JPH0460600B2 - - Google Patents

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JPH0460600B2
JPH0460600B2 JP63251028A JP25102888A JPH0460600B2 JP H0460600 B2 JPH0460600 B2 JP H0460600B2 JP 63251028 A JP63251028 A JP 63251028A JP 25102888 A JP25102888 A JP 25102888A JP H0460600 B2 JPH0460600 B2 JP H0460600B2
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oligonucleotides
amino
nucleoside
dna
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Emu Sumisu Roido
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KARIFUORUNIA INST OBU TEKUNOROJII
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Publication of JPH0460600B2 publication Critical patent/JPH0460600B2/ja
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、脂肪族アミノ基を有するオリゴヌク
レオチドを含有する組成物及びその製造方法に関
するものである。
従来の技術 オリゴヌクレオチドは、所定順序における４種
類のヌクレオチドの線状配列よりなる短鎖重合体
である。ヌクレオチドのサブユニツトはホスホジ
エステル結合により結合されて、１個のヌクレオ
チドの3′ヒドロキシル部分を次のヌクレオチドの
5′ヒドロキシ部分に結合させる。オリゴヌクレオ
チドの例は5′ApCpGpTpApTpGpGpCp3′であ
る。記号Ａ，Ｃ，Ｇ及びＴはデオキシリボースの
１−位置に結合されたプリン若しくはピリミジン
塩基の特性を意味する。すなわちＡはアデニン、
Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミジンであ
る。記号ｐはホスホジエステル結合を示す。オリ
ゴヌクレオチドの部分構造を第１図に示す。
本発明の単一鎖オリゴヌクレオチドは、さらに
ヌクレオシドサブユニツトの配列に関しホモジニ
アスであることを特徴とし、さらに均一な分子量
を有する。
合成オリゴヌクレオチドは、最近の分子生物学
及び組換DNA技術における強力な武器である。
これらの分子に対する用途は多く、たとえば(a)遺
伝子産物の蛋白配列に基づく特定の遺伝子の単離
のためのプローブとして、(b)所望の遺伝子の試験
管内突然変異を指令するため、(c)単一鎖鋳型上に
おけるDNA合成のプライマーとして、(d)遺伝子
の全合成における手順としてなど多くの用途が含
まれ、これらについてはダブリユエム・アール・
バール（Wm.R.Bahl）等、プログレツシブ・ヌ
クレイツク・アシツド・リサーチ・モレキユラ・
バイオロジー、第21巻、第101頁（1978）を参照
することができる。
したがつて、この種のオリゴヌクレオチドの効
率的な化学合成法を開発するため極めて多くの努
力が払われている。現在まで開発されているこれ
ら方法の簡単な説明はジー・シー・クロケツト
（Crockett，G.C）、アルドリヒミカ・アクタ、第
16(3)巻、第47−55頁（1983）に見られる。現在使
用し得る最良の方法は、ヌクレオシドのホスホル
アミダイド誘導体を固相合成法と組み合せて利用
する〔マテウツチ等、ジヤーナル・アメリカン・
ケミカル・ソサエテイー、第103巻、第3185頁
（1981）及びポーケージ等、M.H.テトラヘドロ
ン・レター、第22(20)巻、第1858−1862頁
（1981）〕。30個までの塩基の長さよりなるオリゴ
ヌクレオチドはこのような常法にしたがつて作成
することができ、50個塩基の程度の長さの分子も
作成されている。この技術を使用する装置も現在
市販されている。
DNAの誘導体化に関する他の報告も文献に見
られる。修飾ヌクレオシド三燐酸が開発されてお
り、ここでピオチン基はウラシルの５位置におけ
る脂肪族アミノ基に結合されている〔ランガー
等、ブロシーデイング・ナシヨナル・アカデミ
ー・サイエンス、U.S.A.第78巻、第6633−6637
頁（1981）〕。このヌクレオチド誘導体は二重鎖
DNA中に効果的に組み込まれる。DNAに組み込
まれると、これは抗ビオチン抗体により結合さ
れ、次いでこれを蛍光法又は酵素法により検出す
るために使用することができる。ランガー等の方
法により組み込まれたビオチン結合ヌクレオシド
を有するDNAはより小さい単一鎖及び二重鎖の
ものに断片化され、これらはヌクレオシドサブユ
ニツトの配列についてヘテロジニアスであつて、
分子量が異なつている。ドレーパー及びゴールド
〔バイオケミストリー、第19巻、第1774−1781頁
（1980〕は、重亜硫酸塩で触媒されたアミノ交換
反応及びその後の蛍光性標識との反応による脂肪
族アミノ基の導入を報告している。ドレーパー及
びゴールドの報告においては、アミノ基をピリミ
ジン塩基に直接結合させる。このように結合した
アミノ基は水素結合を抑制し、この理由でこれら
物質はハイブリツド化などに有用でない。チユー
等〔ヌクレイツク・アシツド・リサーチ、第11(1
８）巻、第6513−6529頁、（1983）〕は、アミンをオ
リゴヌクレオチド又は核酸の末端5′燐酸塩に結合
させる方法を報告している。
多くの理由で他の化学物質を合成オリゴヌクレ
オチドに共有結合させる方法が望まれている。オ
リゴヌクレオチドに結合された蛍光染料は、放射
性同位元素をこれらが使用される研究、診断及び
臨床法から排除することを可能にし、かつ使用寿
命及び入手性を向上させる。DNA配列決定装置
のための本出願人による特許出願に記載したよう
に、蛍光標識したオリゴヌクレオチドの合成は
DNA配列決定法の自動化を可能にする。適当な
技術の開発及び蛍光標識したオリゴヌクレオチド
の検出及び使用に対する装置化は、現在面倒な他
の実験的及び臨床的技術の自動化を可能にする。
たとえばシユルツ（Schultz）等によりジヤーナ
ル・アメリカン・ケミカル・ソサエテイー、第
104巻、第6861頁（1982）に開示されたもの及び
ヘルツベルク（Hertzberg）等によりジヤナル・
アメリカン・ケミカル・ソサエテイー、第104巻、
第313頁（1982）に開示されたようなDNA開裂薬
品の結合は合成制限酵素の作成を可能にし、その
特異性はオリゴヌクレオチド配列により指令され
る。
発明が解決しようとする問題点 本発明は、遊離脂肪族アミノ基を合成オリゴヌ
クレオチドに導入する一般的方法を提供する。こ
のアミノ基は各種のアミノ反応性官能基と容易か
つ特異的に反応し、それにより広範な種類の化学
物質の共有結合を可能にする。
問題点を解決するための手段 要するに、本発明は、検出可能な成分に結合さ
れた新規な脂肪族アミノ誘導化単一鎖オリゴヌク
レオチドからなり、検出可能な成分は発色団、蛍
光剤、蛋白質、酵素などの「標識」である。
さらに、本発明はホスホルアミダイト先駆体を
介して少なくとも１種のアミノ誘導化ヌクレオシ
ドを挿入した新規なオリゴヌクレオチドをも包含
する。
他の面において、本発明は固相支持体上のオリ
ゴヌクレオチドの合成方法をも包含し、ここでオ
リゴヌクレオチドは保護されたアミノ誘導化ヌク
レオシドホスホルアミダイトと反応させる。
本発明は、一面において、合成された分子5′−
トリフルオロアセトアミド−5′−デオキシ−3′−
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミドチミジン
（第２図）及び固相オリゴヌクレオチド合成にお
ける最後の付加としての5′末端に対するその付加
である。オリゴヌクレオチドの開裂及び保護解除
の際、トリフルオロアセチル基は加水分解されて
遊離の脂肪族アミノ基をオリゴヌクレオチドの
5′末端に残す。このアミノ誘導化されたオリゴヌ
クレオチドは次いで広範な種類のアミノ反応性分
子のいずれかと反応して、対応するオリゴヌクレ
オチド誘導体を生成することができる。これは、
5′炭素ではなく塩基部分に保護脂肪族アミノ基を
有する修飾ヌクレオシドを使用する一般的方法の
特殊な例である。この種の分子は、数個の遊離ア
ミノ基をオリゴヌクレオチドの内部にかつオリゴ
ヌクレオチド配列における所望位置に組み込むこ
とを可能にする。
本発明の目的は、DNA配列決定に使用しうる
新規な試薬及び技術を提供することである。
さらに本発明の目的は、遺伝病の検出及び他の
目的に対するDNAハイブリツト化の改良を提供
することである。
本発明のこれら及びその他の目的及び利点は、
以下の記載から当業者には明らかとなるであろ
う。
脂肪族アミノ基をオリゴヌクレオチド中へ導入
するために使用する方法は、保護された脂肪族ア
ミノ基を含有するヌクレオシド同族体の3′ホスホ
ルアミダイト誘導体を合成することである。次い
で、このホスホルアミダイトを、非誘導化ヌクレ
オシドホスホルアミダイトの反応と同様な方法
で、固体支持体上で合成されるオリゴヌクレオチ
ドと反応させることができる。固相からの開裂及
び塩基成分と脂肪族アミノ基との保護解除はアミ
ノ誘導化オリゴヌクレオチドを与える。
例 １ の合成：第３図には、市販化合物（チミジ
ン）からの化合物の合成を示す。化合物〜
の合成はホロヒツツ（Horowit）等、ジヤーナ
ル・オーガニツク・ケミストリー、第27巻、第
3045−3048頁（1962）に開示され、さらにギブス
（Gibbs）及びオルゲル（Orgel）、ジヤーナル・
カーボハイドレーツ−ヌクレオシズ・アンド・ヌ
クレオチズ、第３（５及び６）巻、第315−334頁
（1976）に開示されている。化合物及びの合
成は次の通りである。
例 5′−トリフルオロアセタミド−5′−デオキシチ
ミジン（）：1.25ｇ（５ミリモル）の5′−アミ
ノ−5′−デオキシチミジンを25mlの乾燥ジメチル
ホルムアミドに溶解させた。これに1.3ml（10ミ
リモル）のＳ−エチルトリフルオロチオアセテー
ト（アルドリツチ社）を加えた。反応物を室温で
静かに攪拌した。MeOH：アセトン１：１で行
なつたシリカゲルＦ−254プレートにおける前記
反応混合物のTLCは、短波長UVにより検出され
る生成物の単一スポツトを示す。この生成物は、
殆んど移動しない出発化合物に対比してこの溶
剤系において高移動性を有する。
反応混合物を減圧下で回転式に蒸発させ、30ml
のイソプロパノールの三角フラスコに移し、沸と
うイソプロパノール：MeOHから再結晶化させ
た。収率＝1.315ｇ（3.9ミリモル、80％収率）、
融点261°−262℃（分解）、分析予測値Ｃ 42.7
％、Ｈ 4.18％ Ｎ 12.5％；実験値Ｃ 42.7％、
Ｈ 4.16％、Ｎ 12.4％。の構造をさらにＨ
NMRにより確認した。
例 この例は、保護されたアミノ誘導化ヌクレオシ
ドホスホルアミダイトの製造を示している。
5′トリフルオロアセタミド−5′−デオキシ−
3′−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミドチミ
ジン（）：全てガラス製品であるこの反応に使
用した注射器及び毛細管は、乾燥オープン内で１
晩焼成した。ジメチルホルムアミド（DMF）は、
４〓のモレキユラシープ（リンデ社）で貯蔵し
た。ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）は、
水酸化カリウムから、次いで水酸化カルシウムか
ら蒸留し、そして４〓のモレキユラシープで貯蔵
した。
攪拌棒を備える乾燥した三首の50ml丸底フラス
コに63mg（0.19ミリモル）の化合物Ｖを加えた。
三首にはそれぞれゴム栓を施し、これら栓に針を
挿入した。このフラスコを、乾燥CaCl2のデシケ
ータにおいて数時間減圧した。フラスコを乾燥窒
素ガスの静かな流れの下に保ち、２mlの乾燥
DMFを注射器で加えた。60μのDIPEA（0.34ミ
リモル）を乾燥100μ毛細管で加えた。40μの
クロル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノメトキシ
ホスフイン（アメリカン・ビオヌクレア社、カリ
ホルニア州、エメルピル在）を加えた（乾燥
100μ毛細管による）。反応物を全出発物質が溶
解するまで静かに攪拌し、次いで室温に静置した
（常にN2の下で）。１時間後、HCCl3：EtOH：
Et3Ｎ＝88：10：２におけるシリカゲルＦ−254プ
レート上のTLCは、出発物質Ｖよりもずつと移
動度の高い生成物の単一スポツトを示した。ヌク
レオシドホスホルアミダイト(4)につき記載したと
同様な方法で、この生成物を精製する試みは、生
成物の分解により不成功に終つた。したがつて、
粗製反応混合物を、固相支持体上の合成オリゴヌ
クレオチドに対する結合のために直接使用した。
の構造は、オリゴヌクレオチドへの付加におけ
るこの生成物の反応性及び文献の結果に基づく反
応の予想生成物から推定される。
例 この例は、ホスホジエステル結合を介して5′−
アミノ−5′−デオキシチミジンの3′−ヒドロキシ
ルに対し5′末端で結合されたオリゴヌクレオチド
の製造を示している。
オリゴヌクレオチドの5′−末端に対するの付
加：3′末端にて固相に結合された配列5′OH−
AGC ACT TTT AGA GT 3′ の塩基保護さ
れた合成オリゴヌクレオチドを、カリフオルニア
州・フオスターシテイー在、アプライド・バイオ
システムス・インコーポレーシヨン社により発行
された「固体支持体上のジメトキシトリチルヌク
レオシドホスホルアミダイトを用いるデオキシオ
リゴヌクレオチドの合成法」と題する論文に詳細
に記載された方法により作成した。オリゴヌクレ
オチドととの反応の相違点は、(a)工程4.22及び
4.23の代りにを含有する新たに調製された反応
混合物１mlをアセトニトリル中の0.5Mテトラゾ
ール１mlと混合し、これを反応容器に加えるこ
と、(b)工程4.33の後にアセトニトリルで30秒間に
わたり２回洗浄すること、及び(c)キヤツピング工
程５を省略すること（後の付加における未反応ヒ
ドロキシル基の分析を可能にする）である。
結合反応の効率は、比色分析を可能にする「正
常」なホスホルアミダイトとの結合及びジメトキ
シトリチル基の開裂により容易に監視される。オ
リゴヌクレオチドの5′−ヒドロキシル基がと最
初の結合で反応すれば、これはもはや後の結合に
おいて反応に利用されず、第２結合の後のDCA
処理に際し殆んど発色しない。この例において、
DMT基に対するOD450＝1.12（希釈後）が、と
反応する前のオリゴヌクレオチドから発生した。
DMTに対するOD450＝0.026（希釈後）が、との
反応後に加えられたＧ残基から発生した。したが
つて、5′−OH基の98％がとの反応により保護
された。このオリゴヌクレオチドを保護解除し、
かつチオフエノールと濃厚NH4OHとによる常法
での処理によつて固相から開裂させ、そして
NH4OHを減圧下で除去した。オリゴヌクレオチ
ドを１mlの蒸留水に溶解させた。OD280はこの溶
液につき128であり、これはDNAの濃度が4.5
mg／mlであることを示す。この溶液50μを水で
１mlまで希釈し、そして数百（100〜200）mgの
AG50W−X4（ナトリウム型）イオン交換樹脂と
15分間混合して、DNAをアンモニウム塩からナ
トリウム塩に交換させた（アンモニウムイオンは
後のニンヒドリン分析を阻害する）。この樹脂を
遠心分離により除去し、上澄液をサバント型回転
濃縮機で乾燥した。定量ニンヒドリン分析〔ヴ
イ・ケー・サリン（Sarin，V.K.）等、アナリチ
カル・バイオケミストリー、第117巻、第147−
157頁（1981）〕はオリゴヌクレオチド１モル当り
約１モルのアミノ基を与えた（オリゴヌクレオチ
ドのモル濃度は計算吸光係数E260＝1.55×105から
ヌクレオチド組成に基づいて決定した）。が結
合されてない比較オリゴヌクレオチドの同モル量
に対するニンヒドリン分析は、アミノ陽性反応を
示さなかつた。
例 ５ 染料との結合：100μのアミノオリゴヌクレ
オチドの上記溶液へ、200μのH2Ｏと50μの１
モル炭酸塩／重炭酸緩衝液（PH9.0）と25μの新
たに調製した10mg／mlのフルオレセインイソチオ
シアネート（FITC）（オレゴン州、ジヤンクシ
ヨンシテイー在、モレキユラー・ブローブス・イ
ンコーポレーシヨン社）とのジメチルスルホキシ
ドにおける溶液を加えた。この混合物を室温に数
時間放置し、そしてH2Ｏ中のセフアデツクスＧ
−25媒体のカラム（１cm×９cm）に対するクロマ
トグラフイーにより精製した。黄色生成物が溶出
容量に溶出され、これを未反応染料から綺麗に分
離した。が反応していないオリゴヌクレオチド
との比較反応は、カラムの溶出容量に殆んど全く
着色を与えず、これはこの染料が実際に添加され
たアミノ基と反応したことを示している。染料−
オリゴヌクレチド結合物はOD260＝2.3、OD493＝
0.54を有した。FITCにつきE495＝７×104に基づ
いて、これは7.7μモルの染料溶液を与える。E260
＝1.55×105に基づき、DNAは12.8μモルである。
したがつて、およそ60％の（〜60％）DNA分子
が染料により標識された。これは大凡の推定であ
つて、未結合に対する結合したフルオレセインの
吸収における変動を考慮せず、またより短い混入
オリゴヌクレオチド及び非反応オリゴヌクレオチ
ドの変動も考慮していない。この着色DNAのア
リコートを20％ボリアクリルアミドゲルにて電気
泳動にかけ、この長さのオリゴヌクレオチドに適
切な移動度の単一の着色（及び蛍光性）バンドと
して明らかに見られた。
染料結合したオリゴヌクレオチドは、高性能液
体クロマトグラフイー（HPLC）により逆転相
C18カラム（ウオーターズ社）で溶出用としてア
セトニトリル：0.1Mトリエチルアンモニウムア
セテート（PH7.0）勾配を用いて容易に精製され
た。
上記した新規なアミノ誘導化オリゴヌクレオチ
ドには多くの用途が可能である。脂肪族アミノ基
は容易かつ特異的に多数の官能基と反応する。こ
れは、実質的に任意の所望の分子が上記のように
作成されたオリゴヌクレオチドに結合しうること
を意味する。これは酵素、他の蛋白質、蛍光標
識、生物発光性標識、発色団などを包含する。オ
リゴヌクレオチドは、多くの分野にしばしば放射
性標識と組み合せて広く使用されている。非放射
性試料分子を放射性標識の代りに使用することも
できる。これは、オリゴヌクレオチドを使用する
方法をより安価にし、かつ使用を容易となし、さ
らに臨床用途に適合させる。放射性標識は大して
好適でないが、この新規なアミノ誘導化オリゴヌ
クレオチドを、たとえばI125のように放射性標識
することもできる。新規なアミノ誘導化オリゴヌ
クレオチドの用途に関する次の３つの特定例のみ
を例示する： １ 自動化DNA配列決定、 ２ DNAハイブリツド化による遺伝子病の検出、 ３ ハイブリツド化の検出のための蛍光の一般的
使用。
遺伝子異常の検出：オリゴヌクレオチドを使用
して個人の遺伝子型を決定することができる。こ
れは、アミニオセンテシスにより胎児から得られ
たDNA試料につき行なわれる。この情報は、各
種の遺伝子病に対する危険において夫婦の遺伝子
カウンセリングに対し不変である。成人の遺伝子
型をも決定して、効果的診断及び早期の処置を可
能にする。この技術の顕著な１例は、鎌状赤血球
貧血症の検出である〔コナー（Connor）等、プ
ロシーデイング・ナシヨナル・アカデミー・サイ
エンス、U.S.A.第80巻、第278頁（1983）〕。19個
の塩基対長さの合成オリゴヌクレオチドを合成
し、一方は正常なヒトβ−グロビン遺伝子（βA）
に対し補完的であり、かつ一方は鎌状赤血球β−
グロビン遺伝子（βS）に対し補完的である。これ
らの分子を放射能標識し、DNAハイブリツド化
における試料として使用した。適当なハイブリツ
ド化条件の下で、これら試料を使用してβA遺伝子
をβS対立遺伝子から区別することができる。これ
は鎌状赤血球貧血症の診断を可能にする。より一
般的には、コナー等の文献に指摘されたように、
「オリゴヌクレオチドの対立遺伝子特異性のハイ
ブリツド化特性は、単一コピー遺伝子のDNA配
列におけるポイント突然変異を含む任意の遺伝子
病の一般的診断方法を与える」。本発明はこの技
術に直接使用することができる。アミノ基を有す
るオリゴヌクレオチド試料を作成し、これに蛍光
標識をラベルする。蛍光性試料分子は放射性試料
の短い寿命と比べて無限に安定であり、使用又は
取り扱いに関し特殊の注意を必要としない。この
ことは、臨床用途においてこの方法を極めて好適
となし、これが事実上使用しうる主たる領域であ
る。
オリゴヌクレオチド試料は、研究並びに臨床用
途に広く使用される。これらは、「ライブラリー」
すなわちプラスミド又はフアージベクター中にク
ローン化されて生物の全ゲノム（または発現
RNA）を含む配列を有するDNA断片のコレクシ
ヨンにおいて、DNA片及び所望配列を検出する
ために一般的に使用される。さらに、これらは、
特定DNA片の制限分解物の「ブロツト」におけ
る所定配列のDNAにハイブリツド化させるため
にも使用される。これら全ての例或いはその他の
例において、オリゴヌクレオチドには一般に5′末
端にP32を標識し、かつ分子をオートラジオグラ
フイーにより検出する。本発明は、蛍光染料によ
るオリゴヌクレオチドの標識を開示する。したが
つて、蛍光を使用して、放射能が従来使用されて
いる任意の技術で分子を検出することができる。
これは、たとえば試料の安定性、使用のコスト及
び容易さ並びに廃棄のような放射能に対する多く
の利点を有する。
以上、本発明を説明したが、本発明はこれらの
みに限定されない。
【図面の簡単な説明】
第１図は、オリゴヌクレオチドの部分構造であ
る。第２図は、5′−トリフルオロアセタミド−
5′−デオキシ−3′−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホス
ホルアミドチミジンである。第３図は、市販化合
物Ｉ（チミジン）からの化合物VI（5′−トリフルオ
ロアセタミド−5′−デオキシ−3′−Ｎ，Ｎ−ジイ
ソプロピルホスホルアミドチミジン）の合成経路
である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 5′末端ヌクレオシドの5′炭素原子にアミノ基
    を含有する単一鎖のオリゴヌクレオチド。 ２ 前記オリゴヌクレオチドが5′末端5′−アミノ
    −5′−デオキシチミジンヌクレオシドを含有する
    特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ３ 5′末端ヌクレオシドの5′炭素原子にアミノ基
    を含有する単一鎖のオリゴヌクレオチドの製造方
    法において、アミノヌクレオシドホスホルアミダ
    イトを固相支持体上におけるオリゴヌクレオチド
    合成の最終のカツプリング段階で反応させること
    によつてアミノ基を導入することを特徴とする製
    造方法。 ４ 保護された5′−アミノ−5′−デオキシ−3′−
    ホスホルアミドチミジンを反応させることによつ
    てアミノ基を導入する特許請求の範囲第３項記載
    の方法。 ５ ホスホルアミダイト化合物が下記の一般式： （式中、Ｂはヌクレオシド塩基或はヌクレオシ
    ド塩基類縁体であり、R1及びR2は低級アルキル
    である） を有する改良された特許請求の範囲第３項記載の
    方法。 ６ オリゴヌクレオチドを次いで支持体から開裂
    する特許請求の範囲第５項記載の方法。
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