリメチルアンモニウムヒ
ドロキシドまたは同等なものとしてミリスチルト
リメチルアンモニウムヒドロキシド等であつてよ
い。これらのイオン性界面活性剤はカチオン性界
面活性剤の種類に属する。しかし下に示すよう
に、すべてのカチオン性界面活性剤がこの性質を
有するとは限らない。 多くのイオン性界面活性剤は、用いる界面活性
剤とは独立に強塩基を、この発明を効果的にする
ために必要なPHを付与するために必要とする。こ
れらのイオン性界面活性剤はカチオン性界面活性
剤、両性イオン界面活性剤およびアニオン性界面
活性剤を包含する。 界面活性剤の２番目のグループは、それ自体で
は必要なPHを付与するのに十分なほど塩基性でな
いカチオン性界面活性剤である。この種類に属す
るカチオン性界面活性剤は、４価のアンモニウム
塩を含み、特にハライドを含む。さらに詳細に
は、これらのカチオン性界面活性剤は、式： ［式中、R₁はC₁₂−C₁₈アルキル、R₂，R₃およ
びR₄は独立に水素かまたまアルキルであり、 Ｘはハライドである］ で表わされるC₁₂−C₁₈アルキルアンモニウム塩を
含む。 R₂，R₃およびR₄は低級アルキルであることが
好ましい。さらに好ましいカチオン性界面活性剤
はC₁₂−C₁₈アルキルトリメチルアンモニウムハラ
イドである。 例としては、ステアリルトリメチルアンモニウ
ムハライド、ラウリルトリメチルアンモニウムハ
ライド、ミリスチルトリメチルアンモニウムハラ
イド、セチルトリメチルアンモニウムハライド等
を含む。好ましいハライドはクロリドまたはブロ
ミドである。 他のアルキルアンモニウム塩もこの発明の範囲
に包含される。これらのカウンターイオンは、
「スペクテイター（傍観者）」として働く塩基を含
み、非毒性であり、生成物の可視吸収を妨害しな
いものであつて、例えば硫酸塩、硝酸塩、しゆう
酸塩、酢酸塩等である。 必要なPHを付与するために独立の塩基を要する
別の種類の界面活性剤は、両性イオン界面活性剤
である。この種の界面活性剤は式： ［式中、R₁はC₁₂−C₁₈アルキル、R₂およびR₃
は同一かまたは異つていてよく、各々独立にアル
キルである］ で示されるC₁₂−C₁₈アルキルアミン−Ｎ−オキシ
ドを含む。 好ましいアルキル基は低級アルキルである。特
に好ましい両性イオン界面活性剤は、Ｎ，Ｎ−ジ
メチル−C₁₂−C₁₈アルキルアミン−Ｎ−オキシド
を含む。両性イオン界面活性剤の例は、Ｎ，Ｎ−
ジメチルラウリルアミン−Ｎ−オキシド、Ｎ，Ｎ
−ジメチルセチルアミン−Ｎ−オキシド、Ｎ，Ｎ
−ジメチルステアリルアミン−Ｎ−オキシド等を
含む。 イオン性界面活性剤の第４番目の種類は、アニ
オン性界面活性剤である。この種類も効果がある
PH値を付与する独立な塩基と結合した場合にもつ
とも効果的に働く。この種の界面活性剤は、C₁₂
−C₁₈アルキル硫酸のアルカリおよびアルカリ土
類金属塩を含む。アニオン性界面活性剤の例は、
ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸リチウ
ム、ミリスチル硫酸ナトリウム等を含む。必要な
PH値を付与するのに適した強塩基の例としては、
水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムのよう
な、アルカリ金属水酸化物を含む。別の例として
は、テトラブチルアンモニウムヒドロキシドのよ
うな、アルキル基が１〜４個の炭素原子を含み得
るテトラアルキルアンモニウムヒドロキシドがあ
る。 界面活性剤の濃度の好ましい範囲は、デシリツ
トル当り2.0〜5.0グラムの間である。界面活性剤
と独立に使用し必要なPHをもたらす塩基濃度の好
ましい範囲は、0.4〜0.6Nの間である。 先行技術と違つて、約30秒間以内で反応混合物
の吸収を観察し、しかもイオン性シアニドの存在
に付随する危険性なしに信頼できるヘモグロビン
測定が行われる。 この発明のイオン性界面活性剤は、容易に入手
できるかまたは置換もしくは変換のような既知技
術によつて、入手容易な中間体から製造できる。
例えば、アルキル硫酸塩は、強塩基例えば水酸化
ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウム等
で対応する硫酸アルキルを処理して製造すること
ができる。硫酸アルキルは、３酸化いおう、硫酸
またはハロ硫酸、例えばクロロ硫酸等を用いても
周知方法により対応するアルコールまたはハライ
ドを処理して製造する。ジシクロヘキシルカルボ
ジイミドのようなカツプリング剤も用いてもよ
い。 アンモニウムイオン界面活性剤はまた、当技術
で既知の方法で製造することもできる。例えば、
C₁₂−C₁₈アルキルアンモニウムハライドは、対応
するアルキルハライドを過剰のアンモニアと反応
させ、その塩を単離することにより製造できる。
第２級アルキルアンモニウム塩は、過剰の第１級
アミンをアルキルハライドと反応させ、その塩を
単離することにより製造できる。第１級アミンは
種々の方法、例えば上記のように生成した第１級
アルキルアンモニウムハライドを塩基、例えば
NH₃またはヒドロキシドで処理して得られる。
別法としては、第１級アミンは、対応するアミド
のホフマン分解、対応するニトリルの還元、およ
び対応するアルデヒドまたはケトンとアンモニア
を用いる還元的アミノ化等の当技術で周知の有機
化学方法により製造できる。同様に、第３級アル
キルアンモニウムハライドは、過剰の第２級アミ
ンとアルキルハライドを反応させて製造できる。
第２級アミンは、第２級アルキルアンモニウム塩
をヒドロキシドまたはアンモニアのような塩基で
処理して得られる。第２級アミンを得る他の方法
には、アルデヒドまたはケトンと第１級アミンを
用いる還元的アルキル化が含まれる。第４級アル
キルアンモニウム塩は、第３級アルキルアミンと
アルキルハライドを反応させることにより製造で
きる。第３級アルキルアミンは上記と同様にして
得られる。例えば、それは第３級アルキルアンモ
ニウム塩を塩基、例えばヒドロキシドまたはアン
モニアと反応させるか、または第２級アミンとア
ルデヒドまたはケトンを用いる還元的アルキル化
により製造できる。別法として、R₂，R₃および
R₄が同一の場合には、第４級アルキルアンモニ
ウム塩はC₁₂−C₁₈アルキルアミンを過剰のアルキ
ルハライドで徹底的にアルキル化して製造するこ
とができる。 第４級アルキルアンモニウムヒドロキシドは公
知技術で製造できる。例えば、第４級アンモニウ
ムハライドを酸化銀で処理し、ハロゲン化銀を沈
殿させる。混合物を濾過し、濾液を濃縮して第４
級アンモニウムヒドロキシドを得る。 アミン−Ｎ−オキシドもまた周知の方法で製造
できる。例えば、適当な第３級アミンは標準的酸
化剤、例えば過酸化水素、過酸およびカロ酸（Ｈ
−Ｏ−Ｏ−SO₃Ｈ）で酸化することによりアミン
オキシドに変換される。 この発明の方法は、一般に、この発明の新規試
薬組成物と全血試料（または対照または尺度用材
料）中に存在する天然ヘモグロビン種との反応に
由来する特定生成物の検出を含んでいる。天然ヘ
モグロビン種としては、デオキシヘモグロビン、
オキシヘモグロビン、メトヘモグロビン、胎児ヘ
モグロビン、カルボキシヘモグロビンおよび病的
細胞ヘモグロビンが含まれる。血液試料は、試薬
組成物で250倍に希釈され、生成する反応生成物
は570nmの極大吸収と595nmの肩をもつ再現性吸
収スペクトルを有する。この組成物はヘモグロビ
ンがどのような形態にあつてもこれを測定し得る
ものである。 可能な反応機構の１つは下記方程式により支持
される。 (1) WB＋DMLAO＋NaOH →GP−１（λmax570，595sh nm） (2) WB＋SLS＋NaOH →GP−２（λmax495，525sh nm） (3) WB＋CTAB＋NaOH →GP−３（λmax594 nm） （4a）WB＋NaOH pH13 ――――→ アルカリ性ヘマチン DMLAO ―――――――→ GP−１ （4b）WB＋ほう酸緩衝液 pH11.3 ―――――→ オキシHb（Fe）DMLAO GP−１ （4c）WB＋りん酸緩衝液 pH7.5 ―――――→ 黄褐色生成物 （5a）WB＋ほう酸緩衝液＋アセトン → GP−１ −アセトン ―――――――→ N₂気流メトHb（Fe） （5b）WB＋ほう酸 pH11.3 ―――――→ オキシHb（Fe） アセトン ―――――→ GP−１ −アセトンヽN₂ ――――――――――→ メトHb 方程式(1)では、オキシヘモグロビン（Fe）
を含む全血（WB）を、両性イオン界面活性剤で
ある３％−Ｎ，Ｎ−ジメチルラウリルアミン・Ｎ
−オキシド（DMLAO）と0.5M水酸化ナトリウ
ム（NaOH）中で合わせて緑色の最終生成物
（GP−１）を生成する。生成物GP−１は570nm
に極大吸収、595nmに肩をもつ吸収スペクトルを
有する。３％ラウリル硫酸ナトリウム（SLS）
（アニオン性界面活性剤）を0.5N−NaOH中で全
血に反応させると（方程式２）、495nmと603nm
に極大、525nmに肩をもつ吸収スペクトルを有す
る生成物（GP−２）が生成する。３％臭化セチ
ルトリメチルアンモニウム（CTAB）（カチオン
性界面活性剤）を0.5N−NaOH中で全血と反応
させると（方程式３）、594nmに極大をもつ吸収
スペクトルを有する生成物（GP−３）が生成す
る。 方程式１，２および３は、反応生成物のスペク
トルに対する界面活性剤の先端基荷電の影響を説
明している。生成するクロモゲンは、界面活性剤
ミセル中に分散される。上記した生成クロモゲン
のスペクトルは、界面活性剤の先端基の荷電がク
ロモゲンの電子配置を攪乱し、界面活性剤先端基
の荷電が変ると吸収スペクトルも変ることを示し
ている。これらの反応は、変換速度はほとんど瞬
間的である。 DMLAO／NaOH反応系（方程式１）は、方
程式4a〜5bによりさらに完全に示される。方程
式4aでは、全血試料を0.5N−NaOHで希釈する
と、速やかに赤褐色のアルカリ性ヘマチンを生成
する。しかし、全血をまず0.5N−NaOHでなく、
50mMほう酸塩により、PH11.3で希釈すると、オ
キシヘモグロビンのスペクトル（540および
576nmに極大）は保持される。オキシヘモグロビ
ンにPH11.3でDMLAOを加えるとGP−１が生成
する（方程式4b）。ところが、全血を50mMほう
酸塩によりPH7.5で希釈すると、やはりオキシヘ
モグロビンのスペクトルがみられ、DMLAOの
添加後黄褐色の生成物が生成する（方程式4c）。
方程式4aおよび4bは、反応のPHが重要であり、
オキシヘモグロビンからGP−１への変換を急速
に推進するには高アルカリ性でなければならない
ことを示す。界面活性剤不存在下に強アルカリを
用いると、アルカリ性ヘマチンがGP−１への前
駆体となることがわかる。 アルカリ性ヘマチンは第２鉄ヘム誘導体である
から［メルク・インデツクス（Merck Index）
９版］、血中ヘモグロビンの総変換によるGP−１
の吸収スペクトル生成（方程式１）は、必然的に
第１鉄（Fe）から第２鉄（Fe）へのヘム鉄
イオンの酸化を伴なう。この結論は、界面活性剤
の代りにアセトンを用いる方程式5aおよび5bが
示す反応により支持される。方程式5aでは、全
血を50％（Ｖ／Ｖ）アセトンと50％（Ｖ／Ｖ）
50mMほう酸緩衝液からなる試薬で希釈すると
（PH11.3）、GP−１が生成する。方程式5bでは、
全血試料をまずほう酸緩衝液で希釈してオキシヘ
モグロビンのスペクトルをもたらし、アセトンで
１対１に希釈すると、やはりGP−１が生成する。
方程式5aと5bの両者において、試料に窒素気流
を通してアセトンを除くと、メトヘモグロビンを
生ずる。方程式5bに示すように、反応混合物に
再びアセトンを加えると、GP−１が再生する。
これは、GP−１とその特性吸収スペクトルが、
ヘム鉄イオンの酸化により直接生じたことを証明
する。 アセトンとDMLAOは何ら共通の構造上の特
徴をもたない。それ故、反応上におけるこれらの
機能は反応媒質の極性を低めることである筈であ
る。また試験した他の界面活性剤もDMLAOと
類似の役割をもつように見える。反応混合物の極
性の低下は疎水性ヘムの放出に役立つが、これは
グロビンと非共有結合的に複合しており、GP−
１の呈色（吸収スペクトル）の原因物質でもあ
る。さらに、界面活性剤は赤血球の溶解を起し、
生成する細胞ゴーストを充分分散し、試料中の脂
質を乳化して、濁りのない反応混合物をもたら
す。緑色最終生成物をGP−１産生の利点は、ビ
リルビンの妨害を避けて570nmで検出できること
である。またGP−１は極めて急速に、すなわち
血液と試薬の混合後５秒以内に生成し、数時間安
定し、したがつて、ヘモグロビン濃度の手動測定
に適する。 したがつて、血液試料のヘモグロビン濃度の指
標となるGP−１の特徴的スペクトルが、シアニ
ドを全く含まず、試薬の製造、輸送、実験室的使
用および廃液投棄上明白な利点を有する、試薬組
成物の使用によつて得られることがわかる。 ［実施例］ 実施例 １ PH13.7における直線性および相関 この実施例では、本発明による試薬組成物と反
応させた血液標本の総ヘモグロビン濃度と得られ
る吸光度の間に特定の波長で直線関係が存在する
ことについて詳述する。この直線形状はベールの
法則との一致を示し、比色定量アツセイの望まし
い特性であり、アツセイの標準化および較正を容
易にする。ヘモグロビン測定分野において許容さ
れる正確さは、±1.0％の変動を伴う係数により特
徴づけられる。 この方法を実施する際に使用する試薬組成物は
次にようにして製造した。NaOH（20ｇ）を800
mlの脱イオン水に溶解した。その後、30％のＮ，
Ｎ−ジメチルラウリルアミン・Ｎ−オキシド水溶
液133.4mlを穏やかに混合しながら加えた。この
製剤に脱イオン水を加えて１リツトルにし、過
して粒子を除去した（0.2μフイルター）。生成す
る溶液は、0.5N−NaOHおよびDMLAOを成分
とするものであり、PH値は13.7であつた。 全血（10ml）10本の標準EDTAバキユテーナ
ー（ベクトン・デイツケンソン・バキユテーナ
ー・システムズ、ラザフオード、ニユーシヤージ
ー）にとり、プールした。プールされた血液の細
胞／血漿比を操作して、総ヘモグロビン濃度に関
して変化する一連の標本が得られた。「操作する
（manipulate）」の語は、統制された方式で最初
のヘモグロビン濃度すなわちヘマトクリツトを変
えることを意味する。全血のチユーブを遠心分離
し（５分×3000rpm）、それぞれの血漿および軟
膜から赤血球を分離した。軟膜を棄て、固められ
た赤血球を、本来の血漿中、様々な比率で容積測
定用ピペツトにより再懸濁した。2.5〜25ｇ／dl
の臨床範囲にわたる６種のヘモグロビン濃度が得
られた。各濃度を、前記の製造方法で得られた、
2μの標本と500μの試薬（１：250）を混合す
ることにより、（５）回反復で分析した。次に得
られる混合物を570±4nmバンド幅のフイルター
を備えた比色計のフローセル（径路の長さ＝0.80
cm）を通過させた。吸収値は、標本と試薬を混合
後25秒で測定した。結果を表に示す。 表１標本 ヘマトクリツト A₅₇₀±CV％ １ ０ 0.000±０ ２ 15 0.083±0.54 ３ 30 0.166±0.29 ４ 45 0.251±0.57 ５ 60 0.333±0.56 ６ 75 0.412±0.29 表１によると、相対的ヘモグロビン濃度および
A₅₇₀における測定値間の関係は全臨床範囲にわた
つて勾配1.00の一次関数となつている。また、ヘ
モグロビン濃度が０のとき吸光度も０、すなわち
A₅₇₀＝０となるため、検量線は原点を通過する。
さらに、この方法の精度は、変化率の計算により
示されるように0.57％の等しいかまたはそれ以下
であり、この値はヘモグロビン測定における精度
の許容レベル内に充分おさまるものである。 実施例 ２ シアンメトヘモグロビン法に対する相関 この実施例では、この方法の結果がシアンメト
ヘモグロビン法の結果と相関関係にあることを説
明する。 20個の全血標本について、実施例１で記載した
方法およびバン・カンペンおよびツイリストルス
らによるシアニド（CN）を用いたシアンメトヘ
モグロビン（レフアレンス）方法によりヘモグロ
ビン濃度について分析した。テクニコン
（TECHNICON）Ｈ−6000フロー・サイトメト
リー・システム（テクニコン・インストルメン
ツ・コーポレイシヨン、テリータウン、ニユーヨ
ーク）に合わせ、使用説明書にしたがい操作した
表２の結果を参照。 相関の研究から、以下に示す直線系の回帰方程
式を得た。 （Hb、ｇ／dl）CNなし＝0.99（Hb、ｇ／dl）
レフアレンス ＋0.046ｇ／dl 従つて、この発明の方法はレフアレンス法によ
つて得た量の99％を得た。 表２ CNなしHb法とレフアレンスHb法の相関標本 Hb、ｇ／dl、 Hb、ｇ／dl、 CNなし法 レフアレンス法 １ 11.5 11.9 ２ 12.3 12.5 ３ 14.5 14.5 ４ 8.10 8.25 ５ 11.1 11.2 ６ 11.8 11.8 ７ 16.3 16.4 ８ 8.40 8.40 ９ 16.2 16.4 10 10.6 10.7 11 11.8 11.8 12 11.7 12.0 13 9.30 9.35 14 8.90 8.95 15 14.6 14.6 16 11.4 11.5 17 7.90 7.80 18 8.90 8.80 19 10.4 10.4 20 14.6 14.7 要約すると、この方法で観察された直線性、精
度および正確さは、臨床用ヘモグロビン測定法に
必要とする許容範囲以内に充分おさまつている。 実施例 ３ １酸化炭素によつて被毒した血液の測定 ある種のひとの血液中のヘモグロビンは、１酸
化炭素との接触により被毒してカルボキシヘモグ
ロビンを含んでいることがある。例えば、ヘビ
ー・スモーカーおよびタクシー運転手の血液標本
中のカルボキシヘモグロビンは総ヘモグロビン含
量の10％以上を構成している場合がある。ヘモグ
ロビン分析のためのあらゆる信頼すべき方法の重
要な特徴は、被毒ヘモグロビンに天然のヘモグロ
ビンと同様の最終生成物をもたらす能力である
が、これはヘモグロビンの被毒形に対するスペク
トルが、天然のヘモグロビンのスペクトルと異な
るためである。 血液を２本の試験管にとつた。１本の試験管は
「対照」と名称をつけた。２本目の試験管は「カ
ルボキシヘモグロビン」と名称をつけた。２本目
の試験管におおいをし、１酸化炭素の気流を管内
に含まれる血液に１時間吹き込んだ。１酸化炭素
の影響は血液がはつきりと識別できる桜赤色にな
ることで観察される。そして、カルボキシヘモグ
ロビンの試験管が100％カルボキシヘモグロビン
を含むことが分かつた。 次に、「対照」および「カルボキシヘモグロビ
ン」の試験管につき実施例１の方法を用いてヘモ
グロビンを測定した。両方の試験管で得られた反
応生成物は実質的に同一であり、迅速走査スペク
トロフオトメーターによつて測定したところ、何
れも実質的に同じ吸収である570nmのスペクトル
極大値をもつ特徴的な緑色の最終生成物を得た。
このことは、ヘモグロビンの全部または一部が被
毒したかどうかにかかわらず、同じ最終生成物が
生成されたことにより、ヘムが「被毒」ヘモグロ
ビンの内部から離れて反応系の中に入り込んだこ
とを立証している。従つて、この発明の方法は、
表３に示すようにカルボキシヘモグロビンを単独
でまたは天然のヘモグロビンの存在下で測定する
のに効果的である。 表３ 「対照」と「カルボキシヘモグロビン」血液の応
答血液 COHb(%) A₅₇₀±CV(%)
Hb（ｇ／dl） 「対照」 ０ 0.251±0.57
15.2 「カルボキシ 100±２ 0.253±0.58
15.2 ヘモグロビン」 エヌ．タイツ著、「フアンダメンタルス・オ
ブ・クリニカル・ケミストリー」
（Fundamentals of Clinical Chemistry）（1970
年）836頁（ダブル・ビー・サウンダース・カン
パニー）に記載の方法によつて、両方の標本を３
回分析してCOHbの％を決定した。 実施例 ４ PH11.3での直線性および相関 この実施例は、11.3のPH値を有するシアニドを
含まない試薬組成物を用いるこの発明の方法の直
線性および相関を説明するものである。上記実施
例１では試薬組成物は13.7のPH値を有する。 ほう酸ナトリウム19.06ｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチル
ラウリルアミン−Ｎ−オキシド（DMLAO）（水
中、30％保存溶液）66.7ml、NaOH4.0ｇおよび
さらにNaOHでPH11.3±0.2に調製したものから
成る試薬１リツトルを製造した。試薬を過
（0.2μ）しあらゆる不純物を除去した。化合物の
最終濃度は、50ナノモルほう酸ナトリウム緩衝液
（PH11.3）中で２％DMLAOであつた。 この試薬と実施例１で得たのと同様の６つの操
作済み血液標本を、反応した標本の吸収を混合15
秒後に測定することを除いて実施例１に記載の方
法で反応させた。ヘマトクリツトに対してプロツ
トすると、緑色最終生成物の570nmでの吸収は表
４に示すように2.5−25ｇ／dlの範囲で、ヘモグ
ロビン濃度に対する直線を生じる。レフアレンス
法（実施例２に記述）に対する相関の研究から次
に示す一次方程式を得た。 （Hb、ｇ／dl）CNなし＝ 1.00（Hb、ｇ／dl）レフアレンス＋0.22ｇ／dl 表４ PH11.3におけるシアニドなしHb法の直線性お
よび相関

【表】 CNなしHb法（Hb水準ごと５複製）での精度
は0.57％であつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ イオン性界面活性剤の溶液の有効量を含有
   し、約11.3以上のPH値を有している、血液標本中
   のヘモグロビン総濃度測定に用いるシアニドを含
   まない組成物。 ２ 上記PH値がイオン性界面活性剤および／また
   は塩基によりもたらされる、特許請求の範囲第１
   項記載の組成物。 ３ 組成物が少なくとも約13.7のPH値を有する、
   特許請求の範囲第１または２項記載の組成物。 ４ 組成物が水溶液である、特許請求の範囲第１
   または２項記載の組成物。 ５ 塩基が水酸化物である、特許請求の範囲第２
   項記載の組成物。 ６ イオン性界面活性剤がカチオン性界面活性剤
   であり、約11.3以上のPH値を与えるのに充分な程
   度塩基性である、特許請求の範囲第１〜４項のい
   ずれか１項に記載の組成物。 ７ イオン性界面活性剤が、式： ［式中、R₁は、C₁₂〜C₁₈アルキルであり、R₂，
   R₃およびR₄は同一または異なり、それぞれ独立
   して低級アルキルである］ で示されるC₁₂〜C₁₈アルキルアンモニウムヒドロ
   キシドである、特許請求の範囲第６項記載の組成
   物。 ８ イオン性界面活性剤が両性イオン性、カチオ
   ン性またはアニオン性界面活性剤である、特許請
   求の範囲第１〜５項のいずれか１項記載の組成
   物。 ９ 両性イオン性界面活性剤が、式： ［式中、R₁は、C₁₂〜C₁₈アルキルであり、R₂
   およびR₃は、同一または異なり、それぞれ独立
   して低級アルキルである］ で示されるC₁₂〜C₁₈アルキルアミンのＮ−オキシ
   ドである、特許請求の範囲第８項記載の組成物。 １０ カチオン性界面活性剤が、式 ［式中、R₁は、C₁₂〜C₁₈アルキルであり、R₂，
   R₃およびR₄は、独立して水素または低級アルキ
   ルであり、 Ｘはハライドである］ で示されるC₁₂〜C₁₈アルキルアンモニウムハライ
   ドである、特許請求の範囲第８項記載の組成物。 １１ アニオン性界面活性剤が、C₁₂〜C₁₈アルキ
   ル硫酸のアルカリ金属塩である、特許請求の範囲
   第８項記載の組成物。 １２ C₁₂〜C₁₈アルキルが、ラウリル、ミリスチ
   ル、セチルまたはステアリルから選ばれる、特許
   請求の範囲第７，９，１０または１１項記載の組
   成物。 １３ (a) イオン性界面活性剤の溶液の有効量を
   含有し、約11.3以上のPH値を有している、血液
   標本中のヘモグロビン総濃度測定に用いるシア
   ニドを含まない組成物により、血液標本中の赤
   血球を処理して、酸化ヘム生成物を形成せし
   め、 (b) 酸化ヘム生成物の吸収度を測定し、それから
   ヘモグロビン濃度を計算することからなる、血
   液標本中のヘモグロビン総濃度を測定する方
   法。 １４ 特許請求の範囲第１３項の(a)における組成
   物のイオン性界面活性剤が両性イオン性界面活性
   剤であり、(b)が約570nmで反応混合物の吸収を測
   定することからなるか、または イオン性界面活性剤がカチオン性界面活性剤で
   あり、(b)が約594nmで前記吸収を測定することか
   らなる、または イオン性界面活性剤がアニオン性界面活性剤で
   あり、(b)が約594nmで前記吸収を測定することか
   らなる、特許請求の範囲第１３項記載の方法。