JPH0466455B2

JPH0466455B2 -

Info

Publication number: JPH0466455B2
Application number: JP60066728A
Authority: JP
Inventors: Noruberuto Kote Dokutaa; Berutoramu Iichentofu Dokutaa
Original assignee: Biotest AG
Current assignee: Biotest AG
Priority date: 1984-03-31
Filing date: 1985-04-01
Publication date: 1992-10-23
Also published as: EP0156961B1; ATE62816T1; EP0156961A2; JPS60224626A; DE3412144C2; DE3484509D1; DE3412144A1; US4526715A; EP0156961A3

Description

【発明の詳細な説明】本発明は基質を含まず、肝炎の心配のない高純
度のヒト及び動物ヘモグロビン溶液の製造方法に
関する。

ヘモグロビン溶液は生体内で赤血球に関係なく
酸素を輸送できる状態にある。しかし、この溶液
の適合性を良好にするために、溶血によつてヘモ
グロビンを放出させる血液の血漿及び細胞成分
（血漿蛋白質、基質等）をできるだけ完全にする
ことが必要である。

ヘモグロビン溶液の製造には種々な方法が用い
られている。

全ての方法の第１段階では、血漿蛋白質を除去
するために、赤血球の洗浄が行なわれる。

今までに公知の大部分の方法では、例えば西ド
イツ特許明細書第2248475号によるように、赤血
球に等張性電解質溶液を加え、遠心分離によつて
赤血球を分解している。

西ドイツ特許出願公開明細書第3130770号には、
赤血球を洗浄するために沈降を利用する、工業的
規模の製造に適した方法が述べられている。

全ての製造方法に共通した次の段階は、基質成
分の分離を伴う赤血球の溶血であり、基質成分の
分離はヘモグロビンの過、遠心分離、再結晶に
よつてまたはこれらの方法の組合せによつて行な
われる［西ドイツ特許出願公開明細書第3130770
号、デ・ベヌート（De Venuto）等、「ヘモグロ
ビン溶液の代用血液としての承認」、外科、婦人
科及び産科、（Surgery、Gynecology ＆
Obstetrics）1979年９月号、417〜436頁；エフ・
デー・ベヌート）F.De Venute）等、結晶化に
よつて製造した、基質を含まないヘモグロビンの
特性」、J.Lab.Clin.Med.、1977年３月号、509〜
516頁；マリオフエオラ（Mario Feola）等、
「代用血液としての、基質を含まないウシヘモグ
ロビン溶液の開発」、外科、婦人科及び産科、
1983年11月号］。

残留基質の脂質は場合によつては血液凝固に影
響を与え、腎障害を惹起しうるので、基質をでき
るだけ完全に分離することが特に重要である。

今までヘモグロビン溶液の製造に用いられた方
法は全て、さらに決定的な欠点を有している。今
までに実施された方法による赤血球の洗浄では、
まだ血漿蛋白質を含む製品が得られる。また赤血
球の反復洗浄またはヘモグロビンの再結晶による
血漿蛋白質の完全除去は収量のかなりの低下をも
たらすので、大きな工業的規模の場合には不経済
である。

この理由から、ヒトの医療に使用しうるような
ヘモグロビン溶液を動物血から製造することは従
来の方法では不可能であつた。何故ならば、溶液
中に残留蛋白質が存在するとヒトにこの溶液を用
いた場合に免疫反応が生ずるおそれかあるからで
ある。

本発明は、血漿蛋白質及び残留基質の脂質を含
まず、ヒトの治療用に適した高純度ヘモグロビン
溶液をヒト血からのみでなく動物血からも、臨床
用途に必要とされるような大量の製造を可能にす
るような方法を提供するという課題に基づくもの
である。

この課題は本発明に従つて次のように解決され
る。即ち、 (イ) 赤血球含有出発物質を孔径0.1〜1.2μｍの透
過フイルター・ユニツトを通して等張性洗浄液
と向流でポンプによつて循環させ、このときに
使用済み洗浄溶液を過として連続的に取り出
し、新しい洗浄溶液を補充し、 (ロ) このように洗浄され、濃縮された赤血球をフ
イルターから回収し、本来公知の方法で溶血
し、溶血物を一定容量で80000〜100000ダルト
ンの分画分子量を有する透過限外過ユニツト
を通して水と向流でポンプによつて循環させ、 (ハ) 段階(ロ)で限外液として生じた稀薄なヘモグ
ロビン溶液を一定容量で、分画分子量10000〜
50000ダルトンの透過限外過ユニツトを通し
て水と向流でポンプによつて循環させ、透過
過するが、この場合に透過過の全前び／また
は後に同じ限外過ユニツトを通して、水と向
流させることなく、ヘモグロビンが所望の値に
濃縮されるまで、ポンプによつて循環させる。

本発明により、過と孔径の小さいフイルタ一
膜との組合わせによつて、赤血球から血漿蛋白質
を除去し、細胞溶解後に赤血球外被を完全に除去
し、ベモグロビンをこのましからざる随伴物質か
ら浄化することが可能となる。本発明において、
『分画分子量』なる記載は、膜の過（分離）の
限界、言い換えれは、膜の孔の径よりも大きな径
の物質を留保する能力を示す。

例えば、ヘモグロビン分子は64500分子量を有
する。従つて、ヘモグロビンは80000〜100000ダ
ルトンの分画分子量を有する膜を透過することが
出来るが、10000〜50000ダルトンの分画分子量を
有する膜によつて留保される。

また、『水と向流で』なる記載は、一定容量を
維持しながらの透過過を意味する。この方法は
通常『定量透過過』と呼ばれ、それは、クロス
フロー過であつて、それにより、連続式に流出
する液が同容量の水に置き換えられて、透過
過される原料の全容量を一定にすることである。
また、透過過とは圧力により制御される過で
あり、通常はクロスフロー過の形式で行われる
ものである。

添附図面に従つて更に詳細に説明する。

第１図中において、等張性電解質溶液１０は、
管１８を通過して、容器１２から赤血球１６を収
容する容器１４へと通される。ポンプ２０は溶液
を、管２２を介して容器１４から回収し、それを
膜フイルター２４へと送給する。溶解蛋白質を含
む洗浄液は該フイルター２４から開口２６で回収
され、一方、赤血球を含む洗浄液は管２８を介し
て容器１４に戻される。容器１４とフイルター２
４とを介するこの等張性溶液の循環は所定の蛋白
質除去レベルに達するまでの所望の限り続けられ
る。

この場合に、例えばラツカー顔料の回収に通常
用いられるような工業用ポンプ及び工業用過モ
ジユールを用いることができる。

周知のように、赤血球はごく軽度の溶血を受け
るため、当業者は赤血球をできるだけけれいに洗
浄し、溶血を避けることに常に努力している。蓄
積された古い赤血球濃縮液は特に溶血に対して敏
感である。

従つて、当業者にとつて精製処理法として特別
なものに思われない、工業用フイルターモジユー
ルを通す工業用ポンプンを用いた循環ポンプにお
いて溶血が殆ど行なわれないことは全く画期的な
ことであり、特に例えば献血から２週間たつたよ
うな蓄積された赤血球濃縮液の使用にとつては驚
くべきことである。

このように、本発明による方法は動物及びヒト
からの新鮮な全血に対してのみでなく、蓄積され
たヒト赤血球濃縮液に対しても、取るに足るほど
の溶血を起すことなく用いられるものである。

この第１工程によつて、短時間に多量の洗浄溶
液を赤血球と接触させ、再び循環から取出すこと
によつて、強度の洗浄を行なうことが可能にな
る。

洗浄溶液としては、如何なる等張性電解質溶液
ならびに糖または糖アルコールの等張性溶液も適
しているが、特に好ましい洗浄溶液は等張性
NaCl溶液である。

フイルター面積を拡大することによつて、任意
の赤血球量を洗浄することができるため、この方
法はヘモグロビン溶液の工業的規模の製造に適し
ている。

使用するフイルターは平坦な繊維膜および中空
繊維膜のいずれでも良いが、中空繊維膜は平坦な
繊維膜よりも大きな面積を小容積で有するので、
中空繊維膜が好ましい。

膜の平均径は0.1〜1.2μｍの範囲であり、この
下限未満では血漿蛋白質が赤血球と共に保持さ
れ、上限を超えると溶血速度が大きく上昇する。
平均孔径0.4〜0.6μｍの膜を使用するのが特に好
ましい。

過圧力は50〜700ｍbarの範囲であることが
好ましい。

この循環洗浄は血漿蛋白質がもはや検出されな
くなるまで行なう。

上述のように赤血球を洗浄した後に、濃縮した
赤血球を２〜３倍量の水中に導入することによつ
て、溶血を行なう。

第２図に示した第２及び第３工程はヘモグロビ
ンからの基質の分離の説明するものであり、溶血
の直後に第２過段階において赤血球から遊離し
たヘモグロビンが赤血球基質から分離される。溶
血物３０を水３１に対して強度に透過過する
が、この際には80000〜100000ダルトンの、分画
分子量を有する限外過ユニツト３２を用いる
（平坦膜または中空繊維膜、特に中空繊維膜製の
もの。）このことは、溶血物３０が一定容量で限外過
ユニツト３２を通してポンプ３３によつて循環さ
せられ、64500の分子量を有するヘモグロビンが
80000〜100000ダルトン以下の分子量を有する全
ての随伴物質とともに限外過中に現われること
を意味する。

この方法の利点は、ヘモグロビンの大部分が赤
血球基質と共に廃棄されていた今までの公知の方
法とは対照的に、存在する溶血物から殆ど全ての
ヘモグロビンを回収することができることであ
る。

この第２過段階で限外液として生ずる稀薄
なヘモグロビン溶液３４を第２過段階におい
て、第２過と並行してポンプ３５を介して濃縮
する。10000〜50000ダルトン分画分子量を有する
限外過ユニツト３６を再び用いるならば、ヘモ
グロビンが留保されることによつて、ヘモグロビ
ンが濃縮されるとともに、使用した膜の前記の透
過能以下の分子量を有する随伴物質の一部がすで
に除去される。ヘモグロビンが所望の濃度にまで
濃縮されるや否や、完全に濃縮するために、低分
子の随伴物質を水３７に対して新たに透過過す
る。

しかし、実際には第３過段階の如何なる箇所
においても透過過を行なうことができる。例え
ば、最初に透過過し、次に濃縮するか、または
この逆を行なうことができる。しかし、透過過
のためにはヘモグロビン溶液量が多すぎてもまた
溶液が濃厚すぎてもいけないので、透過過は第
３段階のほぼ中央で行なうのが好ましい。すなわ
ちヘモグロビン溶液を最初に或る濃度にまで濃縮
し、次に透過過し、その後に望ましい最終濃度
に調節する。

第２及び第３過段階の過圧力は、その都度
の対応フイルターモジユールに対して許容される
最大圧力によつて、制限を受ける。この最大圧力
は製造者によつてモジユールに記載される。

例えば西ドイツ特許明細書第2449252号、第
2617822号及び第2714252号に述べられているよう
に、通常の方法によつて改質ヘモグロビン溶液に
加工することのできる、望ましい濃度の高純度ヘ
モグロビン溶液が得られるが、前述の文献は改質
のみに関するものであり、浄化に関するものでは
ない。

３段階の全てにおける過は云わゆるクロスフ
ロー形式の透過過である。通常の過では、
過すべき物質が非常に迅速に孔を閉塞してしまう
ことになる。

水としては脱イオン水または蒸溜水を用いるこ
とが好ましい。

すでに前述した刊行物の中でマリオ・フエオラ
（Mario Feola）等が述べているヘモグロビン溶
液の製造法も確かに第２段階を含むものであり、
溶血物を次々に、100000ダルトン及び30000ダル
トンの分画分子量を有するフイルターに通してい
る。しかし、彼らの方法では先行の赤血球洗浄を
電解質溶液による通常の方法で行なつているた
め、血漿蛋白質の完全な分離が行なわれていな
い。

さらに、最後の30000ダルトン過からの限外
液を電解質に対して透析しているため、得られ
たヘモグロビン溶液が高い電解質含量を有する結
果になり、このことは例えば心臓切開手術（心臓
麻痺）における冠血管の潅流のような特定の用途
に対しては不利である。

これに反して、第２及び第３工程で水に対して
透過過する本発明の方法によると、実際に電解
質を含まない製品が得られる。最後に、全ての粗
粒の細胞成分をまだ含有する溶血物を100000ダル
トンフイルターで直接過すると、このフイルタ
ーが非常に迅速に閉塞することが専門家に当然考
えられるので、溶血を行なつた後の２つの限外
過に0.5μｍの孔径を有するフイルターによる過
を前置させる。しかし、本発明によつて溶血物を
100000ダルトンフイルターに通して水と向流でポ
ンプによつて循環させるならば、フイルター閉塞
が生せず、孔径のより大きいフイルターによる溶
血物の前置過段階を省略できることが意外にも
見出された。

本発明による複合方法の利点は１つには技術的
に簡単に実施できることであり、これに伴つてこ
れまでの方法に比べてかなりの時間の節約及びヘ
モグロビン収率の上昇が得られる。他の利点とし
ては、このようにして得られたヘモグロビンの純
度が高いためにヒトの治療用の改質ヘモグロビン
溶液の製造に動物血を用いることがおそらく可能
になることが考えられる。さらに本発明による製
品は実際に電解質を含んでいず、また本発明の方
法は出発物質中に場合によつては存在する細菌ま
たはウイルスを明らかに減少させるため、従来の
方法から公知の、例えばβ−プロピオラクトンに
よる殺菌（例えば、西ドイツ特許明細書第
2248475号、西ドイツ特許出願公開明細書第
3130770号）を省略することが可能である。しか
し、特別な場合には、本発明による方法において
も事情に応じて、赤血球洗浄中にβ−プロピオラ
クトン処理を実施する。

以下の実施例は本発明をさらに詳細に説明する
ものである。

実施例１安定化して新鮮なウシ血液５を血液にフイル
ターを通して過して、５容器に収容した。こ
の血液を孔径0.4μｍ及び総面積１m²の２個の中空
繊維過カートリツジを通して血液ポンプによつ
て循環させた。この循環から去された量の代り
に、絶えず0.9％NaCl溶液を補充した。血漿蛋白
質をほぼ完全にするために、NaCl溶液50（出
発量の10倍）を用いて洗浄した。平均過圧力は
266ｍbarであつた。洗浄は３時間で終了した。
つぎに赤血球を2.5に濃縮した。この赤血球濃
縮物を蒸溜水５中で撹拌し、このときに溶血を
惹起させた。基質を除去するために、この溶血物
を分画分子量1000000ダルトンの２個の中空繊維
カートリツジ（1.8m²）を通してポンプによつて
循環させた。ヘモグロビン（分子量64500）はこ
の膜を通過するが、基質成分及び高分子量物質は
留保された。蒸溜水を絶えず添加することによつ
て、循環量を一定に保持した。30の限外液中
に全ヘモグロビンの約95％が含有されていた。限
外液５が得られるや否や、量を一定に保ちな
がらヘモグロビンを、分画分子量10000ダルトン
（1.8m²）の２個の中空繊維カートリツジが存在す
る他の循環系で濃縮した。基質分離が終了し、５
量中に全ヘモグロビンの95％が存在するように
なるや否や、低分子量成分を除去するために、
10000ダロトンの分画分子量を有する同じ限外
過ユニツトを通して蒸溜水25に対して透過過
した。最後の段階では、同じ循環でヘモグロビン
を22％までに濃縮した。次にこの溶液を0.2μｍフ
イルタを通して無菌化した。収率は80％であつ
た。

実施例２ヘモグロビン溶液から血漿蛋白質が完全に除去
されていることは、免疫電気泳動に基いて及び動
物実験において示された。これに加えて、フロイ
ントアジユバント（Freund's adjnvant）を用
い、実施例１で製造されたヘモグロビン溶液によ
つて、モルモツトを免疫化した。この動物の血漿
中には、ヒト血漿蛋白質及び動物の血漿蛋白質に
対する抗体が検出されなかつた。

実施例３出発血液中に存在する病原菌が本発明の方法に
よつて明らかに減少することは、実験によつても
示された。ヘモグロビン溶液の製造に用いた血液
に約25mmの直径を有するΦ×174フアージまたは
200mmの直径を有するκフアージを10⁷／mlの濃度
で加えた場合に、第１過段階における10倍量の
洗浄溶液による赤血球の洗浄によつて、10³〜10⁴
個のフアージの減少が生ずることが示された。

放出されたヘモグロビンが100000ダルトンの分
画分子量を有する限外過膜によつて過される
次の過段階では、さらに10³個／mlのフアージ
がその直径に基づいて膜を通過できないために、
膜によつて留保された。従つて、添加したフアー
ジは約10⁶個／ml減少した。すなわち10個／mlま
でに低下した。通常の血液銀行基準によつて検査
される輸血用血液は依然として肝炎を伝染させう
るので、この無菌化効果は特に重要である。すで
に前記で詳論したように、従来の方法では化学的
な殺菌処理が必要であつた。ここに述べた過方
法によると、このような化学的な殺菌を省略する
ことが可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、赤血球をフイルターユニツトを通し
て等張性洗浄溶液と向流でポンプによつて循環さ
せる本発明の方法の第１工程の赤血球洗浄法の説
明線図、第２図は、本発明の方法の第２及び第３
行程におけるヘモグロビンからの基質の分離の説
明線図である。１０……等張性洗浄溶液、１６……赤血球、２
４……孔径0.1〜1.2μｍの透過フイルターユニツ
ト、３０……溶血物、３１……水、３２……
80000〜100000ダルトンの分画分子量を有する透
過限外過ユニツト、３３……ポンプ、３４……
稀薄なヘモグロビン溶液、３５……ポンプ、３６
……10000〜50000ダルトンの分画分子量を有する
透過限外過ユニツト、３７……水。

Claims

【特許請求の範囲】１基質を含まず、肝炎の心配のない、高純度の
ヒト及び動物ヘモグロビン溶液の製造方法におい
て、 (イ) 赤血球を含有する出発物質を孔径0.1〜1.2μ
ｍの透過フイルターユニツトを通して、等張性
洗浄液と向流で循環させ、使用済み洗浄溶液を
液として連続的に取り出し、新しい洗浄溶液
を補充し、 (ロ) このように洗浄され、濃縮された赤血球をフ
イルターから取り出し、本来公知の方法で溶血
し、溶血物を一定容量で、80000〜100000ダル
トンの分画分子量を有する透過限外過ユニツ
トを通して水と向流でポンプによつて循環さ
せ、 (ハ) 段階(ロ)で限外液として生じた稀薄なヘモグ
ロビン溶液を一定容量で、10000〜50000ダルト
ンの分画分子量を有する透過限外過ユニツト
を通して水と向流でポンプによつて循環させて
透過過するが、この場合に透過過の前及
び／または後に同じ限外過ユニツトを通し
て、水と向流でなく、ヘモグロビンが望ましい
濃度に濃縮されるまで、ポンプによつて循環さ
せることを特徴とする基質を含まず、肝炎の心
配のない、高純度のヒト及び動物ヘモグロビン
溶液の製造方法。２段階(ハ)において、ヘモグロビンが望ましい濃
度に濃縮されるまで、最初にポンプによつて循環
させ、次に同じ限外過ユニツトを通して水と向
流で循環させて透過過し、次にヘモグロビンを
望ましい最終濃度に調節することを特徴とする特
許請求の範囲第１項に記載の製法方法。３段階(イ)において、50〜700ｍbarの過圧力
で操作することを特徴とする特許請求の範囲第１
項または第２項に記載の製造方法。４段階(イ)の洗浄溶液として等張性NaCl溶液を
用いることを特徴とする特許請求の範囲第１項乃
至第３項のいずれか１項に記載の製造方法。５段階(イ)において0.4〜0.6μｍの孔径を有する
過ユニツトを用いることを特徴とする特許請求
の範囲第１項乃至第４項のいずれか１項に記載の
製造方法。６３段階の全てにおいて、過ユニツトまたは
限外過ユニツトとして中空繊維膜を用いること
を特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第５項の
いずれか１項に記載の製造方法。