JPH0473552B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の背景） （産業上の利用分野） 本発明は試料中の細胞のサブポピユレーシヨン
を同試料中の他の細胞あるいは粒子に妨害される
ことなく区別し同定する方法および装置に関する
ものであり、より詳しくは、試料中の血球あるい
は血球のサブポピユレーシヨンをその他の血球、
特に赤血球の妨害なしに区別し定量する方法およ
び装置に関するものである。 （従来技術） 血液中の白血球（白血球細胞）のサブポピユレ
ーシヨンは、免疫応答において特有の役割を演じ
る種々のサブクラスとして定義される。例えば、
種々のリンパ球サブクラスの細胞の相対数は病的
状態において変化をうけやすい。従つて、この
種々のサブクラスの細胞を同定することは、種々
の病気の診断およびその病気の治療の観察におい
て極めて有用とされている分析手段を与えること
になる。 機能的にはつきりした白血球の少なくともいく
つかの特定のサブクラスは、細胞表面上の抗原決
定基に対する抗体、特にモノクローナル抗体によ
り同定できることが知られている。特に、Ｔ−リ
ンパ球の種々のサブクラスの同定には学術的にも
診断上からもかなりの興味が注がれている。Ｔ−
リンパ球は、自分のサブクラスの細胞をその他の
血球およびリンパ球のその他のサブクラスの細胞
から区別する、その細胞表面上の認識できうる抗
原決定基により特徴づけられる。従つて、白血球
の分析、特にリンバ球およびリンパ球のＴ細胞サ
ブクラスの分析のための迅速な方法の開発に大き
な興味がもたれる。 Ｔ細胞はヘルパー、サブレツサーおよび細胞障
害性Ｔ細胞（これらは順に、反応の促進、反応の
抑制、異種細胞の殺害（溶解）作用を有する）と
呼称される、少なくとも数種のサブタイプに分か
れる。Ｔ細胞のサブタイプを同定しうる方法は
種々の免疫制御の異常あるいは病状の診断あるい
は治療に重要である。 白血球（白血球細胞）のポピユレーシヨンの分
析用の血液試料の調整は、一般に白血球を赤血球
（赤血球細胞）ポピユレーシヨンから分離する明
らかな必要性に基づいて行なわれている。この赤
血球細胞数は白血球細胞数の1000ないし１倍もあ
る。この赤血球細胞の圧倒的な数のために、研究
者達はフローサイトメトリー法による試料中の白
血球細胞の効果的な分析の前に、赤血球を分離せ
ざるを得ないと結論してきた。 概して、赤血球細胞による妨害のない白血球試
料を得る２つの方法が開発されている。一つの方
法では、フイコールーパク（Ficoll−Paque
〔これはフアルマシアフアインケミカルズAB（ウ
ブサラ、スウエーデン）による市販品である〕あ
るいはチキソトロピツクゲル様物質のような分配
剤の存在下に遠心し、白血球を赤血球から単離し
分離する。もう１つの方法〔米国特許第4284412
号、ハンセン（Hansen）等に記載〕では、赤白
球をフローサイトメトリー分析を妨害しないフラ
グメントに破壊するために、赤血球を溶解する。 白血球細胞あるいはそのサブクラスを赤血球細
胞から分離するこの最初の工程は時間がかかり大
変な労力である。事実、白血球細胞あるいはその
サブクラスの染色や分析の比較的単純な工程より
はるかに時間を必要とる。診療目的には（この目
的には迅速かつ反復できる分析が適している）、
白血球細胞を赤血球細胞および好ましくない白血
球細胞のサブクラスから分離せざるを得ないこと
は大きな障害である。更に、これらの研究への応
用において、時間を要することは大きな問題では
ないとしても、最初の分離の工程である赤血球と
望ましくない白血球細胞の除去の際に目的とする
白血球細胞の損失の可能性があり、次の分析に明
白性と正確性を欠くこととなる。このような訳
で、被験試料から不必要な血球を完全に除去し得
ないと、かなりの測定誤差の危険があり、また、
このような不必要な細胞が存在すると次の分析の
誤差の原因ともなり得る。赤血球細胞の溶解を含
む方法は、この方法では白血球のある程度の溶解
をきたすことなしにすべての赤血球の溶解を達成
することは困難であることから、やはり十分に満
足できるものではない。 粒子、細胞等の検知に有用な、現在周知かつ市
販のフロースルーサイトメーターは普通、混合物
中の１つあるいは２つの、通常は２つの、細胞の
サブポピユレーシヨンの検出用の２つのチヤンネ
ルを有している。例えば、各々のケイ光チヤンネ
ルに関する２つの免疫ケイ光剤で特異的に標識し
た細胞を検出することができる２つのケイ光チヤ
ンネルを有する装置が知られている。これらの既
知の装置においては、電気的回路とケイ光検出器
を含む完全なケイ光チヤンネルを、分析される試
料中の細胞の混合物中の検出されるケイ光団で処
理した細胞の各々のカテゴリーに対して使用して
いる。従つて、フロースルーサイトメトリーを用
いる試料中の細胞の多数のサブポピユレーシヨン
を検出するために、同じ多数のケイ光チヤンネル
が使用される。標識された各々の異なるタイプの
ケイ光発色団あるいは免疫ケイ光性染色剤を励起
するためにレーザーのような個々の光源を使用で
きる。免疫ケイ光性染色剤を分析するために２つ
のレーザーを利用する装置が米国特許第3826364
号および第4284412号に記載されている。 １つの試料中の２つの異なる免疫ケイ光性染色
剤の分析、定量は１つの光源により励起される２
つあるいはそれ以上のケイ光発色団（これは夫々
異なる放出特性を有する）について行なうことも
できる。 概して、血液学の分野では、また免疫血液学の
特定の分野では、末梢血液中を循環する種々の白
血球の数を測定することが望ましい。細胞をサブ
分類化し、そのサブクラスの細胞数を計測するこ
とは、最近注目されている後天性免疫不全症侯群
（AIDS）のような免疫に関する病気の診療にお
いて大きな興味が注がれている。特に、血液中の
白血球の単核タイプであるリンパ球のサブクラス
類は診療上極めて重要となつている。 試料の問題とする白血球細胞の異なつた多数の
サブポピユレーシヨンを直接的に検出できること
が望まれる数多くの例がある。例えば、血液につ
いてある種のテストを行なう場合に、血液試料中
のリンパ球細胞の合計のポピユレーシヨンを検出
あるいは定量することおよびリンパ球ポピユレー
シヨンのパーセントとしてＴ細胞とＢ細胞のポピ
ユレーシヨンを決定することが望ましい。同様
に、Ｔ細胞のヘルパー細胞とサプレツサー細胞と
のサブセツトおよびＴ細胞のサプレツサー細胞と
ナチユラルキラー細胞とのサブセツトのようなリ
ンパ球の別の異なるタイプの検出および定量が望
まれる。本発明は以上のことを考慮して、赤血球
細胞の妨害なしに試料中の問題とする白血球細胞
のサブポピユレーシヨンの直接的な測定への必要
性を満足するよう意図されている。 従つて、本発明の第一の目的は、一組の血液細
胞、特に白血球および一組の血液細胞の特定のサ
ブクラスを、妨害となる血液細胞、特に赤血球細
胞の前もつての分離あるいは溶解を必要とせず
に、同定および計測する方法を提供することであ
る。もう１つの目的は、赤血球細胞のような他の
細胞の存在のため、あるいは試料からの細胞の損
失によるデータの損失のための欠点のある分析を
実質的に防ぐ、白血球細胞およびそのサブクラス
の分析法を提供することである。更に別の目的
は、迅速性と比較的簡単さのために血液細胞のサ
ブクラスの同定および計数が診療上の手段に使用
できるような方法を提供することである。 発明の概要 本発明の原理によれば、数々の利点と目標が達
成される。第一に、本発明は、試料中の問題とし
ていない赤血球あるいは白血球から妨害されるこ
となしに、問題の白血球細胞のサブポピユレーシ
ヨンの検出、定量を可能にする。 本発明の原理によれば血液試料の適切な調整に
は、標識された二種の抗体のような、少なくとも
血液細胞の一組およびその一組内の問題としてい
るサブクラスに対して選択性のある二種の標識剤
を用意する必要がある。好ましくは、この標識剤
は適当な入射光源による照射によりケイ光を放出
する特性を有する。１つの方法は、正常なヒト提
供者からの全血液を例えばEDTAで抗凝固処理
後適切に標識された抗体とインキユベートする。
次に、このサンプルは、標識した抗体により放出
される光の検出によるフローサイトフルオロメト
リツク分析にかけられる。この検出は、抗体の１
つにより放出される、前もつて定めた光の強度に
基づいて敷居値をもうけることにより制限され
る。間接的な免疫ケイ光染色を用いる場合には、
求めるケイ光特性を有する、第一の抗体に対する
第二の抗体と２回目のインキユベーシヨンが行な
われる。例えば、問題とする白血球細胞のサブポ
ピユレーシヨンは、２つのレーザーフローサイト
メーターを通して、前もつて定めた異なるケイ光
応答を有する少なくとも２つの抗体で標識したサ
ンプルを通過させることにより測定することがで
きる。区別できる特性をもたらすに十分にケイ光
波長が離れてはいるが、単一光源により励起され
るほどスペクトル範囲が十分に接近しているケイ
光標識剤を選択することにより、２つのレーザー
励起メカニズムに匹敵する結果を生ずる２色の免
疫ケイ光を単一光源により得ることができる。 図１は、フロー流路中の粒子の多数のサブポピ
ユレーシヨンについてのケイ光の測定に有用なフ
ローサイトメトリー装置の光学要素および光の経
路の具体例の１例の模式図である。 図２−５は、本発明の原理により、白血球細胞
と未溶解の赤血球細胞を含む血液サンプルをフロ
ーサイトメーターを通過させることにより測定し
た、白血球細胞のサブポピユレーシヨンの検出と
定量のグラフである。 （発明の構成） 本発明は多くの異なる形式において実施されう
る。以下に本発明の特定の具体例を詳しく図で示
し、また説明する。この具体例は本発明の原理の
例示と解されるべきであり、添附の特許請求の範
囲およびその均等により定義される本発明を限定
するためのものではない。 本発明は、赤血球を含む試料中の白血球の別の
サブクラスに関連して白血球のひとつのサブクラ
スを同定し計数するための方法を提供する。この
方法では血液試料の一部（アリコート）が使用さ
れる。第一の組あるいは白血球のサブクラスは第
一のサブクラスに関する第一の物理的パラメータ
ーの測定により同定される。好ましくは、第一の
サブクラスは、第一の組あるいはサブクラスの細
胞と選択的に反応する、例えだ抗体、レクチン、
核散染色剤あるいは膜電位染色剤のような第一の
標識剤の存在下に試料の一部をインキユベートす
ることにより選択的に標識される。この第一の標
識剤は光学的刺激に応答する前もつて定めたケイ
光を有する。白血球の第二のサブクラスはその第
二のサブクラスに関する第二の物理的パラメータ
ーの測定により同定される。好ましくは、第二の
サブクラスは、第二のサブクラスの細胞と選択的
に反応する第二の標識剤と試料の一部をインキユ
ベートすることにより選択的に標識される。白血
球の第一のサブクラスおよび白血球の第二のサブ
クラスは遂次的にあるいは同時に標識することが
できる。場合によつては、例えば、大きさのよう
な白血球のサブクラスの物理的パラメーターを用
いて、例えば光散乱のような関連する物理的パラ
メーターの測定により第一のサブクラスあるい
は、第二のサブクラスを識別することもできる。
このような場合には、第二のインキユベート工程
は必要でないであろう。 測定する物理的パラメーターが、光学的刺激に
対する第一のサブクラスおよび第二のサブクラス
によるケイ光応答である場合は、第二の標識剤は
第一の標識剤のケイ光応答とは異なる、光学的刺
激に対する前もよて定めたケイ光応答を有する。
このインキユベートしたアリコートは第一の標識
剤および第二の標識剤に対する光学的刺激の領域
を通して実質的に一度に１個の細胞の割合で流さ
れる。第一の標識剤および第二の標識剤から放出
される光は検出され取得される。取得されるデー
タはケイ光の強度のような選ばれた物理的パラメ
ーターの応答に基づいて前もつて定めた範囲に限
定される。このような前もつて定めた範囲は標識
剤の少なくとも１つにより問題とする細胞に与え
られる物理的応答の強度により決定される。第一
の標識剤および第二の標識剤により与えられる、
ケイ光のような物理的パラメーターを前もつて定
めた測定の存在に基づき、細胞の第一のサブクラ
スの細胞は細胞の第二のサブクラスの細胞から区
別される。 本発明の標識剤は２つ以上の標識剤の同時の使
用が可能な測定できうる物理的特性を有していな
ければならないことは理解されるべきである。も
し測定する物理的特性が光学的刺激により活性化
される光の放出であるならば、標識剤は放出スペ
クトルが区別できるような放出特性を有してなけ
ればならない。 標識剤は好ましくは抗体、特にモノクロナール
抗体である。他の適した標識剤はレクチン、プロ
ピジウムアイオダイドおよびLDS751のような核
酸染色剤およびシアニン染色剤のような膜電位染
色剤である。抗体のようないくつかの標識剤は細
胞の表面の抗原決定部位と反応する。核酸染色剤
および膜電位染色剤のようなその他の標識剤は、
問題とする細胞のサブクラスに目印をつけるよう
に特定の細胞成分により吸着される。 自発的に検出できる光を放出しない（例えば、
抗体のような）標識剤の前もつて定めたケイ光は
マーキング剤を標識剤に結合させることにより得
ることができる。いくつかの標識剤（例えば、核
酸染色剤およびメンブランポテンシヤル染色剤の
ような）はケイ光特性を有し、光学的刺激により
検出できる光を放出する。このような場合には結
合するマーキング剤は必要でない。このマーキン
グ剤は好ましくは、２色の検出を可能にするに十
分に波長の離れた放出スペクトルを有するケイ光
発色団である。概して、このケイ光発色団は励起
波長より約10ないし約300nm長い範囲のケイ光を
発するのがよい。マーキング剤の適切な一組は
570nmにケイ光を放出するフイコビリ蛋白である
フイコエリスリンと530nmの波長に放出するフル
オレセインである。３つ以上の適当な標識剤を、
もしそれらが適当な放出特性を有するか、または
それらが適当な放出特性を有するマーカーと結合
されるならば、使用することもできる。抗体をマ
ークするための３つのマーキング剤の一組の適切
な組み合わせはフイコエリスリン、フルオロセイ
ンおよび615nmにケイ光を放出するテキサスレツ
ドである。これらのマーキング剤の１つ以上はエ
キサイトコーポ（Exciton Corp.）デイトン、オ
ハイオ、により市販されている、LDS571のよう
な核酸染色剤と組み合せて使用してもよい。 インキユベートしたサンプルの一部は、赤血球
細胞を除去または溶解したサンプルに対して通常
用いられる、白血球細胞の流れ速度に実質的に等
しい白血球細胞の流れ速度でフローサイトメトリ
ー装置を通過させる。概して、毎秒約20ないし約
2000個の白血球細胞の速さが適当である。サンプ
ルの一部は血液細胞のいかなるクラスの溶解また
は分離を行なうことなしにフローサイトメトリー
装置を通して流すのが好ましい。しかしながら、
本発明の原理は問題とする試料から血液細胞の特
定のサブクラスの溶解または分離を行なつた血液
細胞のフラクシヨンの分析に対しても同様に適し
ていることが理解されるべきである。 本発明の方法により区別することができる、問
題とする血液細胞の組として、有核細胞、白血球
細胞、リンパ球、顆粒球細胞、単核細胞、Ｔ細
胞、Ｂ細胞およびナチユラルキラー／大単核リン
パ球（NK／LGL）細胞を包含する。本発明の方
法により区別することができる１つないしそれ以
上のこれらの組のうち問題とするサブクラスは、
リンパ球、顆粒細胞、単核細胞、ヘルパーＴ細
胞、インデユーサーＴ細胞、サプレツサーＴ細
胞、細胞障害性Ｔ細胞、Ｔ細胞、成熟／活性期段
階Ｔ細胞、Ｂ細胞、成熟／活性期段階Ｂ細胞、成
熟／活性期段階単核細胞、夫々成熟／活性期段階
の好中球、好塩基性細胞、好酸球及び顆粒細胞；
NK／LGL細胞および成熟／活性期段階NK／
LGL細肥を包含する。勿論、本発明の方法は上
述の計測された組の２つあるいはそれ以上の区別
および比較のために使用することができる。 もし必要ならば、標識剤およびマーキング剤を
適切に選択することにより、組とサブクラスは多
くの組み合わせにおいて、各々について調べるこ
とができる。例えば、もし、組が白血球であるな
らば、サブクラスはリンパ球、顆粒細胞、単核細
胞およびそれらの組み合わせであり、もし、組が
リンパ球であるならば、サブクラスはＴ細胞、Ｔ
細胞のサブクラス、Ｂ細胞、Ｂ細胞のサブクラス
およびそれらの組み合わせであり、もし組がＴ細
胞であるならば、サブクラスはＴ細胞のいずれか
のサブクラスあるいはそれらの組み合わせであ
り、もし組が単核細胞であるならば、サブクラス
は好中球、好塩基性細胞、好酸球、成熟段階顆粒
細胞およびそれらの組み合わせであり得る。 本発明の方法の原理は種々様々な方法による血
液細胞のサブクラスの分析に適している。光散乱
あるいは音響的吸着のような、ケイ光以外の物理
的特性を標識剤として使用することができる。本
発明によるサブセツトの分析を実施するにあた
り、標識した血液サンプルを一度に１個の細胞ず
つ検査するために、自動掃査顕微鏡を使用するこ
とができる。標識剤としてケイ光マーキング剤の
使用が好ましく、また、装置としては後述するよ
うなフローサイトメトリー装置が好ましい。 図１には、フローサイトメトリー装置１０の光
学および粒子のフロー要素が示してある。図１の
光学およびフロー要素は粒子の特定の性質を分析
するために実質的に液体流の中に一度に１個ずつ
の粒子を流すためのフローサイトメトリー装置の
主要成分を表わしている。例えば図１の装置の要
素はカリホルニア、サニーバレーのベクトンデイ
キンソンアンドカンパニー（Becton Dickinson
and Company）のFACSシステムデイビジヨン
（FACS Syetem Division）により製造販売され
ているFACS ケイ光活性化分類装置に包含され
るであろう。このFACS細胞分類装置は広く種々
の研究室での応用において、光散乱とケイ光に基
づき細胞のポピユレーシヨンを分析し分離する。
ここに特に詳細に説明する。FACS細胞分類装置
のような装置において見現されるであろう光学お
よびフロー要素に加えて、本発明に関連して有用
な細胞分類装置のその他の詳細は米国特許第
3826364号に記載されている。本発明は、多くの
異なる形式のフローサイトメトリー装置において
（光散乱、粒子体積、ケイ光あるいは試料中の粒
子のサブポピユレーシヨンの同定あるいは定量の
ためのいかなる他のパラメーターを測定するもの
であれ）有用である。 図１に示されるように、光エネルギーはレーザ
ーのような適切な光源１２および１４によりフロ
ーサイトメトリー装置に供給される。説明する実
施例においては、異なるケイ光特性を有する複数
の異なるタイプの粒子を検出し定量するために、
フローサイトメトリー装置１０に２つの光源が設
置されている。しかしながら、図１に示した実施
例における２つのレーザーの設置は、ここで述べ
る発明の形式における１つ以上の光エネルギー源
と分析要素を用いる実施例の例示として解される
べきである。本発明の要素は、たとえローサイト
メトリー装置にただ１つの光源が使用されたとし
ても、十分に利用できるものである。また、レー
ザーのようなコヒーレントな光源は必要でないこ
とも理解されるべきである。水銀蒸気ランプよう
なその他の光源がある種の応用には適しており好
ましい。同様に２つ以上の光源の使用も可能であ
る。 本発明においては、レーザー１２および１４
は、スペクトル範囲にてお互いに離れた特定の波
長にコヒーレント光の主要な放出を起こすために
選択された。例えば、レーザー１２は、好ましく
は、青色／緑色のスペクトル領域にて働くように
選択されており、レーザー１２により発生された
光を通過する粒子に結合してある光の光学的刺激
により照射されるときケイ光を発するケイ光発団
はレーザー１２により励起される。本発明に有用
なそのようなレーザーのひとつは488ナノメータ
ー（nm）に主要な放出を有するアルゴンレーザ
ーである。レーザー１４は、好ましくは、レーザ
ー１２とは異なる離れた波長で働くように選択さ
れる。レーザー１４の波長の光学的刺激により照
射したときケイ光を発するケイ光発色団を持つて
いる粒子は、レーザー１４により発生された光を
通つてこれらの粒子が流れるときに、励起され
る。レーザー１４の働きは、レーザー１２のスペ
クトル領域から十分に波長が離れているように可
視スペクトルの黄／赤領域をカバーし得る。この
要求を満たすようなレーザーの１つは、595nmに
主放出を有することができるローダミン６−Ｇ染
料レーザーである。２つのレーザーの波長の違い
は、各々のレーザーで少なくとも２つのケイ光発
色団を励起するスペクトル範囲の外側にあること
で十分である。２つのレーザー間の波長の差75な
いし300nmは上述の望ましい結果を与えるであろ
う。勿論、ケイ光発色団あるいは他の定量可能な
マーキング剤の選択は、各々のレーザーにより与
えられる光エネルギーにより２つまでのケイ光発
色団が励起できるように、本発明において使用さ
れるレーザーと相容れなければならない。レーザ
ー１２および１４から発した各々のビーム１６お
よび１８は、各々のビームをその平行性を保持し
つつ拡大する、番号20および22により模式的に示
されたビームエキスパンダーを通して進行し得
る。本発明の作動上好ましくは（しかし、必ずと
いうことではない）、各々のビームはこのビーム
エキスパンダーを通過した後、フローサイトメト
リー装置の空間的要求のためにビームをその方向
を変えなければならない。このために、ビーム１
６はプリズム２４および２５を通して反射され、
ビーム１８はプリズム２６および２８を通して反
射される。すべてのこれらのプリズムは操作中ビ
ームを正しく合わせられるように調整できる。 ビーム１６および１８がプリズム１６および１
８を通過したのち、それらは、ビームを粒子の流
れに焦点を合わせるためのレンズ３０および３２
に向けられる。もし使用されるならば、レンズ３
０および３２は使用するフローサイトメトリー装
置の形式によつて選択されるので、これらのレン
ズは米国特許商標局に1982年３月25日にフアイル
された本特許申請と同一出願人の特許申請（申請
番号第361672号）の記載の従つて選択することが
できる。 レーザービームはレンズ３０および３２を通過
後、粒子流３８に向かう。本発明のフローサイト
メトリー装置内に組み込まれたノズル４０は液子
流３８内に粒子４１の流れるのを容易にする。こ
の形式のノズルの利用は周知であり、例えば、米
国特許第3826364に記載されている。図１により
明らかに示されているように、レーザービーム１
６は光散乱チヤンネルの光学軸上に置かれ、粒子
の散乱の検出に用いられる。しかしながら、ここ
で述べる光散乱特性は、光ビームを通過する粒子
から情報を得るために光散乱を用いる典型的なフ
ローサイトメトリー装置の特徴を満たすために単
に包まれているものであり、本発明の実施におい
て必要でないことが理解されるべきである。 従つて、光ビーム１６はノズル４０から出てく
る流れ３８内を流れる粒子に最初に当たる光ビー
ムである。その後、ビーム１６は光散乱チヤンネ
ルの光学軸上の光散乱オブスキユレーシヨンバー
４２に当たる。レンズ４４により集められた散乱
光は、集められた散乱光の最大の角度を決定する
第一の絞り４５を通過する。絞り４５の次に、散
乱検出器４８に向けて入射光の一部を反射し、残
りの入射光を光吸収器（示してない）に通過する
ビームスプリツトミラー４６がある。２番目の絞
り４９は散乱光の源をレーザービーム１６と流れ
３８の交点に制限するためのフイールドストツプ
として作動する。散乱光は、フイルター５０を通
過した後、検出器４８で検出される。この検出器
は周知の方法により液体流中を流れる粒子の大き
さを見積るために電気的に作動する。 レーザービーム１８もまた流れ３８に向けられ
るが、これは流れの垂直軸に沿つてレーザービー
ム１６と鉛直の位置に置かれる。粒子により散乱
されたビーム１８からの光は散乱チヤンネル光学
系により捕まえられるが、好ましくは、散乱チヤ
ンネル内に置かれた絶縁性フイルターにより検出
器４８から保護される。 ケイ光チヤンネルに関して、前もつて定めた
別々の放出スペクトルを有するケイ光発色団の引
き続く励起のために必要なレーザーの異なる波長
の作動により照射が行なわれる。前もつて定めた
別々の放出スペクトルを有する２つまでのケイ光
発色団は各々のレーザーの光エネルギーにより与
えられる励起エネルギーにより励起される。図１
に示すように、２つの独立なレーザービームは粒
子が最初にレーザービーム１６を、次にレーザー
ビーム１８を横切るように垂直に位置する点で流
れ３８と交差する。従つて、２組の光学シグナル
が各々の光ビームを通つて流れる粒子により発生
することになり合計４つの光学シグナルが得られ
る。これらの組の信号は、粒子が第１のビーム交
差点から第２のビーム交差点に到達までに要する
時間だけ時間的にずらすことが好ましい。この時
間のずれは、この組のシグナルを別々に分析する
ことを可能にし、２つの異なる励起波長で励起さ
れたとき、粒子のケイ光放出に比例したシグナル
が得られる。粒子から放出されたケイ光シグナル
は分離したビームから反射光を阻止するオブスキ
ユレーシヨンバー５４のまわりに向けられる。す
べてのケイ光シグナルはレンズ５５により、好ま
しくは、特定の波長の光のみを通過させる第１の
フイルター５６を通して焦点を合わせられる。 光ビーム１６により刺激された粒子により放出
されたケイ光は、フイルター５６を通過後、二色
性ミラー５８に入る。二色性ミラー５８の目的
は、ケイ光の光路に沿つて進行した２つの異なる
光を分離し、それらを別々に分析できるようにす
るためである。例えば、二色性ミラー５８は、例
えばレーザー１２によつてのみ生じた光ビーム１
６により励起された粒子の異なる色の波長を分離
するために選択される。例えば、青色領域の波長
は二色性ミラー５６を通して、引き続いて、唯一
つの色の領域（この場合は青色）の波長を通過す
るよう作られたバリアーフイルター５９を通して
通過される。青色光は次にケイ光検出器６０に入
る。 緑色領域において二色性ミラーに入る光は、唯
一つの色の領域（この場合緑色）の波長を通過す
るバリアーフイルター６１を通して二色性ミラー
により反射される。 光ビーム１８もまた、光ビーム１６により励起
されたケイ光発色団とは異なる２つまでのケイ光
発色団を励起するに十分な単一の波長の励起エネ
ルギーを与える。光ビーム１８により励起された
粒子により放出されたケイ光はレンズ５５および
第一のフイルター５６を通過した後、もう１つの
二色性ミラー６４に入る。二色性ミラー５８につ
いての説明と同様に、第二の二色性ミラー６４は
色スペクトルの２つの異なる領域の波長を分ける
ために選択される。例えば、黄色と赤色の両方の
シグナルがレーザー１４からの光ビーム１８によ
り与えられた単一の励起源により発生される。黄
色領域の波長は、二色性ミラー６４、続いて黄色
領域のみの波長を透過するよう作られたバリヤー
フイルター６５を通して透過される。この光は次
にケイ光検出器６６に向かう。赤色領域の波長は
バリヤーフイルター６８を通り二色性ミラーに反
射され、その後、この光はケイ光検出器６９に入
る。従つて、各々の動作の光の波長で２つまでの
異なるケイ光発色団を励起することができる２つ
のレーザーからの光は、説明したようなフローサ
イトメトリー装置にサンプルを一回流す間にその
試料中の粒子の多数のサブポピユレーシヨンの検
出と定量を可能にすることが理解できる。 ケイ光検出器６０，６２，６６および６９は、
好ましくは、それぞれ４つに分かれた青、緑、黄
および赤色の光の流れを受けつけるように作られ
ている。これらのケイ光検出器は、光学信号を電
気信号に変換する低ノイズ光電倍増管あるいはこ
れ等を同等物である。これらの電気的信号は、分
析またはその他の目的のフローサイトメトリー装
置の電子工学（示していない）により処理するた
めに電気的にフイードされる。種々の表示、情報
表示、積算あるいは記録がフローサイトメトリー
装置に与えられる。本発明のひとつの実施によれ
ば、分析の結果を保存し、プロツトあるいは表の
形式の細胞のサブポピユレーシヨンを直接的に同
定できる様にコンビユーター７１を備えている。
２種の抗体を使用するときは、２次元プロツトが
作られる。３種の抗体の場合は表示用の３次元プ
ロツトが得られ白血球サブポピユレーシヨンを雲
状様形式に示す。 本装置は細胞表面の免疫ケイ光による細胞のサ
ブセツトの分析用に設定され、調整される。リン
パ球と同じバツクグランドケイ光をもつ染色され
ていないリンパ球あるいはミクロスフエアは毎秒
約500ないし約1500の速度で流される。安定した
流速に達したとき、すべての敷居値レベルは最大
に合わせられる。このレベルでは細胞の固数は計
上されない。次に、緑色ケイ光のような問題とす
る細胞を同定するパラメーターについての敷居値
レルを、毎秒１ないし５個が観察する迄下げる。
これで本装置は本発明の方法により染色された溶
解していない全血液サンプルの分析の準備がすべ
て整う。 本発明の実施について、単に例示の目的のため
に、以下の実施例に関して説明する。この実施例
は試料中の粒子の多数のサブポピユレーシヨンを
検出し、区別し、および／または定量する本方法
の範囲を例示するものであるが、それを制限する
ものではない。 実施例 １ ヒト血液はボランテイアから採血した。50の
血液はベクトンデイキンソンアンドカンパニー
（Becton Dickinson and Company）から市販の
２種のモノクロナール抗体の各々5μと４℃に
て30分間インキユベートした。このモノクローナ
ル抗体はフイコエリスリン（PE）と結合したア
ンチ−Leu2aおよびケイ光イソチオシアネート
（FITC）と結合したアンチ−Leu3aであつた。ア
ンチ−Leu2aはＴ細胞のサブレツサー細胞障害性
細胞のサブクラスに対して特異的である。アンチ
−Leu3aはＴ細胞のヘルパー−インデユーサー細
胞のサブクラスに対して特異的である。別のの血
液サンプルを、選択的に赤血球を溶解（白血球を
溶解しない）する塩化アンモニウム緩衝液で溶解
した。このサンプルを上記のモノクローナル抗体
試薬（アンチ−Leu−2a−PEおよびアンチ−Leu
−3a−FITC）の各5μと一緒にし、４℃にて30
分間インキユベートした。 両者はリン酸塩緩衝液を加え最終体積２mlとし
100×ｇにて５分間遠心した。上清をとり除き、
細胞は１mlの緩衝液に懸濁した。サブセツトの分
析はペクトンデイキンソンアンドカンパニーの２
色のケイ光検出システムをもつたFACSアナライ
ザーにより実施された。両者のサンプルは毎秒50
個の白血球細胞の速度でFACSアナライザーを通
過させた。デジタルデータの獲得のための引き金
としては、緑色および赤色ケイ光敷居値の組合せ
による、非排他的OR理論によつた。ケイ光強度
に対する細胞数のヒストグラムは図２ａに示す如
くND６４パルスハイトアナライザーを使用し作
り出した。緑色および赤色ケイ光における最も明
確なポピユレーシヨンはアンチ−Leu3およびア
ンチ−Leu−２染色細胞である。医療の診断にお
いてそれらの比が問題である。典型的な血液サン
プルについて、未溶解の全血液サンプル（9266個
の細胞の分析により）ではLeu−３／Leu2の比
2.6が、また、溶解分離したサンプル（17937個の
細胞の分析により）では同比2.9が見い出された。 図２ｂは、通常用いられる体積あるいは散乱刺
激を用い、同じサンプルについて得たデータを示
す。白血球細胞に比して赤血球が過剰であるため
に、ヒストグラムに赤血球のケイ光だけがみられ
る。 実施例 ２ ヒト血液は実施例１と同様に得た。5μのア
ンチ−Leu−3a−PEと5μのアンチ−Leu−2a
−FITCを12×75mmの試験管に入れ、0.1％のアジ
化ナトリウムを含むリン酸緩衝液生理食塩水を加
え、体積の合計を50μとした。これらの抗体に
50μの未溶解血液を加えた。この混合物を４℃
で30分間インキユベートした。緩衝液を加え合計
１mlの体積とし、次にエキサイトン（Exciton）
社のレーザー染色剤LDS751（Dayton OH）の飽
和メタノール溶液4μを加えた。このサンプル
は、励起用の488nmアルゴンイオンレーザーおよ
びケイ光検出用の３個だけの光電倍増管を備えた
FACSフローサイトメーターで毎秒200個の速度
で分析された。白血球のLDS751のケイ光はデー
タ獲得のためゲートとして用いた。データは
FACS Consort 30データシステムを使用し、セ
ルリスト形式でセルに保存された。アンチ−Leu
−2a−FITCおよびアンチ−Leu−3a−PEで染色
した細胞は明確に同定することができることを図
３は示している。 実施例 ３ ヒト血液は同様に入手した。染色は抗体として
アンチ−HLe−１−FITCおよびアンチ−Leu−
3a−PEを用い実施例２と同様に実施した。アン
チ−HLe−１はすべての白血球に対して特異的
なモノクロナール抗体である。サンプルは細胞を
200×ｇで遠心しそれを１mlの緩衝液に再度懸濁
させることにより１回だけ洗浄した。分析は
FACS装置を使用し毎秒500ないし1000個の標識
した白血球細胞を流すことにより実施した。ケイ
光はアルゴンイオンレーザーを用い488nmで励起
した。HLe−１−FITCで染色した白血球のケイ
光を刺激シグナルとして用いた。図４は白血球サ
ブセツトが明確に同定できることを示している。
アンチ−HLe−１はケイ光強度により白血球を
３つのサブセツトに分けることに注目して欲し
い。独立した実験によりこれらのサブセツトは顆
粒細胞、単核細胞およびリンパ球と同定された。 下側左手の角の点線プロツトのポピレーシヨン
は赤血球を表わしている。アンチ−HLe−１−
FITCのケイ光に基づく赤血球と白血球の優れた
分離を示すために短時間の分散刺激時間を用いこ
れらの点々を作り出した。 実施例 ４ 染色操作は実施例３と同様に行なつた。しかし
ながら、３種の抗細胞表面モノクローナル抗体
（これらはそれぞれ自分自身の発色団で標識され
ている）を染色に用いた。テキサス−レツドを検
出するために、アルゴンイオンレーザーおよび
590nmにセツトしたアルゴンイオンポンブド染料
レーザーの２つのレーザーを備えたFACSフロー
サイトメーターを用いた。図５ａおよび５ｂはア
ンチ−HLe−１−FITCおよびアンチ−Leu−2a
−PEおよびテキサス−レツドのついたアンチ−
Leu−3aについて得られたパターンを示す（FL1
はFITC、FL2はPE、SSCはテキサス−レツドで
ある）。図５ｃおよび５ｄはアンチ−HLe−１−
FITCのみで染色されたコントロールサンプルの
パターンを示す。 表１は、単核細胞についての情報を得るため
に、本発明の方法により得たパーセントデータを
血液溶解法およびフイコールパク（Ficoll
Paque）分離法により得たパーセントデータと比
較する。この比較により本発明の方法はフイコー
ルパクデータおよび溶解法（この２つの方法はリ
ンパ球サブセツトの分析法として十分に確立され
ており認められている）に匹適することが示され
る。 【表】

【図面の簡単な説明】

第１図は、フロー流路中の粒子の多数のサブポ
ピユレーシヨンについてのケイ光の測定に有用な
フローサイトメトリー装置の光学要素および光の
経路の具体例の一例の模式図であり、第２図ない
し第５図は、本発明の原理により、白血球細胞と
未溶解の赤血球細胞を含む血液サンプルをフロー
サイトメーターを通過させることにより測定し
た。白血球細胞のサブポピユレーシヨンの検出の
定量の結果のグラフであり、第２図ａおよびｂは
実施例１における結果、第３図は実施例２におけ
る結果、第４図は実施例３における結果、そして
第５図ａないしｄは夫々実施例４における結果の
グラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ フローサイトメトリー法によつて血液細胞の
   あるサブクラスの細胞を他のサブクラスの細胞と
   の関連において固定及び計数する方法であつて、
   以下の工程： (イ) 血液試料からアリコートを調整し； (ロ) 上記アリコートを、血液細胞の第１のサブク
   ラスの細胞と選択的に反応し、適当な刺激に対
   して測定可能な物理的応答を有する第１の標識
   剤とインキユベートすることにより血液細胞の
   第１のサブクラスの細胞を選択的に標識し； (ハ) 上記アリコートを、血液細胞の第２のサブク
   ラスの細胞と選択的に反応し、適当な刺激に対
   して測定可能な物理的応答を有する第２の標識
   剤とインキユベートすることにより血液細胞の
   少なくとも一つの第２のサブクラスの細胞を選
   択的に標識し； (ニ) 上記アリコートに、実質的に一度に一個ず
   つ、上記第１及び第２の標識剤の両方に対して
   適切な刺激を与え、上記第１及び第２の標識剤
   によつて与えられる測定可能な物理的応答を検
   出し、かかる検出によつて与えられるデータで
   あつて、上記標識剤の少なくとも一つにより分
   析すべき細胞に付与された物理的応答の強さに
   よつて定められる物理的応答の値の閾値を超え
   る所定範囲のものに限定されるデータを取得す
   ることによつて上記アリコートを分析し； (ホ) 上記第１及び第２の標識剤の測定可能な物理
   的応答の発現に基づいて上記細胞の第１のサブ
   クラスの細胞を上記第２のサブクラスから識別
   する； を含むことを特徴とする上記方法。 ２ 上記の第１及び第２の標識剤が、光学的刺激
   に対する所定のケイ光応答を有するものである特
   許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３ 上記アリコートを、光学的刺激の領域を通し
   て通過させ、上記第１の標識剤及び上記第１の標
   識剤から発光される光を検出することによつて分
   析する特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ４ 上記血液細胞の第１のサブクラスが白血球細
   胞の一つの組（set）であり、上記第２のサブク
   ラスが該組中の白血球細胞の一つの群（group）
   である特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ５ 上記第１及び第２の標識剤が、抗体、レクチ
   ン、核酸染色剤及び膜電位染色剤からなる群から
   選択されるものである特許請求の範囲第１項に記
   載の方法。 ６ 上記第１及び第２の標識剤がモノクロナール
   抗体である特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ７ 上記第１及び第２の標識剤からなる群の少な
   くとも一つが、分析すべき細胞のサブクラスの特
   有の抗原決定基と反応性を有するものである特許
   請求の範囲第１項に記載の方法。 ８ 上記第１のサブクラスが、有核細胞、白血球
   細胞、リンパ球、顆粒球細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞及
   びNK／LGL細胞からなる群から選択されるもの
   であり、上記血液細胞の第２のサブクラスが、リ
   ンパ球、顆粒球、単核細胞、ヘルパーＴ細胞、イ
   ンデユーサーＴ細胞、サプレツサーＴ細胞、細胞
   障害性Ｔ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、成熟／活性期Ｔ
   細胞、成熟／活性期Ｂ細胞、成熟／活性期単核細
   胞、好中球、好塩基性細胞、好酸球及び成熟／活
   性期顆粒球細胞及び成熟／活性期NK／LGL細胞
   からなる群から選択されるものである特許請求の
   白血球細胞第１項又は第６項に記載の方法。 ９ 上記アリコートを、血液細胞の第３のサブク
   ラスの細胞と選択的に反応し、適当な刺激に対す
   る測定可能な物理的応答を有する第３の標識剤と
   インキユベートすることによつて、血液細胞の少
   なくとも一つの第３のサブクラスを選択的に標識
   する特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の方
   法。 １０ 上記第３の標識剤が光学的刺激に対する所
   定のケイ光応答を有するものである特許請求の範
   囲第９項に記載の方法。 １１ 上記第３の標識剤モノクローナル抗体であ
   る特許請求の範囲第１０項に記載の方法。 １２ 上記標識剤の一つが核酸染色剤である特許
   請求の範囲第１１項に記載の方法。 １３ 上記標識剤が、抗体、レクチン、核酸染色
   剤及び膜電位染色剤から選択されるものである特
   許請求の範囲第９項に記載の方法。 １４ 上記標識剤が、フイコエリスリン、フルオ
   レセインイソチオシアネート、テキサスレツド、
   アロフイコシアニン、Ｒ−フイコシアニン及び
   LDS−741からなる群から選択されるマーキング
   剤でマーキングされている特許請求の範囲第２項
   に記載の方法。 １５ 上記のアリコートを、白血球細胞が毎秒約
   20〜約2000個の速度で光学的刺激の領域を通して
   通過させる特許請求の範囲第３項に記載の方法。 １６ 上記第１及び第２のサブクラスが白血球細
   胞及びそのサブクラスであり、上記第１及び第２
   の標識剤がケイ光マーキング剤に結合したモノク
   ローナル抗体である特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。 １７ 上記第１、第２及び第３のサブクラスが白
   血球細胞及びそのサブクラスであり、上記第１、
   第２及び第３の標識剤からなる群の少なくとも一
   つがモノクローナル抗体である特許請求の範囲第
   ９項に記載の方法。 １８ 上記インキユベート工程が順次行われる特
   許請求の範囲第１項に記載の方法。 １９ 上記インキユベート工程が同時に行われる
   特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ２０ 上記アリコートが、血液細胞のいかなるサ
   ブクラスをも溶解又は分離することなく分析され
   る特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ２１ 上記標識剤の上記測定可能な物理的応答の
   少なくとも一つが、細胞の上記サブクラスの少な
   くとも一つに関連する物理特性によつて与えられ
   る特許請求の範囲第１項に記載の方法。