JPH0461639B2 - - Google Patents
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- JPH0461639B2 JPH0461639B2 JP59020842A JP2084284A JPH0461639B2 JP H0461639 B2 JPH0461639 B2 JP H0461639B2 JP 59020842 A JP59020842 A JP 59020842A JP 2084284 A JP2084284 A JP 2084284A JP H0461639 B2 JPH0461639 B2 JP H0461639B2
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- fibrinogen
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は新規なモノクローナル抗体の製造法に
関する。 近年、血栓・塞栓により死亡したり基礎疾患が
増悪したりする例が増加してきている。またそれ
故に積極的な線溶療法がなされている。生体の防
御機構として血液の凝固・線溶系が存在するが、
それらの異常が汎発生血管内凝固症候群（DIC）
となつて現われる。通常、臨床的診断方法として
はフイブリノゲン・フイブリン分解産物（FDP）
の測定が重要な位置を占めている。従来FDPの
測定は抗ヒトフイブリノゲン抗体を用いた感作ラ
テツクスにより凝集反応が一般的になされている
が、この方法は抗体が抗ヒトフイブリノゲン抗体
であるため、検体として常に血清あるいは脱フイ
ブリンした検体を使用することが必要である。 ところが、FDPを測定するような患者検体は
しばしば血清にするに足るだけの凝固因子が不足
していたり、フイブリノゲンそのものが低下し十
分な凝固が起こらなかつたりする。また抗凝固療
法を行つている患者血液では凝固そのものが起こ
らないことがある。従つて血清を検体にすること
は臨床診断上極めて危険なことである。これらの
問題点を解決するため研究がされているが、未だ
実用に足るだけの成果には至つていない。 本発明者らは、血漿中のフイブリノゲンの量に
関係なくFDPを測定する方法を鋭意検討した結
果、本発明を完成した。 本発明は、ヒトフイブリンまたは精製ヒトフイ
ブリノゲンのプラスミン分解物をゲル濾過及びイ
オン交換クロマトグラフイーで精製して得られた
Ｄ画分またはDD画分を抗原としてマウスを免疫
し、免疫されたマウスの抗体産生細胞とマウスミ
エローマ細胞とを融合させ、得られた融合細胞の
培養液に精製Ｄ画分または精製DD画分、次いで
フイブリノゲンを溶液中で反応させ、Ｄ画分また
はDD画分とは反応するがフイブリノゲンとは反
応しない融合細胞を選択し、次いでクローニング
することによりモノクローナル抗体産生細胞を
得、さらに当該抗体産生細胞を培養することを特
徴とする、Ｄ画分、DD画分、Ｘ画分及びＹ画分
とは反応するが、ヒトフイブリノゲン及びＥ画分
とは反応しないモノクローナル抗体の製造法であ
る。 本発明の各工程について説明する。 ヒトフイブリノゲンをイオン交換クロマトグラ
フイー、ゲル過クロマトグラフイーで精製す
る。この精製したフイブリノゲンをヒトトロンビ
ン及び第因子を使用し安定化フイブリンに変
換させた後、遠心分離で非凝固性物質とフイブリ
ンを分離し、次いでフイブリンをヒトプラスミン
で分解し、ゲル過及びイオン交換クロマトグラ
フイーでFDP DDを得るか、あるいは精製した
フイブリノゲンを直接プラスミンで消化した後、
ゲル過及びイオン交換クロマトグラフイーで
FDP Ｄを得る。このようにして得たFDP DDま
たはFDP Ｄでマウスに免疫し、一定時間後マウ
スの脾臓を摘出する。摘出した脾臓細胞はポリエ
チレングリコールの存在下ミエローマ細胞と融合
されFDP Ｄ及びDD、またはＤを保持するフイ
ブリノゲン、フイブリンの分解物に対する特異的
モノクローナル抗体産性細胞のハイブリドーマと
なる。なお、抗体産性ハイブリドーマの選択は、
通常、ハイブリイドーマ上清を固相化した抗原と
反応させるELISAにより行われるが、本発明に
おいてはバイブリドーマ上清に精製Ｄ画分または
精製DD画分次いでフイブリノゲンを溶液中で反
応させることにより行う。かようにハイブリドー
マの選択に固相化抗原を用いる場合は、抗原認識
部位が固相との結合部位にある抗体を産生するハ
イブリドーマは選択不可能となるが、本発明によ
ればかかる欠点はない。このハイブリドーマを培
地中に培養させ抗体を得るか、またマウスの腹腔
に注射し、腹水中に抗体を生成させて（インビボ
培養）抗体を得てもよい。 このようにして生成した抗体は硫安塩析、イオ
ン交換クロマトグラフイー、ゲル過法で精製し
高純度の抗体とする。この抗体をシアノジエンブ
ロマイド活性化セフアロース（フアルマシヤ社）
に固定化しカラムに詰め各種精製蛋白を流下せし
め、吸着した蛋白を4M尿素含有50ｍＭグリシン
緩衝液PH2.8で溶出し、分子量の差に基づく電気
泳動法により分析するとFDPD、DD、Ｘ、Ｙと
は明らかに反応し、フイブリノゲン、FDPEとは
全く反応せず、Ｄ画分及びＤ画分を有する画分に
特異的モノクローナル抗体であることが判明し
た。また、正常人血漿を流下せしめ同様の操作を
行つたが、何ら反応する物質は見出せなかつた
が、FDP陽性例の患者血漿またはウロキナーゼ
処理正常血漿を流下せしめ同様に処理したもの
は、明らなにFDPと見なせる蛋白を検出した。 以上の性質を有しているので、本発明で得たモ
ノクローナル抗体を使用することにより検体中の
フイブリノゲン量に全く関係なくFDPが測定可
能となつた。従つて検体としては血液、関節液、
尿等が使用でき優れた方法である。 以下実施例で詳細に説明するが、本発明はこれ
に限定されるものではない。 実施例 １ (1) モノクローナル抗体の調製方法 (イ) フイブリノゲンの精製 ヒトフイブリノゲンはカビ社（スウエーデ
ン）より購入し、次の方法で純化した。フイ
ブリノゲン１ｇを100mlの50ｍＭトリス緩衝
液（PH８）−５ｍＭクエン酸ナトリウム溶液
で溶解し同液に対し一夜透析した。透析内液
を10000回転／min10分間遠心分離し不溶物
を除き、上清液を同液で平衡化したDEAE・
セフアセル（フアルマシア社・スウエーデ
ン）のカラム（直径３cm、長さ25cm）にアプ
ライし、その後塩化ナトリウムの０から
0.2Mまでの直線濃度勾配法により蛋白を溶
出した。SDS・電気泳動法により分析し、他
の不純物蛋白の混在の極めて少いフイブリノ
ゲン画分を集め、終濃度4.5％となるように
分子量4000のポリエチレングリコール
（PEG）を加えフイブリノゲンを沈澱させ
た。沈澱物は遠心分離（10000回転／min、
10分）で集め、50ｍＭトリス緩衝液（PH7.2）
−50ｍＭ塩化ナトリウム−５ｍＭクエン酸ナ
トリウム溶液に溶解し70mlとした。 本フイブリノゲン液を70mlづつプラスチツ
ク試験管に分注し−80℃に保存した。 (ロ) FDPDDの調製 (イ)に示したフイブリノゲン70mg（10mg／
ml）を37℃で解凍し、ヒトトロンビン、ヒト
第13因子（共にミドリ十字社）及び塩化カル
シウムをそれぞれ終濃度10単位／ml、１単
位／ml、10ｍＭとなるように加え、37℃３時
間インキユベイトしフイブリノゲンをクロス
リンクフイブリン（以下フイブリン）に変換
させた。13000回転／min20分遠心しフイブ
リンと非凝固性物質とを分離した。フイブリ
ンは20mlの50ｍＭトリス緩衝液（PH7.2）−
150ｍＭ塩化ナトリウム−10ｍＭ塩化カルシ
ウム液に浮遊させ、37℃で0.25単位／mlヒト
プラスミン（ミドリ十字社）を１時間毎に１
mlづつ５回添加しフイブリンを分解した。不
溶性フイブリンは約８時間でほぼ検出できな
くなつたので、トラジロール （バイエル
社・西ドイツ）を終濃度100単位／mlとなる
ように加えて分解反応を停止させた。５mlの
リジン・セフアロースカラムを通過させプラ
スミンを除去した。通過液は−80℃に一夜保
存した。分解物を解凍し50ｍＭトリス緩衝液
（PH８）−500ｍＭ塩化ナトリウム−10ｍＭ塩
化カルシウム溶液で平衡化したセフアクリル
Ｓ−300（フアシマシア社・スウエーデン）の
カラム（直径2.6cm、長さ100cm）にアプライ
した。平衡化溶液で展開するゲル過を行つ
た。フラクシヨンを分取しSDS電気泳動法及
び抗Ｄ、抗Ｅ、抗血清（共にヘキスト社・西
ドイツ）を用いるオクタロニー法により高分
子量FDP、DD、Ｄ、Ｅの画分を分析した。
DD画分はＥ画分の一部と共に溶出されてい
たので、DD、Ｅ画分として集め50ｍＭトリ
ス緩衝液（PH８）−５ｍＭ塩化カルシウム液
に一夜透析した。同液で平衡化したDEAE−
セフアセルのカラム（直径2.5cm、長さ20cm）
に透析内液をアプライし、DD画分を非吸着
画分に、Ｅを吸着画分にそれぞれ分離した。
精製したDD画分は10ｍＭトリス緩衝液（PH
7.2）−150ｍＭ塩化ナトリウム−５ｍＭ塩化
カルシウム溶液に透析し、透析物は500μｇ
づつ小試験管に移し、−80℃で保存した。 (2) 免疫 DD画分20μｇを0.2mlの完全フロインドアジ
ユバンドとよく混ぜあわせ、７週令のBalb／
ｃ系マウスの腹腔に注射した。２週間後DD画
分20μｇを0.2mlの不完全フロインドアユバンド
（以下IFAと言う）によく混ぜ、腹腔内に注射
した。２週間間隔でDD画分20μｇ／IFA0.2ml
を腹腔内注射し免疫した。 (3) 細胞融合 最終免疫から２週間後に50μｇのDD画分を
0.1mlの生理食塩水に混ぜ、尾静脈に注射し３
日後脾臓を摘出してほぐした後培地
（RPMI1640）でよく洗浄する。この洗浄した
脾細胞108個と同様に培地でよく洗浄したマウ
スsp2／０・Ag14系のミエローマ細胞107個を
混ぜ、培地に対し50w／ｖ％PEG1540を0.5ml
を徐々に滴下し、１分間混和した。培地８mlを
徐々に加えてPEGを稀釈し反応を停止した。
遠心の条件1500回転／分で５分間で細胞を集め
培地２mlで１回洗浄した。30mlの10％FCS加培
地に細胞を懸濁し96穴マイクロプレートの各ウ
エルに0.1mlづつ分注し８％CO2存在下37℃で
インキユベイトした。 HAT培地（10-4Mヒポキサンチン、４×
10-7Mアミノプテリン、1.6×10-5Mチミジン
を含む10％FCS加培地）を融合翌日から３日
間、毎日0.1mlづつ分注した。更に３日間のイ
ンキユベイト後各ウエルの培養上清0.2mlを除
去し、HT培地（HAT培地からアミノプテリ
ンを除いたもの）0.2mlで置換した。この操作
を３回繰り返した。 (4) 融合細胞の選別とクローン化 (イ) 選別 抗Ｄ抗血清をリン酸緩衝液（PH7.2）−生理
食塩水（以下PBS）で5000倍に稀釈し96穴
マイクロプレートに50μづつ分注し、４℃
に一夜固定化した。１％牛血清アルブミン
（BSA）及び0.05％Tween20を加えたPBS
（以下BSAPBS）でよくウエルを洗浄し、一
枚のプレートにはBSAPBSで10μｇ／mlに調
製されたフイブリノゲンを、他方には同様に
2.5μｇ／mlに調製されたDDをそれぞれ50μ
づつ分注し、一夜抗原抗体反応を行わせた。 プレートはBSAPBSでよく洗浄した。フ
イブリノゲンを反応させたプレートに培養上
清50μを加え37℃１時間反応させた。更に
フイブリノゲン0.2mg／mlの液50μを加え37
℃１時間反応さえた。この反応混液50μを
DD画分を反応させて洗浄の終つているプレ
ートに加え、残りは捨てた。DD画分を反応
させておいたプレートに加えた後37℃１時間
反応させた。２種のプレートはそれぞれ
BSAPBSでよく洗浄し1000倍に稀釈された
抗マウスIgGヤギ抗体−パーオキシダーゼ結
合物50μを加えた。38℃、１時間反応後
BSAPBS、水で洗い過酸化水素とオルトフ
エニレンジアシンを基質として酵素反応を行
わせた。活性は500nｍの吸光度で表した。 測定例を次のマイクロプレートの表に示し
た。
関する。 近年、血栓・塞栓により死亡したり基礎疾患が
増悪したりする例が増加してきている。またそれ
故に積極的な線溶療法がなされている。生体の防
御機構として血液の凝固・線溶系が存在するが、
それらの異常が汎発生血管内凝固症候群（DIC）
となつて現われる。通常、臨床的診断方法として
はフイブリノゲン・フイブリン分解産物（FDP）
の測定が重要な位置を占めている。従来FDPの
測定は抗ヒトフイブリノゲン抗体を用いた感作ラ
テツクスにより凝集反応が一般的になされている
が、この方法は抗体が抗ヒトフイブリノゲン抗体
であるため、検体として常に血清あるいは脱フイ
ブリンした検体を使用することが必要である。 ところが、FDPを測定するような患者検体は
しばしば血清にするに足るだけの凝固因子が不足
していたり、フイブリノゲンそのものが低下し十
分な凝固が起こらなかつたりする。また抗凝固療
法を行つている患者血液では凝固そのものが起こ
らないことがある。従つて血清を検体にすること
は臨床診断上極めて危険なことである。これらの
問題点を解決するため研究がされているが、未だ
実用に足るだけの成果には至つていない。 本発明者らは、血漿中のフイブリノゲンの量に
関係なくFDPを測定する方法を鋭意検討した結
果、本発明を完成した。 本発明は、ヒトフイブリンまたは精製ヒトフイ
ブリノゲンのプラスミン分解物をゲル濾過及びイ
オン交換クロマトグラフイーで精製して得られた
Ｄ画分またはDD画分を抗原としてマウスを免疫
し、免疫されたマウスの抗体産生細胞とマウスミ
エローマ細胞とを融合させ、得られた融合細胞の
培養液に精製Ｄ画分または精製DD画分、次いで
フイブリノゲンを溶液中で反応させ、Ｄ画分また
はDD画分とは反応するがフイブリノゲンとは反
応しない融合細胞を選択し、次いでクローニング
することによりモノクローナル抗体産生細胞を
得、さらに当該抗体産生細胞を培養することを特
徴とする、Ｄ画分、DD画分、Ｘ画分及びＹ画分
とは反応するが、ヒトフイブリノゲン及びＥ画分
とは反応しないモノクローナル抗体の製造法であ
る。 本発明の各工程について説明する。 ヒトフイブリノゲンをイオン交換クロマトグラ
フイー、ゲル過クロマトグラフイーで精製す
る。この精製したフイブリノゲンをヒトトロンビ
ン及び第因子を使用し安定化フイブリンに変
換させた後、遠心分離で非凝固性物質とフイブリ
ンを分離し、次いでフイブリンをヒトプラスミン
で分解し、ゲル過及びイオン交換クロマトグラ
フイーでFDP DDを得るか、あるいは精製した
フイブリノゲンを直接プラスミンで消化した後、
ゲル過及びイオン交換クロマトグラフイーで
FDP Ｄを得る。このようにして得たFDP DDま
たはFDP Ｄでマウスに免疫し、一定時間後マウ
スの脾臓を摘出する。摘出した脾臓細胞はポリエ
チレングリコールの存在下ミエローマ細胞と融合
されFDP Ｄ及びDD、またはＤを保持するフイ
ブリノゲン、フイブリンの分解物に対する特異的
モノクローナル抗体産性細胞のハイブリドーマと
なる。なお、抗体産性ハイブリドーマの選択は、
通常、ハイブリイドーマ上清を固相化した抗原と
反応させるELISAにより行われるが、本発明に
おいてはバイブリドーマ上清に精製Ｄ画分または
精製DD画分次いでフイブリノゲンを溶液中で反
応させることにより行う。かようにハイブリドー
マの選択に固相化抗原を用いる場合は、抗原認識
部位が固相との結合部位にある抗体を産生するハ
イブリドーマは選択不可能となるが、本発明によ
ればかかる欠点はない。このハイブリドーマを培
地中に培養させ抗体を得るか、またマウスの腹腔
に注射し、腹水中に抗体を生成させて（インビボ
培養）抗体を得てもよい。 このようにして生成した抗体は硫安塩析、イオ
ン交換クロマトグラフイー、ゲル過法で精製し
高純度の抗体とする。この抗体をシアノジエンブ
ロマイド活性化セフアロース（フアルマシヤ社）
に固定化しカラムに詰め各種精製蛋白を流下せし
め、吸着した蛋白を4M尿素含有50ｍＭグリシン
緩衝液PH2.8で溶出し、分子量の差に基づく電気
泳動法により分析するとFDPD、DD、Ｘ、Ｙと
は明らかに反応し、フイブリノゲン、FDPEとは
全く反応せず、Ｄ画分及びＤ画分を有する画分に
特異的モノクローナル抗体であることが判明し
た。また、正常人血漿を流下せしめ同様の操作を
行つたが、何ら反応する物質は見出せなかつた
が、FDP陽性例の患者血漿またはウロキナーゼ
処理正常血漿を流下せしめ同様に処理したもの
は、明らなにFDPと見なせる蛋白を検出した。 以上の性質を有しているので、本発明で得たモ
ノクローナル抗体を使用することにより検体中の
フイブリノゲン量に全く関係なくFDPが測定可
能となつた。従つて検体としては血液、関節液、
尿等が使用でき優れた方法である。 以下実施例で詳細に説明するが、本発明はこれ
に限定されるものではない。 実施例 １ (1) モノクローナル抗体の調製方法 (イ) フイブリノゲンの精製 ヒトフイブリノゲンはカビ社（スウエーデ
ン）より購入し、次の方法で純化した。フイ
ブリノゲン１ｇを100mlの50ｍＭトリス緩衝
液（PH８）−５ｍＭクエン酸ナトリウム溶液
で溶解し同液に対し一夜透析した。透析内液
を10000回転／min10分間遠心分離し不溶物
を除き、上清液を同液で平衡化したDEAE・
セフアセル（フアルマシア社・スウエーデ
ン）のカラム（直径３cm、長さ25cm）にアプ
ライし、その後塩化ナトリウムの０から
0.2Mまでの直線濃度勾配法により蛋白を溶
出した。SDS・電気泳動法により分析し、他
の不純物蛋白の混在の極めて少いフイブリノ
ゲン画分を集め、終濃度4.5％となるように
分子量4000のポリエチレングリコール
（PEG）を加えフイブリノゲンを沈澱させ
た。沈澱物は遠心分離（10000回転／min、
10分）で集め、50ｍＭトリス緩衝液（PH7.2）
−50ｍＭ塩化ナトリウム−５ｍＭクエン酸ナ
トリウム溶液に溶解し70mlとした。 本フイブリノゲン液を70mlづつプラスチツ
ク試験管に分注し−80℃に保存した。 (ロ) FDPDDの調製 (イ)に示したフイブリノゲン70mg（10mg／
ml）を37℃で解凍し、ヒトトロンビン、ヒト
第13因子（共にミドリ十字社）及び塩化カル
シウムをそれぞれ終濃度10単位／ml、１単
位／ml、10ｍＭとなるように加え、37℃３時
間インキユベイトしフイブリノゲンをクロス
リンクフイブリン（以下フイブリン）に変換
させた。13000回転／min20分遠心しフイブ
リンと非凝固性物質とを分離した。フイブリ
ンは20mlの50ｍＭトリス緩衝液（PH7.2）−
150ｍＭ塩化ナトリウム−10ｍＭ塩化カルシ
ウム液に浮遊させ、37℃で0.25単位／mlヒト
プラスミン（ミドリ十字社）を１時間毎に１
mlづつ５回添加しフイブリンを分解した。不
溶性フイブリンは約８時間でほぼ検出できな
くなつたので、トラジロール （バイエル
社・西ドイツ）を終濃度100単位／mlとなる
ように加えて分解反応を停止させた。５mlの
リジン・セフアロースカラムを通過させプラ
スミンを除去した。通過液は−80℃に一夜保
存した。分解物を解凍し50ｍＭトリス緩衝液
（PH８）−500ｍＭ塩化ナトリウム−10ｍＭ塩
化カルシウム溶液で平衡化したセフアクリル
Ｓ−300（フアシマシア社・スウエーデン）の
カラム（直径2.6cm、長さ100cm）にアプライ
した。平衡化溶液で展開するゲル過を行つ
た。フラクシヨンを分取しSDS電気泳動法及
び抗Ｄ、抗Ｅ、抗血清（共にヘキスト社・西
ドイツ）を用いるオクタロニー法により高分
子量FDP、DD、Ｄ、Ｅの画分を分析した。
DD画分はＥ画分の一部と共に溶出されてい
たので、DD、Ｅ画分として集め50ｍＭトリ
ス緩衝液（PH８）−５ｍＭ塩化カルシウム液
に一夜透析した。同液で平衡化したDEAE−
セフアセルのカラム（直径2.5cm、長さ20cm）
に透析内液をアプライし、DD画分を非吸着
画分に、Ｅを吸着画分にそれぞれ分離した。
精製したDD画分は10ｍＭトリス緩衝液（PH
7.2）−150ｍＭ塩化ナトリウム−５ｍＭ塩化
カルシウム溶液に透析し、透析物は500μｇ
づつ小試験管に移し、−80℃で保存した。 (2) 免疫 DD画分20μｇを0.2mlの完全フロインドアジ
ユバンドとよく混ぜあわせ、７週令のBalb／
ｃ系マウスの腹腔に注射した。２週間後DD画
分20μｇを0.2mlの不完全フロインドアユバンド
（以下IFAと言う）によく混ぜ、腹腔内に注射
した。２週間間隔でDD画分20μｇ／IFA0.2ml
を腹腔内注射し免疫した。 (3) 細胞融合 最終免疫から２週間後に50μｇのDD画分を
0.1mlの生理食塩水に混ぜ、尾静脈に注射し３
日後脾臓を摘出してほぐした後培地
（RPMI1640）でよく洗浄する。この洗浄した
脾細胞108個と同様に培地でよく洗浄したマウ
スsp2／０・Ag14系のミエローマ細胞107個を
混ぜ、培地に対し50w／ｖ％PEG1540を0.5ml
を徐々に滴下し、１分間混和した。培地８mlを
徐々に加えてPEGを稀釈し反応を停止した。
遠心の条件1500回転／分で５分間で細胞を集め
培地２mlで１回洗浄した。30mlの10％FCS加培
地に細胞を懸濁し96穴マイクロプレートの各ウ
エルに0.1mlづつ分注し８％CO2存在下37℃で
インキユベイトした。 HAT培地（10-4Mヒポキサンチン、４×
10-7Mアミノプテリン、1.6×10-5Mチミジン
を含む10％FCS加培地）を融合翌日から３日
間、毎日0.1mlづつ分注した。更に３日間のイ
ンキユベイト後各ウエルの培養上清0.2mlを除
去し、HT培地（HAT培地からアミノプテリ
ンを除いたもの）0.2mlで置換した。この操作
を３回繰り返した。 (4) 融合細胞の選別とクローン化 (イ) 選別 抗Ｄ抗血清をリン酸緩衝液（PH7.2）−生理
食塩水（以下PBS）で5000倍に稀釈し96穴
マイクロプレートに50μづつ分注し、４℃
に一夜固定化した。１％牛血清アルブミン
（BSA）及び0.05％Tween20を加えたPBS
（以下BSAPBS）でよくウエルを洗浄し、一
枚のプレートにはBSAPBSで10μｇ／mlに調
製されたフイブリノゲンを、他方には同様に
2.5μｇ／mlに調製されたDDをそれぞれ50μ
づつ分注し、一夜抗原抗体反応を行わせた。 プレートはBSAPBSでよく洗浄した。フ
イブリノゲンを反応させたプレートに培養上
清50μを加え37℃１時間反応させた。更に
フイブリノゲン0.2mg／mlの液50μを加え37
℃１時間反応さえた。この反応混液50μを
DD画分を反応させて洗浄の終つているプレ
ートに加え、残りは捨てた。DD画分を反応
させておいたプレートに加えた後37℃１時間
反応させた。２種のプレートはそれぞれ
BSAPBSでよく洗浄し1000倍に稀釈された
抗マウスIgGヤギ抗体−パーオキシダーゼ結
合物50μを加えた。38℃、１時間反応後
BSAPBS、水で洗い過酸化水素とオルトフ
エニレンジアシンを基質として酵素反応を行
わせた。活性は500nｍの吸光度で表した。 測定例を次のマイクロプレートの表に示し
た。
【表】
上段はフイブリノゲンで吸収する前の
500nｍの吸光度、下段は吸収後の吸光度を
示した。通常各ウエルはA12、F7のように吸
収後の吸光度は減少した。即ちフイブリノゲ
ンとも反応する抗体を産生するハイブリドー
マであつた。 例は少いもののA5、C4、E3など吸収後も
DD画分と強く反応する抗体を産生すハイブ
リドーマも存在した。このような細胞の存在
するウエルは５つ存在したのでこれをクロー
ニングすることにした。 (ロ) クローニング ４週令のBalb／ｃ系幼若マウスの胸腺を
とり出し倍地中でよく懸濁した。遠心分離に
より細胞を集め、10％FCS加培地に５×106
個／mlとなるよう再懸濁した。96穴マイクロ
プレートに0.2ml／／ウエルで分注し、フイ
ーダーレーヤーとした。５種の培養細胞を10
％FCS加培地で10個／mlに稀釈し、各ウエル
に01mmづつ分注した。10日間の培養により充
分細胞数が増加したので、同様の方法で稀釈
−分注−増殖の過程を４回施した。培養上清
をクローニングの毎に抗DD、抗Ｄ、抗フイ
ブリノゲン活性を分析し、４次のクローニン
グをもつてモノクローナル抗体産生細胞であ
るとした。 実施例 ２ FDP.Dの調製 実施例１の(イ)のフイブリノゲンの70mg（10mg／
ml）を37℃で解凍し、塩化カルシウムの終濃度10
ｍＭとなるように添加し、そのまま37℃に保ちな
がら１時間毎に１mlづつ５回加え８時間フイブリ
ノゲンを分解した。 トラジロール を終濃度100単位／mlとなるよ
うに加え、反応を停止し５mlのリジン・セフアロ
ースカラムを通過させた。通過液は−80℃に一夜
保存後解凍し、(ロ)で用いたセフアクリルＳ−300
のカラムにアプライしゲル過した。フラクシヨ
ンをSDS電気泳動法及びオクタロニー法で分析
し、Ｄ画分を同定した。Ｄ画分はＥ画分と一部重
なつて溶出されていたので、集めて50ｍＭトリス
緩衝液（PH８）−５ｍＭ塩化カルシウム液に透析
した。同液で平衡化したDEAE−セフアセルのカ
ラム（直径2.6cm、長さ20cm）にアプライし、Ｄ
画分を非吸着部に、Ｅ画分を吸着部に分離した。
精製されたＤ画分は10ｍＭトリス緩衝液（PH7.2）
−150ｍＭ塩化ナトリウム−５ｍＭ塩化カルシウ
ム液に透析し、透析物は500μｇづつ小試験管に
分注し−80℃で保存した。 実施例１のDD画分の代りに本実施例で得たＤ
画分を使用し、全く同様に(2)〜(4)の操作を行ない
モノクローナル抗体産生細胞を得た。 実施例 ３ 実施例１で確立されたフイブリドーマ株５種の
免疫学的分類を次に示す。
500nｍの吸光度、下段は吸収後の吸光度を
示した。通常各ウエルはA12、F7のように吸
収後の吸光度は減少した。即ちフイブリノゲ
ンとも反応する抗体を産生するハイブリドー
マであつた。 例は少いもののA5、C4、E3など吸収後も
DD画分と強く反応する抗体を産生すハイブ
リドーマも存在した。このような細胞の存在
するウエルは５つ存在したのでこれをクロー
ニングすることにした。 (ロ) クローニング ４週令のBalb／ｃ系幼若マウスの胸腺を
とり出し倍地中でよく懸濁した。遠心分離に
より細胞を集め、10％FCS加培地に５×106
個／mlとなるよう再懸濁した。96穴マイクロ
プレートに0.2ml／／ウエルで分注し、フイ
ーダーレーヤーとした。５種の培養細胞を10
％FCS加培地で10個／mlに稀釈し、各ウエル
に01mmづつ分注した。10日間の培養により充
分細胞数が増加したので、同様の方法で稀釈
−分注−増殖の過程を４回施した。培養上清
をクローニングの毎に抗DD、抗Ｄ、抗フイ
ブリノゲン活性を分析し、４次のクローニン
グをもつてモノクローナル抗体産生細胞であ
るとした。 実施例 ２ FDP.Dの調製 実施例１の(イ)のフイブリノゲンの70mg（10mg／
ml）を37℃で解凍し、塩化カルシウムの終濃度10
ｍＭとなるように添加し、そのまま37℃に保ちな
がら１時間毎に１mlづつ５回加え８時間フイブリ
ノゲンを分解した。 トラジロール を終濃度100単位／mlとなるよ
うに加え、反応を停止し５mlのリジン・セフアロ
ースカラムを通過させた。通過液は−80℃に一夜
保存後解凍し、(ロ)で用いたセフアクリルＳ−300
のカラムにアプライしゲル過した。フラクシヨ
ンをSDS電気泳動法及びオクタロニー法で分析
し、Ｄ画分を同定した。Ｄ画分はＥ画分と一部重
なつて溶出されていたので、集めて50ｍＭトリス
緩衝液（PH８）−５ｍＭ塩化カルシウム液に透析
した。同液で平衡化したDEAE−セフアセルのカ
ラム（直径2.6cm、長さ20cm）にアプライし、Ｄ
画分を非吸着部に、Ｅ画分を吸着部に分離した。
精製されたＤ画分は10ｍＭトリス緩衝液（PH7.2）
−150ｍＭ塩化ナトリウム−５ｍＭ塩化カルシウ
ム液に透析し、透析物は500μｇづつ小試験管に
分注し−80℃で保存した。 実施例１のDD画分の代りに本実施例で得たＤ
画分を使用し、全く同様に(2)〜(4)の操作を行ない
モノクローナル抗体産生細胞を得た。 実施例 ３ 実施例１で確立されたフイブリドーマ株５種の
免疫学的分類を次に示す。
【表】
認識する抗原決定基の異同を決定するため、そ
れぞれの抗体をパーオキシダーゼで標識しDD画
分に対してフリーの抗体と競合反応を行わせ、阻
害の有無から認識部位、異同とした。 次に結果を示した。
れぞれの抗体をパーオキシダーゼで標識しDD画
分に対してフリーの抗体と競合反応を行わせ、阻
害の有無から認識部位、異同とした。 次に結果を示した。
【表】
＋〇 阻害あり
−〇 阻害なし
上記結果から、03202、03203（03204、03205、
03206）のグループ化ができた。03203は抗原認識
部位は他の２グループと異なるが、酵素標識物は
既に他の抗体と結合した抗原には反応性が弱くな
るかあるいは結合が阻害されるようである。 ３グループの認識するFDPの種類は次に示し
た。
−〇 阻害なし
上記結果から、03202、03203（03204、03205、
03206）のグループ化ができた。03203は抗原認識
部位は他の２グループと異なるが、酵素標識物は
既に他の抗体と結合した抗原には反応性が弱くな
るかあるいは結合が阻害されるようである。 ３グループの認識するFDPの種類は次に示し
た。
【表】
＋ 反応する
− 反応しない
３グループともフイブリノゲン、Ｅとは反応し
ないが、他のＤ及びＤを含むFDPとは反応した。
また市販FDP測定キツトで陽性となつた患者検
体とも反応した。 実施例 ４ 実施例２で確立されたハイブリドーマ株２種の
免疫学的分類は、Ｇクラスの2a及び１でありＬ
鎖は共にＫであつた。 実施例３と同様に検討を加え、共に異なる抗原
決定基を認識することが判明した。また実施例２
のモノクローナル抗体との異同を検討したが、
03202、03204にそれぞれ対応していることが判明
した。
− 反応しない
３グループともフイブリノゲン、Ｅとは反応し
ないが、他のＤ及びＤを含むFDPとは反応した。
また市販FDP測定キツトで陽性となつた患者検
体とも反応した。 実施例 ４ 実施例２で確立されたハイブリドーマ株２種の
免疫学的分類は、Ｇクラスの2a及び１でありＬ
鎖は共にＫであつた。 実施例３と同様に検討を加え、共に異なる抗原
決定基を認識することが判明した。また実施例２
のモノクローナル抗体との異同を検討したが、
03202、03204にそれぞれ対応していることが判明
した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒトフイブリンまたは精製ヒトフイブリノゲ
ンのプラスミン分解物をゲル濾過及びイオン交換
クロマトグラフイーで精製して得られたＤ画分ま
たはDD画分を抗原としてマウスを免疫し、免疫
されたマウスの抗体産生細胞とマウスミエローマ
細胞とを融合させ、得られた融合細胞の培養液に
精製Ｄ画分または精製DD画分、次いでフイブリ
ノゲンを溶液中で反応させ、Ｄ画分またはDD画
分とは反応するがフイブリノゲンとは反応しない
融合細胞を選択し、次いでクローニングすること
によりモノクローナル抗体産生細胞を得、さらに
当該抗体産生細胞を培養することを特徴とする、
Ｄ画分、DD画分、Ｘ画分及びＹ画分とは反応す
るが、ヒトフイブリノゲン及びＥ画分とは反応し
ないモノクローナル抗体の製造法。 ２ 得られるモノクローナル抗体が次の免疫学的
分類に属するものである特許請求の範囲第１項記
載のモノクローナル抗体の製造法。 (1) 免疫グロブリンクラス IgG (2) サブクラス 2a，2bまた１ (3) Ｌ鎖 κ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59020842A JPS60166698A (ja) | 1984-02-09 | 1984-02-09 | モノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59020842A JPS60166698A (ja) | 1984-02-09 | 1984-02-09 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60166698A JPS60166698A (ja) | 1985-08-29 |
| JPH0461639B2 true JPH0461639B2 (ja) | 1992-10-01 |
Family
ID=12038323
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59020842A Granted JPS60166698A (ja) | 1984-02-09 | 1984-02-09 | モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60166698A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2599865B1 (en) * | 2010-07-30 | 2017-09-27 | Sysmex Corporation | Anti-fdp monoclonal antibody, fdp measurement reagent and reagent kit using same, and fdp measurement method |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU572125B2 (en) * | 1983-03-17 | 1988-05-05 | Mabco Limited | Monoclonal antibodies with specificity for crosslinked fibrin and their diagnotic uses |
-
1984
- 1984-02-09 JP JP59020842A patent/JPS60166698A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60166698A (ja) | 1985-08-29 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |