JPH0466596A - 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチド、これをコードする核酸断片およびこれらの利用法 - Google Patents
非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチド、これをコードする核酸断片およびこれらの利用法Info
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- JPH0466596A JPH0466596A JP17666990A JP17666990A JPH0466596A JP H0466596 A JPH0466596 A JP H0466596A JP 17666990 A JP17666990 A JP 17666990A JP 17666990 A JP17666990 A JP 17666990A JP H0466596 A JPH0466596 A JP H0466596A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ｔＪＬＬ立■月１１
本発明は、Ａ型でもＢ型でもない血清型肝炎の原因ウィ
ルス〈非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス）抗原ペプチド、これを
コードする遺伝子断片およびこれらの利用法に関する． ′ 遼Ｊｕ ウィルス性肝炎にはＡ型肝炎（伝染性肝炎）とＢ型肝炎
（血清肝炎）の２種票があることは古くから知られてい
た。これは主として感染経路の相違に基づいたもので、
Ａ型肝炎は経口感染で流行を起こし、Ｂ型肝炎は主とし
て血液を介して伝播されるものであることが確認されて
いた。これら二つの肝炎の起因ウィルスは既に分離同定
され、Ａ型肝炎ウィルスは、ピコルナウィルスに属する
、直径２７ｎ−のＲＮＡウィルスであり［Ｆｉｎｅｓｔ
ｏｎ、Ｓ、間、 ｅｔ ａｌ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ １
８２ ｐ１０２６ （１９７３）］、一方Ｂ型肝炎ウィ
ルスは、ヘパドナウィルスに属する直径４２ｎ鳳のエン
ベロープを待つＤＮＡウィルスであることが突き止めら
れた。 ［Ｄａｏｅ、０．ｓ、、 ｅｔ ａｌ、。
ルス〈非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス）抗原ペプチド、これを
コードする遺伝子断片およびこれらの利用法に関する． ′ 遼Ｊｕ ウィルス性肝炎にはＡ型肝炎（伝染性肝炎）とＢ型肝炎
（血清肝炎）の２種票があることは古くから知られてい
た。これは主として感染経路の相違に基づいたもので、
Ａ型肝炎は経口感染で流行を起こし、Ｂ型肝炎は主とし
て血液を介して伝播されるものであることが確認されて
いた。これら二つの肝炎の起因ウィルスは既に分離同定
され、Ａ型肝炎ウィルスは、ピコルナウィルスに属する
、直径２７ｎ−のＲＮＡウィルスであり［Ｆｉｎｅｓｔ
ｏｎ、Ｓ、間、 ｅｔ ａｌ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ １
８２ ｐ１０２６ （１９７３）］、一方Ｂ型肝炎ウィ
ルスは、ヘパドナウィルスに属する直径４２ｎ鳳のエン
ベロープを待つＤＮＡウィルスであることが突き止めら
れた。 ［Ｄａｏｅ、０．ｓ、、 ｅｔ ａｌ、。
Ｌａｎｃｅｔ、 Ｉ ｐ６９５ ＜１９７０）］また、
現在では、これらの肝炎ウィルスの免疫血清学的診断方
法が確立されるに至っている。
現在では、これらの肝炎ウィルスの免疫血清学的診断方
法が確立されるに至っている。
これら２つの肝炎ウィルスの確定診断方法が確立される
に従い、このいずれにも属さない非Ａ非Ｂ型肝炎の存在
が明らかになってきた［Ｐｒ１ｎｃｅ、Ａ。
に従い、このいずれにも属さない非Ａ非Ｂ型肝炎の存在
が明らかになってきた［Ｐｒ１ｎｃｅ、Ａ。
帽、ｅｔ ａｌ、、 Ｌａｎｃｅｔ、 Ｉ ｐ２４１
（１９７４＞］。
（１９７４＞］。
輸血後肝炎は、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ
）のスクリーニング方法の導入により大幅に減少したが
ゼロにはならず、しがち、発生した肝炎患者からは、Ａ
型、Ｂ型肝炎の感染の証拠は得られなかった。このこと
がら、この肝炎は一般に非Ａ ＩＦ、Ｂ型肝炎と呼ばれ
ている。
）のスクリーニング方法の導入により大幅に減少したが
ゼロにはならず、しがち、発生した肝炎患者からは、Ａ
型、Ｂ型肝炎の感染の証拠は得られなかった。このこと
がら、この肝炎は一般に非Ａ ＩＦ、Ｂ型肝炎と呼ばれ
ている。
この肝炎は、我国では散発性肝炎の約５０％、輸血後肝
炎の９０％以上にのぼり、更に慢性肝炎、肝硬変、肝癌
の５０％以上が非Ａ非Ｂ型肝炎に起因すると推定されて
おり、大きな社会問題となっている。
炎の９０％以上にのぼり、更に慢性肝炎、肝硬変、肝癌
の５０％以上が非Ａ非Ｂ型肝炎に起因すると推定されて
おり、大きな社会問題となっている。
これとは別に、インド、ビルマ、アフガニスタン、また
は、化アフリカなどで経口感染で流行する、第二のウィ
ルス性非Ａ非Ｂ！！！肝炎があることが明らかになった
［ Ｋｈｕｒｏｏ、 Ｍ、 Ｓ、 Ａｍ、 Ｊ、 Ｍ
ｅｄ、 。
は、化アフリカなどで経口感染で流行する、第二のウィ
ルス性非Ａ非Ｂ！！！肝炎があることが明らかになった
［ Ｋｈｕｒｏｏ、 Ｍ、 Ｓ、 Ａｍ、 Ｊ、 Ｍ
ｅｄ、 。
６８ ｐ８１８−８２４． （１９８０）］、 こ
れは、一般には水系、または流行性非Ａ非Ｂ型肝炎と呼
ばれている。我国では、この肝炎の流行は見られていな
いが、渡航者の流行地からの肝炎の輸入は若干見られる
ようである［福原ら、第２５回日本肝臓学余総会講演要
旨集１５１頁（１９８９） １ 。
れは、一般には水系、または流行性非Ａ非Ｂ型肝炎と呼
ばれている。我国では、この肝炎の流行は見られていな
いが、渡航者の流行地からの肝炎の輸入は若干見られる
ようである［福原ら、第２５回日本肝臓学余総会講演要
旨集１５１頁（１９８９） １ 。
本発明は、上記で言う前者の、主に血液を介して感染す
る血清型非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに関するものであり、
本明細書中では、このウィルスを非Ａ非Ｂ型肝炎ウィル
スと言う。
る血清型非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに関するものであり、
本明細書中では、このウィルスを非Ａ非Ｂ型肝炎ウィル
スと言う。
この非Ａ非Ｂ型肝炎についてはウィルス本体の分離同定
はされておらず、このため、この肝炎の診断方法、治療
法、予防法は確立されていない。
はされておらず、このため、この肝炎の診断方法、治療
法、予防法は確立されていない。
また、この肝炎の診断は除外診断によるしかなかった。
即ち、患者の血清について、診断方法が確立されている
Ａ型、Ｂ型肝炎の検査を行い、これらの肝炎であること
を否定し、更に、全身感染の一部の症状として肝炎症状
を示す、ヘルベ入 サイトメガロ、エプスタインバーウ
ィルス感染の可能性を否定し、薬物性や、アルコール性
肝炎、自己免疫性肝炎を否定して非Ａｌｌ：Ｂ型肝炎と
して診断されていた。
Ａ型、Ｂ型肝炎の検査を行い、これらの肝炎であること
を否定し、更に、全身感染の一部の症状として肝炎症状
を示す、ヘルベ入 サイトメガロ、エプスタインバーウ
ィルス感染の可能性を否定し、薬物性や、アルコール性
肝炎、自己免疫性肝炎を否定して非Ａｌｌ：Ｂ型肝炎と
して診断されていた。
この肝炎の原因ウィルスが感染性を持つことは、１９７
８年アメリカの研究グループにより、チンパンジーを用
いた感染実験で証明された［ Ｔａｂｏｒ、 Ｅ、 。
８年アメリカの研究グループにより、チンパンジーを用
いた感染実験で証明された［ Ｔａｂｏｒ、 Ｅ、 。
ｅｔ ａｌ、、Ｌａｎｃｅｔ、Ｉ ｐ４６３ （１９７
８）］、 Ｉ、がし世界中の多くの努力にもかかわら
ず、１０年以上経た今も、原因ウィルスの実態はわかっ
ていない、患者感染チンパンジーの血液や肝組織を材料
として、寒天ゲル内沈降反応、免疫電気向流法、ラジオ
イムノアッセイ、蛍光抗体法、電顕法などのＡ型および
Ｂ型肝炎の研究で用いられたほとんどすべてのアプロー
チにより、ウィルスや関連抗原抗体系捜しが行われたき
たが、い才だ確実といわれるものは得られていない。
８）］、 Ｉ、がし世界中の多くの努力にもかかわら
ず、１０年以上経た今も、原因ウィルスの実態はわかっ
ていない、患者感染チンパンジーの血液や肝組織を材料
として、寒天ゲル内沈降反応、免疫電気向流法、ラジオ
イムノアッセイ、蛍光抗体法、電顕法などのＡ型および
Ｂ型肝炎の研究で用いられたほとんどすべてのアプロー
チにより、ウィルスや関連抗原抗体系捜しが行われたき
たが、い才だ確実といわれるものは得られていない。
非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス究明の歴史は、期待と失望の歴
史であったともいえる。数多くのウィルスあるいは抗原
抗体系の候補が浮かび上がってきたが、それらは次々に
否定されていった［ Ｐｒ１ｎｃｅ、 Ａ、 Ｍ、 、
＾ｎｎ、Ｒｅｖ、１４ｉｃｒｏｂｉｏ１．、 ３７
． ｐ２１７．（１９８３）コ。
史であったともいえる。数多くのウィルスあるいは抗原
抗体系の候補が浮かび上がってきたが、それらは次々に
否定されていった［ Ｐｒ１ｎｃｅ、 Ａ、 Ｍ、 、
＾ｎｎ、Ｒｅｖ、１４ｉｃｒｏｂｉｏ１．、 ３７
． ｐ２１７．（１９８３）コ。
最近の例では、５ｅｔｏらのレトロウィルス説があり［
５ｅｔｏ、Ｂ、 ｅｔ ｔｌ、： Ｌａｎｃｅｔ、 Ｉ
ｐ９４１−９４３ （１９８４）〕、彼等によると、
チンパンジーに非Ａ非Ｂ型肝炎を起こすことが証明され
ている血清や血液製剤に逆転写酵素活性が検出され、シ
ョ糖密度勾配遠心ではこの酵素は、１．１４ｇ／■ｌの
部分にくる、すなわちレトロウィルスと似た浮上密度を
持つというものであった、絖いｒ、 Ｐｒ４ｎＣｅら
は、チンパンジー肝初代培養細砲に患者血清を接種して
、レトロウィルス様粒子が見られたと報告した［Ｐｒ１
ｎｃｅ、ＡＪ、 ｅｔ ａｌ、 Ｌａｎｃｅｔ、 Ｉ：
ｐ１０７１−１０７５ （１９８４）］、 Ｌかしなが
ら、逆転写酵素活性は［（ｏｌｌｉｎｇｅｒらの追試に
より否定された［［Ｉｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ、
、 Ｌａｎｃｅｔ。
５ｅｔｏ、Ｂ、 ｅｔ ｔｌ、： Ｌａｎｃｅｔ、 Ｉ
ｐ９４１−９４３ （１９８４）〕、彼等によると、
チンパンジーに非Ａ非Ｂ型肝炎を起こすことが証明され
ている血清や血液製剤に逆転写酵素活性が検出され、シ
ョ糖密度勾配遠心ではこの酵素は、１．１４ｇ／■ｌの
部分にくる、すなわちレトロウィルスと似た浮上密度を
持つというものであった、絖いｒ、 Ｐｒ４ｎＣｅら
は、チンパンジー肝初代培養細砲に患者血清を接種して
、レトロウィルス様粒子が見られたと報告した［Ｐｒ１
ｎｃｅ、ＡＪ、 ｅｔ ａｌ、 Ｌａｎｃｅｔ、 Ｉ：
ｐ１０７１−１０７５ （１９８４）］、 Ｌかしなが
ら、逆転写酵素活性は［（ｏｌｌｉｎｇｅｒらの追試に
より否定された［［Ｉｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ、
、 Ｌａｎｃｅｔ。
Ｉ ｐ４１ （１９８６）コ、更に、Ｐｒ１ｎｃｅらの
観察したウィルス粒子はミクソウィルスの混入として否
定された。
観察したウィルス粒子はミクソウィルスの混入として否
定された。
非Ａ非Ｂ型肝炎の研究を困難にしている問題点は、血清
中のウィルス濃度が１０２〜１０３と低いこと、同じ接
種材料で再感染を起こしたチンパンジーがあるなど、
抗体の存在が疑がわしいこと、感染実験モデルがチンパ
ンジー、マーモセットしかいないことなどである。
中のウィルス濃度が１０２〜１０３と低いこと、同じ接
種材料で再感染を起こしたチンパンジーがあるなど、
抗体の存在が疑がわしいこと、感染実験モデルがチンパ
ンジー、マーモセットしかいないことなどである。
最近になって米国のカイロン社が、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィ
ルスのｃＤＮＡを捕らえたという報告があり、［Ｃｈｏ
ｏ、 Ｑ ｅｔ ａｌ、 、 ５ｃｉｅｎｃｅ、
２４４． Ｐ２Ｓ５−３６２（１９８９）、 Ｋｕｏ
、Ｇ、 ｅｔ ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、 ２４４．
ｐ３６２−３６４（１９８９） １、その塩基配列の一
部が公開されているが（欧州特許ＥＰ ３１８２１（ｙ
ＡＥ、ウィルスそのものの性状、ウィルス構成蛋白の
性状などはまだ明らかにされていない。
ルスのｃＤＮＡを捕らえたという報告があり、［Ｃｈｏ
ｏ、 Ｑ ｅｔ ａｌ、 、 ５ｃｉｅｎｃｅ、
２４４． Ｐ２Ｓ５−３６２（１９８９）、 Ｋｕｏ
、Ｇ、 ｅｔ ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、 ２４４．
ｐ３６２−３６４（１９８９） １、その塩基配列の一
部が公開されているが（欧州特許ＥＰ ３１８２１（ｙ
ＡＥ、ウィルスそのものの性状、ウィルス構成蛋白の
性状などはまだ明らかにされていない。
一般に、ウィルスの違いは、その免疫血清学的性状の違
い、分子遺伝学的性状の違いよりお新方法がまったく異
なってくる。また、株の違いは、免疫血清学的性状が一
部異なるため同一の診断方法では株間の違いにより検出
感度の違い、ワクチンでは免疫原性、感染防御能の違い
が出てくる８分子遺伝学的診断方法、たとえばＤＮＡプ
ローブ診断においては、プローブとウィルス核酸の間の
ハイブリダイゼーションは核酸レベルでのホモロジーが
非常に高くないと実用的ではないことが一般に知られて
いる。すなわち、株間での核酸レベルでの差異により、
ＤＮＡのハイブリダイゼーションが起こらず、ＤＮＡプ
ローブ診断が効果的にできないケースが考えられる。
い、分子遺伝学的性状の違いよりお新方法がまったく異
なってくる。また、株の違いは、免疫血清学的性状が一
部異なるため同一の診断方法では株間の違いにより検出
感度の違い、ワクチンでは免疫原性、感染防御能の違い
が出てくる８分子遺伝学的診断方法、たとえばＤＮＡプ
ローブ診断においては、プローブとウィルス核酸の間の
ハイブリダイゼーションは核酸レベルでのホモロジーが
非常に高くないと実用的ではないことが一般に知られて
いる。すなわち、株間での核酸レベルでの差異により、
ＤＮＡのハイブリダイゼーションが起こらず、ＤＮＡプ
ローブ診断が効果的にできないケースが考えられる。
血清型の肝炎として、よく知られ、既によく解析されて
いるＢ型肝炎においては、欧米、東南アジア等の地域ご
とにメジャーなり型肝炎ウィルスのサブタイプ、すなわ
ちその地域に特徴的な流行株（サブタイプ〉が存在する
ことが知られていることから、本発明の対象となる非Ａ
非Ｂ型肝炎ウィルスにおいても地域に特有なウィルス種
、もしくはウィルス株等が存在することが考えられる。
いるＢ型肝炎においては、欧米、東南アジア等の地域ご
とにメジャーなり型肝炎ウィルスのサブタイプ、すなわ
ちその地域に特徴的な流行株（サブタイプ〉が存在する
ことが知られていることから、本発明の対象となる非Ａ
非Ｂ型肝炎ウィルスにおいても地域に特有なウィルス種
、もしくはウィルス株等が存在することが考えられる。
したがって、特定の地域、例えば特に日本で流行してい
る非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの診断方法、予防方法を確立
するには、日本でメジャーな非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス株
を捕らえる必要がある。
る非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの診断方法、予防方法を確立
するには、日本でメジャーな非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス株
を捕らえる必要がある。
先１０且激
このような状況のもとに、本発明者らは、非Ａ非Ｂ型肝
炎の原因ウィルスもしくはそのウィルス遺伝子のクロー
ニングを目的として研究を重ねた結果、肝炎患者血清よ
り非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの抗原ペプチド配列をコード
している遺伝子をクローニングし、これにコードされる
ペプチドが非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスと特異的に反応する
ことを確認した。
炎の原因ウィルスもしくはそのウィルス遺伝子のクロー
ニングを目的として研究を重ねた結果、肝炎患者血清よ
り非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの抗原ペプチド配列をコード
している遺伝子をクローニングし、これにコードされる
ペプチドが非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスと特異的に反応する
ことを確認した。
すなわち、本発明者らは、献血者のＧＰＴ高値血漿を用
いて、従来の免疫血清学的方法とは違つた新しい分子遺
伝学的手法を取り入れたイムノスクリーニング法により
得られた非Ａ １１： Ｂ型肝炎ウィルスに特有なペプ
チドおよびこれをコードしている遺伝子断片並びにこれ
らの利用法を提供するものである。
いて、従来の免疫血清学的方法とは違つた新しい分子遺
伝学的手法を取り入れたイムノスクリーニング法により
得られた非Ａ １１： Ｂ型肝炎ウィルスに特有なペプ
チドおよびこれをコードしている遺伝子断片並びにこれ
らの利用法を提供するものである。
］」
本発明の目的とするような核酸断片をクローニングする
に際しては、研究材料として非Ａ Ｉｔ” Ｂ型肝炎に
感染した日本人の肝臓、並びに非Ａ非Ｂ型肝炎を感染さ
せたチンパンジーの肝臓を用い、ｍＲＮＡを抽出しｃＤ
ＮＡを合成して、その中から、染色体ＤＮＡとのサブト
ラクションによりウィルス特異的ｃＤＮＡを選択してく
ることが考えられる。Ｌかしながら、これに必要な良い
実験材料を十分な量確保することはきわめて困難である
。
に際しては、研究材料として非Ａ Ｉｔ” Ｂ型肝炎に
感染した日本人の肝臓、並びに非Ａ非Ｂ型肝炎を感染さ
せたチンパンジーの肝臓を用い、ｍＲＮＡを抽出しｃＤ
ＮＡを合成して、その中から、染色体ＤＮＡとのサブト
ラクションによりウィルス特異的ｃＤＮＡを選択してく
ることが考えられる。Ｌかしながら、これに必要な良い
実験材料を十分な量確保することはきわめて困難である
。
もう一つの研究材料として非Ａ非Ｂ型肝炎感染者あるい
は感染チンパンジーの血漿が考えられる。
は感染チンパンジーの血漿が考えられる。
ヒトでは非Ａ非Ｂ型肝炎のキャリアーの存在が確認され
ており、輸血において供血者のＧ Ｐ Ｔ値が高い程輸
血後非Ａ非Ｂ型肝炎の発生頻度が高いことからＧＰＴ高
値の血漿はキャリアーの頻度が高いと推定されている。
ており、輸血において供血者のＧ Ｐ Ｔ値が高い程輸
血後非Ａ非Ｂ型肝炎の発生頻度が高いことからＧＰＴ高
値の血漿はキャリアーの頻度が高いと推定されている。
そこで我々は比較的多量に入手可能である、日本の献血
者のＧＰＴ高値血漿をプールし、研究材料とした。この
ほか１日本人の非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血清を接種しＩＦ
Ａ非Ｂ型肝炎を発症させたチンパンジーの血漿も用いる
ことができるが、現在ではチンパンジーの入手性から多
少問題が残る。
者のＧＰＴ高値血漿をプールし、研究材料とした。この
ほか１日本人の非Ａ非Ｂ型肝炎患者の血清を接種しＩＦ
Ａ非Ｂ型肝炎を発症させたチンパンジーの血漿も用いる
ことができるが、現在ではチンパンジーの入手性から多
少問題が残る。
血漿中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス濃度は先に述べたよう
に１０２〜ｌＯ）程度しかないと推定されていることか
ら、ウィルス核酸の抽出およびｃＤＮＡの合成には１０
００倍程度ウィルスを濃縮する必要がある。しかしなが
ら、ヒト血漿は７％前後の蛋白溶液であり、ただ単に濃
縮することは不可能であり、除蛋白をしながらウィルス
を濃縮する必要がある。我々が用いたポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）などの沈澱剤による沈澱形成は、比較
的簡便に行うことができ、大量の血漿の処理にも適して
おり、ウィルスの失活も少ないマイルドな方法である。
に１０２〜ｌＯ）程度しかないと推定されていることか
ら、ウィルス核酸の抽出およびｃＤＮＡの合成には１０
００倍程度ウィルスを濃縮する必要がある。しかしなが
ら、ヒト血漿は７％前後の蛋白溶液であり、ただ単に濃
縮することは不可能であり、除蛋白をしながらウィルス
を濃縮する必要がある。我々が用いたポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）などの沈澱剤による沈澱形成は、比較
的簡便に行うことができ、大量の血漿の処理にも適して
おり、ウィルスの失活も少ないマイルドな方法である。
このほかには、超遠心によるベレッテイング、硫安など
の塩類の添加による塩析 限外濾過、ゲルクロマトグラ
フィーなどが用いられうる。
の塩類の添加による塩析 限外濾過、ゲルクロマトグラ
フィーなどが用いられうる。
このように１０００倍程度に濃縮した血漿をグアニジウ
ムチオシアネ−１−７’処理し、フェノール／クロロホ
ルムで抽出をお、コない、エタノール沈澱により濃縮血
漿中の全核酸を精製する。次に１） Ｎ Ａ分解酵素で
混入１７ているヒト由来のＤＮＡを分解し、フェノール
／クロロホルム抽出とエタノール沈澱によりＲＮＡを精
製する。
ムチオシアネ−１−７’処理し、フェノール／クロロホ
ルムで抽出をお、コない、エタノール沈澱により濃縮血
漿中の全核酸を精製する。次に１） Ｎ Ａ分解酵素で
混入１７ているヒト由来のＤＮＡを分解し、フェノール
／クロロホルム抽出とエタノール沈澱によりＲＮＡを精
製する。
精製したＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、λｇｔｌｌベク
ターに挿入しｃＤＮＡライブラリーを作成する。
ターに挿入しｃＤＮＡライブラリーを作成する。
λファージを大腸菌に感染させ、細菌培養プｌ／−トに
まき、４２℃で数時間培養する。その後二１−口セルロ
ースフィルター（ＮＣフィルター）をかぶせ数時間培養
し、ＮＣフィルターをはがし２レプリカをとる。
まき、４２℃で数時間培養する。その後二１−口セルロ
ースフィルター（ＮＣフィルター）をかぶせ数時間培養
し、ＮＣフィルターをはがし２レプリカをとる。
このレプリカをブロキッング液で処理し、ＰＢＳなどで
ｉ先浄した後イムノスクリーニングを行う。
ｉ先浄した後イムノスクリーニングを行う。
すなわち、レプリカを非Ａ非Ｂ型肝炎回復期あるいは急
性期のヒトまたはチンパンジー血清と反応させ、ＰＢＳ
などで洗浄後、酵素標識抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭと反
応させ、洗浄後、基質溶液と反応させて発色させる０発
色したプラークに対応するファージを選び二次スクリー
ニングを行い、再現性のあるクローンを得た。
性期のヒトまたはチンパンジー血清と反応させ、ＰＢＳ
などで洗浄後、酵素標識抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭと反
応させ、洗浄後、基質溶液と反応させて発色させる０発
色したプラークに対応するファージを選び二次スクリー
ニングを行い、再現性のあるクローンを得た。
このクローンについて非Ａ非Ｂ型肝炎特異性を調べた。
非Ａ非Ｂ型肝炎回復期、キャリアー期、および正常期の
チンパンジーのＩｇＧを用いてプラークイムノアッセイ
を行った結果非Ａ非Ｂ型肝炎キャリアー期に特異性の高
いクローンを得ることができた。このクローンをサブク
ローニングし、アガロースゲル電気泳動で約３８０ｂｐ
の挿入断片（ＣＯ−１５）を確認した。
チンパンジーのＩｇＧを用いてプラークイムノアッセイ
を行った結果非Ａ非Ｂ型肝炎キャリアー期に特異性の高
いクローンを得ることができた。このクローンをサブク
ローニングし、アガロースゲル電気泳動で約３８０ｂｐ
の挿入断片（ＣＯ−１５）を確認した。
チンパンジーの正常及び非Ａ非Ｂ型肝炎急性期の肝臓、
並びに正常人の白血球より染色体ＤＮＡを精製し、アガ
ロース電気泳動を行った後、＄２ｐ標識したＣＨ−１５
クローンを用いてサザンハイブリダイゼーションを行っ
た。ＣＨ−１５はいずれのＤＮＡとも反応せず、したが
ってＣＩ＋−１５は染色体由来ＤＮＡでないと判明した
。
並びに正常人の白血球より染色体ＤＮＡを精製し、アガ
ロース電気泳動を行った後、＄２ｐ標識したＣＨ−１５
クローンを用いてサザンハイブリダイゼーションを行っ
た。ＣＨ−１５はいずれのＤＮＡとも反応せず、したが
ってＣＩ＋−１５は染色体由来ＤＮＡでないと判明した
。
本発明（７）ＣＨ−１５クロー、ンのＤＮＡ配列は、ジ
デオキシ法により決定された。その結果Ｃ１，−１５ク
ローンは非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子由来の計３７２
ｂｐのｃＤＮ＾断片であり、その塩基配列は第３図の中
に示される通りであった。この塩基配列とこれから推定
されるアミノ酸配列をデータベース（ＧｅｎｅｔｙｘＣ
Ｄソフトウェア開発 １９８９）で検索したところ、現
在まで知られているウィルス、細菌、その他ホモロジー
を示すものはなかった。さらに、米国カイロン社によっ
て発表された非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス（Ｈｃｖ）の塩基
配列およびアミノ酸配列と比較した結果、ＣＨ−１５の
塩基配列と８３．１％、アミノ酸配列と８９．５％のホ
モロジーを持つ領域がカイロン社の発表した配列中に存
在した。この結果からも、このクローンはカイロン社に
よってクローニングされたものと同種で、株の興なる非
Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスと推定された。
デオキシ法により決定された。その結果Ｃ１，−１５ク
ローンは非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子由来の計３７２
ｂｐのｃＤＮ＾断片であり、その塩基配列は第３図の中
に示される通りであった。この塩基配列とこれから推定
されるアミノ酸配列をデータベース（ＧｅｎｅｔｙｘＣ
Ｄソフトウェア開発 １９８９）で検索したところ、現
在まで知られているウィルス、細菌、その他ホモロジー
を示すものはなかった。さらに、米国カイロン社によっ
て発表された非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス（Ｈｃｖ）の塩基
配列およびアミノ酸配列と比較した結果、ＣＨ−１５の
塩基配列と８３．１％、アミノ酸配列と８９．５％のホ
モロジーを持つ領域がカイロン社の発表した配列中に存
在した。この結果からも、このクローンはカイロン社に
よってクローニングされたものと同種で、株の興なる非
Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスと推定された。
さらに、Ｃト１５がコードするアミノ酸配列の中から、
長さの異なる下記の２種のペプチド（２９■ｅｒおよび
３７ｓｅｒ ）を合成し、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清と反
応させたところ、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清と極めて特異
的に反応することが確認された。
長さの異なる下記の２種のペプチド（２９■ｅｒおよび
３７ｓｅｒ ）を合成し、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清と反
応させたところ、非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清と極めて特異
的に反応することが確認された。
２９■ｅｒ：
Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇ
ｌｕ Ｃｙｓ＾ｌａ Ｓｅｒ旧ｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ
Ｔｙｒ Ｖａｔ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ
！４ｅｔ ＧｉｎＬｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｇｉｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｇｉｎ Ｌｙｓ
Ａｌａ７ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔ
ｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｈｅ＾ｓｐ Ｇｌｕ Ｍｅｔ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ ［（ｉｓ
ＬｅｕＰｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇ
ｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｌｅｕ ＡｌａＧｌｕ Ｇｌｎ
Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｇｉｎ Ｌｙｓ＾１＆すなわち、本
発明はＣＨ−１５にコードされるアミノ酸配列の中でも
特に特異性の高い抗原エピトープを開示するものである
。
ｌｕ Ｃｙｓ＾ｌａ Ｓｅｒ旧ｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ
Ｔｙｒ Ｖａｔ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ
！４ｅｔ ＧｉｎＬｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｇｉｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｇｉｎ Ｌｙｓ
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ｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｈｅ＾ｓｐ Ｇｌｕ Ｍｅｔ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ ［（ｉｓ
ＬｅｕＰｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇ
ｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｎ Ｌｅｕ ＡｌａＧｌｕ Ｇｌｎ
Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｇｉｎ Ｌｙｓ＾１＆すなわち、本
発明はＣＨ−１５にコードされるアミノ酸配列の中でも
特に特異性の高い抗原エピトープを開示するものである
。
上記ペプチドのうち、特に３７■ｅｒを用いた非Ａ非Ｂ
型肝炎ウィルス抗体測定においては、２９■ｅｒを用い
た同様の測定方法と比較しても、特異性および感度のい
ずれの面において極めて優れた結果を示した。
型肝炎ウィルス抗体測定においては、２９■ｅｒを用い
た同様の測定方法と比較しても、特異性および感度のい
ずれの面において極めて優れた結果を示した。
本発明の遺伝子配列は、これを公知の適当な発現系を用
いて発現させるか、または公知の化学的な合成方法を用
いて本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチドを得
ることができる。公知の適当な発現系としては、原核細
胞または真核細胞のいずれの発現系を利用することも可
能であり、必要であれば、適当なペプチドとの融合蛋白
質とすることもできる。また、一方、化学的な合成方法
は、特定のエピトープからなる比較的短いペプチドを調
製する場合に便利である。このような本発明のペプチド
は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの抗体検査に使用すること
ができるし、またペプチドを動物に免疫して、このペプ
チドに特異的な抗体を作らせ、これを用いて非Ａ１１ｌ
型肝炎感染患者の肝組織中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスを
検出することも可能である。
いて発現させるか、または公知の化学的な合成方法を用
いて本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチドを得
ることができる。公知の適当な発現系としては、原核細
胞または真核細胞のいずれの発現系を利用することも可
能であり、必要であれば、適当なペプチドとの融合蛋白
質とすることもできる。また、一方、化学的な合成方法
は、特定のエピトープからなる比較的短いペプチドを調
製する場合に便利である。このような本発明のペプチド
は、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの抗体検査に使用すること
ができるし、またペプチドを動物に免疫して、このペプ
チドに特異的な抗体を作らせ、これを用いて非Ａ１１ｌ
型肝炎感染患者の肝組織中の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスを
検出することも可能である。
さらに、本発明で得られた非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスは、
感染予防のためのワクチンの作製に極めて有用であると
考えられる。
感染予防のためのワクチンの作製に極めて有用であると
考えられる。
また、遺伝子配列そのものは、非Ａ非Ｂ型肝炎のＤＮＡ
プローブ誇断キットの開発に極めて有用である。
プローブ誇断キットの開発に極めて有用である。
このような、本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプ
チド、これをコードする核酸断片およびこれらを利用し
た非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに関する各種検出方法は、特
に日本における非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの検出において
極めて有用であると考えられる。
チド、これをコードする核酸断片およびこれらを利用し
た非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに関する各種検出方法は、特
に日本における非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの検出において
極めて有用であると考えられる。
以下、実施例に沿って本発明を更に詳細に説明する。
日本赤十字社より供与された、ＥｔＢｓ抗原陰性でＧＰ
Ｔ値１００以上のヒトブール血漿（８，５ｆｆ＞を以下
の方法で１０００倍に濃縮した９丈ず、ヒト７−ル血漿
を粗遠心し、不溶物を除去した。これに１７１０量の５
Ｍ塩化ナトリウム液、次いで１／１０量ｆ） ４０％
（Ｗ／１１ ）ポリエチレングリコール液（ＰＥＧ６０
０１１、和光純薬社製、平均分子量７５００）を４℃に
て攪拌しながら添加した。−時閏靜１したのち、７００
０回転、２０分間遠心分離して上清を除き、沈渣に元の
血漿の約１７２０量のＴＮＥ液（１０ｄ Ｔｒｉｓ−［
（Ｃ１，ｐＨ７，４、ｂｗＭ ＥＤＴＡ、１４０ｍＭＮ
ａｃＩ）を加え、再溶解した。この溶液を、癒着の２０
％、１５％、１０％および５％ＴＨＥ液を段階的に重層
した遠心管の頂部に重層し、４℃、８００００ｘａで、
１２時間超遠心分離した０分離後、上清を除去し、沈渣
を８−１のＰＢＳに溶解してＧｆｆｒ−ＧＰＴ高値ヒト
ブール血漿の１０００倍濃縮物とした。
Ｔ値１００以上のヒトブール血漿（８，５ｆｆ＞を以下
の方法で１０００倍に濃縮した９丈ず、ヒト７−ル血漿
を粗遠心し、不溶物を除去した。これに１７１０量の５
Ｍ塩化ナトリウム液、次いで１／１０量ｆ） ４０％
（Ｗ／１１ ）ポリエチレングリコール液（ＰＥＧ６０
０１１、和光純薬社製、平均分子量７５００）を４℃に
て攪拌しながら添加した。−時閏靜１したのち、７００
０回転、２０分間遠心分離して上清を除き、沈渣に元の
血漿の約１７２０量のＴＮＥ液（１０ｄ Ｔｒｉｓ−［
（Ｃ１，ｐＨ７，４、ｂｗＭ ＥＤＴＡ、１４０ｍＭＮ
ａｃＩ）を加え、再溶解した。この溶液を、癒着の２０
％、１５％、１０％および５％ＴＨＥ液を段階的に重層
した遠心管の頂部に重層し、４℃、８００００ｘａで、
１２時間超遠心分離した０分離後、上清を除去し、沈渣
を８−１のＰＢＳに溶解してＧｆｆｒ−ＧＰＴ高値ヒト
ブール血漿の１０００倍濃縮物とした。
まず、前記の１０００倍濃縮血漿８ｍｌに５倍量のグア
ニジウムチオシアネート溶液（４Ｍグアニジウムチオシ
アネート、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，６，
１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ２−メルカプトエタノー
ル、２％ザルコシル）を加え、撹拌した後フェノール／
クロロホルム抽出し、グリコーゲンをキャリアーとして
エタノール沈澱により濃縮血漿中の全核酸を精製した０
次に、この全核酸中に存在するヒト由来のＤＮＡを分解
するために、２ｓＭバナジルリボヌクレオチッドコンブ
レックス存在下、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ １．１
５ＫＵ／ｍｌ（ベーリンガー／マンハイム社製）、５０
−Ｍ ＴｒｉｓＨＣＩ ｐＨ７，４，１ｍＭ ＥＤＴＡ
、ＩＯＩＩＭ ＭｇＣｈの混液４００ｕ！ｊ中にて、３
７℃、３０分間処理した。その後、２５０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ液１６ｕ５．１０％ＳＤＳ液８Δを加え反応を停止し
、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱によ
りＲＮＡを精製した。さらに、このＲＮＡ中に存在する
多量のグリコーゲン及び微量に存在すると思われる不純
物を除くために、Ｑ！ＡＧＢＮ ｐａｃｋ−１００（Ｄ
ｒＡＧＥＮ社製）を用いて精製操作を行った。
ニジウムチオシアネート溶液（４Ｍグアニジウムチオシ
アネート、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，６，
１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｍ２−メルカプトエタノー
ル、２％ザルコシル）を加え、撹拌した後フェノール／
クロロホルム抽出し、グリコーゲンをキャリアーとして
エタノール沈澱により濃縮血漿中の全核酸を精製した０
次に、この全核酸中に存在するヒト由来のＤＮＡを分解
するために、２ｓＭバナジルリボヌクレオチッドコンブ
レックス存在下、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ １．１
５ＫＵ／ｍｌ（ベーリンガー／マンハイム社製）、５０
−Ｍ ＴｒｉｓＨＣＩ ｐＨ７，４，１ｍＭ ＥＤＴＡ
、ＩＯＩＩＭ ＭｇＣｈの混液４００ｕ！ｊ中にて、３
７℃、３０分間処理した。その後、２５０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ液１６ｕ５．１０％ＳＤＳ液８Δを加え反応を停止し
、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱によ
りＲＮＡを精製した。さらに、このＲＮＡ中に存在する
多量のグリコーゲン及び微量に存在すると思われる不純
物を除くために、Ｑ！ＡＧＢＮ ｐａｃｋ−１００（Ｄ
ｒＡＧＥＮ社製）を用いて精製操作を行った。
ｃＤＮＡ−−
前記までの方法で精製したＲＮＡすべてを、ｃＤＮＡ合
成システムプラス（アマジャム社製）を用いてｃＤＮＡ
合成を行った８次に、合成したｃＤＮＡをｃＤＮＡクロ
ニングλｇｔｌｌ（アマジャム社製）によりλｇｔｘｔ
ベクターにクローニングした。 ｉｎ ｖｉｔｒｏパ
ッケージングの結果、１．８Ｘ１０＠プラークフオーミ
ングユニツト（ＰＦＵ）のライブラリーを得た。
成システムプラス（アマジャム社製）を用いてｃＤＮＡ
合成を行った８次に、合成したｃＤＮＡをｃＤＮＡクロ
ニングλｇｔｌｌ（アマジャム社製）によりλｇｔｘｔ
ベクターにクローニングした。 ｉｎ ｖｉｔｒｏパ
ッケージングの結果、１．８Ｘ１０＠プラークフオーミ
ングユニツト（ＰＦＵ）のライブラリーを得た。
（４）非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＦＩ ）回復期及びキ
ャリアの ゝバンコ゛−ＮＡＮＢＨルス クローンのスクリーニング ＾ −ゼ− ｃＤＮ＾ライブラリーのスクリーニングに用いる一次抗
体はＮＡＮＢＨ回復期及びキャリアー期のチンパンジー
血漿であることから、高い非特異反応が予想された。そ
こで、この非特異反応を抑えるためにスクリーニング用
チンパンジー血漿の吸収操作に用いる大腸菌Ｙ１０９０
のライゼートを調製した。即ち、単一コロニーからアン
ピシリン５０ｍ／ｓｌを含むＬＢ培地［１％Ｂａｃｔｏ
−ｔｒｙｔｏｎｅ （ジフコ社製）、０５％Ｂａｃｔｏ
−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ （ジフコ社製）、１％
ＮａＣ１、ｐｌ（７，５’ｌ中で３７℃、−夜培養した
大腸菌Ｙ１０９０培養液２０１１を２ＱのＬＢ培地に加
え、さらに３７℃で一夜培養した。この培養液を遠心管
に移し、９０００回転、１０分間、４℃で遠心分離し、
上清を除去して沈渣を得た。この沈渣１ｇ当り４１のＲ
ＩＰＡ液（１％デオキシコール酸ナトリウム、１％Ｔｒ
ｌｔｏｎ Ｘ−１００、０，３ＭＮａＣ１，０，１％Ｓ
ＤＳ、 ０．ＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５
，１ｍＭ ＰＭＳＦ）を加えて可溶化し、これをさら
に９０００回転、１０分間、４℃で遠心分離してその上
清を大腸菌ライゼートとした。
ャリアの ゝバンコ゛−ＮＡＮＢＨルス クローンのスクリーニング ＾ −ゼ− ｃＤＮ＾ライブラリーのスクリーニングに用いる一次抗
体はＮＡＮＢＨ回復期及びキャリアー期のチンパンジー
血漿であることから、高い非特異反応が予想された。そ
こで、この非特異反応を抑えるためにスクリーニング用
チンパンジー血漿の吸収操作に用いる大腸菌Ｙ１０９０
のライゼートを調製した。即ち、単一コロニーからアン
ピシリン５０ｍ／ｓｌを含むＬＢ培地［１％Ｂａｃｔｏ
−ｔｒｙｔｏｎｅ （ジフコ社製）、０５％Ｂａｃｔｏ
−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ （ジフコ社製）、１％
ＮａＣ１、ｐｌ（７，５’ｌ中で３７℃、−夜培養した
大腸菌Ｙ１０９０培養液２０１１を２ＱのＬＢ培地に加
え、さらに３７℃で一夜培養した。この培養液を遠心管
に移し、９０００回転、１０分間、４℃で遠心分離し、
上清を除去して沈渣を得た。この沈渣１ｇ当り４１のＲ
ＩＰＡ液（１％デオキシコール酸ナトリウム、１％Ｔｒ
ｌｔｏｎ Ｘ−１００、０，３ＭＮａＣ１，０，１％Ｓ
ＤＳ、 ０．ＩＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７，５
，１ｍＭ ＰＭＳＦ）を加えて可溶化し、これをさら
に９０００回転、１０分間、４℃で遠心分離してその上
清を大腸菌ライゼートとした。
Ｂ ス １−二′ し １
−の■ Ｇ（ｒｒ、ＧＰＴ高値ヒトブール血漿濃縮物中のＲＮＡ
より構築したｃＤＮ＾ライブラリーから、−枚のＬＢプ
レート［１，５％＾ｇａｒ （日永製薬社製）、１％Ｂ
ａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、 ０．５％Ｂａｃｔｏ
−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ ｐｌ（
７，５，５０周／膳ｌアンピシリンの入った細菌培養用
プレート（ヌンク社製、２３Ｃ■ｘ２３ｃｍ＞ ］当り
１００ＯＯＰＦＵのファージをとり、大腸菌Ｙ１０９０
に３７℃で１５分間感染させて、Ｔｏｐ Ａｇａｒ ４
０ｍ１ （０，７％Ａｇａｒ、１％Ｂａｃ ｔ。
−の■ Ｇ（ｒｒ、ＧＰＴ高値ヒトブール血漿濃縮物中のＲＮＡ
より構築したｃＤＮ＾ライブラリーから、−枚のＬＢプ
レート［１，５％＾ｇａｒ （日永製薬社製）、１％Ｂ
ａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、 ０．５％Ｂａｃｔｏ
−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ ｐｌ（
７，５，５０周／膳ｌアンピシリンの入った細菌培養用
プレート（ヌンク社製、２３Ｃ■ｘ２３ｃｍ＞ ］当り
１００ＯＯＰＦＵのファージをとり、大腸菌Ｙ１０９０
に３７℃で１５分間感染させて、Ｔｏｐ Ａｇａｒ ４
０ｍ１ （０，７％Ａｇａｒ、１％Ｂａｃ ｔ。
ｔｒｙｐｔｏｏｅ、 ０．５％Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓ
ｔ ｅｘｔｒａｃｔ、 １％ＮａＣ１、ｐＨ７，５，
５０Ｉｔｇ／ｍｌアンピシリン）と共にまき、４２℃で
４〜５時閏培養した。その後、１０■−ＩＰＴＧ（シグ
マ社製）を染みこませたニトロセルロースフィルター（
ＮＣフィルター： Ｓ＆Ｓ社製、Ｃｏｄｅ ＢＡ８５
．２３ｃｍＸ２３ｃｍ）をかぶせ、さらに３７℃で培養
を続けた。
ｔ ｅｘｔｒａｃｔ、 １％ＮａＣ１、ｐＨ７，５，
５０Ｉｔｇ／ｍｌアンピシリン）と共にまき、４２℃で
４〜５時閏培養した。その後、１０■−ＩＰＴＧ（シグ
マ社製）を染みこませたニトロセルロースフィルター（
ＮＣフィルター： Ｓ＆Ｓ社製、Ｃｏｄｅ ＢＡ８５
．２３ｃｍＸ２３ｃｍ）をかぶせ、さらに３７℃で培養
を続けた。
３時間後ＮＣフィルターをプレートからはがし、ＰＢＳ
で洗い、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ液（５％スキムミルク、０．
０５％ＮＪＬＮ３を含むＰＢＳ溶液〉に浸し、４℃で一
夜振とうしＦγ」ロ１人グー火：」弘乙グ ブロッキング液中で一夜漬したレプリカフィルターをＰ
ＢＳで洗浄後、ＰＢＳで１０倍に希釈したＮ Ａ Ｎ
Ｂ Ｈ回復期及びキャリアー期のチンパンジープール血
漿（スクリーニング用血漿） ［ＮＡＮＢＨ回復期及
びキャリアー期のチンパンジープール血漿をＰＢＳで５
倍希釈し、１／２０量の大腸菌ライゼートを加えて４℃
で夜非特異反応の吸収操作を行い、さらにＰＢＳで２倍
希釈した。］に浸し、室温で振とうしながら反応させた
。２時間後、ＰＢＳ−Ｔ（００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含
むＰＢＳ溶液）で、−回につき１５分間、計３回レプリ
カフィルターを洗浄の後、各々１０００倍希釈したペル
オキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧとＩｇＭヤギ抗体（ＭＢ
Ｉ、社製、 Ｆａｂ）の入ったインキュベーションバ
ッファー（１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ溶液）に
浸し、３７℃で振とうしながら反応させた。１時間後、
ＰＢＳＴで一回につき１５分間、計４回、その後ＰＢＳ
で５分間洗浄後、発色液［０，０２％ＤＡＢ （シグマ
社製〉、０．１％ＮｉＣ１？・６Ｈ２０，０００５％Ｈ
２Ｏ２コに浸し発色させた。
で洗い、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ液（５％スキムミルク、０．
０５％ＮＪＬＮ３を含むＰＢＳ溶液〉に浸し、４℃で一
夜振とうしＦγ」ロ１人グー火：」弘乙グ ブロッキング液中で一夜漬したレプリカフィルターをＰ
ＢＳで洗浄後、ＰＢＳで１０倍に希釈したＮ Ａ Ｎ
Ｂ Ｈ回復期及びキャリアー期のチンパンジープール血
漿（スクリーニング用血漿） ［ＮＡＮＢＨ回復期及
びキャリアー期のチンパンジープール血漿をＰＢＳで５
倍希釈し、１／２０量の大腸菌ライゼートを加えて４℃
で夜非特異反応の吸収操作を行い、さらにＰＢＳで２倍
希釈した。］に浸し、室温で振とうしながら反応させた
。２時間後、ＰＢＳ−Ｔ（００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含
むＰＢＳ溶液）で、−回につき１５分間、計３回レプリ
カフィルターを洗浄の後、各々１０００倍希釈したペル
オキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧとＩｇＭヤギ抗体（ＭＢ
Ｉ、社製、 Ｆａｂ）の入ったインキュベーションバ
ッファー（１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ溶液）に
浸し、３７℃で振とうしながら反応させた。１時間後、
ＰＢＳＴで一回につき１５分間、計４回、その後ＰＢＳ
で５分間洗浄後、発色液［０，０２％ＤＡＢ （シグマ
社製〉、０．１％ＮｉＣ１？・６Ｈ２０，０００５％Ｈ
２Ｏ２コに浸し発色させた。
ＮＣフィルター上で発色したプラー・りに対応するファ
ージを選び、二次スクリーニングを行った。即ち、−次
スクリーニングで選択した各ファージ２００ＰＦＵを別
々に挿入断片のないファージ２００ＰＦＵと共に大腸菌
Ｙ１０９０に感染させ、９９５ｍシャーレ（ベクトンデ
ィッキンソン社製）のＬＢプレートにｌｌｆし、レプリ
カフィルターを作製した。これらを上述の方法で抗体ス
クリーニングし、ＮＡＮＢＩ（回復期及びキャリアー期
のチンパンジー血漿と再現性よく反応するファージを１
クローン（ＣＩ（−１５）得た。
ージを選び、二次スクリーニングを行った。即ち、−次
スクリーニングで選択した各ファージ２００ＰＦＵを別
々に挿入断片のないファージ２００ＰＦＵと共に大腸菌
Ｙ１０９０に感染させ、９９５ｍシャーレ（ベクトンデ
ィッキンソン社製）のＬＢプレートにｌｌｆし、レプリ
カフィルターを作製した。これらを上述の方法で抗体ス
クリーニングし、ＮＡＮＢＩ（回復期及びキャリアー期
のチンパンジー血漿と再現性よく反応するファージを１
クローン（ＣＩ（−１５）得た。
（４）で得たクローンについて、（４）、Ｃの２次スク
リーニングと同様にレプリカフィルターを作製し、ＮＡ
ＮＢＨ回復期、キャリアー期及び正常のチンパンジー血
清又は、硫安沈澱後ＤＩ！ＡＥ−セルロファイン力ラム
（生化学工業社製）で精製したＩｇＧ分画を用いてプラ
ークアッセイを行った。その方法は抗体スクリーニング
の場合と同様であるが、−次抗体反応にチンパンジーの
ＩｇＧ分画を用いる場合には５０μ９／１の濃度にＰＢ
Ｓで希釈し、１７２０量の大腸菌ライゼートを加え、４
℃で一夜非特異反応の吸収処理をして使用した。
リーニングと同様にレプリカフィルターを作製し、ＮＡ
ＮＢＨ回復期、キャリアー期及び正常のチンパンジー血
清又は、硫安沈澱後ＤＩ！ＡＥ−セルロファイン力ラム
（生化学工業社製）で精製したＩｇＧ分画を用いてプラ
ークアッセイを行った。その方法は抗体スクリーニング
の場合と同様であるが、−次抗体反応にチンパンジーの
ＩｇＧ分画を用いる場合には５０μ９／１の濃度にＰＢ
Ｓで希釈し、１７２０量の大腸菌ライゼートを加え、４
℃で一夜非特異反応の吸収処理をして使用した。
プラークアッセイの結果、ＣＨ−１５はＮＡＮＢＩ（キ
ャリアー期のチンパンジー血清あるいはＩｇＧ分画と高
率に反応し、正常チンパンジーの血清あるいはＩｇＧ分
画とは全く反応しなかった。
ャリアー期のチンパンジー血清あるいはＩｇＧ分画と高
率に反応し、正常チンパンジーの血清あるいはＩｇＧ分
画とは全く反応しなかった。
この結果から、ＣＥＩ−４５は特にＮ Ａ Ｎ Ｂ Ｈ
キャリアー期のチンパンジー血清に特異性の高いクロー
ンであるといえるや このＣＨ−１５のファージＤＮＡを精製［実験医学臨時
増刊号、遺伝子工学総集編シ（１１）、Ｐ３１−３２（
１９８７）参照］し、制限酵素ＥｃｏＲＩ （東洋紡社
製）切断後ｐ［Ｉｃ１１８ベクターのＢｃｏＲ１部位に
挿入し、サブクローニングを行った［Ｄｏｕｇｌａｓ
Ｈａｎａｈａｎｊ、 Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。
キャリアー期のチンパンジー血清に特異性の高いクロー
ンであるといえるや このＣＨ−１５のファージＤＮＡを精製［実験医学臨時
増刊号、遺伝子工学総集編シ（１１）、Ｐ３１−３２（
１９８７）参照］し、制限酵素ＥｃｏＲＩ （東洋紡社
製）切断後ｐ［Ｉｃ１１８ベクターのＢｃｏＲ１部位に
挿入し、サブクローニングを行った［Ｄｏｕｇｌａｓ
Ｈａｎａｈａｎｊ、 Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。
■島Ｐ５５７−５８０ （１９８３）参照］、このサブ
クローニングしたプラスミドｐＣＨ−１５をＥｃｏＲＩ
切断後、電気泳動で１．５％アガロースゲルに展開した
ところ、約３８０ｂｐの挿入断片（ＣＩ（、−１５＞が
確認できた（第１図）。
クローニングしたプラスミドｐＣＨ−１５をＥｃｏＲＩ
切断後、電気泳動で１．５％アガロースゲルに展開した
ところ、約３８０ｂｐの挿入断片（ＣＩ（、−１５＞が
確認できた（第１図）。
ＣＩ（＝ いた ゝ 口
下記のとうり、ＣＩ（−１５を用いたサザンブロ・ント
分析を行った。チンパンジーの正常及び米国Ｎ Ｉ Ｈ
由来Ｆ株感染ＮＡＮＢ［（急性期（ＮＡＮＢＦＩウィル
ス接種後８週目）の肝臓、さらに正常人の白血球より染
色体ＤＮＡを精製１〜、各々２０ＪｔｇをＥｃｏＲＩで
切断後、電気泳動で２％アガロースゲルに展開し、ＮＣ
フィルターに転写した。このフィルターをマルチプライ
ム法で［ｌｐ］標識したＣｌ−１５プローブを用いサザ
ンハイプリダイゼーションを行った（第２図）。この図
かられかるように、ＣＩ（−１５プローブは、−週間オ
ートラジオグラフィーすると、サブクローニング前のＣ
Ｈ−１５クローンとは反応するが、正常及びＮＡＩＨ急
性期のチンパンジーの染色体ＤＮＡあるいは正常なヒト
の染色体ＤＮＡとは反応しなかった。このことから、Ｃ
Ｈ−１５はヒトの染色体ＤＮＡ由来のクローンではなく
、ウィルス等の外来性の核酸由来のものであると考えら
れる。
分析を行った。チンパンジーの正常及び米国Ｎ Ｉ Ｈ
由来Ｆ株感染ＮＡＮＢ［（急性期（ＮＡＮＢＦＩウィル
ス接種後８週目）の肝臓、さらに正常人の白血球より染
色体ＤＮＡを精製１〜、各々２０ＪｔｇをＥｃｏＲＩで
切断後、電気泳動で２％アガロースゲルに展開し、ＮＣ
フィルターに転写した。このフィルターをマルチプライ
ム法で［ｌｐ］標識したＣｌ−１５プローブを用いサザ
ンハイプリダイゼーションを行った（第２図）。この図
かられかるように、ＣＩ（−１５プローブは、−週間オ
ートラジオグラフィーすると、サブクローニング前のＣ
Ｈ−１５クローンとは反応するが、正常及びＮＡＩＨ急
性期のチンパンジーの染色体ＤＮＡあるいは正常なヒト
の染色体ＤＮＡとは反応しなかった。このことから、Ｃ
Ｈ−１５はヒトの染色体ＤＮＡ由来のクローンではなく
、ウィルス等の外来性の核酸由来のものであると考えら
れる。
ＣＨ−
（Ａ） Ｃ１（−１５クローンの塩基配列の決定ＣＨ−
４５の遺伝子断片を組み込んだプラスミドＤＮＡを鋳型
とし、 ［α−”Ｐ］ ｄＣＴＰ （８００Ｃｉ／−ｍ
ｏｌ）を反応に用いた。Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇ■ｅｎ
ｔによるポリメラーゼ反応は宝酒造の７ＤＥＡＺ＾シー
ケンシングキツトによって行った。８％のポリアクリル
アミド−８−ウレアゲルを用いて、４時間１８００Ｖで
電気泳動し１６時間感光した。
４５の遺伝子断片を組み込んだプラスミドＤＮＡを鋳型
とし、 ［α−”Ｐ］ ｄＣＴＰ （８００Ｃｉ／−ｍ
ｏｌ）を反応に用いた。Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇ■ｅｎ
ｔによるポリメラーゼ反応は宝酒造の７ＤＥＡＺ＾シー
ケンシングキツトによって行った。８％のポリアクリル
アミド−８−ウレアゲルを用いて、４時間１８００Ｖで
電気泳動し１６時間感光した。
Ｂ ｒ−
上記の結果得られた塩基配列とそれから予測されるアミ
ノ酸配列の解読の結果をそれぞれ第３図および第４図に
示した。
ノ酸配列の解読の結果をそれぞれ第３図および第４図に
示した。
得られた塩基配列及びアミノ酸配列をデータベース（前
述）で検索した結果、ウィルス、細菌その他高いホモロ
ジーを示すものはなかった。また、カイロン社によって
発表された非Ａ ｌｌｆ Ｂ型肝炎ウィルスの塩基配列
及びアミノ酸配列と比較した結果、Ｃト１５クローンの
塩基配列と８３．１％、アミノ酸配列と８９．５％のホ
モロジーを持つ領域がカイロン社発表配列中に存在した
（第５図及び第６図参照）。
述）で検索した結果、ウィルス、細菌その他高いホモロ
ジーを示すものはなかった。また、カイロン社によって
発表された非Ａ ｌｌｆ Ｂ型肝炎ウィルスの塩基配列
及びアミノ酸配列と比較した結果、Ｃト１５クローンの
塩基配列と８３．１％、アミノ酸配列と８９．５％のホ
モロジーを持つ領域がカイロン社発表配列中に存在した
（第５図及び第６図参照）。
（８） ２９璽ｅｒおよび３７ｗｒｅｒを用いた抗体測
定法におけＢ ＣＦＩ５がコードするアミノ酸配列に基づき下記の２９
アミノ酸からなる合成ペプチド（２９ａｅｒ ）および
３７アミノ酸からなる合成ペプチド（３７鴎ｅｒ）を合
成した。
定法におけＢ ＣＦＩ５がコードするアミノ酸配列に基づき下記の２９
アミノ酸からなる合成ペプチド（２９ａｅｒ ）および
３７アミノ酸からなる合成ペプチド（３７鴎ｅｒ）を合
成した。
２９ａｅｒ：
Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇ
ｌｕ Ｃｙｓ＾Ｉａ Ｓｅｒ旧５Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｙ
ｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｎ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｇ
ｌｎ Ｌｙｓ＾１ａ３７＋１１ｅｒ： Ｐｒｏ＾ｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔｙ
ｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ ＰｈｅＡｓｐ Ｇｌｕ Ｍｅｔ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌ
ｅｕＰｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｉｎ Ｇｌｙ
Ｍｅｔ Ｇｉｎ Ｌｅｕ ＡｌａＧｌｕ Ｇｌｎ Ｐ
ｈｅ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｌａ合成には、アブ
ライドバイオシステムズ社の４３ＯＡペプチドシンセサ
イザーを用い、精製には合成ペプチド精製用ＨＰ Ｌ
Ｃカラム（Ａｑｕａｐｏｒｅ Ｐｒｅｐｌｏ、 Ｃ−８
，３ＱＯＡ ｐｏｒｅ ５ｉｚｅ、 ２０ｕｍ ５ｐ
ｈｅｒｉｃａｌ ５ｉｌｌＪ：ａ、 １０醋嘗ＩＤＸ
２５０−議、アプライドバイオシステムズ社）を用いた
。精製した合成ペプチドについて常法に従い組成分析を
行ったところ、所望のペプチドが合成されたことを確認
できた。
ｌｕ Ｃｙｓ＾Ｉａ Ｓｅｒ旧５Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｙ
ｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｇｌｎ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｇ
ｌｎ Ｌｙｓ＾１ａ３７＋１１ｅｒ： Ｐｒｏ＾ｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔｙ
ｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ ＰｈｅＡｓｐ Ｇｌｕ Ｍｅｔ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌ
ｅｕＰｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｉｎ Ｇｌｙ
Ｍｅｔ Ｇｉｎ Ｌｅｕ ＡｌａＧｌｕ Ｇｌｎ Ｐ
ｈｅ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｌａ合成には、アブ
ライドバイオシステムズ社の４３ＯＡペプチドシンセサ
イザーを用い、精製には合成ペプチド精製用ＨＰ Ｌ
Ｃカラム（Ａｑｕａｐｏｒｅ Ｐｒｅｐｌｏ、 Ｃ−８
，３ＱＯＡ ｐｏｒｅ ５ｉｚｅ、 ２０ｕｍ ５ｐ
ｈｅｒｉｃａｌ ５ｉｌｌＪ：ａ、 １０醋嘗ＩＤＸ
２５０−議、アプライドバイオシステムズ社）を用いた
。精製した合成ペプチドについて常法に従い組成分析を
行ったところ、所望のペプチドが合成されたことを確認
できた。
それぞれの合成ペプチドを、ＰＢＳ （０，１間ＰＢＳ
）へ溶解し、１μｇ／謙ｌとし、イムノプレートの各ウ
ェルへ２００ＩＡずつ加え ４℃で一夜反応させ、００
１％Ｔｗｅｅｎ８０を含むＰ Ｂ Ｓ （ＰＢＳ４）で
洗浄し、０．１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、ＰＢＳ
溶液２５０ｄ ／ウェルでコーティングを行った。その
後、０１％ＢＳＡ ＰＢＳ−Ｔを各ウェルに２００Δ加
え、これに血漿サンプル２０ハを入れ、プレートミキザ
ーで軽く攪はんした後、３７℃で１時間反応させた。
）へ溶解し、１μｇ／謙ｌとし、イムノプレートの各ウ
ェルへ２００ＩＡずつ加え ４℃で一夜反応させ、００
１％Ｔｗｅｅｎ８０を含むＰ Ｂ Ｓ （ＰＢＳ４）で
洗浄し、０．１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、ＰＢＳ
溶液２５０ｄ ／ウェルでコーティングを行った。その
後、０１％ＢＳＡ ＰＢＳ−Ｔを各ウェルに２００Δ加
え、これに血漿サンプル２０ハを入れ、プレートミキザ
ーで軽く攪はんした後、３７℃で１時間反応させた。
次に、ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰコン
ジュゲートを２００Δ／ウェル加え、３７℃で１時間反
応させた。
ジュゲートを２００Δ／ウェル加え、３７℃で１時間反
応させた。
ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＴＭＢＺ （３’、３’、５’、
５°。
５°。
テトラメチルベンジジン塩酸塩）ｆ、質溶液２００Ｊを
各ウェルへ加え、３７℃で３０分反応させた後、麹酸酸
を５０β／ウェル加えて反応を停止した。これをマイク
ロプレートリーダ一番こて、４５０ｎ園／６５０ｎ−の
２波長で測定を行った。
各ウェルへ加え、３７℃で３０分反応させた後、麹酸酸
を５０β／ウェル加えて反応を停止した。これをマイク
ロプレートリーダ一番こて、４５０ｎ園／６５０ｎ−の
２波長で測定を行った。
その結果、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス感染血液ど思われる
ヒト血漿１６５検体を対象に、上記イムノサンドイッチ
アッセイを行ったことろ、２９■ｅ「を用いた測定法に
おいては１６５検体中１２２検体に対して陽性を示し、
３９ａｅｒを用いた測定法においては１６５検体中１３
５検体に対して陽性を示した。 すなわち、本発明の
３９ａｅｒを用いた非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体測定法
は極めて検出率の高い測定方法である。
ヒト血漿１６５検体を対象に、上記イムノサンドイッチ
アッセイを行ったことろ、２９■ｅ「を用いた測定法に
おいては１６５検体中１２２検体に対して陽性を示し、
３９ａｅｒを用いた測定法においては１６５検体中１３
５検体に対して陽性を示した。 すなわち、本発明の
３９ａｅｒを用いた非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体測定法
は極めて検出率の高い測定方法である。
このような本発明のペプチドを用いた非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
ィルス抗体測定法は、従来の方法に比較して非特異反応
の少ない、極めて優れた測定法である
ィルス抗体測定法は、従来の方法に比較して非特異反応
の少ない、極めて優れた測定法である
第１図は、本発明においてクローニングしたｐＣＨ（５
のＥｃｏＲＩ挿入断片の１．５％アガロースゲル電電気
泳動開開後模式図である。 第２図は、本発明においてクローニングしたＣＨ−１５
とヒト及びチンパンジーの染色体ＤＮＡとのザザンハイ
プリダイゼーションの模式図である。 第３図は、本発明でクローニングした非Ａ１！−Ｂ型肝
炎ウィルス抗原をコードする核酸断片の塩基配列を示す
。 第４図は、本発明でクローニングした非Ａ １トＢ型肝
炎つィルス核酸断片がコードするアミノ酸配列を示す。 第５図は、カイロン社発表の非Ａ ＩＰ−Ｂ型肝炎ウィ
ルス（１−ＩＣＶ）遺伝子の塩基配列とＣＩ（−４５ク
ローンの塩基配列とを比較したものである。上段はＨＣ
■ゲノムの塩基配列、下段は本発明のＣＨ−１５の塩基
配列を示し、共通の塩基を車で示した。 第６図は、カイロン社発表の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス（
ＨＣＶ）遺伝子がコードするアミノ酸配列とＣＦＩ−１
５クローンのアミノ酸配列とを比較したものである。上
段はＨＣＶゲノムにコードされるアミノ酸配列、下段は
本発明のＣ［（−１５がコードするアミノ酸配列であり
５ 共通のアミノ酸を本で示した。
のＥｃｏＲＩ挿入断片の１．５％アガロースゲル電電気
泳動開開後模式図である。 第２図は、本発明においてクローニングしたＣＨ−１５
とヒト及びチンパンジーの染色体ＤＮＡとのザザンハイ
プリダイゼーションの模式図である。 第３図は、本発明でクローニングした非Ａ１！−Ｂ型肝
炎ウィルス抗原をコードする核酸断片の塩基配列を示す
。 第４図は、本発明でクローニングした非Ａ １トＢ型肝
炎つィルス核酸断片がコードするアミノ酸配列を示す。 第５図は、カイロン社発表の非Ａ ＩＰ−Ｂ型肝炎ウィ
ルス（１−ＩＣＶ）遺伝子の塩基配列とＣＩ（−４５ク
ローンの塩基配列とを比較したものである。上段はＨＣ
■ゲノムの塩基配列、下段は本発明のＣＨ−１５の塩基
配列を示し、共通の塩基を車で示した。 第６図は、カイロン社発表の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス（
ＨＣＶ）遺伝子がコードするアミノ酸配列とＣＦＩ−１
５クローンのアミノ酸配列とを比較したものである。上
段はＨＣＶゲノムにコードされるアミノ酸配列、下段は
本発明のＣ［（−１５がコードするアミノ酸配列であり
５ 共通のアミノ酸を本で示した。
Claims (15)
- （１）下記のアミノ酸配列もしくはその一部を含む非Ａ
非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチド。 【遺伝子配列があります】 - （２）下記の２９アミノ酸を少なくとも含む前記第（１
）項記載の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチド。 【遺伝子配列があります】 - （３）下記の３７アミノ酸を少なくとも含む前記第（１
）項記載の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチド。 【遺伝子配列があります】 - （４）該ペプチドが、遺伝子組換え技術による発現産物
である前記第（１）項記載の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗
原ペプチド。 - （５）該ペプチドが、化学的に合成されたペプチドであ
る前記第（１）項記載の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペ
プチド。 - （６）下記のアミノ酸からなる前記第（５）項記載の非
Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチド。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 - （７）下記のアミノ酸からなる前記第（５）項記載の非
Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチド。 【遺伝子配列があります】 - （８）前記第（１）項から（７）抗のいずれかに記載の
ペプチドを抗原として用い、これに特異的な抗体を検出
することを特徴とする非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗体の検出方
法。 - （９）下記のアミノ酸配列もしくはその一部からなるペ
プチドをコードする核酸配列を含む核酸断片。 【遺伝子配列があります】 - （１０）少なくとも下記の３７アミノ酸からなるペプチ
ドをコードする核酸配列を含む前記（８）項記載の核酸
断片。 【遺伝子配列があります】 - （１１）下記の核酸配列もしくはその一部からなる前記
第（９）項記載の核酸断片。 【遺伝子配列があります】 - （１２）下記の塩基配列に含まれる少なくとも１０塩基
以上の核酸断片からなることを特徴とする非Ａ非Ｂ型肝
炎ウィルス遺伝子検出用核酸プローブ。 【遺伝子配列があります】 - （１３）前記第（１２）項の核酸プローブを用いて、対
象となるサンプルの核酸とハイブリダイゼーションさせ
ることを特徴とする非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの検出方法
。 - （１４）前記第（１）項記載のペプチドを抗原として調
製される抗非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗体。 - （１５）前記第（１４）項記載の抗体を用いることを特
徴とする非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの免疫学的検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17666990A JP3042864B2 (ja) | 1990-07-03 | 1990-07-03 | 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチド、これをコードする核酸断片およびこれらの利用法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17666990A JP3042864B2 (ja) | 1990-07-03 | 1990-07-03 | 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチド、これをコードする核酸断片およびこれらの利用法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0466596A true JPH0466596A (ja) | 1992-03-02 |
| JP3042864B2 JP3042864B2 (ja) | 2000-05-22 |
Family
ID=16017647
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17666990A Expired - Fee Related JP3042864B2 (ja) | 1990-07-03 | 1990-07-03 | 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチド、これをコードする核酸断片およびこれらの利用法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3042864B2 (ja) |
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