JPH0458155A - 免疫学的測定用ｂｆ分離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒトまたは動物の体液中の各ａ物質を抗原抗
体反応を利用して測定する場合に使用される免疫学的測
定用ＢＦ分離法に関する。

（従来の技術と発明か解決しようとする課！＆ｉ）血液
や尿等の体液中に存在するホルモン、癌細胞に由来する
物質、病原性微生物に由来する物質、自己抗体、あるい
は病原性微生物に対する抗体等を検出、測定する場合、
抗原に抗体か結合する抗原抗体反応か利用される。この
抗原抗体反応を利用した測定方法（以下免疫測定法と略
す）において、ＢＦ分離（Ｂは抗体または抗原に結合し
た抗原または抗体、Ｆは非結合であるフリーの抗原また
は抗体）が必要な方法としては。

（１）酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｗｉｅ　ｆｗｕｎｏａ
ｓｓａｙ−Ｅ　ＩＡ） （２）放射免疫測定法（Ｒａｄｉｏ　Ｉｍｍｕｎｏａｓ
ｓａｙ　−ＲＩＡ） （３）蛍光免疫測定法（Ｆｌｕｏｒｏ　Ｉｍｍｕｎｏａ
ｓｓａｙ−Ｆ　ＩＡ） （４）時間分解蛍光免疫測定法（Ｔｉｍｅ　Ｒｅ５ｏｌ
ｖｅｄＦｌｕｏｒｏ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ−Ｔ　Ｒ
−Ｆ　Ｉ　Ａ　）などかある。

前記酵素免疫測定法は、第９図にサンドイッチＥＩＡ法
について示すように、固相ｌ（なお、この固相は１図示
のような容器状をなすプレートと称されるもの、あるい
はビーズ状をなすもの、またはチューブ状をなすものか
ある）の表面に予め測定すべき抗原（抗体である場合も
ある）２に対応する抗体（抗原である場合もある）３を
結合しておき、抗原２と、酵素Ｅて標識した抗体３Ａを
入れると、液４内で図示のような抗体３−抗原２−抗体
３Ａからなるサイドイッチ状の抗原抗体複合体か形成さ
れ、その後液４を洗い流し、抗原２の量に対応している
酵素Ｅの量を比色法により測定する方法である。すなわ
ち、固相ｌに結合している抗体３Ａと反応する抗原２の
量は、液４中の抗原２の含有量に比例することに鑑み、
この抗原２の量を酵素Ｅの量として測定する方法である
。なお、この酵素Ｅの琶の測定は、液４を流出し、固相
１を洗浄した後、酵素Ｅにより発色または脱色する物質
（基質）を含む液をプレートに加え、吸光度の変化を測
定することにより行なう。

前記放射免疫測音法は、前記酵素Ｅの代わりに、標識物
質として放射性元素を用い、抗原の量を、液流出後の放
射性元素の量から測定する方法てあり、蛍光免疫測定法
は、酵素Ｅの代わりに蛍光物質を用い、抗原の量を、液
流出後の蛍光物質の光量から測定する方法である。

この従来の測定方法には次のような問題点かあった・ （１）予め抗体くまたは抗原）３を固相ｌに結合してい
るので、抗体（または抗原）３か不安定である場合に、
期間の経過による抗体、抗原の失活あるいは保存の場合
の安定性に問題かあフた。

（２）予め、測定すべき抗原（または抗体）２にそれぞ
れ対応する抗体（または抗ＦＫ）３を結合した固相ｌを
用意しなければならず、数百種類もある抗原または抗体
ごとに異なる固相１を用意することは５製造上あるいは
管理上煩雑となり、製造原価の１昇を招くことにもなる
。

（３）ミクロ的に見て、固相ｌに結合している抗体（ま
たは抗原）３に液４中の抗原（または抗体）２か近接し
なければ抗原抗体反応か起こらず、いわば固相反応であ
るから、反応速度が遅く、測定に時間がかかる。

上記（２）または（３）の問題点を解決する方法として
、アとシンとビオチンを用いたＢＦ分離法が［日本産科
婦人科学会雑誌ＡＣＴＡ　０ＢＳＴ　ＧＹＮＡＥＣＪＰ
Ｎ　　Ｖｏｌ、３［ｉ　　Ｎｏ、５　　Ｐ７６３〜Ｐ７
７０］において報告されている。これは、８１０図に示
すように、固相１にアビジンＡを結合しておき、予め別
の試験管内てビオチンＢ標識抗原２と、酵素Ｅ標識抗体
３とを反応させた後、固相内にその液を加えると、アビ
ジンＡとビオチンＢか結合し、ビオチンＢ標識抗体２と
酵素で標識した抗体３の複合体か固相に結合することを
利用した分離法である。なお、この方法をサンドイッチ
ＲＩＡ法に適用し、固相としてビーズを用いた方法も報
告されている［核医学：２７巻２号（１９９０）　Ｐ１
５５〜Ｐ１６：ｌコ。

このように、固相１にアジピンＡを結合させる方法によ
ると、時間経過によるアビジンＡの失活あるいは保存の
場合の安定性に問題がある。

本発明は、上記問題点に鑑み、期間の経過による失活の
おそれがなく、製造、管理あるいは測定の迅速化の面で
も有利となるＢＦ分離法を提供することを目的とする。

（課題を解決するための手段） 本発明によるＢＦ分離法は、上記目的を達成するため、
ＢＦ分離用固相に予めビオチン（その類似物質、誘導体
を含む）を結合させておき、該固相に、測定時、アビジ
ン（その類似物質を含む）を介して、ビオチン（その類
似物質、誘導体を含む）を標識した抗原もしくは抗体を
結合させることを特徴とする。

第１図は本発明の測定原理を説明する図であり、予めビ
オチンＢを固相工に結合しておき、これに、ビオチンＢ
で標識した抗体３（２は抗体３と複合体を形成している
抗原である）をアビジンＡを介して結合する。また、第
２図に示すように、固相ｌに結合したビオチンＢに、ビ
オチンＢで標識した抗原２（３は抗原２と複合体を形成
している抗体である）をアビジンＡを介して結合する。

なお、ビオチン、アビジンの代わりにそれぞれこれらの
類似物質あるいは誘導体を用いることができる。具体的
には例えばビオチンの代わりに、その誘導体である２−
イミノ−ビオチン（２−１ｍ１ｎ−ｏｂｉｏｔｉｎ）　
、ビオシチン（ｂｉｏｃｙｔｉｎ）、ビスノルビオチン
（ｂｉｓｎｏｒｂｉｏｔｉｎ）、テトラノルビオチン（
ｔｅｔ−ｏｒａｎｏｒｂｉｏｔｉｎ）、デスチオビオチ
ン（ｄｅｓｔｉｏｂｉｏｔｉｎ）、オキシビオチン（ｏ
ｘｙｂｉｏｔｉｎ　）等のビオチン関連物質を用いるこ
とかでき、また、アビジンの類似物質として、例えばス
トレプトアビジン（放線菌から得られるアビジンに類似
した物質）を用いることかてきる。

（作用） アビジンは、ビオチンとの結合部を４個所有しており、
このことを利用し、本発明は、予め固相にビオチンを結
合させておき、このビオチンにアビジンを介して、ビオ
チン等で標識した抗原または抗体を結合させる。ビオチ
ンは安定な物質であり、期間経過による失活は少ない。

また、アビジンはビオチンと極めて高い親和性を有して
おり（解離定数＝１０−Ｉ５Ｍ）、抗原−抗体よりも極
めて強固な結合力を持つ複合体を形成する。また、本発
明においては、抗原抗体反応は液層て起こる。

（実施例１） 第３図は本発明を［サンドイッチＥＩＡ］へ応用した場
合の測定原理説明図てあり、ビオチンＢを結合させた固
相（プレートのウェル）ｌにアビジンＡ、抗ｊＫ２、ビ
オチンＢ標識抗体３および酵素Ｅ標識抗体３Ａを加え、
洗浄後、固相面に残った酵素量を測定する。すなわち、
抗原２をサンドイッチのように挟んて結合する２つの抗
体３．３Ａのうち、一方の抗体３をビオチンＢて標識し
ておき、このビオチン標識抗体３のビオチンＢを、アビ
ジンＡを介して、固相ｌに予め結合しているビオチンＢ
に結合させることにより、抗原２と抗体３Ａとの複合体
を固相に固定する方法であるこの実施例１の具体的な実
験を、ヒト血清アルブミンの測定について行なった結果
について述べる。ＥＩＡ用のプレートのウェルに、ビオ
チン標識ウシ血清アルブミン２０　ｇｇ／ｍｌを２００
ｇ＋加え、室温で２時間反応させ、ビオチン標識ウシ血
清アルブミンを結合させた後、洗浄液でプレートを洗い
ビオチン結合プレートを作製した。続いて下記の試薬を
加えて室温にて２時間反応させた。

試薬１（抗原）：ヒト血清アルブミン５０ＪＬ１（０〜
　１　０　０　０　　ｎｇ／ｍｌ）試薬２（ビオチン標
識抗体）：ビオチン標識抗ヒト血清アルブミン抗体５０
ＪＬ＋（２０終ｇ／■１）試薬３（酵素標識抗体）：ベ
ルオキシターゼ標識抗ヒト血清アルブミン抗体５０　Ｉ
Ｌｌ（５ｕ−ｇ／曹■）試薬４（アビジン）：アビジン
５０　ｇ＋（１０ＩＬｇ／■１） 反応終了後、ベルオキシターゼ基質液二０．２５１ｇ／
璽ＩオＪレトフェニレンシアミン・２ＨＣｌ−０，０１
５％Ｈ２０２０，１１ＭＮａｚ　ＨＰＯ，−０，０４４
Ｍクエン酸（ＰＨ５，４）２００ＩＬｌを加え、室温て
３０分反応させた後、波長４９２ｎｍにおける吸光度を
測定し、検量線を作製した。第４図の方法ｌはその検量
線であり、アルブミン濃度と吸光度との明瞭な相関関係
が得られ、本方法か利用可能であることか確認できた。

また、第４図には前記４種類の試薬を加える手順を変え
て得られた検量線を比較して示す。ｆＪＳ４図において
、方法１〜方法４はそれぞれ次の手順で試薬を加えたも
のである。

方法ｌ：前述のように試薬１〜４を同時に加える。

方法２：試薬１〜３を加え、２時間反応後、試薬４を加
えて１時間反応 方法３．試薬４を加え、１時間反応後、試薬１〜３を加
えて２時間反応 方法４：試薬ｌ、３．４を加え２時間反応後、試薬２を
加え、１時間反応 第４図に示すように、試薬を加える手順によって抗原濃
度と吸光度（抗原の固相への付着量）との関係に変化は
あるが、いずれの方法によっても、抗原濃度と固相への
付着量との関係に相関関係か得られた。

また、前記方法２において２加えるアビジン（試薬４）
の至適濃度についても検討を加えた。

すなわち、アビジンの濃度を０．５ＪＬｇ／ｍｌ、２゜
０川ｇ／ｌ、ｌｏｇｇ／賜１．５０延ｇ／ｍｌと変化さ
せ。

検量線の変動を検討した。その結果を第５図に示す。

第５図から分かるように、アビジンの濃度について、あ
る程度の濃度までは濃度の増加に伴なって吸光度が増大
するか、ある程度以上の濃度になるとかえって吸光度か
減少し、至適な濃度か存在することか判明した。

さらに至適な濃度と応用可能な濃度を決定する検討を行
なった。前記方法２において、ヒト血清アルラミン濃度
を５０　ｎｇ／ｍｌ　、ベルオキシターゼ標識ヒト血清
アルブミン抗体濃度を５ｇｇ／鱈と一定としておき、ビ
オチン標識抗ヒト血清アルブミン濃度か１ルｇ／鳳ｌ、
２ＪＬｇ／層１．　５ｋｇ／■１．１０ｇｇ／ｍｌ、２
０ｕＬｇ／■１の各濃度において、アビジン濃度を０〜
２０００μｇ／ｍｌの範囲で変化させ、吸光度の変動を
検討した結果、第６図のグラフか得られた。第６図から
分かるように、ビオチン標識抗ヒト血清アルブミン抗体
濃度に依存して、最も至適なアビジン濃度は変化するか
、その応用可能な範囲は、アビジンを加えない場合の吸
光度との差か生しる０、５ｇｇ／＋＊ｌ〜２０００ＩＬ
ｇ／■ｌてあった。なお、この濃度は当然のことなから
、固相に結合しであるビオチンの量、ビオチン標識抗ヒ
ト血清アルブミン量およびこれにｊＷｊ１１シであるビ
オチン量、アビジン溶液の用量、反応溶液の総量等に影
響される。従って、応用可能なアビジン濃度は上記要因
と相関関係かあるものと考えられる。

（実施例２） 第７図は本発明を［競合法ＥＴＡ］へ応用した場合の測
定原理図であり、固相ｌにビオチンＢを結合させておき
、これにアビジンＡ、抗＃、　２　、ビオチンＢ標識抗
原２Ａおよび酵素Ｅ標識抗体３Ａを加え、ウェル固相面
にアビジンＡを介して抗原２Ａ抗体３Ａ複合体を固定さ
せ、洗浄後、固相面に残った酵素量（活性）を測定する
。

この実施例２の具体的な実験例を前記同様にヒト血清ア
ルブミンの測定について行なった結果について述べる。

前記実施例１と同様の方法で作製したビオチン結合ウェ
ルに下記の試薬１〜３を加えて室温にて２時間反応させ
た。

試薬１（抗原）：ヒト血清アルブミン５０＃１（０〜１
０００　ｐｇ／ｍｌ） 試薬２（ビオチン標識抗原）：ビオチン標識ヒト血清ア
ルブミン５０鉢１（５牌ｇ／■ｌ）試薬３（酵素標識抗
体）；ベルオキシターゼ標識抗ヒト血清アルブミン抗体
５０　ｇ　Ｉ（５ｇｇ／■ｌ）試薬４（アビジン）：ア
ビジン５０川１（１０ｇｇ／■ｌ） 続いて試薬４（アビジン）を加え、固相面に抗原抗体複
合体を結合させ、洗浄後、実験例１と同一の操作を行な
い、酵素量（活性）を測定し、検量線を作製した。その
結果を第８図に示す。この実験例においては、試薬２、
すなわちビオチン標識抗原２Ａの濃度は一定で、抗原２
の濃度が変わるが、抗原２の濃度か大であるほど、試薬
３（酵素Ｅ標識抗体３Ａ）とビオチン標識抗原２Ａとの
結合数か減少するため、抗原２の濃度が大であるほど固
相に結合する酵素Ｅ標識抗体３Ａの結合量も減少するこ
とになる。第８図の検量線はこのことを裏づけでおり、
本方法が利用できることか確認てきた。

［反応速度の比較］ また、従来法と本発明の方法との反応速度を比較するた
め、競合法ＥＩＡで同し抗！ｌＸ濃度について次のよう
な比較実験を行なった。

（従来法） ＥＩＡ用プレートのウェルにヒト血清アルブミン溶液（
５終ｇ／ｌ）を５０ＪＬ１加え、室温で２時間反応させ
、洗浄を行なうことにより、ヒト血清アルフミンを結合
させ、抗原結合プレートを作製した。

続いてヒト血清アルブミン（ＯＩＬｇＩ厘１〜２５０μ
ｇ／■１）を５０ｋｌ、ベルオキシターゼ標識抗ヒト血
清アルブミン抗体（１０ｇｇ／ｍｌ）を５０ｇ１をそれ
ぞれ加え、反応時間を０．５時間、１時間、２時間、４
時間と変え、洗浄後、前記実施例１と同じ操作を行ない
、酵素量（活性）を測定した。

（本発明） ビオチンを結合させであるウェルに、ヒト血清アＪレブ
ミン溶液（ＯｕＬｇ／ｍｌ〜２５０　ｇ　ｇ／ｍｌ）を
５０．１．ベルオキシターゼ標識抗ヒト血清アルブミン
抗体（１０ｕｇ／■１）を５０ｇ＋、ビオチン標識ヒト
血清アルブミン（５ｐｇ／ｍｌ）を５０ルＩそれぞれ加
え、反応時間を０．５時間、１時間、２時間、４時間と
変えて反応させた後、アビジン（１０ｇｇ／ｍｌ）を５
０７ｚｌ加えて１時間反応させた。そして洗浄後、前記
実施例１と同じ操作を行ない、酵素量（活性）を測定し
た。

第９図はこのような比較実験による結果を示しており１
本発明による場合は、０．５時間の反応時間で吸光度が
４時間反応の場合とほぼ同じとなり、約３０分以下の反
応時間ですむが、従来法によれば、４時間反応後でも反
応が終了に至っておらず１本発明による場合の方が従来
法による場合よりはるかに速く反応か進行することか分
かる。

従来法によれば、このように反応が遅いため、反応時間
を一定時間に設定して測定を行なっていたが、温度の影
響を受けやすい。一方本発明による場合は、温度の影響
が少なくなり、時間管理も鮎密にする必要かない。

［安定性の比較］ 競合法ＥＩＡにおけるヒト血清アルブミンの測定につい
て、第１Ｏ図で説明した従来法と、ＷＳｉ２図て説明し
た公知の方法と、前記実施例の方法におけるそれぞれの
安定性の比較を、ヒト血清アルブミンの測定について行
った。

抗体３を予め固相に結合してお〈従来法については、前
記反応速度の比較で行なった方法で試薬を調製した。

第１１図の方法については、ＥＩＡ用のプレートのウェ
ルに、実施例１と同様の方法てアビジン（２０ＩＬｇ／
腸Ｉ）を２００μ！加え、室温で２時間反応させ、アビ
ジンＤを結合させた後、洗浄液てプレートを洗い、アジ
ピン結合プレートを作製した。

アビジン結合プレートを室温で２時間乾燥後、作製時、
作製７日間、作製３０日間室温で放置した。別の試験管
内で下記の試薬１〜３を４時間反応させた後、その２０
０弘１をアビジン結合プレートに加え、１時間反応させ
、洗浄後、実施例１と同一の方法で酵素量を測定した。

試薬ｌ（抗原）：ヒト血清アルブミン１００！＋（０〜
２５０　終ｇｅｍ＋　） 試薬２（ビオチン標識抗ＩＸ）　：ビオチン標識ヒト血
清アルブミン１００弘１（５ＪＬｇ／鳳ｌ）試薬３（酵
素標識抗体）：ベルオキシターゼ標識抗ヒト血清アルブ
ミン抗体２００ｇ１（２，５ｇｇ／膳１） また、実施例１と同様に作製したビオチン結合プレート
と実施例２と同様に作製した抗原結合プレートを２作製
時、作製後７日間、作製後３０日間室温で放置し、実施
例２と同一の操作を行ない、反応時間４時間において、
酵素量（活性）を測定した。

第１２図（Ａ）〜ＣＣ）は、それぞれ、抗体結合プレー
ト、アビジン結合プレート、本実施例の各場合における
時間経過による安定性の比較実験結果を示す。アビジン
結合プレートと、抗原結合プレートは時間経過により吸
光度の低下か認められ、アビジン、抗原（ヒト血清アル
ブミン）のような蛋白質は固相面での安定性に問題かあ
ることか判明した。ビオチンは第１３図の構造式で示さ
れる低分子量の化合物であり、安定性の面て優れている
ことが確認できた。

以上の説明は、ＥＩＡ法について行なったか、本発明は
、前記ＲＩＡ、ＦＩＡ、ＴＲ−ＦＩＡ等、標識を放射性
物質や蛍光物質により行なう場合にも適用しうろことは
、上記の説明から明白である。

（発明の効果） 本発明は、予めビオチンを固相に結合させておく方法で
あり、ビオチンは有機化合物であるため、タンパク質等
のように温度、酵素等の影響による分解作用を受けに〈
〈、比較的安定であり、安定性の面で有利である。

また、固相に直接結合されるものはビオチンであり、こ
れにアビジンを介してビオチン標識抗原または抗体か結
合されるので、固相として用意するものはビオチンを結
合した共通のものてあり、従来のように、抗原あるいは
抗体の種類毎に固相を用意する必要かないため、製造ラ
インか単純化され、製造原価が低減され、管理も容易と
なる。

また、本発明においては、抗原抗体反応は液層で起こる
ため、反応速度か速くなり測定時間が短縮される。また
、従来法のように１時間を設定して測定する場合のよう
な温度や時間の相違による影響を受けにくく、測定精度
を向上させることができ、かつ時間管理がラフてすむた
め、測定が容易となる。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は本発明の測定原理図、第３図は本
発明をサンドイッチＥＩＡに応用した場合の測定原理図
、第４図はサンドイッチＥＩＡに関する該実施例におい
て、試薬を加える手順を変えた場合における検量線の変
化を示す図、第５図は該実施例においてアビジンの量を
変えた場合ノ検量線の変化を示す図、第６図は本実施例
での種々の抗体濃度におけるアビジン濃度と吸光度との
関係図、第７図は本発明を競合法ＥＩＡに応用した場合
の原理説明図、第８図は該ＥＩＡを応用した本発明の実
施例における検量線を示す図、第９図は従来法と本発明
の方法による場合の測定結果の比較図、第１０図は従来
法の測定原理図、第１１図はアビジン使用の公知の測定
方法の原理図、第１２図（Ａ）〜（Ｃ）は前記従来方法
、公知の方法および本発明による方法の安定性について
の比較図、第１３図はビオチンの構造式である。 Ａ：アビジン、Ｂ：ビオチン、Ｅ：酵素、■：固相、２
．２Ａ：抗原、３．３Ａ：抗体

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＢＦ分離用固相に予めビオチン（その類似物質、誘
   導体を含む）を結合させておき、該固相に、測定時、ア
   ビジン（その類似物質を含む）を介して、ビオチン（そ
   の類似物質、誘導体を含む）を標識した抗原もしくは抗
   体を結合させることを特徴とする免疫学的測定用ＢＦ分
   離法。 ２、請求項１において、前記アビジン濃度が０．５μｇ
   ／ｍｌ〜２０００μｇ／ｍｌであることを特徴とする免
   疫学的測定用ＢＦ分離法。