JPH0469993B2 - - Google Patents

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JPH0469993B2
JPH0469993B2 JP62328445A JP32844587A JPH0469993B2 JP H0469993 B2 JPH0469993 B2 JP H0469993B2 JP 62328445 A JP62328445 A JP 62328445A JP 32844587 A JP32844587 A JP 32844587A JP H0469993 B2 JPH0469993 B2 JP H0469993B2
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JP
Japan
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rhodococcus
weight
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nitrile hydratase
medium
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JP62328445A
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English (en)
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JPH01171479A (ja
Inventor
Kyoshi Kawakami
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KEISHITSU RYUBUN SHINYOTO KAIHATSU GIJUTSU KENKYU KUMIAI
Original Assignee
KEISHITSU RYUBUN SHINYOTO KAIHATSU GIJUTSU KENKYU KUMIAI
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Application filed by KEISHITSU RYUBUN SHINYOTO KAIHATSU GIJUTSU KENKYU KUMIAI filed Critical KEISHITSU RYUBUN SHINYOTO KAIHATSU GIJUTSU KENKYU KUMIAI
Priority to JP62328445A priority Critical patent/JPH01171479A/ja
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  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野) 本発明は、ニトリルヒドラターゼ酵素活性の高
いロドコツカス(Rhodococcus)属菌体を高収
率で生産する方法に関する。 ニトリルヒドラターゼは、ニトリル類を水和し
て対応するアミド類を生成させる酵素として知ら
れており、その産業への利用としては、アクリロ
ニトリルもしくはメタクリロニトリルから、それ
ぞれ対応するアミドへの生成反応が重要であり、
例えば、特開昭62−91189号公報に記載がある。 (従来の技術) ロドコツカス(Rhodococcus)属に属し、ニ
トリルヒドラターゼを産生する能力を有する細菌
を培養して、ニトリルヒドラターゼ酵素活性を有
する細菌菌体を製造するに当り、特開昭61−
162193号公報には、例えば、ロドコツカスsp.S−
6株の場合に、グルコース、ペプトン、酵母エキ
ス、肉エキスから成る通常の栄養培地で培養し、
活性な菌体を取得していた。 一方、特開昭62−91189号公報には、例えば、
ロドコツカスsp.AK32株の場合には、グルコー
ス、ペプトン、肉エキスなどから成る通常の栄養
培地に、ニトリルを添加した培地を用いて培養
し、より高活性な菌体を取得しており、ニトリル
類がロドコツカスsp.AK32株の酵素誘導物質であ
ることが示されていた。 (発明が解決しようとする問題点) ニトリルヒドラターゼ酵素活性を有するロドコ
ツカス(Rhodococcus)属細菌の中で、特開昭
62−91189号公報に記載のAK32株、AK33株、
AK3132株は、いずれも誘導酵素を有しており、
高い酵素活性を発現させるためには、さらに簡便
で、かつ有効な酵素誘導物質の開発が望まれてい
た。 (問題点を解決するための手段) 本発明者は、このように、ロドコツカス属細菌
の中で、誘導酵素としてニトリルヒドラターゼを
有している細菌のより高い酵素活性を発現させる
ため、酵素誘導物質およびその使用条件について
鋭意研究を行なつた結果、アミド化合物を培地に
添加して培養することにより、極めて強力なニト
リルヒドラターゼ活性を有するロドコツカス属細
菌を取得することができることを見出し、本発明
を完成するに至つた。 すなわち、本発明は、ロドコツカス属に属し、
ニトリルヒドラターゼを産生する能力を有する細
菌を培養して、ニトリルヒドラターゼ酵素活性を
有する細菌菌体を製造するに当り、アミド化合物
を培地に添加することを特徴とするロドコツカス
属細菌の培養方法に関するものである。 以下、本発明方法は詳細に説明する。 本発明の一般的実施態様としては、ニトリルヒ
ドラターゼを産生する能力を有する細菌を、炭素
源、例えば、グルコース、フラクトース、シユー
クロースおよびアルドースなど、窒素源、例え
ば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、アン
モニアおよび尿素など、有機栄養源、例えば、酵
母エキス、麦芽エキス、肉エキスおよびペプトン
など、無機栄養源、例えば、リン酸塩、ナトリウ
ム、カリウム、鉄、マグネシウム、マンガン、亜
鉛などを適宜含有した培地に、酵素誘導物質とし
て、イソブチルアミド、n−ブチルアミド、プロ
ピオンアミド、アセトアミド、メタクリルアミ
ド、クロトノアミド、アクリルアミドなどのアミ
ド化合物の中の少なくとも一種を添加し培養を行
なう。また、上記酵素誘導物質としてのアミド化
合物を唯一の炭素源としたものに、必要に応じ、
上記の窒素源、無機栄養源および有機栄養源を添
加した培地で培養してもよい。 培地中の該酵素誘導物質の濃度は、通常0.1
g/以上、50g/未満であるが、好ましくは
0.5g/以上、20g/未満となるように調整
する。この濃度が50g/以上になると、菌体増
殖に著しい阻害が見られると共に、取得した菌体
の活性低下が見られる。一方、0.1g/未満で
は、十分に酵素活性を誘導できず、菌体の活性は
低い。培地のPHは、通常5〜9、好ましくは6〜
8、温度は、通常20〜35℃、好ましくは27〜32℃
で、1〜5日間好気的に培養を行なう。 (発明の効果) 本発明にしたがえば、ニトリルヒドラターゼを
産生する能力を有するロドコツカス属細菌に、強
力にニトリルヒドラターゼ酵素活性を発現させる
ことができるため、ニトリルからアミドを酵素法
により製造する際、細菌菌体当りのアミド生産量
を増大させると共に、アミド生産速度を上げるこ
とが可能となり、設備の小型化およびコストの低
減といつた面からの生産性の向上に寄与するとこ
ろが大である。 (実施例) 次に、本発明を実施例により、さらに詳細に説
明するが、本発明の範囲は実施例に限定されるも
のではない。 実施例 1 グルコース2重量%、肉エキス0.1重量%、ペ
プトン0.1重量%、食塩0.1重量%、リン酸第一カ
リウム0.1重量%、硫酸マグネシウム0.05重量%、
硫酸第一鉄0.005重量%、硫酸マンガン0.005重量
%、硫酸アンモニウム0.1重量%、硝酸カリウム
0.1重量%を含んだ培地(以後、Z培地と呼ぶ)
に、イソブチルアミドを0.25重量%添加した後、
水酸化カリウムでPHを7.0に調整したものを、121
℃で30分間滅菌し、室温まで冷却後、ロドコツカ
ス(Rhodococcus)sp.AK33株(微工研菌寄第
1047号)をスラントより一白金耳植菌し、30℃で
38時間培養した。次に、得られた培養液から4℃
で遠心分離により集菌し、0.05Mリン酸バツフア
ー(PH7.0)で洗浄したものを反応に供した。す
なわち、乾燥菌体量として0.2重量%、メタクリ
ルニトリル2.0重量%、0.05Mリン酸バツフアー
(PH7.0)97.8重量%の反応液を調合し、30℃で反
応を開始した。反応開始10分後に、反応液をガス
クロマトグラフにより分析したところ、2.5重量
%のメタクリルアミドを含み、未反応のメタクリ
ロニトリル、メタクリル酸およびその他の副生物
は全く含まれず、反応はほぼ定量的に進行し完結
していた。 実施例 2〜8 実施例1で用いたZ培地に、種々のアミド化合
物を0.25重量%添加した後、水酸化カリウムでPH
を7.0に調整したものを、121℃で30分間滅菌し、
室温まで冷却後、ロドコツカス(Rhodococcus)
sp.AK32株(微工研菌寄第1046号)をスラントよ
り一白金耳植菌し、30℃で38時間培養した。次
に、得られた培養液からの集菌、菌体の洗浄およ
びメタクリロニトリルとの水和反応は、実施例1
と同一の方法で行ない、反応時間5分後のメタク
リルアミド収率を比較した。なお、分析にはガス
クロマトグラフイーを用い、得られた結果は第1
表に示した。
【表】 実施例 9〜13 実施例1で用いたZ培地に、イソブチルアミド
を種々の濃度で添加した後、実施例1と同様な方
法で、ロドコツカスsp.AK32株を植菌し、30℃で
培養を行なつた。菌体の増殖が見られたものにつ
いては、実施例1と同一条件で反応を行ない、反
応時間5分後のメタクリルアミド収率を測定し
た。得られた結果を第2表に示した。
【表】 実施例 14 リン酸第一カリウム0.1重量%、硫酸マグネシ
ウム0.05重量%、硫酸第一鉄0.005重量%、硫酸
マンガン0.005重量%、硫酸アンモニウム0.1重量
%、硝酸カリウム0.1重量%を含んだ培地(以後
B培地と呼ぶ)にイソブチルアミドを0.25重量%
添加した後、実施例1と同様な方法で、ロドコツ
カスsp.AK32株を植菌し、30℃で96時間培養し
た。次に、得られた培養液から集菌、菌体の洗浄
およびメタクリロニトリルとの水和反応は、実施
例1と同一の方法で行ない、反応時間15分後に、
反応液を分析したところ、1.2重量%のメタクリ
ルアミドが生成し、1.1重量%のメタクリロニト
リルが検出された。 実施例 15 グルコース1重量%、肉エキス1重量%、ペプ
トン1重量%、食塩0.1重量%を含んだ培地(PH
7.0)を、121℃で30分間滅菌し、室温まで冷却
後、ロドコツカスsp.AK33株をスラントより一白
金耳植菌し、30℃で40時間培養した。次に、得ら
れた培養液から菌体を4℃で遠心分離により集菌
し、生理食塩水で洗浄後、実施例14に示したB培
地にイソブチルアミドを0.25重量%添加し、水酸
化カリウムでPH7.0に調整した液に洗浄菌体を投
入し、30℃で8時間撹拌した。次に、この菌体浸
漬液から菌体を分離し、メタクリロニトリルとの
水和反応を実施例1と同一の方法で行ない、反応
時間15分後に反応液を分析したところ、2.1重量
%のメタクリルアミドが生成し、0.3重量%のメ
タクリロニトリルが検出された。 実施例 16 反応基質をメタクリロニトリルからアクリロニ
トリルに変更した以外は、実施例4と同一条件で
アクリロニトリルの水和反応を行ない、反応開始
15分後に、反応液をガスクロマトグラフイーによ
り分析したところ、2.6重量%のアクリルアミド
を含み、未反応のアクリロニトリル、アクリル酸
およびその他の副生物は全く含まれず、反応はほ
ぼ定量的に進行し完結していた。 実施例 17 反応基質をメタクリロニトリルからアクリロニ
トリルに変更した以外は、実施例5と同一条件で
アクリロニトリルの水和反応を行ない、反応開始
15分後に、反応液を分析したところ、2.5重量%
のアクリルアミドが生成し、0.1重量%のアクリ
ロニトリルが検出された。 実施例 18 菌株をロドコツカスsp.AK3132株とし、培養時
間を120時間とした以外は、実施例14と同一条件
で培養した。菌体は、得られた培養液から実施例
1と同様の方法で取得し、反応に供した。すなわ
ち、乾燥菌体量として1.0重量%、メタクリロニ
トリル1.0重量%、0.05Mリン酸バツフアー(PH
7.0)98.0重量%の反応液を調合し、30℃で反応
を開始した。反応開始1時間後に、反応液を分析
したところ、0.4重量%のメタクリルアミドが生
成し、0.7重量%のメタクリロニトリルが検出さ
れた。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 ロドコツカス(Rhodococcus)属に属し、
    ニトリルヒドラターゼを産生する能力を有する細
    菌を培養して、ニトリルヒドラターゼ酵素活性を
    有する細菌菌体を製造するに当り、アミド化合物
    を培地に添加することを特徴とするロドコツカス
    属細菌の培養方法。 2 アミド化合物がイソブチルアミド、n−ブチ
    ルアミド、プロピオンアミド、アセトアミド、メ
    タクリルアミド、クロトノアミド、アクリルアミ
    ドからなるものである特許請求の範囲第1項記載
    の培養方法。 3 培地中の該アミド化合物の濃度が0.1g/
    以上、50g/未満である特許請求の範囲第1項
    記載の培養方法。 4 ロドコツカス属に属し、ニトリルヒドラター
    ゼを産生する能力を有する細菌がロドコツカス
    sp.AK32(Rhodococcus sp.AK32)微工研菌寄第
    1046号、ロドコツカスsp.AK33(Rhodococcus
    sp.AK33)微工研菌寄第1047号またはロドコツカ
    ス・エリスロポリスAK3132(Rhodococcus
    erythropolis AK3132)微工研菌寄第1040号であ
    る特許請求の範囲第1項記載の培養方法。
JP62328445A 1987-12-26 1987-12-26 ロドコッカス属細菌の培養方法 Granted JPH01171479A (ja)

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