JPH0459800A - 高純度ネコインターフェロンの製造方法 - Google Patents
高純度ネコインターフェロンの製造方法Info
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- JPH0459800A JPH0459800A JP17329990A JP17329990A JPH0459800A JP H0459800 A JPH0459800 A JP H0459800A JP 17329990 A JP17329990 A JP 17329990A JP 17329990 A JP17329990 A JP 17329990A JP H0459800 A JPH0459800 A JP H0459800A
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- virus
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、蛋白質の一次構造がネコの遺伝情報由来であ
るインターフェロンを遺伝子組換え核多角体病ウィルス
を利用して量産し、以って医薬品（抗ウィルス剤）とす
ることを目的とした、組換えカイコ核多角体ウィルスお
よびカイコ幼虫を利用して生産したネコインターフェロ
ン（以下、ＦｅＩＦＮと略す）を高純度で製造する方法
に関する。
るインターフェロンを遺伝子組換え核多角体病ウィルス
を利用して量産し、以って医薬品（抗ウィルス剤）とす
ることを目的とした、組換えカイコ核多角体ウィルスお
よびカイコ幼虫を利用して生産したネコインターフェロ
ン（以下、ＦｅＩＦＮと略す）を高純度で製造する方法
に関する。
［従来の技術］
インターフェロンは、抗ウィルス作用を示す蛋白質を主
成分とする生理活性物質でＩＦＮと略記される。
成分とする生理活性物質でＩＦＮと略記される。
遺伝子操作技術の進歩によりヒトのＩＦＮのみならず、
ウシ、ウマ、イヌなどの動物のＩＦＮも大量生産が可能
となり、その結果、ウィルス病や腫瘍などの治療薬とし
てのＩＦＮの用途開発研究が行なわれているものもある
。
ウシ、ウマ、イヌなどの動物のＩＦＮも大量生産が可能
となり、その結果、ウィルス病や腫瘍などの治療薬とし
てのＩＦＮの用途開発研究が行なわれているものもある
。
ネコについても、α、β、γ各タイプのｒＦＮが報告さ
れている（文献１）。
れている（文献１）。
ネコには、ネコエイズ、ネコ白血病、ネコウィルス性鼻
気管炎、ネコカリキウイルス病、ネコ伝染性腹膜炎はじ
め多数のウィルス病が知られている。
気管炎、ネコカリキウイルス病、ネコ伝染性腹膜炎はじ
め多数のウィルス病が知られている。
そこで、ヒトのαＩＦＮやウシのβＩＦＮを経口投与し
、ネコ白血病ウィルス感染ネコの延命を図った事例が報
告されている。経口ではなく、体内注射を行なえば、よ
り顕著な効果が期待されるものの、異種ＩＦＨに対する
中和抗体の生産が起こることが懸念される。同種ＩＦＮ
、つまりネコのＩＦＮが容易に入手可能となれば、ネコ
の抗ウィルス剤、抗腫瘍剤としての用途が開かれると期
待される。
、ネコ白血病ウィルス感染ネコの延命を図った事例が報
告されている。経口ではなく、体内注射を行なえば、よ
り顕著な効果が期待されるものの、異種ＩＦＨに対する
中和抗体の生産が起こることが懸念される。同種ＩＦＮ
、つまりネコのＩＦＮが容易に入手可能となれば、ネコ
の抗ウィルス剤、抗腫瘍剤としての用途が開かれると期
待される。
本発明者らは、以前にＦｅＩＦＮを遺伝子操作技術によ
り生産する方法、すなわちＦｅＩＦＮをコードするＤＮ
Ａをクローニングし、サルのＣ０８１細胞、チャイニー
ズハムスターのＣＨＯ細胞、大腸菌などを利用して生産
する方法を開発した（文献２）。
り生産する方法、すなわちＦｅＩＦＮをコードするＤＮ
Ａをクローニングし、サルのＣ０８１細胞、チャイニー
ズハムスターのＣＨＯ細胞、大腸菌などを利用して生産
する方法を開発した（文献２）。
［発明が解決しようとする課題］
しかしながら、実用に供する程度の高純度のＦｅＩＦＮ
を大量に生産するという方法は未だ確立されていない。
を大量に生産するという方法は未だ確立されていない。
本発明の目的は、遺伝子操作技術を利用し、ＦｅＩＦＮ
をさらに高純度に、かつ大量生産する方法を提供するこ
とにある。
をさらに高純度に、かつ大量生産する方法を提供するこ
とにある。
［課題を解決するための手段］
本発明者らは、かかる状況に鑑み、創意工夫をなし、カ
イコ核多角体病ウィルスのＤＮＡをＦｅＩＦＮの蛋白を
コードするＤＮＡで組換えた組換え体ウィルスを単離し
、この組換え体ウィルスをカイコ生体中で増殖させてＦ
ｅＩＦＮを生産することに成功し、さらにＦｅＩＦＮを
高純度で精製する方法を確立し、かくして本発明を完成
させるに至った。
イコ核多角体病ウィルスのＤＮＡをＦｅＩＦＮの蛋白を
コードするＤＮＡで組換えた組換え体ウィルスを単離し
、この組換え体ウィルスをカイコ生体中で増殖させてＦ
ｅＩＦＮを生産することに成功し、さらにＦｅＩＦＮを
高純度で精製する方法を確立し、かくして本発明を完成
させるに至った。
すなわち本発明は、ＦｅＩＦＮの蛋白質をコードするＤ
ＮＡを外来遺伝子として遺伝子組換えされた組換えカイ
コ核多角体病ウィルスを、カイコ生体中で増殖させてＦ
ｅＩＦＮを生産させた後、生産されたＦｅＩＦＮを含む
溶液を、ブルー色素を結合させた担体に接触させ、次い
で該担体への吸着物を溶出剤で溶出させることを特徴と
する高純度ネコインターフェロンの製造方法を提供する
ものである。
ＮＡを外来遺伝子として遺伝子組換えされた組換えカイ
コ核多角体病ウィルスを、カイコ生体中で増殖させてＦ
ｅＩＦＮを生産させた後、生産されたＦｅＩＦＮを含む
溶液を、ブルー色素を結合させた担体に接触させ、次い
で該担体への吸着物を溶出剤で溶出させることを特徴と
する高純度ネコインターフェロンの製造方法を提供する
ものである。
以下、本発明に関し逐次詳細に説明する。
本発明の組換えカイコ核多角体病ウィルスは、例えば文
献２に記載のＥ、ｃｏｉｌ （ｐＦｅＩＦＮｌ）（微
工研条寄第１６３３号）から抽出したプラスミドからＦ
ｅ１ＦＮの蛋白質をコードするＤＮＡを切り出して、カ
イコのクローニングベクター（文献３）に連結して作製
した組換え体プラスミドとカイコ核多角体病ウィルスＤ
ＮＡとを、カイコ樹立細胞にコ・トランスフェクション
することにより容易に作製することができる。従って、
本発明の組換え体ウィルスは、ｉｎ ｖ’ｉｖ”ｏ的な
方法で作製することができる。
献２に記載のＥ、ｃｏｉｌ （ｐＦｅＩＦＮｌ）（微
工研条寄第１６３３号）から抽出したプラスミドからＦ
ｅ１ＦＮの蛋白質をコードするＤＮＡを切り出して、カ
イコのクローニングベクター（文献３）に連結して作製
した組換え体プラスミドとカイコ核多角体病ウィルスＤ
ＮＡとを、カイコ樹立細胞にコ・トランスフェクション
することにより容易に作製することができる。従って、
本発明の組換え体ウィルスは、ｉｎ ｖ’ｉｖ”ｏ的な
方法で作製することができる。
すなわち、ＦｅＩＦＮの蛋白質をコードするＤＮＡを含
むプラスミドｐＦｅＩＦＮ１を含有する大腸菌形質転換
体（微工研条寄第１６３３号）から、例えば文献４のよ
うな一般的な方法により抽出したプラスミドｐＦｅｒＦ
Ｎ１からＦｅ１ＦＮの蛋白質をコードするＤＮＡ部分を
、例えばｐＢＭＯ３０（文献３）などのカイコのクロー
ニングベクターの発現調節部分の下流に連結するという
一般的な遺伝子操作に従って組換え体プラスミドを作製
することができる。この組換え体プラスミドとカイコ核
多角体病ウィルスＤＮＡ （文献３）とを、文献３のよ
うな方法でカイコ樹立細胞、例えばＢＭ−Ｎ株（文献３
）にコ嗜トランスフフェクションした後、培養を続け、
培養液中に出現した非組換え体（野生型）と組換え体の
ウィルスの中から限界希釈法、もしくはプラーク法など
の一般的な方法によって組換え体ウィルスをクローニン
グすることができる。組換え体ウィルスは多角体の形成
能がないことから、野生型ウィルスと容易に区別できる
。
むプラスミドｐＦｅＩＦＮ１を含有する大腸菌形質転換
体（微工研条寄第１６３３号）から、例えば文献４のよ
うな一般的な方法により抽出したプラスミドｐＦｅｒＦ
Ｎ１からＦｅ１ＦＮの蛋白質をコードするＤＮＡ部分を
、例えばｐＢＭＯ３０（文献３）などのカイコのクロー
ニングベクターの発現調節部分の下流に連結するという
一般的な遺伝子操作に従って組換え体プラスミドを作製
することができる。この組換え体プラスミドとカイコ核
多角体病ウィルスＤＮＡ （文献３）とを、文献３のよ
うな方法でカイコ樹立細胞、例えばＢＭ−Ｎ株（文献３
）にコ嗜トランスフフェクションした後、培養を続け、
培養液中に出現した非組換え体（野生型）と組換え体の
ウィルスの中から限界希釈法、もしくはプラーク法など
の一般的な方法によって組換え体ウィルスをクローニン
グすることができる。組換え体ウィルスは多角体の形成
能がないことから、野生型ウィルスと容易に区別できる
。
ＦｅＩＦＮの生産は、前記の組換えカイコ核多角体ウィ
ルスをカイコ生体中で増殖させることにより行なう。前
記の組換え体ウィルスを含む培養液をカイコ幼虫に注射
して、クワの葉または合成飼料を与えて飼育する。飼育
後、体液を採取し、その上清からＦｅＩＦＮを回収する
。
ルスをカイコ生体中で増殖させることにより行なう。前
記の組換え体ウィルスを含む培養液をカイコ幼虫に注射
して、クワの葉または合成飼料を与えて飼育する。飼育
後、体液を採取し、その上清からＦｅＩＦＮを回収する
。
体液中に存在する組換えカイコ核多角体病ウィルスはｐ
Ｈ１〜４で、４℃で１日保存することによって失活させ
ることができる。
Ｈ１〜４で、４℃で１日保存することによって失活させ
ることができる。
本発明で使用するブルー色素を結合した担体（以下、ブ
ルー担体と略す）としては、次のものが使用される。
ルー担体と略す）としては、次のものが使用される。
ブルー色素は一般名をＣＩリアクティブルー２といい、
例えばＣＩ ＢＡ−ＧＥ ＩＧＹ社から“シバクロンブ
ルーＦ３ＧＡ”または“シバクロンブルー３ＧＡ”とい
う商品名で市販されている青色色素などが挙げられる。
例えばＣＩ ＢＡ−ＧＥ ＩＧＹ社から“シバクロンブ
ルーＦ３ＧＡ”または“シバクロンブルー３ＧＡ”とい
う商品名で市販されている青色色素などが挙げられる。
実際のクロマトグラフィーに用いるブルー担体としては
、′ブルー〇セファロースＣＬ−６Ｂ”（Ｐｂａｒｍａ
ｃｉａ社）、′ブルーーセファロース６フアーストフロ
ー″ （Ｐｈａｔｍａｃｉａ社）、“マドレックスゲル
・ブルーＡ″ （Ａｍｉｃｏｎ社）、および“アフィゲ
ル畳ブルー （Ｂｉｏｒａｄ社）などの商品名で市販さ
れているブルーアガロースゲル、または“ブルー・トリ
スアクリル−Ｍ″ （ＬＫＢ社）、“ブルーセルロース
ゲル″′ （チッソ社）などの商品名で市販されている
ブルーセルロースゲルなどが適当であり、容易に入手す
ることができる。
、′ブルー〇セファロースＣＬ−６Ｂ”（Ｐｂａｒｍａ
ｃｉａ社）、′ブルーーセファロース６フアーストフロ
ー″ （Ｐｈａｔｍａｃｉａ社）、“マドレックスゲル
・ブルーＡ″ （Ａｍｉｃｏｎ社）、および“アフィゲ
ル畳ブルー （Ｂｉｏｒａｄ社）などの商品名で市販さ
れているブルーアガロースゲル、または“ブルー・トリ
スアクリル−Ｍ″ （ＬＫＢ社）、“ブルーセルロース
ゲル″′ （チッソ社）などの商品名で市販されている
ブルーセルロースゲルなどが適当であり、容易に入手す
ることができる。
ブルー担体によるＦｅＩＦＮの精製操作は次のように行
なう。
なう。
すなわち、まずＦｅＩＦＮを含む溶液をブルー担体に接
触吸着させる。吸着は、バッチ法、カラム法どちらでも
可能であるが、カラム法の方が吸着効率が高い。
触吸着させる。吸着は、バッチ法、カラム法どちらでも
可能であるが、カラム法の方が吸着効率が高い。
溶離は、溶出剤のｐＨ値、イオン強度、疎水度によって
決定される。例えば、高イオン強度下ではｐＨ６〜８で
ＦｅＩＦＮは溶出される。このイオン強度は、リン酸、
酢酸、クエン酸、ホウ酸、トリス・塩酸などの緩衝液の
濃度を上げたり、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化
カルシウムのような中性塩の添加（０，２Ｍ〜１．０Ｍ
）により増加させることができる。また、溶出剤中にエ
チレングリコール、プロピレングリコールなどの疎水的
相互作用を弱める溶剤を含む場合、ｐＨ５〜８での溶出
が可能になる。
決定される。例えば、高イオン強度下ではｐＨ６〜８で
ＦｅＩＦＮは溶出される。このイオン強度は、リン酸、
酢酸、クエン酸、ホウ酸、トリス・塩酸などの緩衝液の
濃度を上げたり、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化
カルシウムのような中性塩の添加（０，２Ｍ〜１．０Ｍ
）により増加させることができる。また、溶出剤中にエ
チレングリコール、プロピレングリコールなどの疎水的
相互作用を弱める溶剤を含む場合、ｐＨ５〜８での溶出
が可能になる。
溶出剤の組成や濃度、液量は特に限定されるものではな
く、それぞれ材料とした粗ＦｅＩＦＮ中に含まれる夾雑
蛋白質を除去するのに有効で、ｐＨを保持するのに必要
な濃度、吸着されたＦｅＩＦＮを実質的に回収するのに
必要な量が用いられる。
く、それぞれ材料とした粗ＦｅＩＦＮ中に含まれる夾雑
蛋白質を除去するのに有効で、ｐＨを保持するのに必要
な濃度、吸着されたＦｅＩＦＮを実質的に回収するのに
必要な量が用いられる。
このようにしてＦｅＩＦＮをブルー担体に吸着・溶離さ
せることにより、粗ＦｅＩＦＮ中に混在していた夾雑蛋
白質を除去して、選択的にＦｅＩＦＮを精製分離するこ
とができる。
せることにより、粗ＦｅＩＦＮ中に混在していた夾雑蛋
白質を除去して、選択的にＦｅＩＦＮを精製分離するこ
とができる。
また、本発明方法は、他のアフィニティークロマトグラ
フィーと組合わせて使用することもできる。他のアフィ
ニティ−クロマトグラフィーとしては、銅をキレート結
合させた担体（以下、銅キレート担体と略す）を用いる
方法が好ましく用いられる。また、これらを連続しｔ使
用しても・よい。
フィーと組合わせて使用することもできる。他のアフィ
ニティ−クロマトグラフィーとしては、銅をキレート結
合させた担体（以下、銅キレート担体と略す）を用いる
方法が好ましく用いられる。また、これらを連続しｔ使
用しても・よい。
銅キレート担体としては、アガロース、セルロース、ポ
リアクリルアミドゲルなどに、例えばビスカルボキシメ
チルイミノ基［−（ＣＨ２Ｃ００）ｌ） ２ ］などの
キレート能を有する交換基が結合した担体を硫酸銅など
の銅塩の溶液で処理した担体が挙げられる。好ましくは
、“キレ−ティングセファロース” （Ｐｈａｒｍａｅ
ｉａ社製）などの不溶性多糖類系担体に銅をキレートさ
せた担体が用いられる。
リアクリルアミドゲルなどに、例えばビスカルボキシメ
チルイミノ基［−（ＣＨ２Ｃ００）ｌ） ２ ］などの
キレート能を有する交換基が結合した担体を硫酸銅など
の銅塩の溶液で処理した担体が挙げられる。好ましくは
、“キレ−ティングセファロース” （Ｐｈａｒｍａｅ
ｉａ社製）などの不溶性多糖類系担体に銅をキレートさ
せた担体が用いられる。
また、銅キレート担体からの溶離は、通常、リン酸、酢
酸、クエン酸などの酸性緩衝液で行ない、ｐＨ５以下が
好ましい。しかし、高イオン強度下では、さらに高いｐ
Ｈでの溶液が可能となる。
酸、クエン酸などの酸性緩衝液で行ない、ｐＨ５以下が
好ましい。しかし、高イオン強度下では、さらに高いｐ
Ｈでの溶液が可能となる。
［実 施 例］
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。
。
実施例１
（１） 抗ウイルス活性測定法
ウィルスはＶｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ
Ｖｉｒｕｓ、感受性細胞はネコＦＣ９（文献１）を用
い、ＣＰＥ法に従って抗ウィルス活性を測定した。スタ
ンダードリファレンスとして、ＮＩＨのヒトの天然型α
ｒＦＮ換算したＨｕ Ｉ ＦＮαを用いた。
Ｖｉｒｕｓ、感受性細胞はネコＦＣ９（文献１）を用
い、ＣＰＥ法に従って抗ウィルス活性を測定した。スタ
ンダードリファレンスとして、ＮＩＨのヒトの天然型α
ｒＦＮ換算したＨｕ Ｉ ＦＮαを用いた。
形質転換大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ （ｐＦｅＩＦＮｌ）（微
工研条寄第１６３３号）から文献４の方法で抽出したプ
ラスミドｐＦｅＩＦＮ１ ２０μｇを制限酵素Ｓ ｆ
ａＮｌ、ＨｉｎｃＩＩで完全分解し、得られた複数のＤ
ＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分け、約７５０ｂ
ｐのＤＮＡ断片をエレクトロエリューションで取り出し
、約２μｇを回収した。こうして、ＦｅＩＦＮをコード
するＤＮＡを含む５ｆａＮ１−ＨｉｎｃｌＩ断片を得た
。
工研条寄第１６３３号）から文献４の方法で抽出したプ
ラスミドｐＦｅＩＦＮ１ ２０μｇを制限酵素Ｓ ｆ
ａＮｌ、ＨｉｎｃＩＩで完全分解し、得られた複数のＤ
ＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分け、約７５０ｂ
ｐのＤＮＡ断片をエレクトロエリューションで取り出し
、約２μｇを回収した。こうして、ＦｅＩＦＮをコード
するＤＮＡを含む５ｆａＮ１−ＨｉｎｃｌＩ断片を得た
。
クローニングベクターｐＢＭＯ３０（文献３）５μｇを
制限酵素Ｂｇｌｎ、ＳｍａＩで完全分解し、上記の５ｆ
ａＮ１−ＨｉｎｃＩＩ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼでライ
ゲーションした。この反応液をコンピテント化したＥ、
ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ（全酒造製）と混合し、形質転
換を行なった。１００μｇ ／ ｍｌのアンピシリンを
含むＬＢプレート上に生育するコロニーの中から、アル
カリミニスクリーン法で抽出したプラスミドのＨｉｎｄ
Ｉ［［での制限分析により、クローニングベクターｐＢ
Ｍ０３０に約７５０ｂｐのＤＮＡ断片が組み込まれてい
るプラスミドを得た。そのプラスミドのＦｅＩＦＮをコ
ードするＤＮＡの開始コドンを含む約１００ｂａｓｅの
ＤＮＡシーケンスを行なって、ｐＢＭＯ３０にＦｅＩＦ
ＮをコードするＤＮＡが組み込まれているプラスミドを
得た。この組換え体プラスミドをｐＢｍＦｅＩＦＮｌと
した。ｐＢｍＦｅＩＦＮｌの作製法を第１図に示す。
制限酵素Ｂｇｌｎ、ＳｍａＩで完全分解し、上記の５ｆ
ａＮ１−ＨｉｎｃＩＩ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼでライ
ゲーションした。この反応液をコンピテント化したＥ、
ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ（全酒造製）と混合し、形質転
換を行なった。１００μｇ ／ ｍｌのアンピシリンを
含むＬＢプレート上に生育するコロニーの中から、アル
カリミニスクリーン法で抽出したプラスミドのＨｉｎｄ
Ｉ［［での制限分析により、クローニングベクターｐＢ
Ｍ０３０に約７５０ｂｐのＤＮＡ断片が組み込まれてい
るプラスミドを得た。そのプラスミドのＦｅＩＦＮをコ
ードするＤＮＡの開始コドンを含む約１００ｂａｓｅの
ＤＮＡシーケンスを行なって、ｐＢＭＯ３０にＦｅＩＦ
ＮをコードするＤＮＡが組み込まれているプラスミドを
得た。この組換え体プラスミドをｐＢｍＦｅＩＦＮｌと
した。ｐＢｍＦｅＩＦＮｌの作製法を第１図に示す。
（３）ＦｅＩＦＮをコードするＤＮＡで組換えられ文献
３の方法で組換え体ウィルスを作製した。
３の方法で組換え体ウィルスを作製した。
すなわち、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッフｙ−ｐＨ７，
１，０，２８Ｍ ＮａＣ１，０，７ｍＭＮａ２ＨＰＯ
４，０，７ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４からなる２、５ｍｌ
の溶液に、２．５ｍｌのＤＮＡ混合液（０，２５Ｍ
ＣａＣｌ２、カイコ核多角体病ウィルスＢｍＮＰＶ
Ｔａ株（文献３）のＤＮＡ混合液ｇ、組換え体プラスミ
ドｐＢｍＦｅｌＦＮ１のＤＮＡ混合液ｇを含む）を滴下
し、生じた懸濁液の０．５ｍｌを５ｍｌの１０％ＦＢＳ
を添加したＴＣ−１０培地（文献５）中、２５ａＩｒの
フラスコで平面培養した約３Ｘ１０５個のＢＭ−Ｎ細胞
（文献３）の培養基に加え、カイコ細胞にＤＮＡを導入
した。２０日間後、新鮮な培地と交換し、さらに５日間
培養後、培養液を回収した。その培養液を遠心して清澄
化した上清を希釈して、平面に培養したＢＭ−Ｎ細胞の
培養基に添加して７日間培養後、顕微鏡観察によりウィ
ルス感染が見られ、かつ多角体が形成していない培養基
を選択した（限界希釈法）。限界希釈法を２回繰り返す
ことによって組換え体ウィルスをクローニングし、ここ
で作製したＦｅＩＦＮをコードするＤＮＡを含む組換え
体ウィルスをＢｍＦｅ Ｉ ＦＮＩとした。
１，０，２８Ｍ ＮａＣ１，０，７ｍＭＮａ２ＨＰＯ
４，０，７ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４からなる２、５ｍｌ
の溶液に、２．５ｍｌのＤＮＡ混合液（０，２５Ｍ
ＣａＣｌ２、カイコ核多角体病ウィルスＢｍＮＰＶ
Ｔａ株（文献３）のＤＮＡ混合液ｇ、組換え体プラスミ
ドｐＢｍＦｅｌＦＮ１のＤＮＡ混合液ｇを含む）を滴下
し、生じた懸濁液の０．５ｍｌを５ｍｌの１０％ＦＢＳ
を添加したＴＣ−１０培地（文献５）中、２５ａＩｒの
フラスコで平面培養した約３Ｘ１０５個のＢＭ−Ｎ細胞
（文献３）の培養基に加え、カイコ細胞にＤＮＡを導入
した。２０日間後、新鮮な培地と交換し、さらに５日間
培養後、培養液を回収した。その培養液を遠心して清澄
化した上清を希釈して、平面に培養したＢＭ−Ｎ細胞の
培養基に添加して７日間培養後、顕微鏡観察によりウィ
ルス感染が見られ、かつ多角体が形成していない培養基
を選択した（限界希釈法）。限界希釈法を２回繰り返す
ことによって組換え体ウィルスをクローニングし、ここ
で作製したＦｅＩＦＮをコードするＤＮＡを含む組換え
体ウィルスをＢｍＦｅ Ｉ ＦＮＩとした。
ＢｍＦｅＩＦＮｌは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎ ｏｆＡｎｉｍａｌ Ｃｅ１ｌ Ｃｕｔｕｒｅ
ｓにブダペスト条約に基づき寄託されている（Ａｃｃｅ
ｓｓｉｏｎ Ｎｏ、 Ｖ８９０６２７０１）。
ｔｉｏｎ ｏｆＡｎｉｍａｌ Ｃｅ１ｌ Ｃｕｔｕｒｅ
ｓにブダペスト条約に基づき寄託されている（Ａｃｃｅ
ｓｓｉｏｎ Ｎｏ、 Ｖ８９０６２７０１）。
（４）組換え体ウィルス液の調製
７５ｃｏｆのフラスコ底面で、１５ｍ１の１０％ＦＢＳ
を含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０６の
ＢＭ−Ｎ細胞に、前記（３）でクローニングした組換え
体ウィルスを含むＢＭ−Ｎ細胞の培養液５０μｌをＢＭ
−Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間培養後、培養液を
３．ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心分離して遠心上清を組換
え体ウィルス液として得た。それぞれのウィルス液を１
０−７希釈し、その１ｍｌをＢＭ−Ｎ細胞の培養基に添
加して２７℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によ
って培養基のＢＭ−Ｎ細胞にウィルス感染が認められた
。
を含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０６の
ＢＭ−Ｎ細胞に、前記（３）でクローニングした組換え
体ウィルスを含むＢＭ−Ｎ細胞の培養液５０μｌをＢＭ
−Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間培養後、培養液を
３．ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心分離して遠心上清を組換
え体ウィルス液として得た。それぞれのウィルス液を１
０−７希釈し、その１ｍｌをＢＭ−Ｎ細胞の培養基に添
加して２７℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によ
って培養基のＢＭ−Ｎ細胞にウィルス感染が認められた
。
（５）カイコ生体中でのＦｅＩＦＮの生産５令１日目の
カイコ幼虫に、（４）で得た組換え体ウィルスのウィル
ス液をそれぞれ５０μｌ／頭注射し、２５℃で４日間、
市販の合成飼料（ビタミルク販売株式会社）を与えて飼
育後、尾脚を切り、体液を氷冷したエッペンドルフ・チ
ューブに採取し、遠心し、上清を得、抗ウィルス活性を
調べた。
カイコ幼虫に、（４）で得た組換え体ウィルスのウィル
ス液をそれぞれ５０μｌ／頭注射し、２５℃で４日間、
市販の合成飼料（ビタミルク販売株式会社）を与えて飼
育後、尾脚を切り、体液を氷冷したエッペンドルフ・チ
ューブに採取し、遠心し、上清を得、抗ウィルス活性を
調べた。
７．７Ｘ１０７単位／ｍｌ（体液）のＦｅＩＦＮが生産
されていた。
されていた。
（６） 組換えカイコ核多角体病ウィルスの失活０．
１ｍｌ当たり４Ｘ１０８ＴＣＩＤ５ｏの組換えカイコ核
多角体病ウィルスＢｍＦｅ Ｉ ＦＮＩを含むカイコ体
液を、０．ＩＮ塩酸でｐＨ１，５にして４℃で１日保存
した。２Ｎ ＮａＯＨ溶液で中和し、その１ ｍｌを
ＢＭ−Ｎ細胞の培養液に添加したがＢＭ−Ｎ細胞はウィ
ルス感染しなかった。
１ｍｌ当たり４Ｘ１０８ＴＣＩＤ５ｏの組換えカイコ核
多角体病ウィルスＢｍＦｅ Ｉ ＦＮＩを含むカイコ体
液を、０．ＩＮ塩酸でｐＨ１，５にして４℃で１日保存
した。２Ｎ ＮａＯＨ溶液で中和し、その１ ｍｌを
ＢＭ−Ｎ細胞の培養液に添加したがＢＭ−Ｎ細胞はウィ
ルス感染しなかった。
塩酸によって組換え体ウィルスＢｍＦｅｌＦＮ１を失活
させ、ＮａＯＨ溶液によって中和したカイコ体液と粗Ｆ
ｅＩＦＮ溶液とした。
させ、ＮａＯＨ溶液によって中和したカイコ体液と粗Ｆ
ｅＩＦＮ溶液とした。
（７）ブルー色素を結合させた担体を用いたＦｅＩＦＮ
の精製 前記（６）項の３．８Ｘ１０６Ｕ／ｍｌのＦｅＩＦＮ活
性を含み、ＦｅＩＦＮ比活性が１．２Ｘ１０６Ｕ／ｍｇ
蛋白質である粗ＦｅＩＦＮ溶液１４．５１を、“ブルー
セファロース（ファースト・フロータイブ）２７０ｍ１
を含むカラムにかけ、続いてこのカラムを０．５Ｍ塩化
カリウムを含む５０ｍＭ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８）
１２５０ｍｌで洗浄した後、１Ｍ塩化カリウムを含む５
０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８）１．０８１および
１Ｍ塩化カリウム、４０％エチレングリコールを含む５
０ｍＭ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８）１，０８１でＦｅ
ＩＦＮを溶出した。溶出されたＦｅＩＦＮは４．２Ｘ１
０７Ｕ／ｍｌのＦｅ１ＦＮ活性を含み、比活性１．ｌＸ
１０８Ｕ／■蛋白質であった。このときのＦｅ１ＦＮ活
性回収率は８２．４％で、比活性は９２倍に上昇した。
の精製 前記（６）項の３．８Ｘ１０６Ｕ／ｍｌのＦｅＩＦＮ活
性を含み、ＦｅＩＦＮ比活性が１．２Ｘ１０６Ｕ／ｍｇ
蛋白質である粗ＦｅＩＦＮ溶液１４．５１を、“ブルー
セファロース（ファースト・フロータイブ）２７０ｍ１
を含むカラムにかけ、続いてこのカラムを０．５Ｍ塩化
カリウムを含む５０ｍＭ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８）
１２５０ｍｌで洗浄した後、１Ｍ塩化カリウムを含む５
０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８）１．０８１および
１Ｍ塩化カリウム、４０％エチレングリコールを含む５
０ｍＭ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８）１，０８１でＦｅ
ＩＦＮを溶出した。溶出されたＦｅＩＦＮは４．２Ｘ１
０７Ｕ／ｍｌのＦｅ１ＦＮ活性を含み、比活性１．ｌＸ
１０８Ｕ／■蛋白質であった。このときのＦｅ１ＦＮ活
性回収率は８２．４％で、比活性は９２倍に上昇した。
（８）銅をキレート結合させた担体を用いたＦｅＩＦＮ
の精製 前記（７）項のブルー担体からのＦｅＩＦＮ溶出液１．
０８１を、銅をキレート結合させた“キレ−ティングセ
ファローズ”１５０ ｍｌを含むカラムに直接かけ、０
．３Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
４，２）で洗浄後、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む２０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３，９）７５０ｍｌでＦｅＩＦＮ
を溶出した。溶出されたＦｅＩＦＮは２．７Ｘ１０７Ｕ
／ｍｌのＦｅＩＦＮ活性を含み、比活性１．４Ｘ１０８
Ｕ／■蛋白質であった。このときのＦｅＩＦＮ活性回収
率は４５％で、比活性は１．３倍に上昇した。
の精製 前記（７）項のブルー担体からのＦｅＩＦＮ溶出液１．
０８１を、銅をキレート結合させた“キレ−ティングセ
ファローズ”１５０ ｍｌを含むカラムに直接かけ、０
．３Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
４，２）で洗浄後、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む２０
ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３，９）７５０ｍｌでＦｅＩＦＮ
を溶出した。溶出されたＦｅＩＦＮは２．７Ｘ１０７Ｕ
／ｍｌのＦｅＩＦＮ活性を含み、比活性１．４Ｘ１０８
Ｕ／■蛋白質であった。このときのＦｅＩＦＮ活性回収
率は４５％で、比活性は１．３倍に上昇した。
［発明の効果コ
本発明によれば、ネコの抗ウィルス剤、抗腫瘍剤として
期待されるＦｅＩＦＮを高純度で、かつ大量生産するこ
とができる。
期待されるＦｅＩＦＮを高純度で、かつ大量生産するこ
とができる。
［参考文献］
（１） Ｊ、 Ｋ、 Ｙａｍａｍｏｔｏら： Ｙｅｔ
、 １ｍｍｕｎｏ１． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ。
、 １ｍｍｕｎｏ１． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎ。
ｐａｔｈｏｌ、 、 Ｉｆ、 １−１９． （１
９８６）。
９８６）。
（２） Ａ、Ｙａｎａｉ ら：ヨーロッパ公開特許
第３２２８７０号 （３） Ｔ、Ｈｏｔｉｕｃｈｉら： Ａｇｒｉｃ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 、 ５１． １５７３−１５８
０． （１９８７） （４） Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら編：Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ｅｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、 （１９８２） ｐ８６〜９６．
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｔｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
第３２２８７０号 （３） Ｔ、Ｈｏｔｉｕｃｈｉら： Ａｇｒｉｃ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 、 ５１． １５７３−１５８
０． （１９８７） （４） Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら編：Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ｅｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、 （１９８２） ｐ８６〜９６．
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｔｂｏｒ Ｌａｂｏ
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（５） Ｇ、ＲｌＧａｒｄｉｎｅｒ ａｎｄ ＨｌＳ
ｔｏ、ｃｋｄａｌｅ ： １． Ｉｎｖｅｒｔｅｂ
ｒａｔｅ ＰａｔｈｏｌｏｇＦ、 ２５． ３６３−
３７０． （１９７５）。
ｔｏ、ｃｋｄａｌｅ ： １． Ｉｎｖｅｒｔｅｂ
ｒａｔｅ ＰａｔｈｏｌｏｇＦ、 ２５． ３６３−
３７０． （１９７５）。
第１図は、ネコインターフェロンをコードするＤＮＡを
含む組換え体プラスミドｐＢｍＦｅＩＦＮ１の作製例の
概略図である。 特許出願人 東 し 株 式 会 社第１図
含む組換え体プラスミドｐＢｍＦｅＩＦＮ１の作製例の
概略図である。 特許出願人 東 し 株 式 会 社第１図
Claims (1)
- （１）ネコインターフェロンの蛋白質をコードするＤＮ
Ａにより遺伝子組換えされた組換えカイコ核多角体病ウ
ィルスを、カイコ生体中で増殖させてネコインターフェ
ロンを生産させた後、生産されたネコインターフェロン
を含む溶液を、ブルー色素を結合させた担体に接触させ
、次いで該担体への吸着物を溶出剤で溶出させることを
特徴とする高純度ネコインターフェロンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2173299A JP2629411B2 (ja) | 1990-06-28 | 1990-06-28 | 高純度ネコインターフェロンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2173299A JP2629411B2 (ja) | 1990-06-28 | 1990-06-28 | 高純度ネコインターフェロンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0459800A true JPH0459800A (ja) | 1992-02-26 |
| JP2629411B2 JP2629411B2 (ja) | 1997-07-09 |
Family
ID=15957871
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2173299A Expired - Fee Related JP2629411B2 (ja) | 1990-06-28 | 1990-06-28 | 高純度ネコインターフェロンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2629411B2 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0322870A2 (en) * | 1987-12-29 | 1989-07-05 | Toray Industries, Inc. | Synthetic plasmid, transformant, feline interferon gene and method for producing feline interferon |
-
1990
- 1990-06-28 JP JP2173299A patent/JP2629411B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0322870A2 (en) * | 1987-12-29 | 1989-07-05 | Toray Industries, Inc. | Synthetic plasmid, transformant, feline interferon gene and method for producing feline interferon |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2629411B2 (ja) | 1997-07-09 |
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