JPH0458957B2 - - Google Patents
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- JPH0458957B2 JPH0458957B2 JP63163779A JP16377988A JPH0458957B2 JP H0458957 B2 JPH0458957 B2 JP H0458957B2 JP 63163779 A JP63163779 A JP 63163779A JP 16377988 A JP16377988 A JP 16377988A JP H0458957 B2 JPH0458957 B2 JP H0458957B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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Description
【発明の詳細な説明】
(イ) 産業上の利用分野
本発明は高度好熱菌由来の耐熱性トリプトフア
ン合成酵素遺伝子及び該遺伝子をマーカーとする
高度好熱菌プラスミドベクターに関するものであ
る。 トリプトフアン合成酵素はインドールとセリン
より必須アミノ酸であるトリプトフアンを合成す
る酵素であり、その遺伝子はトリプトフアンの安
価な製造に利用することができる。また、プラス
ミドベクターは高度好熱菌を遺伝子操作により育
種改良するのに用いることができる。 (ロ) 従来の技術及び問題点 摂氏75℃以上という高い温度で生育できる高度
好熱菌は、その生産する生体高分子が熱に対して
安定であるばかりでなく化学試薬や有機溶媒にも
耐性が高い。そのため、高度好熱菌を用いての高
温での発酵生産やその酵素あるいは菌体を固定化
するバイオリアクターが検討されている。これら
を効率よく行うためには高度好熱菌を育種改良す
る必要がある。遺伝子操作は現在最も有力な育種
改良手段であるが、高度好熱菌には薬剤耐性プラ
スミドがない等の理由により、プラスミドベクタ
ーがなく遺伝子操作を行うことができなかつた。 発明者は、すでにグラム陰性の高度好熱菌の代
表種であるサーマス・サーモフイラス
（Thermus thermophilus）HB27株において、遺
伝子DNAの導入法である形質転換法の開発（特
開昭60−188076）をしているほか、同菌より、ト
リプトフアン合成酵素遺伝子を含む3.1Kbの
DNA断片を分離している（特願昭62−297129）。
上記のDNA断片をサーマス属細菌のクリプテイ
ツクスプラスミドに連結して選択マーカー遺伝子
として利用することを検討したが、同DNA断片
は、宿主のサーマス・サーモフイラスHB27株中
では染色体DNAと高顆度に組換えを起こし、染
色体DNAに組み込まれてしまうため、選択マー
カーとして使用できず、ベクタープラスミドを作
成できなかつた。 (ハ) 問題点を解決するための手段 本発明者は各種サーマス属細菌について研究を
行つた結果、サーマス・サーモフイラスHB27株
の中において染色体DNAとほとんど組換えを起
こさない耐熱性トリプトフアン合成酵素遺伝子を
含むDNA断片をサーマス・アクアテイカス
（Thermus aquaticua）T2株（ATCC27737）よ
り取り出すことに初めて成功した。 さらに同DNA断片を大腸菌プラスミドベクタ
ーpUC13と共に選択マーカーを持たないクリプ
テイツクプラスミドpTT8（サーマス・サーモフ
イラスHB8株由来）に連結することにより、サ
ーマス属細菌において初めて選択マーカーをもつ
プラスミドベクターを創製するに至つた。 すなわち、本発明は高度好熱菌サーマス・アク
アテイカスT2株の耐熱性トリプトフアン合成酵
素の遺伝情報を有し、第１図に示されるような制
限酵素切断地図により特徴付けられる3.1Kbの長
さのDNA断片及びそれをクリプテイツクプラス
ミドpTT8に連結することにより作成した新規な
サーマス属細菌プラスミドベクターpYK105に関
するものである。 以下、本発明を詳細に説明する。 サーマス・サーモフイラスHB27株の染色体
DNAと組換えを起こしにくい耐熱性トリプトフ
アン合成酵素遺伝子は同菌と類縁性の低いサーマ
ス属細菌より分離することができる。 サーマス・アクアテイカスT2株
（ATCC27737）は分類学的にサーマス・サーモフ
イラスHB27株とは遠縁であることが知られてい
る。実際にT2株の染色体DNAを用いて、HB27
株のトリプトフアン合成酵素遺伝子変異株を形質
転換すると、Trp+への形質転換効率が低く、
HB27野生株染色体DNAを用いた時の５千分の
１以下の効率しか示さない。このことは、T2株
のトリプトフアン合成酵素遺伝子付近のDNA塩
基配列とHB27株のDNA塩基配列とではホモロ
ジーが低いため組換えを起こしにくいことを意味
する。 T2株のトリプトフアン合成酵素遺伝子はすで
に分離してあるサーマス・サーモフイラスHB27
株の同遺伝子をプローブとしてコロニーハイブリ
ダイゼーシヨンにより分離した。ハイブリダイゼ
ーシヨンは条件を緩くすることにより、ホモロジ
ーの低いクローンも分離が可能である。 クローニングは第２図に示すスキームにより行
つた。 先ず、プローブDNAの作成について説明する。
サーマス・サーモフイラスHB27株のトリプトフ
アン合成酵素遺伝子はエシエリシア・コリJM83
（pKA21）株（FERM Ｐ−9685）の保持する
pKA21プラスミド上にクローニングされており、
同遺伝子は第２図右上の制限酵素地図上に示され
た位置に存在している。そこでこのプラスミドを
制限酵素SacIで消化後、アガロースゲル電気泳
動し、その1.8KbのDNA断片を切り出した後、
泳動溶出することによりtrpB遺伝子を含むより
DNA断片を分離した。このDNA断片をマルチプ
ライムラベリング法によりα−32Ｐ−dCTPで標
識して下記のコロニーハイブリダイゼーシヨンの
プローブとした。 次にサーマス・アクアテイカスT2株の染色体
DNAライブラリーの作成とコロニーハイブリダ
イゼーシヨンについて説明する。 サーマス・アクアテイカスT2株の染色体DNA
はフエノール法などの常法により分離精製するこ
とができる。T2株を培養集菌後、リゾチーム溶
液を加え一定時間保温する。SDS溶液を加え溶菌
させた後、フエノールを加えDNAを抽出する。
DNAをエタノール沈殿により回収した後、
RNaseで処理し、染色体DNAを得る。 染色体DNAは制御酵素MboIで部分消化した
後、その４〜10KbのDNA断片を泳動溶出により
分離する。このDNA断片と制限酵素BamHIで消
化後ホスフアターゼ処理したpUC13プラスミド
DNAとをT4DNAリガーゼを用いて連結する。 上記の方法で得られた組換えDNAを用いて大
腸菌MC1061株を０℃で塩化カルシウム処理する
ことにより形質転換する。アンピシリンを含む寒
天栄養培地に塗布し形質転換体のコロニーを得
る。 これらのコロニーを前記の標識したプローブを
用いてコロニーハイブリダイゼーシヨン法により
スクリーニングを行い、ポジテイブクローンを選
択した。 上記のようにして得られた形質転換体エシエリ
シア・コリMC1061（pKA207）株を微生物工業技
術研究所に寄託した（受託番号 FERM BP−
1924）。この株よりプラスミドDNAを調製し、簡
単な制限酵素地図を作成した（第３図上段）。
pKA207は6.8Kbの挿入DNAを持つている。 トリプトフアン合成酵素遺伝子本体は約2Kbの
大きさであるので、pKA207プラスミド上のトリ
プトフアン合成酵素遺伝子の位置を推定するため
に、公知のtacプロモーターをもつプラスミド
pTTQ18にサブクローニングを行つた。 pKA207の挿入DNAのうち第３図上段の制限
酵素地図で最も左にあるBglサイトより左側の
3.1Kbの長さのDNA断片をサブクローニングす
るために、pKA207DNAをBgl，PstIで消化後
アガロースゲル電気泳動し、3.1KbのDNA断片
を切り出し、泳動溶出によりDNAを回収した。
BamHI，PstIで消化したpTTQ18DNAと回収し
たDNAとをT4DNAリガーゼにより連結後、大
腸菌MV1184株を形質転換した。上記のようにし
てエシエリシア・コリMV1184（pKA208）株を
分離し、この株よりpKA208プラスミドDNAを
調製した。 pKA208プラスミドはプラスミドベクターのプ
ロモーターに対する挿入DNAの向きがpKA207
とは逆になつている（第３図下段）。 pKA208の挿入DNAは、詳しい制限酵素解析
の結果、第１図の制限酵素地図によつて示され、
ClaI，EcoRI，EcoRV，HpaI，MluI，PstI，
Pvu，SalI，SphI，XbaIの制限酵素で切断さ
れない3.1Kbの長さのDNA断片であることが明
らかになつた。 本DNA断片は発明者がサーマス・アクアテイ
カスT2株より初めて分離したものであり、先に
分離したサーマス・サーモフイラスHB27株由来
のトリプトフアン合成酵素遺伝子を含むDNA断
片とは、BamHI，Hind，NcoI，Pvu，など
の制限酵素による切断に違いがあり、明らかに異
なるDNA断片である。 pKA208プラスミドの挿入DNA上にトリプト
フアン合成酵素遺伝子がのつていることは、大腸
菌中での酵素活性の発現により確認した。 pKA208プラスミドを保持する大腸菌MV1184
（pKA208）株をイソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトシド（IPTG）を含む栄養培地で培養集菌
後、緩衝液に懸濁し超音波処理により菌を破壊し
た。遠心分離後の上清をさらに80℃で熱処理して
大腸菌由来の酵素を失活させ、その遠心分離上清
を分取した。この上清を粗酵素液として
Yanofskyらの方法（Methods in Enzymology，
Vo５，P794（1962）に記載されている）によ
り70℃という高い温度でのトリプトフアン合成酵
素活性を測定した。その結果、高い温度での活性
が検出され、pKA208プラスミドの挿入DNA上
にトリプトフアン合成酵素遺伝子がのつており、
かつ大腸菌においてサーマス菌の耐熱性トリプト
フアン合成酵素が産生されていることが確認され
た。 上記のようにサーマス・サーモフイラスHB27
株の染色体DNAと組換えをほとんど起こさない
サーマス・アクアテイカスT2株のトリプトフア
ン合成酵素遺伝子のDNA断片がクローニングさ
れたので、サーマス・サーモフイラスHB27株の
トリプトフアン合成酵素遺伝子変異株を宿主とし
た場合に選択可能にプラスミドベクターを作成し
た。 第４図のスキームに示すように、pKA207を制
限酵素Bglで消化したものと、サーマス・サー
モフイラスHB8株（ATCC27634）由来の選択マ
ーカーをもたないクリプテイツクプラスミド
pTT8をBglで消化したものとを混合し、
T4DNAリガーゼで連結した。このDNAにより
サーマス・サーモフイラスHB27株トリプトフア
ン合成酵素変異株（トリプトフアン要求株）を形
質転換した。形質転換はサーマス属細菌が自然形
質転換能を持つていることを利用し、培養液に
DNAを加え一時間培養することにより行つた。
トリプトフアンを含まないサーマス属細菌の最小
培地に塗布した後、70℃で２日間培養すると、ト
リプトフアンを要求しなくなつた形質転換体サー
マス・サーモフイラスHB27trp-（pYK105）が得
られた。 形質転換体より分離されたプラスミドpYK105
は第４図下段に示される構造をしている。
pUC13プラスミドを持つているので、サーマス
だけでなく大腸菌においても複製できるシヤトル
ベクターであり、形質転換体の選択は大腸菌の場
合アンピシリン耐性で、好熱菌サーマス・サーモ
フイラスHB27trp-ではトリプトフアン要求性の
相補により選択できる。pYK105はサーマス属細
菌で初めて作られた選択が可能なプラスミドベク
ターである。 以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明
する。 実施例 (1) pKA21プラスミドの調製 サーマス・サーモフイラスHB27株（FERM
Ｐ−7502）のトリプトフアン合成酵素遺伝子をプ
ラスミドpKA21上にクローニングしたエシエリ
シア・コリJM83（pKA21）株［微生物工業技術
研究所寄託菌株 FERM Ｐ−9685］をアンピシ
リン（100μｇ／ml）を含む2TY培地（デイフ
コ・トリプトン16ｇ，イーストエキス10ｇ，
NaCl ５ｇを純水１に含む）200ml中で37℃で
培養後集菌し、25mM Tris−Cl（PH８）−
10mMEDTA−50mMグルコース−0.5％リゾチ
ームの溶液４mlに懸濁し、37℃で５分間放置し
た。これに10mlの0.2N NaOH−１％SDSを加
え、０℃で10分間放置した後7.5mlの5M酢酸カリ
ウム（PH4.8）を加え、０℃で10分間放置後、遠
心分離し、上清を得た。上清にPEG6000を終濃
度10％になるように加え、０℃で２時間放置後、
遠心してDNAを沈殿させた。これを５mlのTE緩
衝液（10mM Tris−Cl，1mM EDTA，PH7.5）
に溶かした後、エチジウムブロマイド−塩化セシ
ウム平衡密度匂配遠心にかけプラスミドDNAを
得た。以下、プラスミドの調製はすべてこの方法
で行つた。 (2) pKA21よりプローブDANの調製 pKA21より、各種菌株間でホモロジーの高い
trpB部分を切り出すために(1)で得た
pKA21DNA5μｇを制限酵素Sacl，20unitにより
消化後、40mM Tris−20mM酢酸−2mM
EDTA−0.7％アガロース中で電気泳動を行い、
1.85KbDNAのバンドを切り出し、さらにアガロ
ースから泳動溶出によりDNAを回収した。 上記のDNA25ngをランダムプライマーDNA
ラベリングキツト（宝酒造製）を用いてα−32Ｐ
−dCTPにより標識し、放射性DNAプロープを
作成した。 (3) サーマス・アクアテイカスT2株の染色体
DNAの調製と制限酵素による切断 サーマス・アクアテイカス（Thermus
aquaticus）T2株（ATCC27737）を２のサー
マス培地（デイフコ・イーストエキストラクト２
ｇ，ポリペプトン（大五栄養）４ｇ，Nacl1ｇを
純水１に含み、PHを7.5に調整したもの）に接
種し、対数増殖期の終わり近くで集菌し、約６ｇ
の湿菌体を得る。これをリゾチーム12mgを溶かし
た６mlの0.15M NaCl−0.1M EDTA（PH８）に
懸濁し、37℃で20分間保温後、エタノール・ドラ
イアイスの溶媒中に入れてすみやかに凍らせる。
50mlの0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH９）−１％SDS
−0.1M NaClを加え、攪拌後、上記緩衝液で飽
和させたフエノールを56ml加え、４℃で振盪後、
遠心し、上層を分取する。これに２容の冷エタノ
ールを加えて核酸画分を糸状沈殿として回収し、
20mlの0.1×SSC（SSC＝0.15M NaCl−0.015Mク
エン酸ナトリウム）に溶かしたあと２mlの10×
SSCを加え、粗DNA溶液を得る。次にRNase
Ａ（シグマ社製），RNase T1（シグマ社製）をそ
れぞれ50μｇ／ml，30μｇ／mlになるように加え、
37℃で30分間保温し、RNAを分解した後、上記
フエノール処理を繰り返し、染色体DNA溶液を
得る。 次にこの染色体DNA100μｇに対し10unitの
MboI制限酵素を加え、10mM Tris−Cl（PH7.4）
−50mM NaCl−10mM MgCl2の反応液0.5ml中
で、24℃にて１時間反応を行わせ部分消化した
後、フエノール処理、エーテル抽出により制限酵
素を失活させる。次いでこれを0.7％アガロース
−100mM Tris−ほう酸−2mM EDTA（PH8.3）
中で電気泳動を行い、その約４〜10Kbpの大きさ
のDNA画分を泳動溶出により取得し、フエノー
ル処理、クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行
つた後、0.1mlのTE緩衝液に溶解させる。 (4) ベクターDNAへの染色体DNA断片の挿入 大腸菌ベクタープラスミドpUC13を制限酵素
BamHIで消化後ホスフアターゼ処理したDNA
（フアルマシア社より購入、Gene，Vo 33，
P103（1985）に記載されている）0.1μｇと(3)で得
られた染色体DNA断片1μｇを混合し、50mM
Tris−Cl（PH7.5）−5mM MgCl2−10mM DTT−
0.4mM ATPの反応液30μ中で、1unitの
T4DNAリガーゼにより16℃で12時間反応させ、
ベクターと染色体DNA断片を連結させた。 (5) 組換えプラスミドの大腸菌への導入（形質転
換） エシエリシア・コリMC1061株（フアルマシア
社販売株）を10mlの2TY培地に接種し37℃で培
養し、培養液の660nmの吸光度が0.3になつたら
集菌する。５mlの50mM CaCl2に懸濁し、０℃で
１時間放置後、遠心集菌し、１mlの50mM CaCl2
に再び懸濁する。この液0.2mlに(4)で得たDNA溶
液30μを加え、０℃で１時間放置後、５mlの
2TY培地を加え、37℃で１時間培養する。これ
をアンピシリン（50μｇ／ml）を含むＨ寒天培地
（トリプトン１％，NaCl 0.8％，PH７，寒天1.5
％）に塗布し、37℃で15時間培養し、アンピシリ
ン耐性の大腸菌形質転換体コロニーを得る。 (6) トリプトフアン合成酵素遺伝子をクローニン
グした組換え体大腸菌の選択 クローンの選択はコロニーハイブリダイゼーシ
ヨンにより行つた。(5)で得られた形質転換体のコ
ロニーをニトロセルロースフイルターにレプリカ
した後、0.5MNaOH，0.5M Tris−Cl（PH7.5），
1.5M NaCl−0.5M Tris−Cl，２×SSCの４溶液
に順に10分間づつ浸した後、80℃で３時間加熱し
た。 上記のフイルターに、１枚当たり１mlのハイブ
リダイゼーシヨン溶液（50％ホルムアミド，４×
SSC，50mM Tris−Cl，PH7.5）と(2)で得た放射
性DNAプローブとを加え、42℃で20時間保温し
た。 フイルターを４×SSCで１回、２×SSCで２
回、核15分ずつ室温で洗い、風乾した後、オート
ラジオグラフイーにかけ、ポジテイブなクローン
を選択した。 上記のようにして得られた組換え体をシエリシ
ア・コリMC1061（pKA207）と名付け、微生物工
業技術研究所へ寄託した（受託番号 FERM
BP−1924）。 組換え体よりpKA207プラスミドDNAを調製
し、簡単な制限酵素地図（第３図上段）を作成し
た。pKA207のインサートDNAは6.8Kbの長さで
あり、EcoRI，PstI，SalI，XbaI、で切断されな
い。 (7) pKA207よりサブクローンプラスミド
pKA208の作成 トリプトフアン合成酵素遺伝子は、trpAB合わ
せて約2KbであるのでpKA207のインサート
DNA上の遺伝子の位置を細かく推定するために
サブクローニングを行つた。 pKA207のインサートDNA上の最も左にある
BglサイトとPstIサイトとではさまれる3.1Kb
のDNAを以下のようにサブクローニングした。 pKA207DNA5μｇをBgl，PstIそれぞれ
20unitにより消化後、アガロースゲル電気泳動を
行い、その3.1KbDNA断片を切り出して泳動溶
出によりDNAを回収した。 上記のDNA断片と、BamHI，PstIで消化した
tacプロモーターベクターpTTQ18（アマーシヤム
製，Gene，Vo51，P255（1987）に記載されて
いる）のDNA50ngとをT4DNAリガーゼにより
連結した。 これを用いて、(5)と同様の方法で大腸菌
MV1184株（宝酒造から購入）を形質転換した。 上記のようにして得られた組換え体をエシエリ
シア・コリMV1184（pKA208）株と名付けた。
この株よりpKA208プラスミドDNAを調製した。 pKA208プラスミド（第３図下段）はプラスミ
ドベクターのプロモーターに対する挿入DNAの
向きがpKA207とは逆になつている。 pKA208の挿入DNAは、さらに詳しい制限酵
素解析の結果、第１図の制限酵素地図によつて示
され、ClaI，EcoRI，EcoRV，HpaI，MluI，
PstI，Pvu，SalI，SphI，XbaIの制限酵素で切
断されない3.1Kbの長さのDNA断片であること
が明らかになつた。 本DNA断片は発明者がサーマス・アクアテイ
カスT2株より初めて分離したものであり、先に
分離したサーマス・サーモフイラスHB27株由来
のトリプトフアン合成酵素遺伝子を含むDNA断
片とは、BamHI，Hind，NcoI，Pvuなどの
制限酵素による切断に違いがあり、明らかに異な
るDNA断片である。 (8) pKA208プラスミドを保持する大腸菌の耐熱
性トリプトフアン合成酵素活性 pKA208プラスミドの挿入DNA上にトリプト
フアン合成酵素遺伝子がのつていることは、大腸
菌中での酵素活性の発現により確認した。 pKA208プラスミドを保持する大腸菌MV1184
（pKA208）株を2TY培地（IPTGを120μｇ／ml
含む）に接種し定常期まで37℃で培養し、集菌
後、100mM Tris−Cl（PH7.8）緩衝液に懸濁し、
超音波処理により菌を破壊した。遠心分離後の上
清をさらに80℃で熱処理して大腸菌由来の酵素を
失活させ、その遠心分離上清を分取し、これを酵
素液とした。 酵素液10μに１mlの反応液（100mM Tris−
Cl（PH7.8）−0.4mMインドール−80mM DLセリ
ン−180mM NaCl−0.03mMピリドキサルリン
酸）を加え70℃で20分間反応させた後、0.1mlの
0.1N NaOHを加え反応を停止させる。次にトル
エン４mlを加え、インドールを抽出した後、その
１mlに２mlの呈色液（９ｇのｐ−ジメチルベンズ
アルデヒドを200mlのエタノールに溶かした後、
45mlの濃塩酸を加え、さらにエタノールで250ml
にフイルアツプしたもの）と４mlの95％エタノー
ルを加え20分間放置後、540nmの吸光度を比色定
量した。この方法により反応後のインドールの残
量を求め、トリプトフアン合成酵素活性を調べ
た。 その結果、コントロールであるpTTQ18ベクタ
ーのみを保持する大腸菌の酵素液と比べpKA208
を保持する大腸菌の酵素液は顕著な耐熱性トリプ
トフアン合成酵素活性を示した。 このことよりpKA208プラスミドの挿入DNA
上にサーマス・アクアテイカスT2株由来の耐熱
性トリプトフアン合成酵素遺伝子がのつており、
かつpKA208を保持する大腸菌においてサーマス
菌の耐熱性トリプトフアン合成酵素が産生されて
いることが確認された。 (9) サーマス属細菌プラスミドベクターpYK105
の作成 ベクターの作成は第４図のスキームに示す方法
により行つた。pKA207DNA1μｇを制限酵素Bgl
で消化したものと、サーマス・サーモフイラス
HB8株（ATCC27634）より調製した選択マーカ
ーをもたないクリプテイツクプラスミド
pTT8DNA1μｇをBglで消化したものとを混合
し、T4DNAリガーゼ1unitで16℃、８時間反応
させ連結した。このDNAによりトリプトフアン
合成酵素遺伝子変異株（トリプトフアン要求株）
であるサーマス・サーモフイラスHB27Trp-株
（微生物工業技術研究所寄託菌株 FERM Ｐ−
7507）を形質転換した。上記株の１夜培養液をサ
ーマス培地に１％接種し、70℃で２時間培養後、
その0.5mlに連結したDNAを加え、70℃で１時間
培養を継続した。 生理食塩水（０／９％NaCl）で稀釈した後、
サーマス属細菌の最小合成寒天培地（蔗糖５ｇ，
K2HPO4 0.5ｇ，KH2PO40.25ｇ，NaCl ２ｇ，
（NH4）2SO4 2.5ｇ，ビオチン 100μｇ，塩酸チ
アミン １mg，MgCl2・6H2Ｏ 0.125ｇ，
CaCl2・2H2Ｏ 25mg，FeSO4・7H2Ｏ ６mg，
CoCl2・6H2Ｏ 0.8mg，NiCl2・6H2Ｏ 20μｇ，
NaMoO2・2H2Ｏ 1.2mg，VOSO4・3H2Ｏ 0.1
mg，MnCl2・4H2Ｏ 0.5mg，ZnSO4・7H2Ｏ
60μｇ，CuSO4・5H2Ｏ 15μｇおよび寒天（半井
化学）15gを純水１に含みPH7.2に調整したも
の）に塗布した。 70℃で２日間培養すると、トリプトフアンを要
求しなくなつた形質転換体サーマス・サーモフイ
ラスHB27trp-（pYK105）が得られた。形質転換
体より分離されたプラスミドpYK105は第４図下
段に示されるような構造をしている。pUC13プ
ラスミドを持つているので、サーマスだけでなく
大腸菌においても複製できるシヤトルベクターで
あり、形質転換体の選択は大腸菌の場合アンピシ
リン耐性で、好熱菌サーマス・サーモフイラス
HB27trp-ではトリプトフアン要求性の相捕によ
り選択できる。pYK105はサーマス属細菌で初め
て作られた選択が可能なプラスミドベクターであ
る。 (ニ) 発明の効果 分離された耐熱性トリプトフアン合成酵素遺伝
子により耐熱性トリプトフアン合成酵素を多量に
大腸菌より取得することが可能になる。 またプラスミドベクターpYK105によりサーマ
ス・サーモフイラスHB27株の遺伝子操作が可能
になつた。
ン合成酵素遺伝子及び該遺伝子をマーカーとする
高度好熱菌プラスミドベクターに関するものであ
る。 トリプトフアン合成酵素はインドールとセリン
より必須アミノ酸であるトリプトフアンを合成す
る酵素であり、その遺伝子はトリプトフアンの安
価な製造に利用することができる。また、プラス
ミドベクターは高度好熱菌を遺伝子操作により育
種改良するのに用いることができる。 (ロ) 従来の技術及び問題点 摂氏75℃以上という高い温度で生育できる高度
好熱菌は、その生産する生体高分子が熱に対して
安定であるばかりでなく化学試薬や有機溶媒にも
耐性が高い。そのため、高度好熱菌を用いての高
温での発酵生産やその酵素あるいは菌体を固定化
するバイオリアクターが検討されている。これら
を効率よく行うためには高度好熱菌を育種改良す
る必要がある。遺伝子操作は現在最も有力な育種
改良手段であるが、高度好熱菌には薬剤耐性プラ
スミドがない等の理由により、プラスミドベクタ
ーがなく遺伝子操作を行うことができなかつた。 発明者は、すでにグラム陰性の高度好熱菌の代
表種であるサーマス・サーモフイラス
（Thermus thermophilus）HB27株において、遺
伝子DNAの導入法である形質転換法の開発（特
開昭60−188076）をしているほか、同菌より、ト
リプトフアン合成酵素遺伝子を含む3.1Kbの
DNA断片を分離している（特願昭62−297129）。
上記のDNA断片をサーマス属細菌のクリプテイ
ツクスプラスミドに連結して選択マーカー遺伝子
として利用することを検討したが、同DNA断片
は、宿主のサーマス・サーモフイラスHB27株中
では染色体DNAと高顆度に組換えを起こし、染
色体DNAに組み込まれてしまうため、選択マー
カーとして使用できず、ベクタープラスミドを作
成できなかつた。 (ハ) 問題点を解決するための手段 本発明者は各種サーマス属細菌について研究を
行つた結果、サーマス・サーモフイラスHB27株
の中において染色体DNAとほとんど組換えを起
こさない耐熱性トリプトフアン合成酵素遺伝子を
含むDNA断片をサーマス・アクアテイカス
（Thermus aquaticua）T2株（ATCC27737）よ
り取り出すことに初めて成功した。 さらに同DNA断片を大腸菌プラスミドベクタ
ーpUC13と共に選択マーカーを持たないクリプ
テイツクプラスミドpTT8（サーマス・サーモフ
イラスHB8株由来）に連結することにより、サ
ーマス属細菌において初めて選択マーカーをもつ
プラスミドベクターを創製するに至つた。 すなわち、本発明は高度好熱菌サーマス・アク
アテイカスT2株の耐熱性トリプトフアン合成酵
素の遺伝情報を有し、第１図に示されるような制
限酵素切断地図により特徴付けられる3.1Kbの長
さのDNA断片及びそれをクリプテイツクプラス
ミドpTT8に連結することにより作成した新規な
サーマス属細菌プラスミドベクターpYK105に関
するものである。 以下、本発明を詳細に説明する。 サーマス・サーモフイラスHB27株の染色体
DNAと組換えを起こしにくい耐熱性トリプトフ
アン合成酵素遺伝子は同菌と類縁性の低いサーマ
ス属細菌より分離することができる。 サーマス・アクアテイカスT2株
（ATCC27737）は分類学的にサーマス・サーモフ
イラスHB27株とは遠縁であることが知られてい
る。実際にT2株の染色体DNAを用いて、HB27
株のトリプトフアン合成酵素遺伝子変異株を形質
転換すると、Trp+への形質転換効率が低く、
HB27野生株染色体DNAを用いた時の５千分の
１以下の効率しか示さない。このことは、T2株
のトリプトフアン合成酵素遺伝子付近のDNA塩
基配列とHB27株のDNA塩基配列とではホモロ
ジーが低いため組換えを起こしにくいことを意味
する。 T2株のトリプトフアン合成酵素遺伝子はすで
に分離してあるサーマス・サーモフイラスHB27
株の同遺伝子をプローブとしてコロニーハイブリ
ダイゼーシヨンにより分離した。ハイブリダイゼ
ーシヨンは条件を緩くすることにより、ホモロジ
ーの低いクローンも分離が可能である。 クローニングは第２図に示すスキームにより行
つた。 先ず、プローブDNAの作成について説明する。
サーマス・サーモフイラスHB27株のトリプトフ
アン合成酵素遺伝子はエシエリシア・コリJM83
（pKA21）株（FERM Ｐ−9685）の保持する
pKA21プラスミド上にクローニングされており、
同遺伝子は第２図右上の制限酵素地図上に示され
た位置に存在している。そこでこのプラスミドを
制限酵素SacIで消化後、アガロースゲル電気泳
動し、その1.8KbのDNA断片を切り出した後、
泳動溶出することによりtrpB遺伝子を含むより
DNA断片を分離した。このDNA断片をマルチプ
ライムラベリング法によりα−32Ｐ−dCTPで標
識して下記のコロニーハイブリダイゼーシヨンの
プローブとした。 次にサーマス・アクアテイカスT2株の染色体
DNAライブラリーの作成とコロニーハイブリダ
イゼーシヨンについて説明する。 サーマス・アクアテイカスT2株の染色体DNA
はフエノール法などの常法により分離精製するこ
とができる。T2株を培養集菌後、リゾチーム溶
液を加え一定時間保温する。SDS溶液を加え溶菌
させた後、フエノールを加えDNAを抽出する。
DNAをエタノール沈殿により回収した後、
RNaseで処理し、染色体DNAを得る。 染色体DNAは制御酵素MboIで部分消化した
後、その４〜10KbのDNA断片を泳動溶出により
分離する。このDNA断片と制限酵素BamHIで消
化後ホスフアターゼ処理したpUC13プラスミド
DNAとをT4DNAリガーゼを用いて連結する。 上記の方法で得られた組換えDNAを用いて大
腸菌MC1061株を０℃で塩化カルシウム処理する
ことにより形質転換する。アンピシリンを含む寒
天栄養培地に塗布し形質転換体のコロニーを得
る。 これらのコロニーを前記の標識したプローブを
用いてコロニーハイブリダイゼーシヨン法により
スクリーニングを行い、ポジテイブクローンを選
択した。 上記のようにして得られた形質転換体エシエリ
シア・コリMC1061（pKA207）株を微生物工業技
術研究所に寄託した（受託番号 FERM BP−
1924）。この株よりプラスミドDNAを調製し、簡
単な制限酵素地図を作成した（第３図上段）。
pKA207は6.8Kbの挿入DNAを持つている。 トリプトフアン合成酵素遺伝子本体は約2Kbの
大きさであるので、pKA207プラスミド上のトリ
プトフアン合成酵素遺伝子の位置を推定するため
に、公知のtacプロモーターをもつプラスミド
pTTQ18にサブクローニングを行つた。 pKA207の挿入DNAのうち第３図上段の制限
酵素地図で最も左にあるBglサイトより左側の
3.1Kbの長さのDNA断片をサブクローニングす
るために、pKA207DNAをBgl，PstIで消化後
アガロースゲル電気泳動し、3.1KbのDNA断片
を切り出し、泳動溶出によりDNAを回収した。
BamHI，PstIで消化したpTTQ18DNAと回収し
たDNAとをT4DNAリガーゼにより連結後、大
腸菌MV1184株を形質転換した。上記のようにし
てエシエリシア・コリMV1184（pKA208）株を
分離し、この株よりpKA208プラスミドDNAを
調製した。 pKA208プラスミドはプラスミドベクターのプ
ロモーターに対する挿入DNAの向きがpKA207
とは逆になつている（第３図下段）。 pKA208の挿入DNAは、詳しい制限酵素解析
の結果、第１図の制限酵素地図によつて示され、
ClaI，EcoRI，EcoRV，HpaI，MluI，PstI，
Pvu，SalI，SphI，XbaIの制限酵素で切断さ
れない3.1Kbの長さのDNA断片であることが明
らかになつた。 本DNA断片は発明者がサーマス・アクアテイ
カスT2株より初めて分離したものであり、先に
分離したサーマス・サーモフイラスHB27株由来
のトリプトフアン合成酵素遺伝子を含むDNA断
片とは、BamHI，Hind，NcoI，Pvu，など
の制限酵素による切断に違いがあり、明らかに異
なるDNA断片である。 pKA208プラスミドの挿入DNA上にトリプト
フアン合成酵素遺伝子がのつていることは、大腸
菌中での酵素活性の発現により確認した。 pKA208プラスミドを保持する大腸菌MV1184
（pKA208）株をイソプロピル−β−Ｄ−チオガ
ラクトシド（IPTG）を含む栄養培地で培養集菌
後、緩衝液に懸濁し超音波処理により菌を破壊し
た。遠心分離後の上清をさらに80℃で熱処理して
大腸菌由来の酵素を失活させ、その遠心分離上清
を分取した。この上清を粗酵素液として
Yanofskyらの方法（Methods in Enzymology，
Vo５，P794（1962）に記載されている）によ
り70℃という高い温度でのトリプトフアン合成酵
素活性を測定した。その結果、高い温度での活性
が検出され、pKA208プラスミドの挿入DNA上
にトリプトフアン合成酵素遺伝子がのつており、
かつ大腸菌においてサーマス菌の耐熱性トリプト
フアン合成酵素が産生されていることが確認され
た。 上記のようにサーマス・サーモフイラスHB27
株の染色体DNAと組換えをほとんど起こさない
サーマス・アクアテイカスT2株のトリプトフア
ン合成酵素遺伝子のDNA断片がクローニングさ
れたので、サーマス・サーモフイラスHB27株の
トリプトフアン合成酵素遺伝子変異株を宿主とし
た場合に選択可能にプラスミドベクターを作成し
た。 第４図のスキームに示すように、pKA207を制
限酵素Bglで消化したものと、サーマス・サー
モフイラスHB8株（ATCC27634）由来の選択マ
ーカーをもたないクリプテイツクプラスミド
pTT8をBglで消化したものとを混合し、
T4DNAリガーゼで連結した。このDNAにより
サーマス・サーモフイラスHB27株トリプトフア
ン合成酵素変異株（トリプトフアン要求株）を形
質転換した。形質転換はサーマス属細菌が自然形
質転換能を持つていることを利用し、培養液に
DNAを加え一時間培養することにより行つた。
トリプトフアンを含まないサーマス属細菌の最小
培地に塗布した後、70℃で２日間培養すると、ト
リプトフアンを要求しなくなつた形質転換体サー
マス・サーモフイラスHB27trp-（pYK105）が得
られた。 形質転換体より分離されたプラスミドpYK105
は第４図下段に示される構造をしている。
pUC13プラスミドを持つているので、サーマス
だけでなく大腸菌においても複製できるシヤトル
ベクターであり、形質転換体の選択は大腸菌の場
合アンピシリン耐性で、好熱菌サーマス・サーモ
フイラスHB27trp-ではトリプトフアン要求性の
相補により選択できる。pYK105はサーマス属細
菌で初めて作られた選択が可能なプラスミドベク
ターである。 以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明
する。 実施例 (1) pKA21プラスミドの調製 サーマス・サーモフイラスHB27株（FERM
Ｐ−7502）のトリプトフアン合成酵素遺伝子をプ
ラスミドpKA21上にクローニングしたエシエリ
シア・コリJM83（pKA21）株［微生物工業技術
研究所寄託菌株 FERM Ｐ−9685］をアンピシ
リン（100μｇ／ml）を含む2TY培地（デイフ
コ・トリプトン16ｇ，イーストエキス10ｇ，
NaCl ５ｇを純水１に含む）200ml中で37℃で
培養後集菌し、25mM Tris−Cl（PH８）−
10mMEDTA−50mMグルコース−0.5％リゾチ
ームの溶液４mlに懸濁し、37℃で５分間放置し
た。これに10mlの0.2N NaOH−１％SDSを加
え、０℃で10分間放置した後7.5mlの5M酢酸カリ
ウム（PH4.8）を加え、０℃で10分間放置後、遠
心分離し、上清を得た。上清にPEG6000を終濃
度10％になるように加え、０℃で２時間放置後、
遠心してDNAを沈殿させた。これを５mlのTE緩
衝液（10mM Tris−Cl，1mM EDTA，PH7.5）
に溶かした後、エチジウムブロマイド−塩化セシ
ウム平衡密度匂配遠心にかけプラスミドDNAを
得た。以下、プラスミドの調製はすべてこの方法
で行つた。 (2) pKA21よりプローブDANの調製 pKA21より、各種菌株間でホモロジーの高い
trpB部分を切り出すために(1)で得た
pKA21DNA5μｇを制限酵素Sacl，20unitにより
消化後、40mM Tris−20mM酢酸−2mM
EDTA−0.7％アガロース中で電気泳動を行い、
1.85KbDNAのバンドを切り出し、さらにアガロ
ースから泳動溶出によりDNAを回収した。 上記のDNA25ngをランダムプライマーDNA
ラベリングキツト（宝酒造製）を用いてα−32Ｐ
−dCTPにより標識し、放射性DNAプロープを
作成した。 (3) サーマス・アクアテイカスT2株の染色体
DNAの調製と制限酵素による切断 サーマス・アクアテイカス（Thermus
aquaticus）T2株（ATCC27737）を２のサー
マス培地（デイフコ・イーストエキストラクト２
ｇ，ポリペプトン（大五栄養）４ｇ，Nacl1ｇを
純水１に含み、PHを7.5に調整したもの）に接
種し、対数増殖期の終わり近くで集菌し、約６ｇ
の湿菌体を得る。これをリゾチーム12mgを溶かし
た６mlの0.15M NaCl−0.1M EDTA（PH８）に
懸濁し、37℃で20分間保温後、エタノール・ドラ
イアイスの溶媒中に入れてすみやかに凍らせる。
50mlの0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH９）−１％SDS
−0.1M NaClを加え、攪拌後、上記緩衝液で飽
和させたフエノールを56ml加え、４℃で振盪後、
遠心し、上層を分取する。これに２容の冷エタノ
ールを加えて核酸画分を糸状沈殿として回収し、
20mlの0.1×SSC（SSC＝0.15M NaCl−0.015Mク
エン酸ナトリウム）に溶かしたあと２mlの10×
SSCを加え、粗DNA溶液を得る。次にRNase
Ａ（シグマ社製），RNase T1（シグマ社製）をそ
れぞれ50μｇ／ml，30μｇ／mlになるように加え、
37℃で30分間保温し、RNAを分解した後、上記
フエノール処理を繰り返し、染色体DNA溶液を
得る。 次にこの染色体DNA100μｇに対し10unitの
MboI制限酵素を加え、10mM Tris−Cl（PH7.4）
−50mM NaCl−10mM MgCl2の反応液0.5ml中
で、24℃にて１時間反応を行わせ部分消化した
後、フエノール処理、エーテル抽出により制限酵
素を失活させる。次いでこれを0.7％アガロース
−100mM Tris−ほう酸−2mM EDTA（PH8.3）
中で電気泳動を行い、その約４〜10Kbpの大きさ
のDNA画分を泳動溶出により取得し、フエノー
ル処理、クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行
つた後、0.1mlのTE緩衝液に溶解させる。 (4) ベクターDNAへの染色体DNA断片の挿入 大腸菌ベクタープラスミドpUC13を制限酵素
BamHIで消化後ホスフアターゼ処理したDNA
（フアルマシア社より購入、Gene，Vo 33，
P103（1985）に記載されている）0.1μｇと(3)で得
られた染色体DNA断片1μｇを混合し、50mM
Tris−Cl（PH7.5）−5mM MgCl2−10mM DTT−
0.4mM ATPの反応液30μ中で、1unitの
T4DNAリガーゼにより16℃で12時間反応させ、
ベクターと染色体DNA断片を連結させた。 (5) 組換えプラスミドの大腸菌への導入（形質転
換） エシエリシア・コリMC1061株（フアルマシア
社販売株）を10mlの2TY培地に接種し37℃で培
養し、培養液の660nmの吸光度が0.3になつたら
集菌する。５mlの50mM CaCl2に懸濁し、０℃で
１時間放置後、遠心集菌し、１mlの50mM CaCl2
に再び懸濁する。この液0.2mlに(4)で得たDNA溶
液30μを加え、０℃で１時間放置後、５mlの
2TY培地を加え、37℃で１時間培養する。これ
をアンピシリン（50μｇ／ml）を含むＨ寒天培地
（トリプトン１％，NaCl 0.8％，PH７，寒天1.5
％）に塗布し、37℃で15時間培養し、アンピシリ
ン耐性の大腸菌形質転換体コロニーを得る。 (6) トリプトフアン合成酵素遺伝子をクローニン
グした組換え体大腸菌の選択 クローンの選択はコロニーハイブリダイゼーシ
ヨンにより行つた。(5)で得られた形質転換体のコ
ロニーをニトロセルロースフイルターにレプリカ
した後、0.5MNaOH，0.5M Tris−Cl（PH7.5），
1.5M NaCl−0.5M Tris−Cl，２×SSCの４溶液
に順に10分間づつ浸した後、80℃で３時間加熱し
た。 上記のフイルターに、１枚当たり１mlのハイブ
リダイゼーシヨン溶液（50％ホルムアミド，４×
SSC，50mM Tris−Cl，PH7.5）と(2)で得た放射
性DNAプローブとを加え、42℃で20時間保温し
た。 フイルターを４×SSCで１回、２×SSCで２
回、核15分ずつ室温で洗い、風乾した後、オート
ラジオグラフイーにかけ、ポジテイブなクローン
を選択した。 上記のようにして得られた組換え体をシエリシ
ア・コリMC1061（pKA207）と名付け、微生物工
業技術研究所へ寄託した（受託番号 FERM
BP−1924）。 組換え体よりpKA207プラスミドDNAを調製
し、簡単な制限酵素地図（第３図上段）を作成し
た。pKA207のインサートDNAは6.8Kbの長さで
あり、EcoRI，PstI，SalI，XbaI、で切断されな
い。 (7) pKA207よりサブクローンプラスミド
pKA208の作成 トリプトフアン合成酵素遺伝子は、trpAB合わ
せて約2KbであるのでpKA207のインサート
DNA上の遺伝子の位置を細かく推定するために
サブクローニングを行つた。 pKA207のインサートDNA上の最も左にある
BglサイトとPstIサイトとではさまれる3.1Kb
のDNAを以下のようにサブクローニングした。 pKA207DNA5μｇをBgl，PstIそれぞれ
20unitにより消化後、アガロースゲル電気泳動を
行い、その3.1KbDNA断片を切り出して泳動溶
出によりDNAを回収した。 上記のDNA断片と、BamHI，PstIで消化した
tacプロモーターベクターpTTQ18（アマーシヤム
製，Gene，Vo51，P255（1987）に記載されて
いる）のDNA50ngとをT4DNAリガーゼにより
連結した。 これを用いて、(5)と同様の方法で大腸菌
MV1184株（宝酒造から購入）を形質転換した。 上記のようにして得られた組換え体をエシエリ
シア・コリMV1184（pKA208）株と名付けた。
この株よりpKA208プラスミドDNAを調製した。 pKA208プラスミド（第３図下段）はプラスミ
ドベクターのプロモーターに対する挿入DNAの
向きがpKA207とは逆になつている。 pKA208の挿入DNAは、さらに詳しい制限酵
素解析の結果、第１図の制限酵素地図によつて示
され、ClaI，EcoRI，EcoRV，HpaI，MluI，
PstI，Pvu，SalI，SphI，XbaIの制限酵素で切
断されない3.1Kbの長さのDNA断片であること
が明らかになつた。 本DNA断片は発明者がサーマス・アクアテイ
カスT2株より初めて分離したものであり、先に
分離したサーマス・サーモフイラスHB27株由来
のトリプトフアン合成酵素遺伝子を含むDNA断
片とは、BamHI，Hind，NcoI，Pvuなどの
制限酵素による切断に違いがあり、明らかに異な
るDNA断片である。 (8) pKA208プラスミドを保持する大腸菌の耐熱
性トリプトフアン合成酵素活性 pKA208プラスミドの挿入DNA上にトリプト
フアン合成酵素遺伝子がのつていることは、大腸
菌中での酵素活性の発現により確認した。 pKA208プラスミドを保持する大腸菌MV1184
（pKA208）株を2TY培地（IPTGを120μｇ／ml
含む）に接種し定常期まで37℃で培養し、集菌
後、100mM Tris−Cl（PH7.8）緩衝液に懸濁し、
超音波処理により菌を破壊した。遠心分離後の上
清をさらに80℃で熱処理して大腸菌由来の酵素を
失活させ、その遠心分離上清を分取し、これを酵
素液とした。 酵素液10μに１mlの反応液（100mM Tris−
Cl（PH7.8）−0.4mMインドール−80mM DLセリ
ン−180mM NaCl−0.03mMピリドキサルリン
酸）を加え70℃で20分間反応させた後、0.1mlの
0.1N NaOHを加え反応を停止させる。次にトル
エン４mlを加え、インドールを抽出した後、その
１mlに２mlの呈色液（９ｇのｐ−ジメチルベンズ
アルデヒドを200mlのエタノールに溶かした後、
45mlの濃塩酸を加え、さらにエタノールで250ml
にフイルアツプしたもの）と４mlの95％エタノー
ルを加え20分間放置後、540nmの吸光度を比色定
量した。この方法により反応後のインドールの残
量を求め、トリプトフアン合成酵素活性を調べ
た。 その結果、コントロールであるpTTQ18ベクタ
ーのみを保持する大腸菌の酵素液と比べpKA208
を保持する大腸菌の酵素液は顕著な耐熱性トリプ
トフアン合成酵素活性を示した。 このことよりpKA208プラスミドの挿入DNA
上にサーマス・アクアテイカスT2株由来の耐熱
性トリプトフアン合成酵素遺伝子がのつており、
かつpKA208を保持する大腸菌においてサーマス
菌の耐熱性トリプトフアン合成酵素が産生されて
いることが確認された。 (9) サーマス属細菌プラスミドベクターpYK105
の作成 ベクターの作成は第４図のスキームに示す方法
により行つた。pKA207DNA1μｇを制限酵素Bgl
で消化したものと、サーマス・サーモフイラス
HB8株（ATCC27634）より調製した選択マーカ
ーをもたないクリプテイツクプラスミド
pTT8DNA1μｇをBglで消化したものとを混合
し、T4DNAリガーゼ1unitで16℃、８時間反応
させ連結した。このDNAによりトリプトフアン
合成酵素遺伝子変異株（トリプトフアン要求株）
であるサーマス・サーモフイラスHB27Trp-株
（微生物工業技術研究所寄託菌株 FERM Ｐ−
7507）を形質転換した。上記株の１夜培養液をサ
ーマス培地に１％接種し、70℃で２時間培養後、
その0.5mlに連結したDNAを加え、70℃で１時間
培養を継続した。 生理食塩水（０／９％NaCl）で稀釈した後、
サーマス属細菌の最小合成寒天培地（蔗糖５ｇ，
K2HPO4 0.5ｇ，KH2PO40.25ｇ，NaCl ２ｇ，
（NH4）2SO4 2.5ｇ，ビオチン 100μｇ，塩酸チ
アミン １mg，MgCl2・6H2Ｏ 0.125ｇ，
CaCl2・2H2Ｏ 25mg，FeSO4・7H2Ｏ ６mg，
CoCl2・6H2Ｏ 0.8mg，NiCl2・6H2Ｏ 20μｇ，
NaMoO2・2H2Ｏ 1.2mg，VOSO4・3H2Ｏ 0.1
mg，MnCl2・4H2Ｏ 0.5mg，ZnSO4・7H2Ｏ
60μｇ，CuSO4・5H2Ｏ 15μｇおよび寒天（半井
化学）15gを純水１に含みPH7.2に調整したも
の）に塗布した。 70℃で２日間培養すると、トリプトフアンを要
求しなくなつた形質転換体サーマス・サーモフイ
ラスHB27trp-（pYK105）が得られた。形質転換
体より分離されたプラスミドpYK105は第４図下
段に示されるような構造をしている。pUC13プ
ラスミドを持つているので、サーマスだけでなく
大腸菌においても複製できるシヤトルベクターで
あり、形質転換体の選択は大腸菌の場合アンピシ
リン耐性で、好熱菌サーマス・サーモフイラス
HB27trp-ではトリプトフアン要求性の相捕によ
り選択できる。pYK105はサーマス属細菌で初め
て作られた選択が可能なプラスミドベクターであ
る。 (ニ) 発明の効果 分離された耐熱性トリプトフアン合成酵素遺伝
子により耐熱性トリプトフアン合成酵素を多量に
大腸菌より取得することが可能になる。 またプラスミドベクターpYK105によりサーマ
ス・サーモフイラスHB27株の遺伝子操作が可能
になつた。
第１図はpKA208プラスミドにクローニングさ
れている挿入DNA（3.1Kb）の制限酵素地図。第
２図はサーマス・アクアテイカスT2株トリプト
フアン合成酵素遺伝子をクローニングした
pKA207プラスミド分離のスキーム 第３図は
pKA207，pKA208プラスミドの制限酵素地図と
その挿入DNA間の関係。第４図は高度好熱菌プ
ラスミドベクターpYK105作成のスキーム。
れている挿入DNA（3.1Kb）の制限酵素地図。第
２図はサーマス・アクアテイカスT2株トリプト
フアン合成酵素遺伝子をクローニングした
pKA207プラスミド分離のスキーム 第３図は
pKA207，pKA208プラスミドの制限酵素地図と
その挿入DNA間の関係。第４図は高度好熱菌プ
ラスミドベクターpYK105作成のスキーム。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 高度好熱菌サーマス・アクアテイカスT2株
由来の耐熱性トリプトフアン合成酵素の遺伝情報
を担い、第１図の制限酵素地図によつて特徴付け
られ、ClaI，EcoRI，EcoRV，HpaI，MluI，
PstI，Pvu，SalI，SphI，XbaIの制限酵素で切
断されない3.1Kbの長さを有するDNA断片 ２ 高度好熱菌サーマス・アクアテイカスT2株
由来の耐熱性トリプトフアン合成酵素の遺伝情報
を担い、第１図の制限酵素地図によつて特徴付け
られ、ClaI，EcoRI，EcoRV，HpaI，MluI，
PstI，Pvu，SalI，SphI，XbaIの制限酵素で切
断されない3.1Kbの長さを有するDNA断片を大
腸菌プラスミドベクターpUC13と共にクリプテ
イツクプラスミドpTT8に組み込んだ高度好熱菌
プラスミドベクターpYK105。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63163779A JPH0213378A (ja) | 1988-06-30 | 1988-06-30 | 耐熱性トリプトファン合成酵素遺伝子及び該遺伝子をマーカーとする高度好熱菌プラスミドベクター |
| US07/329,765 US5120658A (en) | 1988-06-30 | 1989-03-28 | Thermostable tryptophan synthetase gene and extremely thermophilic plasmid vector incorporating said gene |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63163779A JPH0213378A (ja) | 1988-06-30 | 1988-06-30 | 耐熱性トリプトファン合成酵素遺伝子及び該遺伝子をマーカーとする高度好熱菌プラスミドベクター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0213378A JPH0213378A (ja) | 1990-01-17 |
| JPH0458957B2 true JPH0458957B2 (ja) | 1992-09-18 |
Family
ID=15780556
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63163779A Granted JPH0213378A (ja) | 1988-06-30 | 1988-06-30 | 耐熱性トリプトファン合成酵素遺伝子及び該遺伝子をマーカーとする高度好熱菌プラスミドベクター |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5120658A (ja) |
| JP (1) | JPH0213378A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115261365B (zh) * | 2022-06-22 | 2024-01-30 | 南通紫琅生物医药科技有限公司 | 色氨酸合成酶突变体及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06102029B2 (ja) * | 1984-07-31 | 1994-12-14 | 味の素株式会社 | Ｌ−トリプトフアンの製造法 |
-
1988
- 1988-06-30 JP JP63163779A patent/JPH0213378A/ja active Granted
-
1989
- 1989-03-28 US US07/329,765 patent/US5120658A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0213378A (ja) | 1990-01-17 |
| US5120658A (en) | 1992-06-09 |
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|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |