JPH04634B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素にて処理された抗体をリガンド
とするアフイニテイクロマトグラフイーを使用す
る、前記抗体に対応する抗原物質の精製方法に関
する。更に詳しくは、本発明は、抗原、抗体の機
作を用いて、精製しようとする抗原物質に対して
特異性のある免疫抗体を酵素処理することによ
り、特異性の非常に高い修飾精製抗体とし、これ
を不溶性担体に固定せしめ、この親和性の高い固
定化担体により粗製抗原物質から高純度、高回収
率に抗原物質を製造する方法に関する。

例えば、ウロキナーゼは血液中に存在するプラ
スミノゲンをプラスミンへ活性化する線溶系酵素
である。従つて、これを人体へ注射することによ
り血管内に生じた血栓を溶解するので、脳血栓、
その他の血栓症の治療に有効である以外に、制癌
剤としても併用することにより治療効果が上が
り、その有用性が広がつている。

特に、人尿から採取し精製したウロキナーゼ
は、副作用がほとんどないことにより医薬品とし
て現在広く用いられている。

従来、ウロキナーゼの精製には、シリカゲル、
ハイフロスーパーセル、ゼオライトアクリルニト
リル、硫酸バリウム、あるいは各種イオン交換体
とゲル濾過および対応する抗体を用いた抗ウロキ
ナーゼ抗体を固定化した免疫吸着体が用いられて
いる。

また、Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）も高純度
化し、不活化処理を行なつたものはＢ型肝炎ワク
チンとして利用できる。

HBsAgの精製法としては、硫安、エアロジル、
イオン交換樹脂、ゲル濾過、超遠心分離、対応す
る抗体を用いた抗HBsAg抗体を固定化した免疫
吸着体を用いる方法が用いられる。

そこで本発明者等は、これらの公知の精製方法
に比較して、更に優れた精製方法を種々検討した
結果、既知のいずれの精製方法よりも優れた精製
効率を有し、操作が簡単で、しかも繰り返し使用
できる粗製抗原物質の精製方法を見いだした。

即ち、抗体には一般に、他の夾雑蛋白、糖など
が結合しており、抗体を通常の精製方法、例えば
陰イオン交換体にて精製しても、これらの夾雑蛋
白、糖などの不純物を切断、分解することができ
ない。

ところが、抗体を適当な条件下、特定の酵素を
組み合わせて処理すれば、これら不純物を除去す
ることができ、しかもかかる処理抗体をアフイニ
テイクロマトグラフイーにおける吸着体のリガン
ドとし、当該抗体に対抗する抗原物質の精製に使
用すれば、高収率、高純度で抗原物質が回収され
ることを見出した。

本発明は、かかる新知見に基づいて完成された
ものであり、ペプシン、トリプシン、プラスミン
から選ばれる少なくとも蛋白分解酵素、およびア
ミラーゼ、アルギナーゼから選ばれる少なくとも
一の糖分解酵素にて処理された抗体を固定化した
担体を吸着体することによる、前記抗体に対応す
る抗原物質の精製方法に関する。

本発明によれば、高純度、高収率で抗原物質が
得られ、しかも操作が簡単である他、大規模製造
時での免疫抗体の固定化不溶性担体の機能向上と
生物学的安定性（腐敗、発熱性物質の発生の防止
等）の向上が図られる。

本発明における精製対象である抗原物質には、
特に制限はなく、動物に免疫して、抗体を生成し
うるものであればよく、たとえばウロキナーゼ、
HBsAg、カリクレイン、インターフイエロンな
どがあげられる。

本発明に用いられる抗体は、前記抗原に対応す
る抗体であり、酵素処理を付す際には、必ずしも
高度精製品でなくてもよく、たとえば免疫動物の
血漿、血清などであつてもよい。又、モノクロー
ナル抗体も好適に利用される。

酵素処理に用いられる酵素は、ペプシン、トリ
プシン、プラスミンの蛋白分解酵素、およびアミ
ラーゼ、アルギナーゼの糖分解酵素であり、少な
くとも一の蛋白分解酵素および糖分解酵素を組み
合わせて処理すればよい。

酵素処理は個々の示適条件下で行われ、その条
件は、たとえば次の通りである。

例えば、抗体純度に応じて抗体の0.1μｇ〜１mg
当たり、ペプシン、トリプシン、プラスミンの場
合は、0.1〜100μｇ／mlを使用して、PH２〜4.5に
て25〜37℃で10〜30時間処理、β−アミラーゼの
場合は0.1μｇ〜100μｇを使用してPH5.5〜8.5にて、
25〜37℃で10〜30時間処理、アルギナーゼの場合
は0.1μｇ〜100μｇを加えて、PH7.5〜10にて、25
〜37℃で10〜30時間の処理を行う。

この酵素処理後、一般には透析、濃縮及び／又
は、限外濾過により濃縮してゲル濾過を行つて、
E₂₈₀nｍの高い部分について赤血球凝集反応法に
よる抗ウロキナーゼのHAI法による測定を行い
プールする。

かくして得られた抗体を固定させるための担体
としては、従来既知の固定化担体がいずれも好適
に使用しうる。具体的には、たとえば精製寒天ゲ
ル、セルロース誘導体、デキストラン重合物、ポ
リアクリルアミド等の重合物のゲル、ガラス粒子
などが例示される。

抗体の担体への固定化は、従来既知の方法
〔Cuatrecasasらの方法（P.Cuaftrecasas，J.
Biol.Chem.，245，3059（1970）〕、またはこれに
準ずる方法にて行えばよい。

本方法によれば、非常に比活性の高い純品を回
収率85％以上で得ることができて、その特異性は
非常に良く、高分子ウロキナーゼの抗体を使用し
た場合、100％近い高分子ウロキナーゼが回収で
きた。

同様に、HBsAgも酵素処理して使用した場合
も高回収、高純度の回収を得た。

以下に実施例を示すが、本発明はこれらに限定
されない。

実施例 １ 公知の方法で精製したウロキナーゼの比活性、
80000単位／E₂₈₀nｍ以上のものの、10〜20万単
位／mlとFreunds complete adjuvantを均等混合
する。

この１mlを３〜４Kgの家兎に皮下、または皮内
注射し、以後４〜６週間毎に0.5mlずつを同様追
加免疫して、その後抗ウロキナーゼ価を赤血球凝
集反応法（HAI法）で測定し値の上がつた時点
で家兎の耳静脈より１回に50mlずつ採血した。

この抗血清100mlに、まず硫安12ｇを加え、そ
の遠心上清へPH7.2にて13ｇを追加して沈澱物を
遠心分離で得た。

この沈澱物を0.03M食塩を含む0.04Mリン酸緩
衝液のPH8.0E₂₈₀nｍの吸光度で２付近まで溶解し
た。

そして、この溶液を同一緩衝液で平衡化した
DEAE−セルロース70ml（直径３cm、高さ10cm）
カラムを通過して、抗ウロキナーゼ部分をHAI
法とE₂₈₀nｍで測定して、高純度抗ウロキナーゼ
画分、約１ｇを得た。

この抗ウロキナーゼ画分の40mg当たり、PH3.5
にてペプシン1μｇ／終濃度として37℃で18時間
の反応を行い、次いで1N−NaOHでPH6.5に調製
後、β−アミラーゼを5μｇ／終濃度にして、25
℃で12時間処理して、最後にPH9.2にてアルギナ
ーゼの1μｇ／終濃度を加えて25℃、18時間の処
理後、室温にてPH10で１時間放置して、0.3M食
塩加0.01Mリン酸緩衝液PH8.5にて透析、濃縮し
て、それと同一緩衝液のセフアクリルＳ−500に
てゲル濾過して、PHA法にて抗ウロキナーゼ分
画として約0.4ｇ相当を得た。

この酵素処理液のE₂₈₀nｍを、５付近に0.1M炭
酸ソーダ緩衝液PH９を希釈して、ほぼ等量の
CNBr−activated Sepharose 4B（フアルアシア
製）を加えて、４℃で24時間ゆつくりと撹拌し
た。

この間、最初のHAI値は、１：2000から１：
２付近に混合液は低下し、カツプリングが順調に
進んだことが判つた。

反応終了後、0.15M食塩加0.02Mホウ酸緩衝液
PH８にて充分洗浄して、酵素処理した修飾抗ウロ
キナーゼ固定Sepharose 4Bを得た。

本品１ml当たり、比活性3000単位／E₂₈₀nｍの
粗製ウロキナーゼは約300000単位を吸着すること
が出来て、同一緩衝液で洗浄後、0.5M食塩加
0.17Mグリシン緩衝液にて溶出して、比活性
85000単位／E₂₈₀nｍ以上、回収率95％以上を得
た。

同様に、比活性1000単位／E₂₈₀nｍの組織培養
ウロキナーゼも約200000単位が吸着し、比活性
100000単位／E₂₈₀nｍで、回収率95％以上を得た。

なお、酵素処理を行わない抗体による抗ウロキ
ナーゼ固定Sepharose 4Bでの精製では吸着率が
劣り、とりわけ比活性の上昇が500000単位／
E₂₈₀nｍを上がらず、回収率80％程度を示した。

実施例 ２ 実施例１にて調製された、酵素処理した修飾抗
ウロキナーゼ固定Sepharose 4Bを用いて、本品
１ml当り、組織培養ウロキナーゼの培養液の約
10000単位を吸着することが出来て、比活性とし
て90000単位／E₂₈₀nｍ以上のものを回収率95％で
得た。

尚、酵素処理を行わない抗体による抗ウロキナ
ーゼ固定Sepharose 4Bでの精製では吸着率が劣
り、とりわけ比活性の上昇が75000単位／E₂₈₀nｍ
で回収率が75％を示した。

実施例 ３ HBsAg陽性血漿を公知の方法で精製した逆受
身赤血球凝集反応（RPHA）で１：4000、比活
性はE₂₈₀nｍ１：25000の純度のものを、等量
Freunds complete adjuvantと混合し、この0.1
mlずつを250〜300ｇのモルモツトの皮下又は皮内
に注射し、以後５週間0.1mlずつを同様追加免疫
して、その後抗HBs価を赤血球凝集法（PHA法）
で測定し、値の上がつた時点で全量の血液を採血
した。

以後実施例１の方式と同様の方法で精製し、酵
素処理した修飾抗HBs固定Sepharoseを得た。

本品１ml当たり、比活性としてE₂₈₀nｍ当たり
RPHAで１：3000のHBsAgを、力価で１：
240000を吸着することが出来て、洗浄溶出後は比
活性としてE₂₈₀nｍ当り１：32000以上で、回収率
96％以上を示した。

尚、酵素処理を行わない抗体による抗HBs固
定Sepharose 4Bでの精製では吸着率が劣り、と
りわけ比活性の上昇が、１：8000を上がらず、回
収率も75％程度を示した。

実施例 ４ 公知の方法で精製した抗HBsモノクローナル
抗体のHAI法で１：1600000、比活性でE₂₈₀nｍ当
たり１：55000の培養液を実施例１の方法で精製
し、抗HBs固定Sepharose 4Bを調製した。

本品１ml当たり、比活性としてE₂₈₀nｍ当たり
１：3000のHBsAgを力価で１：300000を吸着す
ることが出来て、洗浄溶出後は比活性として
E₂₈₀nｍ当たり１：35000以上で、回収率95％以上
を示した。

尚、酵素処理を行わない抗体による抗HBs固
定Sephaprse 4Bでの精製では吸着率が劣り、と
りわけ比活性の上昇が、１：12000を上がらず、
回収率も73％程度であつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ペプシン、トリプシン、プラスミンから選ば
   れる少なくとも一の蛋白分解酵素、およびアミラ
   ーゼ、アルギナーゼから選ばれる少なくとも一の
   糖分解酵素にて処理された抗体を固定化した担体
   を吸着体とすることを特徴とする、前記抗体に対
   応する抗原物質の精製方法。 ２ 抗原物質がウロキナーゼ、又はＢ型肝炎表面
   抗原（HBsAg）である特許請求の範囲第１項記
   載の精製方法。