JPH0469345B2 - - Google Patents
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- JPH0469345B2 JPH0469345B2 JP10484683A JP10484683A JPH0469345B2 JP H0469345 B2 JPH0469345 B2 JP H0469345B2 JP 10484683 A JP10484683 A JP 10484683A JP 10484683 A JP10484683 A JP 10484683A JP H0469345 B2 JPH0469345 B2 JP H0469345B2
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-
- G—PHYSICS
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、補体フラグメント（complement
fragment）C3ａ，C4ａおよびC5ａまたは、その
des−Arg誘導体の改良された検定法、および該
免疫学的検定を行なうのに有用な市販用キツトを
提供するものである。
fragment）C3ａ，C4ａおよびC5ａまたは、その
des−Arg誘導体の改良された検定法、および該
免疫学的検定を行なうのに有用な市販用キツトを
提供するものである。
従来技術
ヒトおよび他の哺乳動物の補体系には、20以上
の成分が含まれ、これらは、補体の活性化により
生ずる規則的な連続反応に関与している。多数の
研究は補体系が正常なホスト防御（host
defence）構造における基本的な要素であること
を示している。その結果、補体活性化は、通常、
各種の病理学的状態、例えば、ある種の悪性腫
瘍、心筋梗塞症、全身性狼瘡紅斑および成人の呼
吸困難症候群などと関連している。これらの相関
性により、補体活性化を検知する臨床的な試験法
は、ある種の症状の診断に有用である。
の成分が含まれ、これらは、補体の活性化により
生ずる規則的な連続反応に関与している。多数の
研究は補体系が正常なホスト防御（host
defence）構造における基本的な要素であること
を示している。その結果、補体活性化は、通常、
各種の病理学的状態、例えば、ある種の悪性腫
瘍、心筋梗塞症、全身性狼瘡紅斑および成人の呼
吸困難症候群などと関連している。これらの相関
性により、補体活性化を検知する臨床的な試験法
は、ある種の症状の診断に有用である。
補体活性化は、「古典的系路」および「別系路
（alternative pathway）」として各々知られる二
つの主な機作のいずれかにより起りうる。これら
の異なつた系路は、一般に、補体の活性化を開始
させる過程にもとづいて区別される。古典的系路
を通じての活性化は、通常、免疫性刺激に関連し
ており、一方、別系路を通じての活性化は、ほと
んどの場合、一般に非免疫性刺激に関通してい
る。開始刺激にかかわらず、両系路は一点に集中
し、補体のC3成分は、C3ａおよびC3ｂフラグメ
ントに変換される。このC3のその副成分への分
裂は、該別の補体カスケード（complement
cascade）の活性化を知らせる重大な現像の一つ
と考えられる。C3の変換につづいて、C5変換酵
素複合体が形成される。この酵素は、C5補体を
分裂させ、フラグメントC5ａおよびC5ｂを生ず
る。古典的系路機構による補体活性化は、この系
路がC4補体のそのフラグメントC4ａおよびC4ｂ
への変換を導くという事実によつて独特に特徴づ
けられる。
（alternative pathway）」として各々知られる二
つの主な機作のいずれかにより起りうる。これら
の異なつた系路は、一般に、補体の活性化を開始
させる過程にもとづいて区別される。古典的系路
を通じての活性化は、通常、免疫性刺激に関連し
ており、一方、別系路を通じての活性化は、ほと
んどの場合、一般に非免疫性刺激に関通してい
る。開始刺激にかかわらず、両系路は一点に集中
し、補体のC3成分は、C3ａおよびC3ｂフラグメ
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裂は、該別の補体カスケード（complement
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と考えられる。C3の変換につづいて、C5変換酵
素複合体が形成される。この酵素は、C5補体を
分裂させ、フラグメントC5ａおよびC5ｂを生ず
る。古典的系路機構による補体活性化は、この系
路がC4補体のそのフラグメントC4ａおよびC4ｂ
への変換を導くという事実によつて独特に特徴づ
けられる。
分裂生成物C3ａ，C4ａおよびC5ａは、アナフ
イラトキシンと称され、その物理化学的および生
理学的性質は、よく知られている。いずれも、生
物活性ポリペプチドの能力を有し、かつ急性炎症
過程の伝達物質として重要な役割を演ずる。これ
ら３つのアナフイラトキシンの内で、C5ａのみ
が白血球と相互作用を行なう能力を有するという
独特の特徴を有する。C3ａおよびC4ａは、in
vivoにて、血清カルボキシペプチターゼによる
各々の脱アルギニン誘導体（C3ａ des−Argま
たはC3ai，C4ades−ArgまたはC4ai）への変換に
より共に不活性となる。一方、ヒトC5ａは、反
応しうる白血球のC5ａ結合部位の全てが飽和し
た後に、はじめて該血清カルボキシペプチターゼ
によりC5ａ des−Argに変換される。
イラトキシンと称され、その物理化学的および生
理学的性質は、よく知られている。いずれも、生
物活性ポリペプチドの能力を有し、かつ急性炎症
過程の伝達物質として重要な役割を演ずる。これ
ら３つのアナフイラトキシンの内で、C5ａのみ
が白血球と相互作用を行なう能力を有するという
独特の特徴を有する。C3ａおよびC4ａは、in
vivoにて、血清カルボキシペプチターゼによる
各々の脱アルギニン誘導体（C3ａ des−Argま
たはC3ai，C4ades−ArgまたはC4ai）への変換に
より共に不活性となる。一方、ヒトC5ａは、反
応しうる白血球のC5ａ結合部位の全てが飽和し
た後に、はじめて該血清カルボキシペプチターゼ
によりC5ａ des−Argに変換される。
ヒト補体成分C3およびC5のそれら各々のアナ
フイラトキシン生成物への変換は、ある種の自然
発生病理学的状態に関連しており、これには、自
己免疫病、例えば全身性狼瘡紅斑、リウマトイド
関節炎、悪性腫瘍、心筋梗塞症、プルチエル
（Purtscher′s）網膜症および成人の呼吸困難症候
群などが含まれる。さらに、C3ａおよびC5ａの
悪循環レベルの増加が治療に原因する補体活性
化、例えば心肺バイパス外科手術、腎臓透析およ
びナイロン繊維白血球除去血輸血などに関連する
ある種の状態において認められる。C4ａアナフ
イラトキシンの上昇したレベルは、一般に前記自
己免疫病と関連する。したがつて、これらアナフ
イラトキシンまたはdes−Arg誘導体の循環レベ
ルの定量的測定技術は、各種の重大な病理学的状
態を診断するにあたつて極めて有用である。さら
に、C4ａまたはC4ａ des−Argのレベルの測定
技術は、補体活性化が生ずる系路を決定すること
ができる。この技術により補体活性化の正確な機
構が決定されるだけでなく、患者の自然免疫防御
機構が機能しているか否かが決定される。
フイラトキシン生成物への変換は、ある種の自然
発生病理学的状態に関連しており、これには、自
己免疫病、例えば全身性狼瘡紅斑、リウマトイド
関節炎、悪性腫瘍、心筋梗塞症、プルチエル
（Purtscher′s）網膜症および成人の呼吸困難症候
群などが含まれる。さらに、C3ａおよびC5ａの
悪循環レベルの増加が治療に原因する補体活性
化、例えば心肺バイパス外科手術、腎臓透析およ
びナイロン繊維白血球除去血輸血などに関連する
ある種の状態において認められる。C4ａアナフ
イラトキシンの上昇したレベルは、一般に前記自
己免疫病と関連する。したがつて、これらアナフ
イラトキシンまたはdes−Arg誘導体の循環レベ
ルの定量的測定技術は、各種の重大な病理学的状
態を診断するにあたつて極めて有用である。さら
に、C4ａまたはC4ａ des−Argのレベルの測定
技術は、補体活性化が生ずる系路を決定すること
ができる。この技術により補体活性化の正確な機
構が決定されるだけでなく、患者の自然免疫防御
機構が機能しているか否かが決定される。
トニー・イー・ハグリー（Tony E.Hugli）お
よびデニス・イー・チエノウエス（Dennis E.
Chenoweth）による報文（“Immunoassays：
Clinical Laboratory Techniques for the
1980s”，443−460，Alan R.liss，Inc.New
York，Ny（1980））に記載のラジオイムノアツセ
イ（RIA）法が開発されるまでは、アナフイラト
キシンC3ａ，C4ａおよびC5ａまたはそのdes−
Arg誘導体の測定は、これらの因子が比較的上昇
したとき、例えば、病気の過程が進行した状態に
あるときにはじめて行なうことができた。ハグリ
ーおよびチエノウエスによるRIA技術によれば、
痕跡量のアナフイラトキシンまたはそのdes−
Arg誘導体の定量測定を行なうことが可能であ
り、これにより、鋭敏な診断手段が提供される。
しかしながら、これらの因子を測定する従来公知
の方法は、アナフイラトキシンのC3，C4および
C5ａ血漿前駆物質をテストすべき生物学的液体
より除去しなければならないという要求に関連す
る重大な問題を有していた。このきびいしい要求
は、C3ａ，C4ａまたはC5ａが、各々の親分子C3，
C4およびC5ａの一部分であるので、アナフイラ
トキシンに対して生じた抗体がその各血漿前駆物
質と大きな交叉反応性をもつことが観察されるこ
とに基づく。この避けがたい交叉反応性のため、
血清および血漿中に比較的高濃度で存在する前駆
物質を完全に除去し、通常は痕跡程度存在するに
すぎないアナフイラトキシンの人工的なレベル増
加を検知しないようにすることは避けられないこ
とである。その血漿前駆物質からアナフイラトキ
シンを分離する従来公知の方法は、血漿を塩化ナ
トリウム溶液で希釈し、塩酸で酸性とし、ついで
回収した血清サンプルを中和することよりなる
（前記ハグリーおよびチエノウエスの報文を参
照）。本発明は、生物学的サンプルよりアナフイ
ラトキシンの血漿前駆物質を定量的に除去する新
規かつ簡単な方法を提供すると同時に、低分子量
のアナフイラトキシン、C3ａ，C4ａおよびC5ａ
またはそのdes−Arg誘導体の定量的回収を行な
うものである。
よびデニス・イー・チエノウエス（Dennis E.
Chenoweth）による報文（“Immunoassays：
Clinical Laboratory Techniques for the
1980s”，443−460，Alan R.liss，Inc.New
York，Ny（1980））に記載のラジオイムノアツセ
イ（RIA）法が開発されるまでは、アナフイラト
キシンC3ａ，C4ａおよびC5ａまたはそのdes−
Arg誘導体の測定は、これらの因子が比較的上昇
したとき、例えば、病気の過程が進行した状態に
あるときにはじめて行なうことができた。ハグリ
ーおよびチエノウエスによるRIA技術によれば、
痕跡量のアナフイラトキシンまたはそのdes−
Arg誘導体の定量測定を行なうことが可能であ
り、これにより、鋭敏な診断手段が提供される。
しかしながら、これらの因子を測定する従来公知
の方法は、アナフイラトキシンのC3，C4および
C5ａ血漿前駆物質をテストすべき生物学的液体
より除去しなければならないという要求に関連す
る重大な問題を有していた。このきびいしい要求
は、C3ａ，C4ａまたはC5ａが、各々の親分子C3，
C4およびC5ａの一部分であるので、アナフイラ
トキシンに対して生じた抗体がその各血漿前駆物
質と大きな交叉反応性をもつことが観察されるこ
とに基づく。この避けがたい交叉反応性のため、
血清および血漿中に比較的高濃度で存在する前駆
物質を完全に除去し、通常は痕跡程度存在するに
すぎないアナフイラトキシンの人工的なレベル増
加を検知しないようにすることは避けられないこ
とである。その血漿前駆物質からアナフイラトキ
シンを分離する従来公知の方法は、血漿を塩化ナ
トリウム溶液で希釈し、塩酸で酸性とし、ついで
回収した血清サンプルを中和することよりなる
（前記ハグリーおよびチエノウエスの報文を参
照）。本発明は、生物学的サンプルよりアナフイ
ラトキシンの血漿前駆物質を定量的に除去する新
規かつ簡単な方法を提供すると同時に、低分子量
のアナフイラトキシン、C3ａ，C4ａおよびC5ａ
またはそのdes−Arg誘導体の定量的回収を行な
うものである。
発明の概要
本発明は、実質的に全ての痕跡量の補体前駆物
質または補体成分C3，C4およびC5を生物学的液
体のサンプルにより除去し、該液体より補体フラ
グメントC3ａ，C4ａおよびC5ａまたはそのdes−
Arg誘導体を該フラグメントの免疫原性に影響を
与えずに回収する新規な方法を提供するものであ
つて、等容量の生物学的液体サンプルと0.8〜1.6
％アクリノールの緩衝溶液を混合し、該混合液を
約25℃にて１分〜２時間インキユベートし、生じ
た沈殿より上澄液を分離することよりなる。
質または補体成分C3，C4およびC5を生物学的液
体のサンプルにより除去し、該液体より補体フラ
グメントC3ａ，C4ａおよびC5ａまたはそのdes−
Arg誘導体を該フラグメントの免疫原性に影響を
与えずに回収する新規な方法を提供するものであ
つて、等容量の生物学的液体サンプルと0.8〜1.6
％アクリノールの緩衝溶液を混合し、該混合液を
約25℃にて１分〜２時間インキユベートし、生じ
た沈殿より上澄液を分離することよりなる。
本発明は、また、生物学的サンプル中の補体フ
ラグメントC3ａ，C4ａまたはC5ａ、あるいはそ
のdes−Arg誘導体を定量的に測定する新規かつ
改良された方法を提供するものであつて、等容量
の生物学的サンプルと0.8〜1.6％アクリノールを
混合し、該混合液を約25℃で１分〜２時間インキ
ユベートし、生じた沈殿より上澄液を回収し、該
上澄液をC3ａ，C4ａまたはC5ａ、あるいはその
des−Arg誘導体より選ばれた既知量の標識補体
フラグメントおよび該標識補体フラグメントまた
はそのdes−Arg誘導体を認識する既知量の抗体
と共にインキユベートし、結合していない標識補
体フラグメントを結合した標識補体フラグメント
より分離し、抗体と結合していないあるいは結合
した補体成分中の標識補体フラグメントの量を測
定し、標準曲線と対照して生物学的サンプル中の
補体フラグメントの濃度を決定することからな
る。
ラグメントC3ａ，C4ａまたはC5ａ、あるいはそ
のdes−Arg誘導体を定量的に測定する新規かつ
改良された方法を提供するものであつて、等容量
の生物学的サンプルと0.8〜1.6％アクリノールを
混合し、該混合液を約25℃で１分〜２時間インキ
ユベートし、生じた沈殿より上澄液を回収し、該
上澄液をC3ａ，C4ａまたはC5ａ、あるいはその
des−Arg誘導体より選ばれた既知量の標識補体
フラグメントおよび該標識補体フラグメントまた
はそのdes−Arg誘導体を認識する既知量の抗体
と共にインキユベートし、結合していない標識補
体フラグメントを結合した標識補体フラグメント
より分離し、抗体と結合していないあるいは結合
した補体成分中の標識補体フラグメントの量を測
定し、標準曲線と対照して生物学的サンプル中の
補体フラグメントの濃度を決定することからな
る。
本発明は、また、新規なキツトを提供するもの
であり、これは、構成部品が生物学的液体のサン
プルの補体フラグメントC3ａ，C4ａおよびC5ａ
またはそのdes−Arg誘導体を検定するのに用い
るために集められており、アクリノールの0.8〜
1.6％溶液の緩衝液を入れた第１容器、ラベルさ
れた補体フラグメントC3ａ，C4ａまたはC5ａあ
るいはそのdes−Arg誘導体より選ばれた標識試
薬を入れた第２容器、および補体フラグメント
C3ａ，C4ａまたはC5ａあるいはそのdes−Arg誘
導体を認識する抗体より選ばれた抗体試薬を入れ
た第３容器からなつている。
であり、これは、構成部品が生物学的液体のサン
プルの補体フラグメントC3ａ，C4ａおよびC5ａ
またはそのdes−Arg誘導体を検定するのに用い
るために集められており、アクリノールの0.8〜
1.6％溶液の緩衝液を入れた第１容器、ラベルさ
れた補体フラグメントC3ａ，C4ａまたはC5ａあ
るいはそのdes−Arg誘導体より選ばれた標識試
薬を入れた第２容器、および補体フラグメント
C3ａ，C4ａまたはC5ａあるいはそのdes−Arg誘
導体を認識する抗体より選ばれた抗体試薬を入れ
た第３容器からなつている。
発明の詳細
本明細書にて用いられるアクリノールとは、２
−エトキシ−６，９−ジアミノアクリジンまたは
その乳酸塩一水和物を意味する。
−エトキシ−６，９−ジアミノアクリジンまたは
その乳酸塩一水和物を意味する。
本発明を実施するにあたつては、生物学的サン
プルは、いかなる体液であつてもよく、例えば、
血清、血漿、尿または脳脊髄液であつてよい。用
いられる生物学的液体が、血漿または脳脊髄液で
あるときは、これにEDTAが添加される。
プルは、いかなる体液であつてもよく、例えば、
血清、血漿、尿または脳脊髄液であつてよい。用
いられる生物学的液体が、血漿または脳脊髄液で
あるときは、これにEDTAが添加される。
等容量の生物学的液体と0.8〜1.6％アクリノー
ルを最終濃度がアクリノール0.4〜0.8％となるよ
うに混合する。好ましい最終濃度は、アクリノー
ル0.4％である。該アクリノール蛋白複合体は、
PH約7.4に緩衝させる。塩化物イオンを含まない
いずれの緩衝剤も適当であり、例えば、炭酸塩緩
衝剤、リン酸塩緩衝剤、またはHEPES（Ｎ−２
−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン
酸）を用いうる。緩衝剤の好ましいモル濃度は、
0.05〜0.1MでPHは6.8〜7.8である。本発明を実施
するのに用いられる好ましい緩衝剤は、0.5Mリ
ン酸塩緩衝剤（PH7.4）である。
ルを最終濃度がアクリノール0.4〜0.8％となるよ
うに混合する。好ましい最終濃度は、アクリノー
ル0.4％である。該アクリノール蛋白複合体は、
PH約7.4に緩衝させる。塩化物イオンを含まない
いずれの緩衝剤も適当であり、例えば、炭酸塩緩
衝剤、リン酸塩緩衝剤、またはHEPES（Ｎ−２
−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン
酸）を用いうる。緩衝剤の好ましいモル濃度は、
0.05〜0.1MでPHは6.8〜7.8である。本発明を実施
するのに用いられる好ましい緩衝剤は、0.5Mリ
ン酸塩緩衝剤（PH7.4）である。
一旦、生物学的液体とアクリノールを混合する
と、ほとんど直ちに沈殿が生ずる。しかしなが
ら、活性化された補体フラグメントより補体前駆
物質C3，C4およびC5を最大限に分離するために、
複合体を少なくとも20分間インキユベートするの
が好ましい。本発明者らは、補体成分の沈殿が約
１分〜２時間以内に完了することを見出した。該
複合体は、必要により２時間以上インキユベート
してもよいが、２時間以上によつてもさらに蛋白
質の分離は進まず利点はない。インキユベーシヨ
ンは室温、すなわち約25℃にて行なわれる。
と、ほとんど直ちに沈殿が生ずる。しかしなが
ら、活性化された補体フラグメントより補体前駆
物質C3，C4およびC5を最大限に分離するために、
複合体を少なくとも20分間インキユベートするの
が好ましい。本発明者らは、補体成分の沈殿が約
１分〜２時間以内に完了することを見出した。該
複合体は、必要により２時間以上インキユベート
してもよいが、２時間以上によつてもさらに蛋白
質の分離は進まず利点はない。インキユベーシヨ
ンは室温、すなわち約25℃にて行なわれる。
沈殿の除去は、アクリノール蛋白質複合体を約
3000〜7000Xgで約10〜20分間遠心分離し、つい
で補体フラグメントC3ａ，C4ａおよびC5ａまた
はそのdes−Arg誘導体を含む上澄をデカンテー
シヨンすることにより都合よく行なえる。前記の
ごとく、補体フラグメントC3ａ，C4ａおよびC5
ａは、in vivoにて、血清および血漿中、カルボ
キシペプチターゼにより、各々不活性なdes−
Arg誘導体に変換されることにより不活性とな
る。この変換は、in vivoにて尿中でも生ずる。
したがつて、本発明の新規アクリノール沈殿法に
より回収された上澄液は、生物学的液体が血漿、
血清または尿である場合は、補体フラグメント
C3ａ，C4ａおよびC5ａの活性化された形態より
もその補体フラグメントのdes−Arg誘導体を主
に含む。診断の目的のためには、不活性des−
Arg誘導体の測定も、活性形態の補体フラグメン
トの直接測定と全く同じ意義を有する。
3000〜7000Xgで約10〜20分間遠心分離し、つい
で補体フラグメントC3ａ，C4ａおよびC5ａまた
はそのdes−Arg誘導体を含む上澄をデカンテー
シヨンすることにより都合よく行なえる。前記の
ごとく、補体フラグメントC3ａ，C4ａおよびC5
ａは、in vivoにて、血清および血漿中、カルボ
キシペプチターゼにより、各々不活性なdes−
Arg誘導体に変換されることにより不活性とな
る。この変換は、in vivoにて尿中でも生ずる。
したがつて、本発明の新規アクリノール沈殿法に
より回収された上澄液は、生物学的液体が血漿、
血清または尿である場合は、補体フラグメント
C3ａ，C4ａおよびC5ａの活性化された形態より
もその補体フラグメントのdes−Arg誘導体を主
に含む。診断の目的のためには、不活性des−
Arg誘導体の測定も、活性形態の補体フラグメン
トの直接測定と全く同じ意義を有する。
回収された上澄液は、この免疫検定法において
さらに処理または加工されずに使用される。本発
明者らは、テストサンプル中のアクリノールの存
在が、補体フラグメントまたはそのdes−Arg誘
導体の抗原性を妨げず、このため独特の極めて簡
単な前記フラグメントの検定方法を提供すること
を見出した。
さらに処理または加工されずに使用される。本発
明者らは、テストサンプル中のアクリノールの存
在が、補体フラグメントまたはそのdes−Arg誘
導体の抗原性を妨げず、このため独特の極めて簡
単な前記フラグメントの検定方法を提供すること
を見出した。
本発明の免疫検定法は、公知のC3ａ，C4ａお
よびC5ａまたはそのdes−Arg誘導体の免疫検定
法と実質的に異ならない。等容量の検定されるべ
きテストサンプル、標識補体フラグメントC3ａ，
C4ａまたはC5ａあるいはそのdes−Arg誘導体、
および該補体フラグメントを認識する抗体を混合
してインキユベートし、ついで抗体結合および非
結合の即ち結合していない標識補体フラグメント
を分離し、標準曲線と比較してテストサンプル中
の補体フラグメントの量を測定する。検定用緩衝
剤は、一般にインキユーベーシヨン中に加えられ
る。本発明者らは、HEPES、プロタミン硫酸
塩、チメロソール（thimerosol）およびゼラチン
よりなる緩衝剤が特に有用であることを見出し
た。
よびC5ａまたはそのdes−Arg誘導体の免疫検定
法と実質的に異ならない。等容量の検定されるべ
きテストサンプル、標識補体フラグメントC3ａ，
C4ａまたはC5ａあるいはそのdes−Arg誘導体、
および該補体フラグメントを認識する抗体を混合
してインキユベートし、ついで抗体結合および非
結合の即ち結合していない標識補体フラグメント
を分離し、標準曲線と比較してテストサンプル中
の補体フラグメントの量を測定する。検定用緩衝
剤は、一般にインキユーベーシヨン中に加えられ
る。本発明者らは、HEPES、プロタミン硫酸
塩、チメロソール（thimerosol）およびゼラチン
よりなる緩衝剤が特に有用であることを見出し
た。
補体フラグメントC3ａ，C4ａまたはC5ａある
いはそのdes−Arg誘導体の精製は、抗体を発生
させるのに用いられ、かつ標準曲線の作製に用い
られるとともに標識補体フラグメントの製造に用
いられ、該精製はJ.Biol.Chem.第256巻、8685〜
8692頁（1981年）に記載の一般的な方法により行
ないうる。本発明者らは、塩酸沈殿法を前記アク
リノール沈殿法に置換することにより、従来法を
修正し改良することができることを見出したもの
である。
いはそのdes−Arg誘導体の精製は、抗体を発生
させるのに用いられ、かつ標準曲線の作製に用い
られるとともに標識補体フラグメントの製造に用
いられ、該精製はJ.Biol.Chem.第256巻、8685〜
8692頁（1981年）に記載の一般的な方法により行
ないうる。本発明者らは、塩酸沈殿法を前記アク
リノール沈殿法に置換することにより、従来法を
修正し改良することができることを見出したもの
である。
補体フラグメントC3ａ，C4ａ，C5ａまたはそ
のdes−Arg誘導体に対する抗体は、ハーグリー
他（J.Biol.Chem.250，1472−1478（1975）および
J.Biol.Chem.256，8685〜8692（1981））に一般的
に記載されているごとく生じる。
のdes−Arg誘導体に対する抗体は、ハーグリー
他（J.Biol.Chem.250，1472−1478（1975）および
J.Biol.Chem.256，8685〜8692（1981））に一般的
に記載されているごとく生じる。
標識補体フラグメントまたはそのdes−Arg誘
導体に用いられるラベルは、物理的または化学的
手段により検知しうる物質であればいかなるもの
であつてもよい。トリチウムヨウ素131およびト
リチウムヨウ素125などのラジオアイソトープ並
びに125Iが好ましい。125Iでラベルされた物質
は、固相ラクトパーオキシダーゼ法などの一般に
公知の各種の方法により作られる。好ましい方法
の１つとしては、リン酸塩で緩衝されたTCDG
（１，３，４，６−テトラクロロ−3α，6α−ジフ
エニルグリコリル）が用いられる。
導体に用いられるラベルは、物理的または化学的
手段により検知しうる物質であればいかなるもの
であつてもよい。トリチウムヨウ素131およびト
リチウムヨウ素125などのラジオアイソトープ並
びに125Iが好ましい。125Iでラベルされた物質
は、固相ラクトパーオキシダーゼ法などの一般に
公知の各種の方法により作られる。好ましい方法
の１つとしては、リン酸塩で緩衝されたTCDG
（１，３，４，６−テトラクロロ−3α，6α−ジフ
エニルグリコリル）が用いられる。
補体フラグメントが結合した抗体は、免疫検定
法にて通常用いられる各種の方法によりフリーの
即ち結合していない補体フラグメントより分離さ
れうる。例えば、この分離は、ポリエチレングリ
コールを用いて〔ビー・デスブキオイスおよびジ
ー・デイー・オウバツク（B.Desbuquois and G.
D.Auback），J.Clin.Endocrinol.Metab.33、732
（1971）〕、またはIgG Sorbを用いて処理すること
により、あるいは第二抗体とのインキユベーシヨ
ンを行なうことにより行ないうる。第二抗体は、
標準的方法、例えば、ドーアデイら
（Daughaday.et al.，“Principle of Competitive
Protein Binding Assay”，J.B.Lippincott，
Philadelphia（1971））の報文にもとづき作ること
ができ、インキユベート中に含まれた補体フラグ
メント−抗体複合体を認識する。第二抗体法の使
用は、特に好ましい。
法にて通常用いられる各種の方法によりフリーの
即ち結合していない補体フラグメントより分離さ
れうる。例えば、この分離は、ポリエチレングリ
コールを用いて〔ビー・デスブキオイスおよびジ
ー・デイー・オウバツク（B.Desbuquois and G.
D.Auback），J.Clin.Endocrinol.Metab.33、732
（1971）〕、またはIgG Sorbを用いて処理すること
により、あるいは第二抗体とのインキユベーシヨ
ンを行なうことにより行ないうる。第二抗体は、
標準的方法、例えば、ドーアデイら
（Daughaday.et al.，“Principle of Competitive
Protein Binding Assay”，J.B.Lippincott，
Philadelphia（1971））の報文にもとづき作ること
ができ、インキユベート中に含まれた補体フラグ
メント−抗体複合体を認識する。第二抗体法の使
用は、特に好ましい。
標準曲線は、基本的には、前記検定方法にもと
づき、テストサンプルの代りに、既知量の補体フ
ラグメントC3ａ，C4ａまたはC5ａ、あるいはそ
のdes−Arg誘導体を用いて作成される。本明細
書に記載の検定方法は、高い感度を有しており、
補体フラグメントの濃度範囲1.0〜25nｇについて
の標準曲線を作成するのに特に有用であることが
わかつた。
づき、テストサンプルの代りに、既知量の補体フ
ラグメントC3ａ，C4ａまたはC5ａ、あるいはそ
のdes−Arg誘導体を用いて作成される。本明細
書に記載の検定方法は、高い感度を有しており、
補体フラグメントの濃度範囲1.0〜25nｇについて
の標準曲線を作成するのに特に有用であることが
わかつた。
つぎに、本発明を実施例によりさらに詳しく説
明する。
明する。
実施例 １
補体フラグメントまたはdes−Arg誘導体の精
製 血清２〜４を煮沸酵母（boiled yeast）20
mg／ml血清の添加により37℃で活性化し、該混合
液を45分〜１時間放置した。0.05Mリン酸塩緩衝
剤でPH7.4に緩衝した等容量の前記活性化血清お
よび0.8〜1.6％アクリノールを混合し、30分間、
25℃で放置した後、該混合液を遠心分離して上澄
液をデカンテーシヨンする。該上澄液を流水で一
晩５〜８℃にて透析し、ついでｐ−60カラムで
過したゲルを0.1Mギ酸アンモニウム（PH5.0）で
平衡に保つ。補体フラグメントC3ａ ，C4ａまたはC5ａあるいはそのdes−Arg誘導体
を含むフラクシヨンをため、0.1Mギ酸アンモニ
ウム（PH5.0）で平衡としたSP−Sephadexカラ
ムに付す。該カラムは、0.1〜0.8Mの直線勾配の
ギ酸アンモニウム（PH7.0）によつて溶出される。
C3ａ，C4ａおよびC5ａまたはそのdes−Arg誘導
体のフラクシヨンは、集められて各々別のCM−
セルロースカラムに付され、0.15〜0.43Mの勾配
のギ酸アンモニウム（PH7.0）により流速75ml／
時で溶出する。各補体成分のC3ａ，C4ａまたは
C5ａをカラムより回収された各々のdes−Arg誘
導体とともに貯え、凍結乾燥し、ついで水に再溶
解し１％酢酸で透析する。最後に凍結乾燥し、約
10mg／mlの水中懸濁液として各フラグメントを容
易に使用に供する。
製 血清２〜４を煮沸酵母（boiled yeast）20
mg／ml血清の添加により37℃で活性化し、該混合
液を45分〜１時間放置した。0.05Mリン酸塩緩衝
剤でPH7.4に緩衝した等容量の前記活性化血清お
よび0.8〜1.6％アクリノールを混合し、30分間、
25℃で放置した後、該混合液を遠心分離して上澄
液をデカンテーシヨンする。該上澄液を流水で一
晩５〜８℃にて透析し、ついでｐ−60カラムで
過したゲルを0.1Mギ酸アンモニウム（PH5.0）で
平衡に保つ。補体フラグメントC3ａ ，C4ａまたはC5ａあるいはそのdes−Arg誘導体
を含むフラクシヨンをため、0.1Mギ酸アンモニ
ウム（PH5.0）で平衡としたSP−Sephadexカラ
ムに付す。該カラムは、0.1〜0.8Mの直線勾配の
ギ酸アンモニウム（PH7.0）によつて溶出される。
C3ａ，C4ａおよびC5ａまたはそのdes−Arg誘導
体のフラクシヨンは、集められて各々別のCM−
セルロースカラムに付され、0.15〜0.43Mの勾配
のギ酸アンモニウム（PH7.0）により流速75ml／
時で溶出する。各補体成分のC3ａ，C4ａまたは
C5ａをカラムより回収された各々のdes−Arg誘
導体とともに貯え、凍結乾燥し、ついで水に再溶
解し１％酢酸で透析する。最後に凍結乾燥し、約
10mg／mlの水中懸濁液として各フラグメントを容
易に使用に供する。
実施例 ２
125I補体C3ａまたはそのdes−Arg誘導体
インキユベーシヨンチユーブに補体フラグメン
トC3ａまたはそのdes−Arg誘導体50μｇ、リン酸
塩で緩衝した食塩水150μ、TCDG100μｇおよ
び125Iナトリウム1mCi（10μ）を加える。該リ
ン酸塩で緩衝された食塩水を塩化ナトリウム81
mg、無水リン酸水素ナトリウム39mg、二塩基性リ
ン酸ナトリウム六水和塩試薬199mgおよび脱イオ
ン蒸留水100mlからなるストツク溶液として調整
した。該混合液を20分間、約25℃にてインキユベ
ートし、ついで塩化ナトリウム143ｇ、チメロソ
ールNF200mg、無水リン酸水素ナトリウム６ｇ、
二塩基性リン酸ナトリウム六水和塩試薬34ｇ、ゼ
ラチン17ｇに脱イオン水を加え17.5としたスト
ツク溶液として調整したゼラチンを有するリン酸
塩で緩衝した食塩水より平衡としたカラムクロマ
トグラフイに付す。各0.5mlの放射性のフラクシ
ヨンを集め、希釈してゼラチンを含むリン酸塩で
緩衝した食塩水中20000〜60000cpm／0.05mlの溶
液を得る。
トC3ａまたはそのdes−Arg誘導体50μｇ、リン酸
塩で緩衝した食塩水150μ、TCDG100μｇおよ
び125Iナトリウム1mCi（10μ）を加える。該リ
ン酸塩で緩衝された食塩水を塩化ナトリウム81
mg、無水リン酸水素ナトリウム39mg、二塩基性リ
ン酸ナトリウム六水和塩試薬199mgおよび脱イオ
ン蒸留水100mlからなるストツク溶液として調整
した。該混合液を20分間、約25℃にてインキユベ
ートし、ついで塩化ナトリウム143ｇ、チメロソ
ールNF200mg、無水リン酸水素ナトリウム６ｇ、
二塩基性リン酸ナトリウム六水和塩試薬34ｇ、ゼ
ラチン17ｇに脱イオン水を加え17.5としたスト
ツク溶液として調整したゼラチンを有するリン酸
塩で緩衝した食塩水より平衡としたカラムクロマ
トグラフイに付す。各0.5mlの放射性のフラクシ
ヨンを集め、希釈してゼラチンを含むリン酸塩で
緩衝した食塩水中20000〜60000cpm／0.05mlの溶
液を得る。
実施例 ３
(a) 活性化血漿0.45ml、0.05Mリン酸塩緩衝剤
（PH7.4）中0.8％アクリノール液0.45mlおよび蒸
留水0.1mlの混合液を約25℃で20分間反応させ、
ついで、1700Xｇで10分間遠心分離する。得ら
れた上澄液をあつめる。前記のごとく調整した
検定緩衝剤50μ、前記にて得られた上澄液
50μ、125I補体フラグメントC3ａまたはその
des−Arg誘導体50μおよびウサギ抗血清の補
体フラグメントC3a50μの混合物を約25℃に
て30分間インキユベートし、ついでヤギ抗−ウ
サギ血清50μを加えよく混合する。該混合物
をさらに約25℃にて30分間インキユベートし、
その後、等張食塩水２mlを加える。該混合液
2000Xｇで10分間遠心分離し、上澄液をデカン
テーシヨンする。得られたペレツトの放射線量
は、4555cpmであつた。
（PH7.4）中0.8％アクリノール液0.45mlおよび蒸
留水0.1mlの混合液を約25℃で20分間反応させ、
ついで、1700Xｇで10分間遠心分離する。得ら
れた上澄液をあつめる。前記のごとく調整した
検定緩衝剤50μ、前記にて得られた上澄液
50μ、125I補体フラグメントC3ａまたはその
des−Arg誘導体50μおよびウサギ抗血清の補
体フラグメントC3a50μの混合物を約25℃に
て30分間インキユベートし、ついでヤギ抗−ウ
サギ血清50μを加えよく混合する。該混合物
をさらに約25℃にて30分間インキユベートし、
その後、等張食塩水２mlを加える。該混合液
2000Xｇで10分間遠心分離し、上澄液をデカン
テーシヨンする。得られたペレツトの放射線量
は、4555cpmであつた。
(b) 前記方法は、ハグリーおよびチエノウエスの
酸沈殿法（Immunoassays：Clinical
Laboratory Techniques for the 1980s：443）
をアクリノール沈殿操作に代えることによつて
はじめて実施しうる。得られたペレツトの放射
線量は、4521〜4757cpmであつて、アクリノー
ル沈殿法により完全な蛋白質前駆物質が塩酸に
よる処理およびこれにつづくアルカリによる中
和処理と同様効果的に除去され、極めて簡単な
改良された検定法が提供される。また、これら
２つの実験の結果、アクリノールの存在は、第
一および第二の免疫学的反応に対していずれも
影響を与えないことがわかる。
酸沈殿法（Immunoassays：Clinical
Laboratory Techniques for the 1980s：443）
をアクリノール沈殿操作に代えることによつて
はじめて実施しうる。得られたペレツトの放射
線量は、4521〜4757cpmであつて、アクリノー
ル沈殿法により完全な蛋白質前駆物質が塩酸に
よる処理およびこれにつづくアルカリによる中
和処理と同様効果的に除去され、極めて簡単な
改良された検定法が提供される。また、これら
２つの実験の結果、アクリノールの存在は、第
一および第二の免疫学的反応に対していずれも
影響を与えないことがわかる。
1.0，2.5，5.0，10，25および50nｇの量のC3
ａを用いて補体フラグメントC3ａまたはその
des−Argに対する標準曲線を作成する場合、
アクリノール沈殿操作をハグリーおよびチエノ
ウエスの酸沈殿−アルカリ中和操作の代りに用
いると、検知範囲が短縮され、％Ｂ／Bp
（Standard Counts／Bound Standard）が−
2.3〜−4.0に増加することからわかるように12
の因子により免疫検定の感応性が増加すること
が判明した。
ａを用いて補体フラグメントC3ａまたはその
des−Argに対する標準曲線を作成する場合、
アクリノール沈殿操作をハグリーおよびチエノ
ウエスの酸沈殿−アルカリ中和操作の代りに用
いると、検知範囲が短縮され、％Ｂ／Bp
（Standard Counts／Bound Standard）が−
2.3〜−4.0に増加することからわかるように12
の因子により免疫検定の感応性が増加すること
が判明した。
実施例 ４
前記３(a)に記載の検定法は、活性化した血漿サ
ンプルを用い、これに２〜20nｇの既知量の補体
因子C3ａまたはそのdes−Arg誘導体を加えて実
施される。得られた結果は、検定した各スパイク
通常サンプル（Spiked normal sample）中に
100％の既知のC3ａ濃度が存在することを示して
いる。
ンプルを用い、これに２〜20nｇの既知量の補体
因子C3ａまたはそのdes−Arg誘導体を加えて実
施される。得られた結果は、検定した各スパイク
通常サンプル（Spiked normal sample）中に
100％の既知のC3ａ濃度が存在することを示して
いる。
実施例 ５
本発明の免疫検定法を実施するための基本試薬
を市販用ユニツトとしてキツトに組立てた。この
キツトは、ピンまたは他の適当な容器など、以下
に示すような複数の容器よりなる。
を市販用ユニツトとしてキツトに組立てた。この
キツトは、ピンまたは他の適当な容器など、以下
に示すような複数の容器よりなる。
(a) アクリノール0.8〜1.6％の緩衝された容器を
入れた第１容器、 (b) 125Iラベルを行なつた補体フラグメントC3
ａ，C4ａまたはC5ａあるいはそのdes−Arg誘
導体より選ばれた標識試薬を入れた第２容器、 (c) 特定の補体フラグメントに対するウサギ抗血
清を入れた第３容器、 (d) 前記のごとく調製した検定用緩衝剤をいれた
容器、 (e) 初期補体フラグメント−抗体反応の生成物に
結合する第二抗体、好ましくは、ヤギ抗−ウサ
ギ抗血清を入れた容器、 (f) 補体フラグメント標準25nｇを入れた容器、 (g) 補体フラグメント標準10nｇを入れた容器、 (h) 補体フラグメント標準5nｇを入れた容器、 (i) 補体フラグメント標準2.5nｇを入れた容器、 (j) 補体フラグメント標準1.0nｇを入れた容器。
入れた第１容器、 (b) 125Iラベルを行なつた補体フラグメントC3
ａ，C4ａまたはC5ａあるいはそのdes−Arg誘
導体より選ばれた標識試薬を入れた第２容器、 (c) 特定の補体フラグメントに対するウサギ抗血
清を入れた第３容器、 (d) 前記のごとく調製した検定用緩衝剤をいれた
容器、 (e) 初期補体フラグメント−抗体反応の生成物に
結合する第二抗体、好ましくは、ヤギ抗−ウサ
ギ抗血清を入れた容器、 (f) 補体フラグメント標準25nｇを入れた容器、 (g) 補体フラグメント標準10nｇを入れた容器、 (h) 補体フラグメント標準5nｇを入れた容器、 (i) 補体フラグメント標準2.5nｇを入れた容器、 (j) 補体フラグメント標準1.0nｇを入れた容器。
各(f)〜(j)の補体フラグメント中には、C3ａ，
C4ａまたはC5ａあるいはそのdes−Arg誘導体の
いずれかが含まれており、これにより補体フラグ
メントが検定される。
C4ａまたはC5ａあるいはそのdes−Arg誘導体の
いずれかが含まれており、これにより補体フラグ
メントが検定される。
前記実施例は、分離および補体フラグメント
C3ａまたはそのdes−Argの検定に限定されてい
るが、本発明の新規な分離および検定方法は、補
体フラグメントC4ａおよびC5ａまたはそのdes−
Argに対しても同様に適用される。
C3ａまたはそのdes−Argの検定に限定されてい
るが、本発明の新規な分離および検定方法は、補
体フラグメントC4ａおよびC5ａまたはそのdes−
Argに対しても同様に適用される。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 等容量の生物学的サンプルおよび0.8〜1.6％
アクリノール溶液を混合し、該混合液を約25℃に
て約１分〜約２時間インキユベートし、上澄液を
生じた沈澱より分離し、該上澄液をC3ａ，C4ａ
またはC5ａあるいはその脱アルギニン誘導体よ
り選ばれた既知量の標識補体フラグメントおよび
該補体フラグメントまたはその脱アルギニン誘導
体を認識する既知量の抗体とともにインキユベー
トし、結合していない標識補体フラグメントを結
合した標識補体フラグメントより分離し、結合し
ていない補体成分または抗体結合補体成分中の標
識補体フラグメントの量を測定し、該生物学的サ
ンプル中の補体フラグメントまたはその脱アルギ
ニン誘導体の濃度を標準曲線と比較して決定する
ことを特徴とする生物学的サンプル中の補体フラ
グメントC3ａ，C4ａまたはC5ａあるいはその脱
アルギニン誘導体の検定方法。 ２ アクリノール溶液が、0.05Mリン酸緩衝剤
（PH7.4）で緩衝された２−エトキシ−６，９−ジ
アミノアクリジン乳酸塩−水和物であり、標識が
125Iである特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 結合していない標識補体フラグメントまたは
その脱アルギニン誘導体が、第二抗体の添加によ
り結合した標識補体フラグメントより分離される
特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 検定される補体フラグメントが、C3ａまた
はその脱アルギニン誘導体である特許請求の範囲
第３項記載の方法。 ５ 検定される補体フラグメントが、C4ａまた
はその脱アルギニン誘導体である特許請求の範囲
第３項記載の方法。 ６ 検定される補体フラグメントが、C5ａまた
はその脱アルギニン誘導体である特許請求の範囲
第３項記載の方法。 ７ (a) 緩衝された0.8〜1.6％アクリノール溶液
を入れた第１容器、 (b) 標識補体フラグメントC3ａ，C4ａまたはC5
ａあるいはその脱アルギニン誘導体より選ばれ
た標識試薬を入れた第２容器、および (c) 補体フラグメントC3ａ，C4ａまたはC5ａあ
るいはその脱アルギニン誘導体を認識する抗体
より選ばれた抗体試薬を入れた第３容器、 からなることを特徴とする生物学的液体の補体
フラグメントC3ａ，C4ａまたはC5ａあるいは
その脱アルギニン誘導体の検定に用いるための
市販用キツト。 ８ (a) 検定用緩衝液を入れた第４容器、 (b) 第二抗体を入れた第５容器、 (c) 補体フラグメントC3ａ，C4ａまたはC5ａあ
るいはその脱アルギニン誘導体標準25ngを入
れた第６容器、 (d) 補体フラグメントC3ａ，C4ａまたはC5ａあ
るいはその脱アルギニン誘導体標準10ngを入
れた第７容器、 (e) 補体フラグメントC3ａ，C4ａまたはC5ａあ
るいはその脱アルギニン誘導体標準5.0ngを入
れた第８容器、 (f) 補体フラグメントC3ａ，C4ａまたはC5ａあ
るいはその脱アルギニン誘導体標準2.5ngを入
れた第９容器、および (g) 補体フラグメントC3ａ，C4ａまたはC5ａあ
るいはその脱アルギニン誘導体標準1.0ngを入
れた第10容器、 が付加され、かつアクリノールが、２−エトキシ
−６，９−ジアミノアクリジン乳酸塩一水和物で
ある特許請求の範囲第７項記載の市販用キツト。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US38806882A | 1982-06-14 | 1982-06-14 | |
| US388068 | 1995-02-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS595958A JPS595958A (ja) | 1984-01-12 |
| JPH0469345B2 true JPH0469345B2 (ja) | 1992-11-05 |
Family
ID=23532522
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10484683A Granted JPS595958A (ja) | 1982-06-14 | 1983-06-10 | 補体フラグメントの免疫学的検定方法および検定用キツト |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0097440B1 (ja) |
| JP (1) | JPS595958A (ja) |
| DE (1) | DE3366421D1 (ja) |
| FI (1) | FI75935C (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE452067B (sv) * | 1986-04-11 | 1987-11-09 | Ulf R Nilsson | Reagens for och sett vid immunkemisk bestemning av c3a |
| NO162210C (no) * | 1987-07-20 | 1989-11-22 | Fasting Biotech As | Monoklonale antistoffer mot c5a for in-vitro anvendelse ved immunologiske kvantitative teknikker eller ved isolering av c5a. |
| EP0312645B1 (de) * | 1987-10-23 | 1993-09-15 | PROGEN Biotechnik GmbH | Antigene Peptide des Komplementfaktors C3a, Verwendung der Peptide, Zell-Linien, Antikörper gegen die Peptide und Verwendung der Antikörper |
| RU2149406C1 (ru) * | 1998-06-24 | 2000-05-20 | Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского | Способ определения функциональной активности компонента c4 комплемента человека (варианты) |
| US6297024B1 (en) | 1998-10-15 | 2001-10-02 | Cell Activation, Inc. | Methods for assessing complement activation |
| US6235494B1 (en) | 1999-02-08 | 2001-05-22 | The Scripps Research Institute | Substrates for assessing mannan-binding protein-associated serine protease activity and methods using the substrates |
| AU2011332241B2 (en) * | 2010-11-02 | 2015-11-26 | Kypha, Inc. | Lateral flow immunoassay for complement activation and methods of use for point-of-care assessment of complement-associated disorders |
| KR20180091097A (ko) * | 2015-12-23 | 2018-08-14 | 그리노파티온 바이오테크 게엠베하 | 보체 활성화를 억제하기 위한 폴리펩티드 |
| WO2018075758A1 (en) * | 2016-10-19 | 2018-04-26 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | A method of quantitating unbound c5 in a sample |
| EP3529619B1 (en) | 2016-10-19 | 2021-06-30 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | A method of quantitating unbound c5a in a sample |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2840847A1 (de) * | 1978-09-20 | 1980-04-03 | Behringwerke Ag | Verfahren zum nachweis und zur bestimmung komplementbindender antikoerper |
-
1983
- 1983-06-01 DE DE8383303142T patent/DE3366421D1/de not_active Expired
- 1983-06-01 EP EP83303142A patent/EP0097440B1/en not_active Expired
- 1983-06-10 JP JP10484683A patent/JPS595958A/ja active Granted
- 1983-06-13 FI FI832120A patent/FI75935C/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI832120A0 (fi) | 1983-06-13 |
| FI75935B (fi) | 1988-04-29 |
| EP0097440B1 (en) | 1986-09-24 |
| FI832120L (fi) | 1983-12-15 |
| FI75935C (fi) | 1988-08-08 |
| EP0097440A1 (en) | 1984-01-04 |
| JPS595958A (ja) | 1984-01-12 |
| DE3366421D1 (en) | 1986-10-30 |
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