JPH0457225B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、液体試料中のアンモニア生成基質を
分析するための一体型多層分析要素に関するもの
である。さらに詳しくは本発明は、血液、尿、リ
ンパ液等の生物体液中に含まれるクレアチニン、
尿素等のアンモニア生成基質を、内因性アンモニ
アの影響を排除して定量分析するのに適した一体
型多層分析要素に関するものである。 ［発明の背景］ 生物体液中に含有されているクレアチニン、尿
素等のアンモニア生成基質の定量分析は、腎臓病
等の疾患の診断、その疾患の経過コントロールの
ための検査および腎機能の検査のために極めて重
要である。 アンモニア生成基質の分析方法の例としては、
アンモニア生成基質からアンモニアを生成させる
操作および生成されたアンモニアを定量する操作
からなる分析方法を代表例として挙げることがで
きる。このアンモニアへの変換を利用する分析方
法は、従来より湿式法または溶液法と呼ばれる方
法で広く一般に実施されてきた。 上記のアンモニア生成基質からアンモニアを生
成させる操作としては、酵素の作用によってアン
モニアを生成させる方法が一般的に用いられてい
る。たとえば生物体液中のクレアチニンの定量分
析においては、クレアチニンデイミナーゼ
（EC3.5.4.21）を用いて体液中のクレアチニンを
特異的にアンモニアとＮ−メチルヒダントインに
加水分解する方法が利用されている。また、生物
体液中の尿素窒素（以下BUNとも記す）の定量
分析においては、ウレアーゼを触媒として用い、
尿素をアンモニアと二酸化炭素に加水分解する方
法が利用されている。 生成したアンモニアを定量する操作としては、
一般にアンモニア定量法として知られている様々
な定量方法が用いられている。たとえば、生成し
たアンモニアをアンモニアイオン選択電極を用い
て定量する方法、あるいは生じたアンモニアでPH
指示薬等を変色させ、その変色の程度を測定する
ことによりアンモニア量を定量する方法等が用い
られている。また、生成したアンモニア（アンモ
ニウムイオン）とα−ケトグルタル酸とをグルタ
ミン酸デヒドロナーゼ（EC1.4.1.3）とNADH（ニ
コチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド還元
型）の存在下でカツプリング反応させてＬ−グル
タミン酸と水とを生成させ、このとき同時に起る
NADHからNAD⁺（ニコチンアミド・アデニン・
ジヌクレオチド酸化型）への変化により生ずる
NAD⁺の生成量またはNADHの減少量を340nｍ
の近紫外光を利用した測定または蛍光測定により
定量する方法も用いられている。なお上記
NADHの代りにNADPH（ニコチンアミド・アデ
ニン・ジヌクレオチド・ホスフエート還元型）を
用いて、NADPHからNADP⁺（ニコチンアミ
ド・アデニン・ジヌクレオチド・ホスフエート酸
化型）への変化により生ずるNADP⁺の生成量ま
たはNADPHの減少量を測定または定量する方
法も用いられている。 上記二段階の操作からなるアンモニア生成基質
の分析方法は、アナリテイカル・ケミストリー
「Analytical Chemistry」、46、246（1974）、クリ
ニカ・キミカ・アクタ「Clinica Chimica
Acta」、18、409（1967）、「臨床化学分析含窒素
成分」第２版（東京、東京化学同人）13〜14頁、
67〜87頁（1979年発行）、「臨床検査」第５巻（第
６号）387〜391頁（1961年）等の文献に記載され
ている。 しかし、分析の対象となる生物体液中には、ア
ンモニウムイオンとして遊離した状態にあるアン
モニア（内因性アンモニア）が含まれていること
が多く、この内因性アンモニアによる誤差を無視
することができない。従つて、アンモニア生成基
質の正確な定量には、内因性アンモニアの影響を
排除する必要があり、既にいくつかの内因性アン
モニアの除去の方法が提案されている。 内因性アンモニアを予め除去する操作を含むア
ンモニア生成基質の分析方法の具体例としては、
特開昭58−5198号公報記載のクレアチニン検体の
ための自動連続流れ法を挙げることができる。こ
の方法は、試料を内因性アンモニア除去のための
試薬（たとえば、グルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ、α−ケトグルタル酸およびNADHからなる
試薬）で反応処理した後、透析器を用いて試料反
応液に未反応のまま含有されているクレアチニン
を透析する操作を、クレアチニンからアンモニア
を生成させる操作の前段階として行なうものであ
る。 また、特開昭59−21398号および特開昭59−
31689号各公報に記載の検体の前処理方法は、内
因性アンモニアにNADPH（またはNADH）、グ
ルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびα−ケトグル
タル酸を反応させて消去する方法において、
NADP還元酵素（またはNAD還元酵素）を用い
ることで、反応の副産物として生成される
NADP⁺（またはNAD⁺）を元のNADPH（または
NADH）に戻してサイクリツクに利用する方法
である。この前処理方法を用いてアンモニア生成
基質の分析を行なう場合には、特開昭59−31696
号、同59−31698号および同59−31700号各公報に
記載の定量方法のように、前記処理を施した検体
に、アンモニア生成基質からアンモニアを生成さ
せる酵素を添加して、発生したアンモニアを、
NADH（またはNADPH）、グルタミン酸デヒド
ロゲナーゼおよびα−ケトグルタル酸からなる試
薬系を用いてアンモニア生成基質の定量を行な
う。 以上の分析方法は、従来より湿式法または溶液
法と呼ばれる方法で実施されてきたもの、あるい
は湿式法を前提として提案されたものである。一
方、臨床検査の領域においては診断に関与する医
師等の医療関係者から、試料が少量ですみ、操作
が簡便であり、短時間で充分な精度を有する結果
が得られる分析方法を求める強い要請がある。こ
れに答える方法として、従来用いられてきた湿式
法の代りに、取り扱い操作の容易な乾式分析方法
の実用化が検討されるようになつている。上記乾
式分析方法を用いたアンモニア生成基質の分析用
具としては、米国特許第3011874号明細書記載の
血中尿素窒素（BUN）定量分析用試験片などが
提案されている。さらに、定量操作がより簡易で
充分な精度を有する一体型の多層分析要素（以
下、分析要素とも記す）を用いる分析方法が開発
され、その改良が進められている。 アンモニア生成基質の分析に用いることができ
る一体型多層分析要素としては、特公昭58−
19062号公報記載の一体型分析要素、特開昭58−
77660号および同58−77661号の各公報記載のアン
モニアまたはアンモニア生成基質分析用一体型多
層分析要素などを挙げることができる。これらの
分析要素は、基本的な構成として、光透過性・液
体不透過性支持体の上に、アンモニアとの接触に
より検知可能な変化を生じる指示薬を含むアンモ
ニア指示薬層、液体を透過させることなくガス状
アンモニアを通過させるバリアー層、アンモニア
生成基質と反応してアンモニアを生成させる試薬
を含有する反応層および多孔性展開層がこの順に
積層されてなるものである。しかし、これらの分
析要素は、前述の体液中に含まれているアンモニ
ア（内因性アンモニア）の影響を排除することが
できない。従つて、これらの分析要素を用いてア
ンモニア生成基質を正確に測定するのは困難であ
つた。 これに対して、前記特開昭58−5198号公報記載
の内因性アンモニアの除去の方法等は、内因性ア
ンモニアの除去試薬および内因性アンモニアとの
生成物を一度反応系外に除去するための透析操作
がなければ使用出来ないものである等、一般に湿
式分析方法に適用されるものであり、乾式の分析
方法である一体型多層分析要素内にそのまま組み
込むことはできない。また前記特開昭59−21398
号公報等に記載の方法では、一度内因性アンモニ
アを反応させて、ブランクのODを測定してか
ら、クレアチニン・デイミナーゼを添加するとい
う煩雑な操作を行なつてから、クレアチニンより
アンモニアを生成させる反応でクレアチニンを測
定する方法である。 ［発明の目的］ 本発明の目的は、アンモニア生成基質分析用一
体型多層分析要素における内因性アンモニアによ
る測定誤差を除去することである。 本発明の他の目的は、煩雑な操作を行なうこと
なく、簡易かつ迅速にクレアチニンまたは尿素窒
素（BUN）等のアンモニア生成基質を高精度に
て定量分析することができる一体型多層分析要素
を提供することである。 ［発明の要旨］ 本発明は、 () 光透過性・液体不透過性支持体； () ガス状アンモニアにより検知可能な変化を
生じる指示薬を含むアンモニア指示薬層； () ガス状アンモニアを通過させる液体透過遮
断層； () アンモニア生成基質と反応してガス状アン
モニアを生成させ得る試薬を含有するアンモニ
ア生成基質反応層； () 内因性アンモニアに作用して内因性アンモ
ニアを実質的に上記反応層に到達しえない状態
に変化させ得る試薬を含有する内因性アンモニ
ア捕捉層； および、 () 多孔性展開層 がこの順に積み重ねられていることを特徴とする
アンモニア生成基質分析用一体型多層分析要素を
提供するものである。 本発明の一体型多層分析要素の機能を損なわな
い限り、本発明の一体型多層分析要素には、公知
の中間層、接着層、光遮蔽層など公知の機能層が
任意に付設されていてもよい。 なお、本発明において「アンモニア生成基質」
とは、特定の試薬と反応してそれ自体からアンモ
ニアを生成するか、あるいは複数個の反応系を経
由してアンモニアを生成するような化合物または
化合物群を意味するものである。 ［発明の効果］ 本発明の一体型多層分析要素は、内因性アンモ
ニアをあらかじめ上層でトラツプ除去し、その後
にクレアチニンあるいは尿素窒素（BUN）等の
アンモニア生成基質を反応層で反応させ生成する
アンモニアを指示薬層で発色させて検出定量する
ものである。従つて本発明の一体型多層分析要素
を用いることにより、内因性アンモチア量の定
量、前処理としての内因性アンモニアの除去ある
いは試料液の透析などの煩雑な操作を行なう必要
がないため、簡便かつ迅速にクレアニンや尿素の
定量が出来る。また、本発明の分析要素は、一体
型であるから操作および取扱いも簡便である。 また、本発明の一体型多層分析要素は、被検成
分（アナライト）であるアンモニア生成基質と、
アンモニア生成基質と反応してアンモニアを生成
させる試薬とを反応させ、生成するアンモニアを
定量することによりアンモニア生成基質を間接的
に定量するものである。従つて本発明の一体型多
層分析要素は、上記のアンモニア生成用の反応試
薬の種類を変えることにより、様々なアンモニア
生成基質の分析用として製造することができる。 ［発明の詳細な記述］ 本発明のアンモニア生成基質分析用一体型多層
分析要は、添付の第１図に模式的に示されている
ように、 () 光透過性・液体不透過性支持体； () ガス状アンモニアにより検知可能な変化を
生じる指示薬を含むアンモニア指示薬層； () ガス状アンモニアを通過させ得る液体透過
遮断層； () アンモニア生成基質と反応してガス状アン
モニアを生成させ得る試薬を含有するアンモニ
ア生成基質反応層； () 内因性アンモニアに作用して内因性アンモ
ニアを実質的に上記反応層に到達しえない状態
に変化させ得る試薬を含有する内因性アンモニ
ア捕捉層； および、 () 多孔性展開層 からなる基本構成を有する。 本発明の一体型多層分析要素を構成する光透過
性・液体不透過性支持体（以下、支持体と記す）
の具体例としては、ポリエチレンテレフタレー
ト、ビスフエノールＡのポリカルボネート、ポリ
スチレン、セルロースエステル（例、セルロース
ジアセテート、セルローストリアセテート、セル
ロースアセテートプロピオネート等）等のポリマ
ーからなる厚さ約50μｍから約１mmの範囲内、好
ましくは約80μｍから約300μｍの範囲内の透明支
持体を挙げることができる。 支持体の表面には必要により下塗層を設けて、
支持体の上に設けられる反応層あるいはその他、
必要に応じて設けられる層（例、吸水層）と支持
体との接着を強固なものにすることができる。ま
た、下塗層の代りに、支持体の表面を物理的ある
いは化学的な活性化処理を施して接着力の向上を
図つてもよい。 支持体の上には、（場合によつては下塗層等の
他の層を介して）本発明の一体型多層分析要素を
構成するガス状アンモニアにより検知可能な変化
を生じる指示薬を含むアモニア指示薬層（以下、
指示薬層と記す）が設けられる。指示薬層には、
少なくとも１種の呈色性アンモニア指示薬が含ま
れる。呈色性アンモニア指示薬とは、ガス状アン
モニアにより検知可能な変化（たとえば、吸収波
長の変化による発色または変色）を生じるような
化合物である。 本発明の一体型多層分析要素に使用することが
できる呈色性アンモニア指示薬としては、たとえ
ば、ロイコシアニン染料、ニトロ置換ロイコ染料
およびロイコフタレイン染料のようなロイコ染料
（米国再発行特許第30267号明細書または特公昭58
−19062号公報記載）；ブロムフエノールブルー、
ブロムクレゾールグリーン、ブロムチモールブル
ー、キノリンブルーおよびロゾール酸のようなPH
指示薬（共立出版(株)、化学大辞典、第10巻63〜65
頁参照）；トリアリールメタン系染料前駆体；ロ
イコベンジリデン色素（特開昭55−397号および
特開昭56−145273号各公報に記載）；ジアゾニウ
ム塩とアゾ染料カプラー；塩基漂白可能染料等を
挙げることができる。 指示薬層は、通常これらの呈色性アンモニア指
示薬の少なくとも一種を、有機溶剤溶解性バイン
ダーポリマーあるいは水溶性バインダーポリマー
と混合して塗布液を調製し、これを透明支持体上
に塗布・乾燥することにより形成する。上記バイ
ンダーポリマーの具体例としては、セルロースモ
ノアセテート、セルロースジアセテート、セルロ
ーストリアセテート、セルロースアセテートブチ
レート、セルロースアセテートプロピオネート等
のセルロースエステル類；メチルセルロース、エ
チルセルロース、プロピルセルロース等のアルキ
ルセルロース類；ポリメチルメタクリレート、ポ
リアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリロニ
トリル、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルブチラー
ル、クロル化ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミ
ド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコー
ル等の合成ビニル重合体またはこれらの共重合体
等を挙げることができる。 バインダーの重量に対する呈色性アンモニア指
示薬の配合量は10〜70重量％の範囲内であること
が好ましい。また製造中あるいは保存中に、呈色
性アンモニア指示薬が発色または変色するのを防
止するために、エタンスルホン酸、アスパラギン
酸、アゼライン酸、グルタル酸、コハク酸、グル
タコン酸、酒石酸、ピメリン酸、マロン酸、リン
ゴ酸、３，３−ジメチルグルタル酸、クエン酸、
ｐ−トルエンスルホン酸、過塩素酸、塩酸などの
有機酸あるいは無機酸などを指示薬層中に加える
ことで、指示薬層のPH値が呈色性アンモニア指示
薬の呈色域のPH値の範囲内となるように調整する
ことができる。 指示薬層を形成する塗布液は、これらの呈色性
アンモニア指示薬、バインダーポリマーおよび必
要に応じて加えられる上記PH調整用の酸等の試薬
類を、アセトン、２−メトキシエタノール、メチ
ルエチルケトン、ジクロロメタン、ジクロロエタ
ン、メタノール、エタノール等の有機溶剤あるい
は水に、固形分濃度が約１〜20重量％、好ましく
は約３〜10重量％となるように加えて調製するこ
とができる。この塗布液を、乾燥後の層厚が通常
は約１〜30μｍの範囲内、好ましくは約２〜20μ
ｍの範囲内となるように、前記支持体上に塗布、
乾燥することにより指示薬層を形成することがで
きる。 指示薬層の上に、ガス状アンモニアを通過させ
得る液体透過遮断層（以下バリアー層とも記す）
を設ける。このバリアー層は、多層分析要素の製
造時（具体的には、後述する反応層をバリアー層
の上に塗布により設ける時）および／または分析
操作時において、塗布液、試料液等の液体および
これらの液体に溶解含有されている妨害成分（例
えば、アルカリ性成分等）を実質的に通過または
透過させず、かつガス状アンモニアが通過できる
物質からなる層であることを意味する。 バリアー層は構造上、二種類の態様に大別され
る。一つの態様は、連続した空隙を有する多孔性
材料からなり、実質的に空気層がバリアー層とし
て作用する空気バリアー層（以下、空気バリアー
層と記す）であり、他の一つの態様は、疎水性
（または親水性の乏しい）ポリマーからなる均質
な非孔質薄層であるポリマーバリアー層（以下、
ポリマーバリアー層と記す）である。 空気バリアー層を構成する連続した空隙を有す
る多孔性材料の例としては、メンブランフイルタ
ー；繊維状材料が相互にからみあわされてなる
か、あるいは接着または結合されてなる多孔性材
料（例、紙、濾紙、フエルト、不織布等）；およ
び織物生地、編物生地または細網状物からなる多
孔性材料を挙げることができる。 空気バリアー層として用いることができるメイ
ンブランフイルターの具体例としては、アセテー
ト（ジアセテートまたはトリアセテート等）、セ
ルロースニトレート、再生セルロース、ポリアミ
ド（ナイロン類）、ビスフエノールＡのポリカル
ボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン等を用
いて製造されているメンブランフイルターを挙げ
ることができる。本発明の一体型多層要素に用い
る場合、上記メンブランフイルターの厚さは、約
30〜300μｍの範囲内、好ましくは約70〜200μｍ
範囲内である。メンブランフイルターの気孔率
は、約25％〜約90％、好ましくは約65％〜約85％
である。また、メンブランフイルターの平均孔径
は約0.01〜20μｍ、好ましくは約0.1〜10μｍの範
囲内である。上記の特性を有するメンブランフイ
ルターは、たとえば米国特許第1421341号明細書、
特公昭53−21677号公報にそれぞれ記載の方法に
より製造することができる。また、メンブランフ
イルターは、既に多くのメーカーから様々な種類
のものが市販されており、これらの市販品の中か
ら必要に応じて選択して用いることもできる。そ
のような市販品の例としては、ミクロフイルター
FM22、FM30、FM45、FM55、FM80、
FM120、FM300、FM500等のFMシリーズおよ
びFRシリーズ（以上商品名、富士写真フイルム
(株)製）、SM11301、SM11103、SM11907、および
SM13604（以上商品名、ザルトリウス社製）、
FALP14200、LSWP14200等のFA、FH、LC、
LSの各シリーズ（以上商品名、ミリポア・コー
ポレーシヨン製）、メンブランフイルターTM、
TM−Ｐ、TM−Ａおよびウルトラフイルター
UH、UK、UP（以上商品名、東洋化学産業(株)
製）、微多孔膜セルポアNW−01、Ｗ−01（以上商
品名、積水化学工業(株)製）などを挙げることがで
きる。 空気バリアー層として用いることができる繊維
状材料が相互にからみあわされてなるか、接着ま
たは結合されてなる多孔性材料は、繊維状材料ま
たはその集合体を物理的にからみあわせるか、物
理的および／または化学的に接着または結合させ
た構成からなる連続した空隙を有する多孔性材料
である。 上記多孔性材料を構成する繊維状材料の具体例
としては、セルロース繊維、綿繊維、麻繊維、絹
繊維、羊毛繊維等の天然繊維性材料、レーヨン繊
維、ビニロン繊維、セルロースアセテート繊維等
の再生または半合成材料からなる繊維、グラスウ
ール、ポリエチレン繊維、ポリエチレンテレフタ
レート繊維、ポリアクリロニトリル繊維状物質お
よびポリ塩化ビニル繊維等の合成材料からなる繊
維状材料、またこれらを混合してなる繊維状材料
を挙げることができる。また、上記繊維状材料を
用いて製造される多孔性材料の例としては、繊維
状材料を抄造することにより製造した半紙、美濃
紙や障子紙の和紙、濾紙、硫酸紙、擬硫酸紙等の
紙および繊維状材料から製造したフエルトおよび
不織布等を挙げることができる。 繊維状材料が相互にからみあわされてなるか、
接着または結合されてなる多孔性材料の空隙率
は、通常約20〜90％の範囲内、好ましくは約50〜
85％の範囲内である。上記多孔性材料の平均空隙
サイズは、通常約0.01〜20μｍの範囲内、好まし
くは約0.1〜10μｍの範囲内である。また上記多孔
性材料の厚さは、通常約50〜500μｍの範囲内、
好ましくは約70〜300μｍの範囲内である。 空気バリアー層として用いることができる織物
の例としては、天然繊維からなる織物（例、綿ブ
ロード等）半合成繊維からなる織物（例、ビスコ
ースレーヨン、銅アンモニアレーヨン、フオルチ
ザン等の再生セルロース繊維からなるブロード織
物等）、合成繊維からなる織物（例、ポリアミド
（ナイロン）、ポリエチレンテレフタレート、ポリ
アクリルニトリル等の繊維からなるブロード織物
等）、天然繊維と半合成繊維または合成繊維との
混紡織物（例、綿繊維とポリエチレンテレフタレ
ート繊維の混紡糸等からなるブロード織物等）を
挙げることができる。空気バリアー層として用い
ることができる織物の例としては、前記織物の製
造に用いることができる繊維と同じ繊維または繊
維の撚り糸からなる編物を挙げることができる。
また、空気バリアー層として用いることができる
細網状物の例としては、合成繊維または糸（例、
ポリアミド（ナイロン）、ポリエチレンテレフタ
レート、ポリアクリロニトリル、ポリエチレン、
ポリプロピレン、ポリビニルクロリド等）からな
る細ネツトまたは細メツシユを挙げることができ
る。以上の織物、編物、細網状物の厚さは、通常
約30〜300μｍの範囲内である。また、織物、編
物、細網状物の空隙率は通常約20％〜約60％、好
ましくは約40％〜約50％である。 以上の連続した空隙を有する多孔性材料からな
る空気バリアー層は、その内部空隙において、液
体、特にアルカリ性材料等の妨害物を溶解含有す
る液体が、毛細管現象にによつてバリアー層を通
過する危険性がある。したがつて、上記毛細管現
象による毛細管流を生じない程度に、空気バリア
ー層は疎水性または撥水性を有していることが好
ましい。また、連続した空隙を有する多孔性材料
の疎水性または撥水性が弱い場合には、疎水化処
理または撥水化処理を施すことが好ましい。上記
多孔性材料の疎水化処理または撥水化処理は、シ
リコーン樹脂、シリコーンオイル、弗素樹脂、弗
素オイルに代表される一般に疎水化処理剤または
撥水化処理剤として公知の材料をそのまま、ある
いは必要により溶剤（例えば、ヘキサン、シクロ
ヘキサン、石油エーテル等）で固形分含有量が約
0.1〜５重量％の範囲内になるように稀釈し、こ
れを含浸、塗布またはスプレー等の方法により、
連続した空隙を有する多孔性材料の少なくとも一
表面およびその近傍に適用することにより実施す
ることができる。 空気バリアー層は、前述した指示薬層のマトリ
ツクスを構成している有機溶剤性バインダーポリ
マーあるいは水溶性バインダーポリマーに、連続
した空隙を有する多孔性材料を接着することで形
成される。上記多孔性材料の接着は、指示薬層が
湿潤状態であるときに、多孔性材料を貼り付け
て、乾燥させることで接着する方法を用いること
ができる。指示薬層が湿潤状態であるとは、バイ
ンダーを溶解している溶媒が残つているか、ある
いは乾燥した膜が可溶性溶媒（有機溶媒がまたは
水）で再び濡らされて、指示薬層のマトリツクス
を構成しているバインダーが膨潤状態、分散状態
または溶液状態にあることを意味する。また、指
示薬層のバインダーが、たとえばポリ酢酸ビニル
のように粘着性を有する場合には、指示薬層を特
に湿潤状態とすることなく、連続した空隙を有す
る多孔性材料を、そのまま指示薬層に圧着するこ
とで接着することができる。 疎水性（または親水性の乏しい）ポリマーから
なる均質な非孔質薄層であるポリマーバリアー層
は、ポリマーとして、疎水性または親水性の乏し
いポリマーを用いることが好ましい。疎水性また
は親水性の乏しいポリマーの具体例としては、セ
ルロース・アセテート・プロピオネート、セルロ
ース・アセテート・ブチレート・ビスフエノール
Ａのポリカルボネート、ポリエチレン、ポリプロ
ピレン、エチレン・酢酸ビニルコポリマー、ポリ
ウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、塩化
ビニル・酢酸ビニルコポリマー、ポリアミド（ナ
イロン）、ポリメチルメタクリレート、およびポ
リビニルブチラールなどを挙げることができる。
これらのポリマーは、単独でも、これらのポリマ
ー相互の混合物としても、用いることができる。 ポリマーバリアー層の厚さは、通常約0.1〜6μ
ｍの範囲内にあり、特に約0.2〜3μｍの範囲内に
あることが好ましい。ポリマーバリアー層は特公
昭58−19062号公報および特開昭60−21452号公報
にそれぞれ記載の方法によりポリマーの有機溶媒
溶液を塗布し乾燥することにより設けることがで
きる。 バリアー層としては分析操作時間の短かさ、高
感度、および指示薬層の発色または変色の一様性
の良好さの観点からメンブランフイルターまたは
撥水処理したメンブランフイルターからなる空気
バリアー層が好ましい。 バリアー層の上に、直接、または後述する粘着
性中間層を介して、アンモニア生成基質と反応し
てガス状アンモニアを生成させる試薬を含有する
反応層（以下単に反応層と記すこともある）を設
ける。反応層は、アンモニア生成基質と反応して
アンモニアを生成させる試薬（一般には、酵素ま
たは酵素を含有する試薬）、反応により生成した
アンモニアをガス状アンモニアとして効率良く遊
離させるためのアルカリ性緩衝剤およびフイルム
形成能を有する親水性ポリマーバインダーを通常
含有する層である。 アンモニア生成基質と反応してアンモニアを生
成させる試薬は酵素、または酵素を含有する試薬
であることが好ましく、アナライトであるアンモ
ニア生成基質の種類に応じて、分析に適した酵素
を選択して用いることができる。上記試薬として
酵素を用いる場合には、その酵素の特異性から、
アンモニア生成基質と試薬の組み合せが決定され
る。アンモニア生成基質／試薬の組合せの具体例
としては、尿素／ウレアーゼ、クレアチニン／ク
レアチニンデイミナーゼ、アミノ酸／アミノ酸デ
ヒドロゲナーゼ、アミノ酸／アミノ酸オキシダー
ゼ、アミノ酸／アンモニアリアーゼ、アミン／ア
ミンオキシダーゼ、ジアミン／アミンオキシダー
ゼ、グルコース及びホスホアミダート／ホスホア
ミダートヘキソースホスホトランスフエラーゼ、
ADP／カルバミン酸塩キナーゼ及び燐酸カルバ
モル、酸アミド／アミドヒドロラーゼ、ヌクレオ
塩基／ヌクレオ塩基デアミナーゼ、ヌクレオシ
ド／ヌクレオシドデアミナーゼ、ヌクレオチド／
ヌクレオチドデアミナーゼ、グアニン／グアナー
ゼ等を挙げることができる。 反応層に用いることができるアルカリ性緩衝剤
としては、PHが7.0から10.5、好ましくは7.5から
10.0の範囲の緩衝剤を用いることができる。緩衝
剤の具体例としては、エチレンジアミンテトラ酢
酸（EDTA）、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン（Tris）、燐酸塩緩衝剤、Ｎ，Ｎ−ビス
（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Bicine）、Ｎ
−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−ア
ミノプロパンスルホン酸（Taps）、Ｎ−２−ヒド
ロキシエチルピペラジン−N′−２−ヒドロキシ
プロパン−３−スルホン酸（Heppso）、Ｎ−２−
ヒドロキシエチルピペラジン−N′−３−プロパ
ンスルホン酸（Epps）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒド
ロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、
３−［Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）アミノ］−２
−ヒドロキシプロパンスルホン酸（Dipso）、Ｎ
−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−エタンス
ルホン酸（Hepes）、ピペラジン−Ｎ，N′−ビス
（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）２水和物
（Popso）、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）
メチルアミノ］−２−ヒドロシプロパンスルホン
酸（Tapso）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）
メチルアミノエタンスルホン酸（Tes）、Ｎ−［２
−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキメチル）
エチル］グリシン（Tricine）等またはこれらの
リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアル
カリ金属塩、またはアルカリ土類金属塩等を挙げ
ることができる。上記緩衝剤の詳細は、バイオケ
ミストリー「Biochemistry」５巻467〜477頁
（1966年）、アナリテイカルバイオケミストリー
「Analytical Biochememtry」104巻、300〜310
頁（1980年）、日本化学会編「化学便覧基礎編」
（東京、丸善(株)1966年発行）1312−1320頁等に記
載されている。 反応層に用いることができるフイルム形成能を
有する親水性ポリマーバインダーとしては、前述
の指示薬層に用いることができる水溶液バインダ
ーポリマーのうち親水性を有するポリマーから適
宜に選択して用いることができる。その他、反応
層に用いることができる親水性ポリマーとして
は、ゼラチン、ゼラチン誘導体、アガロース、プ
ルラン、プルラン誘導体、ポリビニルアルコー
ル、ポリアクリルアミド等を挙げることができ
る。これのポリマーのうちでは、ゼラチンまたは
ゼラチン誘導体を用いるのが一般的には好まし
い。 反応層には、アンモニア生成基質と反応してア
ンモニアを生成させる試薬、アルカリ性緩衝剤お
よびフイルム形成能を有する親水性ポリマーバイ
ンダー以外にも、必要に応じて、湿潤剤、バイン
ダー架橋剤（硬化剤）、安定剤、重金属イオント
ラツプ剤（錯化剤）等を含有させることができ
る。重金属イオントラツプ剤は、酵素活性を阻害
するような重金属イオンをマスキングするために
使用されるものである。重金属イオントラツプ剤
の具体例としては、EDTA・2Na、EDTA・
4Na、ニトリロトリ酢酸（NTA）、ジエチレント
リアミンペンタ酢酸のようなコンプレクサン
（complexane）を挙げることができる。 反応層は、アンモニア生成基質と反応してアン
モニアを生成させる試薬、アルカリ性緩衝剤およ
び必要に応じて加えられる上記の試薬類を、フイ
ルム形成能を有するゼラチン等の親水性バインダ
ーと混合して塗布液とし、バリアー層または粘着
性中間層の上に塗布、乾燥することにより形成す
ることができる。 反応層に含まれるアンモニア生成基質と反応し
てアンモニアを生成させる試薬の量は、バインダ
ーの重量に対して通常約0.1〜50重量％、好まし
くは約２〜20％の範囲内である。アルカリ性緩衝
剤の使用量は、バインダーの重量に対して0.1〜
10重量％の範囲内であるのが適当である。また、
重金属イオントラツプ剤を使用する場合、その使
用量は、バインダーの重量に対して約0.5〜20％
の範囲内であるのが適当である。この反応層の乾
燥層厚は通常１〜20μｍの範囲内、好ましくは３
〜10μｍの範囲内である。 バリアー層と反応層の間に設けることができる
粘着性中間層は、湿度10％〜85％、通常の環境温
度（約０℃から約40℃）の大気中で粘着性を示す
ポリマー組成物からなる層である。上記粘着性中
間層は、特願昭58−128759号明細書に記載の素材
および方法に従つて設けることができる。粘着性
中間層を構成するポリマー組成物は、ガラス転移
点（Tg）が０℃以下の公知のポリマーの単一物
または二種以上の混合物、またはそれに必要に応
じて公知の粘着付与剤（タツキフアイアー）や界
面活性剤などを添加した混合物である。粘着性中
間層の厚さは、通常約0.1〜6μｍの範囲内、好ま
しくは約１〜4μｍの範囲内である。 粘着性中間層に用いることができるポリマーの
具体例としては、酢酸ビニル・ブチルアクリレー
トコポリマー、ポリ（エチルアクリレート）、ス
チレン・ブチルアクリレート・アクリル酸・Ｎ−
（ヒドロキシメチル）アクリルアミド四元コポリ
マー、ブチルアクリレート・（アセト酢酸エチル）
メタクリレート・２−アクリルアミド−２−メチ
ルプロパンスルホン酸三元コポリマー等を挙げる
ことができる。 バリアー層が疎水性（または親水性に乏しい）
ポリマーの均質な非孔質薄層からなるポリマーバ
リアー層の場合には、粘着性中間層を設けること
が好ましい。 反応層の上に直接、または後述する光遮蔽層ま
たは他の中間層を介して、内因性アンモニアに作
用して内因性アンモニアを実質的に前記反応層に
到達しえない状態に変化させる試薬を含む内因性
アンモニア捕捉層（以下、単に内因性アンモニア
捕捉層と記す）を設ける。内因性アンモニア捕捉
層は、アナライト（被検成分）であるクレアチニ
ンまたは尿素窒素等のアンモニア生成基質が反応
層に到達してアンモニアが生成する反応が生起す
るに先だつて、併存する内因性アンモニアを捕捉
する機能を有する層である。 内因性アンモニアを捕捉するとは、内因性アン
モニア捕捉層に含有される試薬系が内因性アンモ
ニアと結合して内因性アンモニアを分析操作時間
内に実質的に解離することができない状態にする
か、または内因性アンモニア捕捉層に含有される
試薬系が内因性アンモニアと化学反応を起こし
て、内因性アンモニアを他の化学物質（具体的に
は、アンモニウム塩、アンモニウムイオンあるい
はガス状アンモニアとは異なる化学物質）に変化
させることにより内因性アンモニアを内因性アン
モニア捕捉層内に固定して、実質的に反応層に到
達させないことを意味する。内因性アンモニア捕
捉層としては、後者の内因性アンモニアと反応し
て固定する機能を有する試薬系を含有することが
好ましい。内因性アンモニアと化学反応を起こし
て、内因性アンモニアを異なる他の化学物質に変
化させる試薬系を本明細書では内因性アンモニア
捕捉試薬という。 内因性アンモニア捕捉試薬としては、アンモニ
アを基質として他の材料に変化させる触媒能を有
する酵素を含む試薬組成物を用いるのが好まし
い。内因性アンモニア捕捉試薬の具体例として
は、NADH（ニコチンアミド・アデニン・ジヌク
レオチド還元型）および／またはNADPH（ニコ
チンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・ホスフ
エート還元型）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
（EC1.4.1.3；以下、GLDHと記す）およびα−ケ
トグルタル酸（またはその塩；以下、α−KGと
記す）を含む試薬組成物を挙げることができる。
またアスパルターゼ（EC4.3.1.1）とフマル酸ま
たはフマル酸塩を含む試薬組成物を用いてもよ
い。本発明の一体型多層分析要素においては、
NADH、GLDHおよびα−KGを含む試薬組成物
を内因性アンモニア捕捉試薬として用いることが
好ましい。また、GLDHを含む試薬組成物また
はアスパルターゼを含む試薬組成物を用いる場合
には、内因性アンモニア捕捉層のPH値を通常8.5
以下、好ましくは7.0から8.5の範囲内に維持でき
るように、適当な緩衝剤を用いることが好まし
い。 内因性アンモニア捕捉試薬に用いることができ
る。前述のPH値を維持する緩衝剤としては、日本
化学会編「化学便覧基礎編」（東京、丸善(株)、
1966年発行）1312−1320頁に記載の緩衝剤、ノー
マン・イー・グツド外（Norman E.Good et
al）著、バイオケミストリー［Biochemistry］、
５(2)、467−477（1966）、ハイドロジエン・イオ
ン・バツフアー・フオア・バイオロジカル・リサ
ーチ、［Hydrogen Ion Buffers for Biological
Research］記載の緩衝剤、アール・エム・シ
ー・ドーソン外（R.M.C.Dawson et al）編のデ
ータ・フオア・バイオケミカル・リサーチ
［Date for Biochemical Research］第２版（オ
ツクスフオード・アト・ザ・クラレンドン・プレ
ス）（Oxford at the Clarendon Press 1969年発
行）476−508頁、アナリテイカル・バイオケミス
トリー［Analytical Biochemistry］、104、300
−310（1980）に記載の緩衝剤等を挙げることがで
きる。また、特公昭57−28277号公報記載の一体
型多層分析要素に用いられる有機酸類またはその
アルカリ金属（またはアルカリ土類金属）塩類、
特開昭59−143959号および特開昭60−10171号各
公報に記載の一体型多層分析要素に用いられる塩
基性ポリマー、酸性ポリマー、酸性ポリマーのア
ルカリ金属（またはアルカリ土類金属）塩類な
ど、およびこれらの混合物等も上記緩衝剤として
用いることができる。 これらのPH緩衝剤のうちで、特に好ましい緩衝
剤の具体例としては、燐酸水素二ナトリウムと３
−モルホリノプロパンスルホン酸（MOPS、
CAS Reg.No［1132−61−２］）と水酸化ナトリ
ウムの組合せ、燐酸二水素カリウムと燐酸水素二
ナトリウムの組合せ、燐酸水素二ナトリウムとク
エン酸の組合せ、ホウ酸と塩化ナトリウムとホウ
砂の組合せ、燐酸二水素カリウムと四ホウ酸ナト
リウムの組合せ等を挙げることができる。 内因性アンモニア捕捉層は、上記内因性アンモ
ニア捕捉試薬やPH緩衝剤等の試薬類およびフイル
ム形成能を有する親水性ポリマーバインダーから
なる層である。上記親水性ポリマーバインダーと
しては、前述の反応層に用いることができるとし
て挙げた親水性ポリマーバインダーと同じものを
用いることができる。これらのポリマーのうちで
は、ゼラチンまたはゼラチン誘導体を用いるのが
一般的には好ましい。 内因性アンモニア捕捉層の層厚は通常は約１〜
20μｍ、好ましくは約２〜10μｍである。 本発明の分析要素の特徴的構成要素である内因
性アンモニア捕捉層は、NADPHまたはNADH、
α−ケトグルタル酸（α−KG）、およびグルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼ（GLDH）を含有する
ことが好ましい。これらの各成分の特に好ましい
含有量（内因性アンモニア捕捉層１m²当り）およ
びその基準値を次に記す。 【表】 従つて内因性アンモニア捕捉層は、NADPH
および／またはNADHを80mg／m²以上含有する
ことが好ましい。また内因性アンモニア捕捉層
は、α−ケトグルタル酸を400mg／m²以上含有す
ることも好ましい。さらに内因性アンモニア捕捉
層は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼを2000ユニ
ツト／m²以上含有することも好ましい。 なお、内因性アンモニア捕捉層がアスパルター
ゼとフマル酸（フマル酸塩であつてもよい）を含
有する場合の、それぞれの好ましい含有量の範囲
は、アスパルターゼ1000ユニツト／m²以上、フマ
ル酸（および／またはフマル酸塩）200mg／m²以
上である。 バリアー層と内因性アンモニア捕捉層の間に設
けることができる光遮蔽層は、光遮蔽性、または
光遮蔽性と光反射性とを兼ね備えた微粒子または
微粉末（以下、単に微粒子と記す）が、少量の被
膜形成能を有する親水性（または弱親水性）のポ
リマーバインダーに分散保持されている水透過性
または水浸透性の層である。光遮蔽層は、指示薬
層にて発生した検出可能な変化（色変化、発色緩
衝剤等）を支持体側から反射測光する際に、後述
する多孔性展開層に点着供給された水性液体試料
の色、特に全血の場合のヘモグロビンによる赤色
等を遮蔽するとともに光反射層および背景層とし
ても機能する。 光遮蔽性と光反射性とを兼ね備えた微粒子の例
としては、二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微
粒子、アルミニウム微粒子または微小フレーク等
を挙げることができる。また、光遮蔽性微粒子の
例としては、カーボンブラツク、ガスブラツク、
カーボンミクロビーズ等を挙げることができる。
これらのうちでは、特に二酸化チタン微粉末、硫
酸バリウム微粉末が好ましい。 被膜形成能を有する親水性（または弱親水性）
ポリマーバインダーの例としてはゼラチン（例、
酸処理ゼラチン、脱イオン化ゼラチン等）、ゼラ
チン誘導体（例、フタル化ゼラチン、ヒドロキシ
メチルアクリレートグラフト化ゼラチン等）、ポ
リビニルアルコール、再生セルロース、セルロー
スアセテート（例、セルロースジアセテート）等
を挙げることができる。これらのうちではゼラチ
ン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好
ましい。なお、ゼラチン、ゼラチン誘導体は公知
の硬化剤（架橋剤）を混合して用いることができ
る。 光遮蔽層に含有させる光遮蔽性微粒子ポリマー
バインダー（乾燥時）との比は、体積比で通常光
遮蔽性微粒子10に対しポリマーバインダー（乾燥
体積）約2.5から約7.5の範囲、好ましくは約3.0か
ら約6.5の範囲である。光遮蔽性微粒子が二酸化
チタン微粒子の場合には、重量比で二酸化チタン
微粒子10に対しポリマーバインダー（乾燥重量）
約0.6から約1.8の範囲、好ましくは約0.8から約
1.5の範囲である。光遮蔽層の乾燥層厚は、通常
3μｍから30μｍの範囲内、好ましくは約5μｍから
約20μｍの範囲内である。 光遮蔽層は、光遮蔽微粒子と親水性ポリマーの
水性分散液（必要に応じて界面活性剤等の試薬類
を含有させることができる）を公知の方法により
バリアー層に上に塗布し乾燥することにより設け
ることができる。また光遮蔽層は、バリアー層と
内因性アンモニア捕捉層の間に設ける代りに、内
因性アンモニア捕捉層と後述する多孔性展開層の
間に設けてもよい。あるいは、光遮蔽層を設ける
代りに、内因性アンモニア捕捉層中あるいは後述
する多孔性展開層中に光遮蔽層の成分を含有させ
てもよい。 なお、内因性アンモニア捕捉層の上に、場合に
よつては光遮蔽層等の層を介して、後述する多孔
性展開層を接着し積層するために、接着層を設け
てもよい。 接着層は水で湿潤しているとき、または水を含
んで膨潤しているときに多孔性展開層を接着する
ことができ、これにより各層を一体化できるよう
な親水性ポリマーからなることが好ましい。接着
層の製造に用いることができる親水性ポリマーの
例としては、反応層の製造に用いられる親水性ポ
リマーがあげられる。これらのうちではゼラチ
ン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好
ましい。接着層の乾燥層厚は一般に約0.5μｍから
約20μｍ、好ましくは約1μｍから約10μｍの範囲
である。接着層は上記親水性ポリマーと、必要に
よつて加えられる界面活性剤等を含む水溶液を、
塗布する等の公知の方法により設けることができ
る。 これらの層の上に、多孔性展開層（以下、展開
層とす）が設けられる。この展開層は、液体試料
計量作用を有していることが好ましい。液体試料
計量作用を有する展開層とは、その上側の表面
（支持体から遠い側の表面）に点着供給された水
性液体試料を、その中に含有している成分を実質
的に偏在させることなしに、急速に横方向に円形
に広げ、反応層に水性液体試料が単位面積当りほ
ぼ一定容量の割合で供給する作用を有する層であ
る。 以上の点から本発明の展開層のマトリツクスを
構成する材料としては、濾紙、不織布、織物生
地、編物生地、ガラス繊維濾紙、ブラツシユポリ
マーより形成されるメンブランフイルターあるい
はポリマーミクロビーズ等からなる三次元格子状
構造物層等を用いることが好ましい。 展開層のマトリツクスは、これらの材料から分
析条件等に応じて選択するが、全血など分析を阻
害する非溶解性物質（全血の場合は血球）を含む
試料を用いる場合には、阻害物質を除去する作用
を有する織物生地または編物生地を用いることが
好ましい。 上記展開層に用いることができる織物生地（織
布）としては特開昭55−164356号および特開昭57
−66359号の各公報に記載の広範囲の種類の織物
生地が挙げられる。織物生地のうちでは、たて
（経）糸とよこ（緯）糸とで織つた平織物が好ま
しく、平織物のうちでは細布生地、金巾生地、ブ
ロード生地、ポプリン生地等が好ましい。織物生
地を構成する糸としては後述する編物生地を構成
する糸と同様の素材からなる糸が挙げられ、糸の
形態としてはフイラメント糸、紡績糸（加捻糸）
のいずれをも用いることができ、これらのうちで
は紡績糸が好ましい。織物生地の糸の太さは綿紡
績糸番手で表わして約20Sから約150S、好ましく
は約40Sから約120S相当の範囲、または絹糸デニ
ールで表して約35Dから約300D、好ましくは約
45から約130D相当の範囲、織物生地の厚さは約
100μｍから約500μｍ、好ましくは約120μｍから
約350μｍの範囲、織物生地の有する空隙率は約
40％から約90％、好ましくは約50％から約85％の
範囲である。 また、上記展開層に用いることができる編物生
地（編布、すなわち編んだ布状物）としては、広
範囲の種類の編物生地があげられ、それらのうち
ではたて（経）メリヤスとよこ（緯）メリヤスが
好ましい。たてメリヤスとしては、一重アトラス
編生地、トリコツト編生地、ダブルトリコツト編
生地、ミラニーズ編生地、ラツシエル編生地、等
を用いることができ、よこメリヤスとしては、平
編生地、パール編生地、ゴム編生地、両面編生地
等を用いることができる。編物生地を編成する糸
としては、綿、絹、羊毛等の天然繊維の糸、ビス
コースレーヨン、キユプラ等の再生セルロース、
セルロースジアセテート、セルローストリアセテ
ート等の半合成有機ポリマー、ポリアミド（各種
のナイロン類）、アセタール化ポリビニルアルコ
ール（ビニロン等）、ポリアクリロニトリル、ポ
リエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリ
プロピレン、ポリウレタン等の合成有機ポリマー
の細繊維からなる糸または単繊維からなる糸、天
然繊維と再生セルロース、半合成または合成有機
ポリマー繊維との混合繊維からなる糸があげられ
る。糸の形態としては、フイラメント糸、紡績糸
（加捻糸）のいずれをも用いることができ、これ
らのうちでは紡績糸が好ましい。編物生地の糸の
太さは、綿紡績糸番手で表わして約40Sから約
150S、好ましくは約60Sから約120S相当の範囲、
または絹糸デニールで表わして約35Dから約
130D、好ましくは約45Dから約90D相当の範囲で
ある。編物生地の編成工程時のゲージ数として
は、約20から約50の範囲、編物生地の厚さは、約
100μｍから約600μｍ、好ましくは約150μｍから
約40μｍの範囲、編物生地の有する空隙率は、約
40％から約90％、好ましくは約50％から約85％の
範囲である。たてメリヤスのうちでは縦方向の伸
縮が少なく、編物からなる展開層の積層工程にお
ける操作のしやすさ、裁断時の編目ほどけのなさ
等の観点でトリコツト編生地、ラツセル編生地、
ミラニーズ編生地、ダブルトリコツト編生地が好
ましい。 多孔性展開層に用いられる織物または編物生地
は水洗等の脱脂処理により少なくとも糸製造時、
織物製造時あるいは編物編成時に供給または付着
した油脂類を実質的に除去した織物または編物生
地であるが、さらにその織物または編物生地は特
開昭57−66359号公報に開示の物理的活性化処理
（好ましくはグロー放電処理またはコロナ放電処
理等）を生地の少なくとも片面に施すか、あるい
は特開昭55−164356号、特開昭57−66359号公報
等に開示の親水性ポリマー含浸処理等の親水化処
理、またはこれら処理工程を逐次実施することに
より織物または編物を親水化し、下側（支持体に
近い側）の層との接着力を強化することができ
る。 織物または編物生地からなる展開層を内因性ア
ンモニア捕捉層、光遮蔽層、または接着層に接着
積層するには、特開昭55−164356号および特開昭
57−66359号各公報などに開示の方法に従つて作
成することができる。すなわち、反応層または接
着層の塗布後、未乾燥のうちに、または乾燥後の
層に水（または界面活性剤を少量含む水）を実質
的に均一に供給して層を膨潤させ、ついで織物ま
たは編物生地を湿潤または膨潤している層の上に
実質的に均一に軽く圧力をかけながら接着、積層
し一体化する。 また展開層が、ブラツシユポリマーまたはメン
ブランフイルターからなる場合には特公昭53−
21677号公報等、ポリマーミクロビーズからなる
三次元格子状構造物層である場合には特開昭55−
90859号公報等、濾紙または不織布からなる場合
には特開昭57−148250号公報等にそれぞれ記載の
方法に従つて設けることができる。 展開層を積層する内因性アンモニア捕捉層、光
遮蔽層、または接着層の親水性ポリマーバインダ
ーがゼラチンまたはゼラチン誘導体の場合には、
層の塗布後、ゼラチン（誘導体）が未乾燥のゲル
状態の間に上記多孔性展開層を構成する材料（織
物または編物生地等）を接着、積層し一体化する
方法を採用することができる。 また多孔性展開層として、定面積多孔性層を用
いてもよい。定面積多孔性層は、実開昭57−
42951号公報、特開昭57−208998号公報等に記載
の素材および方法を用いて設けることができる。 また本発明における展開層には、光遮蔽性微粒
子や界面活性剤等の試薬を必要に応じて含有させ
ることができる。 本発明の一体型多層分析要素を用いてアンモニ
ア生成性物質を測定するには、展開層上に試薬液
５〜30μ程度を点着し、必要により30〜40℃好
ましくは35〜39℃で、１〜20分、好ましくは２〜
10分程度インキユベーシヨンを行つた後、支持体
側から指示薬層の色変化（発色、変色または退
色）の程度を反射測光するか、標準色と視覚的に
比較すればよい。 次に実施例をあげて本発明を具体的に説明する
が、本発明がこれらに限定されるものでないこと
はいうまでもない。 実施例 １ 透明ポリエチレンテレフタレート（PET）フ
イルム（厚さ180μｍ）の上にアンモニア指示薬
層（乾燥層厚：4μｍ）を塗布、乾燥することに
より形成した。次に、撥水性が付与されたメンブ
ランフイルター（商品名：富士ミクロフイルター
FM120（富士写真フイルム(株)製）：厚さ140μｍ、
空孔率約75％、平均孔径1.2μｍを撥水性シリコー
ン樹脂のヘキサン溶液に浸漬後、乾燥することに
より撥水性を付与したもの）をアンモニア指示薬
層（乾燥状態においても接着性を有している）に
はりつけ接着することによりバリアー層を形成し
た。 次いで、バリアー層上に反応層（乾燥層厚：
8μｍ）、光遮蔽層（乾燥層厚：5μｍ）、内因性ア
ンモニア捕捉層（乾燥層厚：5μｍ）および接着
層（乾燥層厚：5μｍ）を順次塗布、乾燥するこ
とにより形成した。 さらに、乾燥状態にある上記各層を塗布した面
を水で膨潤させ、その上に展開層として、布（コ
ツトンブロード100番）を圧着ラミネートして接
着しクレアチニン定量検出用の一体型多層分析要
素を作製した。 なおアンモニア指示薬層、反応層、光遮蔽層、
内因性アンモニア捕捉層および接着層の形成に用
いられる塗布液の組成と調製法は、それぞれ以下
に示すものである。（組成物の量は、各層１m²当
りの塗布量である） アンモニア指示薬層塗布液 ブロムフエノールブルー 0.7ｇ エタノール−水 20ml ポリ酢酸ビニル・アクリル酸エステル共重合体ラ
テツクスバインダー（固形物含有量約50％PH4.5）
15ｇ ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル
0.15ｇ 水 40ｇ 以上の組成からなる塗布液を、クエン酸でPH
2.60に調整した。 反応層塗布液 ゼラチン 15ｇ 水 128ｇ ｐ−ノニルフエノキシポリグリシドール 0.3ｇ エチレンジアミンテトラ酢酸四ナトリウム 0.3ｇ オルト燐酸二ナトリウム塩 0.2ｇ Taps［（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル
−３−アミノプロパンスルホン酸］ ３ｇ Tris［（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン）］ ３ｇ クレアチニンイミノヒドラーゼ 3500ユニツト 以上の組成からなる塗布液を、水酸化ナトリウ
ムでPH9.2に調整した。 光遮蔽層塗布液 二酸化チタン微粉末 ４ｇ ゼラチン ４ｇ ｐ−ノニルフエノキシポリグリシドール 0.2ｇ 水 42ｇ 内因性アンモニア捕捉層塗布液 ゼラチン ５ｇ 水 40ｇ ｐ−ノニルフエノキシポリグリシドール 0.2ｇ α−ケトグリタル酸 800mg NADPH 160mg グルタミン酸デヒドロゲナーゼ 7500ユニツト オルト燐酸一カリウム塩 0.3ｇ 以上の組成からなる塗布液を、Na₂B₄O₇でPH
8.0に調整した。 接着層塗布液 ゼラチン ５ｇ 水 60ｇ ｐ−ノニルフエノキシポリグリシドール 0.2ｇ 比較例 １ 内因性アンモニア捕捉層を形成しなかつた以外
は、実施例１と同様な操作を行ない比較用の分析
要素を作成した。 以上のようにして得られた本発明の分析要素お
よび比較用の分析要素を下記の方法で評価および
比較を行なつた。 ７％アルブミン水溶液（ブランク）、アンモニ
ア窒素として硫酸アンモニウムを400μｇ／dl含
む７％アルブミン水溶液及びクレアチニンを１、
４、８及び20mg／dl含む７％アルブミン水溶液を
調製した。さらに硫酸アンモニウムを400μｇ／
dlとクレアチニンをそれぞれ１、４、８及び20
mg／dl含む７％アルブミン水溶液も調製した。こ
れらの溶液を10μずつ実施例１及び比較例１の
分析要素の展開層上に点着し、37℃で６分間イン
キユベーシヨンを行つた後、発色濃度を600nｍ
の光で反射測光した。結果を下記の第１表に示
す。なお第１表におけるNH₄ ⁺は、硫酸アンモニ
ウムを意味する。 【表】 以上の結果で明らかなように、内因性アンモニ
ア捕捉層のない比較例１の分析要素では内因性の
アンモニアの影響を受けるが、内因性アンモニア
捕捉層を有する実施例１の分析要素ではその影響
を受けないことがわかる。（NH₄ ⁺400μｇ／dlの
列を参照） 実施例 ２ 透明ポリエチレンテレフタレート（PET）フ
イルム（厚さ180μｍ）の上にアンモニア指示薬
層（乾燥層厚：4μｍ）を塗布、乾燥することに
より形成した。次に、撥水性が付与されたメンブ
ランフイルター（富士ミクロフイルター
FM300：厚さ140μｍ、空孔率約75％、平均孔径
1.2μｍ；撥水性シリコーン樹脂のヘキサン溶液に
浸漬後、乾燥することにより撥水性を付与した）
を指示薬層（乾燥状態においても接着性を有して
いる）にはりつけ接着することによりバリアー層
を形成した。 次いで、バリアー層上に反応層（乾燥層厚：
8μｍ）、光遮蔽層（乾燥層厚：5μｍ）、内因性ア
ンモニア捕捉層（乾燥層厚：5μｍ）および接着
層（乾燥層：5μｍ）を順次塗布、乾燥すること
により形成した。 さらに、乾燥状態にある上記各層を塗布した面
を水で膨潤させ、その上に展開層として、布（コ
ツトンブロード100番）を圧着ラミネートして接
着しクレアチニン定量検出用の一体型多層分析要
素を作製した。 なお指示薬層、反応層、光遮蔽層、内因性アン
モニア捕捉層および接着層の形成に用いられる塗
布液の組成と調製法は、それぞれ以下に示すもの
である。（組成物の量は、各層１m²当りの塗布量
である） 指示薬層塗布液 ブロムフエノールブルー 0.7ｇ エタノール−水 7.5ml ポリ酢酸ビニル・アクリル酸エステル共重合体ラ
テツクスバインダー（固形物含有量約50％PH4.5）
15ｇ ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル
0.15ｇ 水 40ｇ 以上の組成からなる塗布液を、クエン酸でPH
2.60に調整した。 反応層塗布液 ゼラチン 15ｇ 水 128ｇ ｐ−ノニルフエノキシポリグリシドール 0.3ｇ エチレンジアミンテトラ酢酸四ナトリウム塩
0.3ｇ オルト燐酸二ナトリウム塩 0.2ｇ Taps ３ｇ Tris ３ｇ クレアチニンイミノヒドラーゼ 4400ユニツト 以上の組成からなる塗布液を、水酸化ナトリウ
ムでPH9.5に調整した。 光遮蔽層塗布液 二酸化チタン微粉末 ４ｇ ゼラチン ６ｇ ｐ−ノニルフエノキシポリグリシドール 0.2ｇ 水 60ｇ 内因性アンモニア捕捉層塗布液 ゼラチン ５ｇ 水 40ｇ ｐ−ノニルフエノキシポリグリシドールα−ケト
グルタル酸 800mg NADH 160mg グルタミン酸デヒドロゲナーゼ 7500ユニツト オルト燐酸二カリウム塩 0.1ｇ MOPS［３−（Ｎ−モリホリノ）プロパンスルホ
ン酸］ 0.5ｇ 以上の組成からなる塗布液を、NaOHでPH8.0
に調整した。 接着層塗布液 ゼラチン ５ｇ 水 60ｇ ｐ−ノニルフエノキシポリグリシドール 0.2ｇ 比較例 ２ 内因性アンモニア捕捉層を形成しなかつた以外
は、実施例２と同様な操作を行ない比較用の分析
要素を作成した。 以上のようにして得られた本発明の分析要素お
よび比較用の分析要素を、実施例１および比較例
１と同様の方法で、評価および比較を行なつた。
結果を下記の第２表に示す。 【表】 以上の結果で明らかなように、内因性アンモニ
ア捕捉層のない比較例２の分析要素では内因性の
アンモニアの影響を受けるが、内因性アンモニア
捕捉層を有する実施例２の分析要素ではその影響
を受けないことがわかる。（NH₄ ⁺200μｇ／dlの
列を参照）

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のアンモニア生成基質分析用
一体型多層分析要素の基本構成を示す模式図であ
る。 ：光透過性・液体不透過性支持体、：アン
モニア指示薬層、：液体透過遮断層、：アン
モニア生成基質反応層、：内因性アンモニア捕
捉層、：多孔性展開層。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ () 光透過性・液体不透過性支持体； () ガス状アンモニアにより検知可能な変化を
   生じる指示薬を含むアンモニア指示薬層； () ガス状アンモニアを通過させ得る液体透過
   遮断層； () アンモニア生成基質と反応してガス状アン
   モニアを生成させ得る試薬を含有するアンモニ
   ア生成基質反応層； () 内因性アンモニアに作用して内因性アンモ
   ニアを実質的に上記反応層に到達しえない状態
   に変化させ得る試薬を含有する内因性アンモニ
   ア捕捉層； および、 () 多孔性展開層 がこの順に積み重ねられていることを特徴とする
   アンモニア生成基質分析用一体型多層分析要素。 ２ 前記内因性アンモニア捕捉層が、NADHお
   よび／またはNADPH、α−ケトグルタル酸お
   よびグルタミン酸デヒドロゲナーゼを含有し、か
   つ該補捉層のPH値が7.0〜8.5の範囲内にあること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の一体型
   多層分析要素。 ３ 前記内因性アンモニア捕捉層がNADHおよ
   び／またはNADPHを80mg／m²以上、α−ケト
   グルタル酸を400mg／m²以上、およびグルタミン
   酸デヒドロゲナーゼを2000ユニツト／m²以上含有
   することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の一体型多層分析要素。 ４ 前記内因性アンモニア捕捉層がアスパルター
   ゼおよびフマル酸を含有し、かつ該層のPH値が
   7.0〜8.5の範囲内にあることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の一体型多層分析要素。 ５ 前記反応層がクレアチニンと反応してアンモ
   ニアを生成させる酵素を含有し、クレアチニン分
   析用であることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項乃至４項のいずれかの項記載の一体型多層分析
   要素。