JPH0476450A - 電気泳動用支持体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、高分子微多孔性皮膜からなる電気泳動用支持
体に関するものであり、特に血清蛋白の分画又は分析に
好適な電気泳動用支持体に関するものである。

し従来の技術］ 電気泳動法は荷電物質の分離、精製に用いられており、
特に蛋白質の分離、分画に有用な方法である。電気泳動
法には一般の電気泳動法の他に不連続緩衝液系を用い、
分離を行うディスク（Ｄｉｓｃ）電気泳動法、免疫拡散
反応によって分離、検出を行う免疫電気泳動法、ｐＢ勾
配を電極間に形成させ、そのｐｎ勾配の中で分離、分画
を行う等電点分画法等の方法がある。

血清蛋白の分画は臨床検査の分野で広く行なわれており
、この目的のために、セルロースアセテートなどの高分
子を主成分とした微多孔性皮膜からなる電気泳動用支持
体が多数用いられている。

高分子微多孔性、支持体としてセルロースアセテート微
多孔性膜を用いて血清蛋白を電気泳動により分画する方
法として、濃度０．０３〜０．０８ｔ＃／Ｌ、　ｐＨ８
，６の緩衝液に微多孔性膜を浸漬した後、血清を微多孔
性膜表面に塗布し直流電流を印加し蛋白質を電気泳動さ
せて分画後、蛋白質を染色する方法がある。染色用染料
として、ボンソー−３１１，ボンソー−５゜ニグロシン
、アミドブラック、クマシーブリリアントブルー等の染
料が用いられる。このようにして得られた分画染料像は
通常５つの分画に分かれており、陽極側から順にアルブ
ミン分画、α、グロブリン分画、α２グロブリン分画、
βグロブリン分画、γグロブリン分画と命名されている
。

血清蛋白は、電気泳動分析の上では大きく５つの分画に
分けられるが、５つの分画の各々が、同一の化学成分に
属するものではなく、たまたま電界による易動度といる
点で、５つに分けられたのであって、化学構造的には全
く異なる種別に属する成分が１つの分画に共存するにす
ぎない。例えば、βグロブリン分画にはグロブリン成分
のほかに、コレステロール（遊離コレステロールとエス
テル型コレステロール）とアポ蛋白（含有量乾燥ｆｆｆ
ｆ１で約１８％〜約２２％）を含む複合体であるＬＤＬ
（低比重リボ蛋白）が共存する。またα２グロブリン分
画には、グロブリン成分のほかに、コレステロール（遊
離コレステロールとエステル型コレステロール）とアポ
蛋白（含有量乾燥ｆｉｆｆｉで約６％〜約１０％）を含
む複合体であるＶＬＤＬ（超低比稍リボ蛋白）が共存す
る。

電気泳動による血清蛋白の分画は血清中の蛋白質を、化
学構造的に、単純明解に５系統に分類するものではない
が、臨床検査の一次スクリーニングとして、先づ５つの
分画にわけ、それぞれの分画値が正常値と大きく異った
値か否かを確認するために行なわれるものである。−次
スクリーニングとして先ず上記の５分画の検査を行った
上で、問題のある結果が得られたら、更に精密な蛋白検
査が実施されるのが常である。

血清蛋白の分画又は分析に好適な微多孔性電気泳動用支
持体として、特公昭５５−３１４１８には、電気浸透度
０＋ｕｉ〜＋１０ｍｍ、平均孔径０．１μ酋〜ｌＯμ簡
の等電点分画用に適した微多孔性電気泳動膜が記載され
ている。この電気泳動膜の例として、電気浸透度調節剤
として、セルロースエーテル（ヒドロキンメチルセルロ
ース）、ノニオン界面活性剤（アルキルフェニルエーテ
ル）、可塑剤として、トリアセチンが添加された微多孔
性電気泳動膜がある。また、特開平０１−２２７０５５
には、ｉＩ電気浸透度０ＩＩＩ未満〜−３１Ｊ平均孔径
０．２μ■〜５μ■１表面の平均孔径１０μｌ〜３０μ
■であり、血清試料の塗布点（原点）がγグロブリンの
泳動位置より外側になる、蛋白の泳動像の分離が良好な
微多孔性電気泳動膜が記載されている。この電気泳動膜
の例として、電気浸透度調節剤トして、ヒドロキシエチ
ルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロ
キシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール
、可塑剤として、トリアセチンが添加された微多孔性電
気泳動膜がある。

［従来の技術の問題点］ 近年、自動分析機器により、検査結果をコンピューター
からデジタル又はアナグロアウトプットして読み取る方
法が普及している。自動読み取り法は病態を更に正確に
よみとれるという利点がある反面、通常血清蛋白を６分
画に分類している中で、わずかの変動により余分なピー
クが発生したり、ピークの間隔が不揃いになると、自動
処理によるパターン認識の面で混乱が生じ、誤った読み
取りをすることがある。従って、多少の変動やピーク間
隔の不揃いが生じても一次スクリーニングを目的とした
血清分画では、殆ど全ての血清に関して識別しやすい５
分画になるような分画性を持つ電気泳動用支持体の開発
が望まれている。

ＶＬＤＬやＬＤＬの場合（各々プレβリボ蛋白、βリボ
蛋白と呼ばれる）、含有量の多少により分画される位置
が異ってくる。例えば、α２グロブリン分画く第３分画
）とβグロブリン分画（第４分画）の開にβリボ蛋白の
分画（第６分画）が生じ、しかもβリボ蛋白の分画は、
βリボ蛋白の含有量に応じて　α２グロブリン分画（第
３分画）とβグロブリン分画（第４分画）の間で位置が
変動する、すなわちβリボ蛋白の含有ｍが少ないと　α
２グロブリン分画に含まれるが、βリボ蛋白の含有量が
増大すると　α２グロブリン分画とβグロブリン分画の
間に独立の分画となって現れる。このように第６番目の
分画が現われると、５分画を原則とした検査結果を判断
するのに障害になることが多い。

この障害は、例えば特開昭６３−２６２５４９に記載の
孔径分布範囲０．１μ−〜２．０μ冒の微多孔性高分子
皮膜からなる電気泳動用支持体、特開昭６３−２６２５
５０に記載の特定の湿潤剤又は可塑剤を高分子の重量に
対して２０％以下の割合で添加した微多孔性高分子皮膜
からなる電気泳動用支持体によって改善されたが、まだ
解決されたとは言い難い状況であった。

さらに、これらの電気泳動用支持体によってもなお分離
された蛋白のピーク間隔の下指いは充分に解消されない
ままであった。

また、特公昭５５−３１４１８、特開平０１−２２７０
５５に記載の微多孔性電気泳動膜も、［気浸透度は小さ
い（前者）又は充分に小さくはない（後者）が、いずれ
も。

電気泳動分離された蛋白の各分画について隣接するピー
ク間の距離が等間隔でな（不揃いであった。

分離された蛋白のピーク間隔の不揃いは、電気泳動パタ
ーンの読取り・識別を行ない難く、検査結果を判断する
のに障害になることが多い。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明の目的は生物体液に含まれる諸種の蛋白の分画・
分析に広く適用できる電気泳動用支持体を提供すること
にあり、特にβリボ蛋白を多く含む血清についても、β
リボ蛋白による６番目の分画による余分なピークが発生
せず、かつ分離された蛋白のピークの間隔の不揃いが生
じない電気泳動用支持体を提供することにある。

本発明の他の目的は取り扱い操作の容易な実質的に乾燥
した電気泳動用支持体を提供することにある。

［問題点を解決するための手段］ 本発明は、添加剤としてヒドロキンプロピルセルロース
、トリフェニルホスフェート又はトリクレシルホスフェ
ートを含有し、電気浸透度が０１１ｍから＋１０ｍｍの
範囲内にあることを特徴とする高分子微多孔性皮膜から
なる電気泳動用支持体である。

［発明の構成の詳細な説明コ 本発明の高分子微多孔性皮膜からなる電気泳動用支持体
は、特公昭５５−３１４１８．特開昭６３−２６２５４
９．特開昭６３−２６２５５０及び特開平０１−２２７
０５５に記載の高分子微多孔性皮膜からなる電気泳動用
支持体を改良したもので、その特徴は、電気浸透度をＯ
ｓｍから＋１０ｍ５の範囲内に調節するための添加剤と
して、ヒドロキシプロピルセルロース、トリフェニルホ
スフェート又はトリクレシルホスフェートを含有する点
にある。本明細書における電気浸透度の定義は、特公昭
５５−３１４１８明細書に記載の定義による。

本発明の高分子微多孔性皮膜からなる電気泳動用支持体
は実質的に乾燥した皮膜で、厚さ約５０μ閣から約３０
０μｍ、好ましくは約１００μ−から約２００μ簡、最
も好ましくは約１００μ−から約１５０μ網の範囲であ
る。微孔の孔径範囲は約ｏ、ｉμｍから約ｌθμ園、好
ましくは約０．１μ園から約２．０μＭの範囲である。

微孔のしめる空隙率は約５０％から約９０％、好ましく
は約６０％から約８５％の範囲である。

本発明の微多孔性皮膜からなる電気泳動用支持体は、特
公昭５５−３１４１１１．特開昭５０−１２２５６．特
開昭５５−７６３６０、特開昭６３−２６２５４９、特
開昭６３−２６２５５０等に記載の公知の方法に従って
製造することができる。

高分子微多孔性皮膜を構成する高分子成分として、ニト
ロセルロース、セルロースアセテート（セルロースジア
セテート、セルローストリアセテート等）、セルロース
アセテートブチレート、セルロースプロピオネートの如
きセルロースエステル、ポリアミド樹脂、ポリ塩化ビニ
ル樹脂等がある。高分子成分はＩＦＪ単独で、又は２種
以上混合して用いることができる。これらの高分子成分
の中でもセルロースエステルおよびポリアミド樹脂が好
ましく、セルロースアセテート（セルロースジアセテー
ト、セルロー、ストソアセテート）は最も好ましい。

高分子微多孔性皮膜からなる電気泳動用支持体の電気浸
透度がＯｍｌから＋１０ｍｍの範囲内にするための添加
剤として用いられるヒドロキシプロピルセルロースとし
て、ヒドロキンプロピル基の含有爪約５５％から約７５
％の範囲のものがある。ヒドロキシプロピルセルロース
、トリフェニルポスフェート又はトリクレシルホスフェ
ートのいずれが１種を用いてもよいし、これら３種のう
ちの任意の２種又は３種を併用してもよい。ヒドロキシ
プロピルセルロース、トリフェニルホスフェート又はト
リクレシルホスフェートの含有量（２Ｆ！以上併用の場
合にはその合計量）は高分子微多孔性皮膜を構成する高
分子成分に対して、重量比で、約０．１％から約３．０
％の範囲、好ましくは約０．２％がら約２．５％の範囲
である。

高分子微多孔性皮膜には、皮膜に柔軟性をもたせるため
に、公知の可塑剤又は湿潤剤を含有させることができる
。可塑剤又は湿潤剤の含有量は高分子成分に対して、ｆ
ｆｆｆ１比で、約１％〜約２０％の範囲である。有用な
可塑剤又は湿潤剤の例として、エチレングリコール、ジ
エチレングリコール、プロピレングリフール、テトラメ
チレングリコール、グリセロールモノアセチルエステル
のようなジオール類、グリセロール、拘樽酸トリエチル
、拘樽酸トリプチル、拘樽酸トリメチル、蓚酸ジエチル
、蓚酸ジプロピル、トリブチリン（グリセロールトリブ
チレート）、トリアセチン（グリセロールトリアセテー
ト）、琥珀酸ジエチル、琥珀酸ジブチル等がある。

微多孔高分子皮膜の製造方法について説明する。

まず高分子成分を溶剤と添加剤（ヒドロキシプロピルセ
ルロース、トリフェニルホスフェート又はトリクレシル
ホスフェート）、さらに所望により添加される可塑剤又
は湿潤剤成分を後述する混合溶剤に実質的に一様に溶解
する。得られた溶液は前記諸特許明細書等に記載の公知
の方法に従って微多孔性皮膜を調製する。例えば、−様
な溶液を平滑表面の仮支持体の上に流延塗布し、コント
ロールされた温度のもとで乾燥させ、形成された皮膜を
仮支持体から剥離することにより微多孔高分子皮膜が得
られる。

混合溶剤とは、親溶剤、貧溶剤および非溶剤の３者を混
合した混合溶剤をいう。ここで親溶剤とは高分子成分を
溶解するものをいい、貧溶剤とは親溶剤とは相溶性があ
るが、実質的に高分子成分を溶解させず、膨潤させるの
みで、しかも親溶剤よりも沸点の高いものをいい、非溶
剤とは親溶剤又は貧溶剤と相溶性があるが、高分子成分
を溶解も膨潤もしないもので、かつ親溶剤より沸点の高
いものをいう。

親溶剤の具体例をあげると１例えば、セルロースアセテ
ートに対して塩化メチレン、アセトン、蟻酸メチル等、
ニトロセルロースに対して、ジエチルエーテル、酢酸メ
チル、アセトン、酢酸等、ポリアミド樹脂に対して、メ
タノール、エタノール等がある。

貧溶剤の具体例をあげると、例えば、セルロースアセテ
ートに対して、テトラヒドロフラン、メタノール等、ニ
トロセルロースに対して、ブタノール、エタノール等、
ポリアミド樹脂に対して、テトラヒドロフラン、ジオキ
サン、酢酸エチル等がある。

非溶剤としては多くの場合水が用いられる。

溶剤についての親溶剤、貧溶剤、非溶剤の区別は必ずし
も一義的なものではない。上述の製造法は本発明の電気
泳動用支持体を得るための１例である。

溶媒の使用法、特に親溶剤、貧溶剤の使用法に関しては
特公昭５５−３１４１８、特開昭５０−１２２５６５．
特開昭５１−７６３６０等の明細書に記載の手法を応用
することができる。

本発明の電気泳動用支持体に用いられる高分子微多孔性
皮膜の孔径分布範囲は、Ｅ、Ｗ、Ｗａｓｈ　Ｂａｈｎ著
ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．Ｊ（
１）、１１１５（１９２１）、慶伊富長著共立全書１５
７「吸着Ｊ（１３０頁）、近藤連−著「多孔材料」（技
報堂、　１９７３年）、「化学工学Ｊ３１巻６〇−６６
頁（１９６７年）等に記載の水銀厚入法で測定された値
である。孔径分布範囲は約０．１μ調から約１０μ閣の
範囲、好ましくは約０．１μ閣から約２．０μ嘗の範囲
に９７％の径が収まるものを用いることができる。

ここで孔径分布とは水銀圧入法により得られた孔径−累
積率表により、累積率が３％から９７％の範囲に相当す
る孔径範囲を意味する。

「ワ園 実施例１〜３及び比較例１〜３ ［高分子微多孔性皮膜の調製］ 下記の組成の実質的に一様な溶液を調製し、各溶液を表
面が平滑表面のガラス板（仮支持体）の上に厚さ１ｍｍ
１こ流延し、２５℃で乾燥し、皮膜の全面がほぼ一様に
白くなった時にガ、ラス板から剥ぎとり、枠にはってさ
らにｔ　ｏ　ｏ　’ｃで１時間乾燥して微多孔性皮膜を
調製した。得られた微多孔性皮膜はいずれも乾燥厚さ約
１５０μ鴎、孔径範囲０．１μ＋！〜２．０μ簡の範囲
にあった。また、微多孔性皮膜の電気浸透度の測定値は
第１表に記載のとおりであった。

溶液の組成（※は第１表に記載のｍ） セルローストリアセテート はセチル基含有Ｊ１４３．５％）　　　　　　　３ａｇ
セルロースジアセテート （アセチル基含有量３９．４％）　　　゛３０ｇグリセ
ロール　　　　　　　　　　　　　４．２ｇトリブチリ
ン（ＴＢ）　　　　　　　　　　　　　　４．８ｇトリ
アセチン（ＴＡ）　　　　　　　　　　　　　　※トリ
フェニルホスフェー）　（ＴＰｈＰｈ）　　　　　　※
メチレンクロリド　　　　　　　　　　　６００ｇメタ
ノール　　　　　　　　　　　　　　２８０ｇ水 ４０ｇ ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）（ヒドロキシ
プロピル基含有ｆｉ１６４．０％）ヒドロキシエチルセ
ルロース（ＩＩＥｃ）（ヒドロキシエチル基含有量４０
％） メチルセルロース（ＭＣ） （メトキシ基含有量２９．８％） ※ ※ ※ ［性能評価試験コ 実施例１〜３及び比較例１〜３で調製した微多孔性皮膜
４種を７０＊ｖＸ　２００ｍ＋ｎのサイズに裁断し、そ
れぞれにｐｌｌｌｌ、６の０．０７ＭへＯナールｐｌ＋
緩衝水溶１（ｌ（２，３０ｇのベロナールと１１．８０
ｇのベロナールナトリウムを蒸留水に溶解し、全量を２
５°Ｃで１０１００Ｏにしたもの）を含浸させ、これら
の皮膜を同じ緩衝液を充填した電気泳動槽にセットし、
濾紙をブリッジとして載置した。マイクロピペットで、
線状に１０ｍｍにわたり全ｆｆ１０．１μ１２のヒト血
清を微多孔性皮膜の陰極端から１５＋＋ｍの距離に塗布
した。皮膜面に沿って血清の塗布線と垂直な方向（７０
■の幅方向）に０．６１＾／ｃＩＲの直流定電流を４０
分印加して血清蛋白を電気泳動し、泳動後皮膜をボンソ
ー−３Ｒ染色液（ボンソー３Ｒ３ｇ、トリクロロ酢酸６
ｇ、水９１ｇの組成比の染色水溶液）に６０秒浸漬して
染色し、１％酢酸水溶液で２分間ずつ４回洗浄した。洗
浄後皮膜の両面に濾紙をあてて洗浄液を吸い取った後、
皮膜を風乾した。

風乾後、血清蛋白の泳動パターンを観察したところ、全
ての微多孔性膜において蛋白分画の数は５で、βリボ蛋
白による６番目の分画は出現していなかった。染色され
た泳動パターンの光学濃度変化をデンシトメーターによ
りを測定したところ、泳動パターンは第１図に示す５つ
のピーク（それぞれＡＬＢ、α１．α２．β、γという
）に明確にわかれた。

第１図に示すように、５分画された血清蛋白の泳動パタ
ーンの光学濃度変化曲線について、分離性能の良／不良
を次のように定義する。

分画＾ＬＢ、α１、α２．β　のピーク間隔ＡＬＢ−α
１、α、−α２．α２−β　それぞれの間隔の相対比が
、１・１・ｌに近いときに分離性能が良いとする。

本発明の電気泳動用支持体において改良される分離性能
は、ピーク間隔ＡＬＢ−α１、α１−α２、α２−β　
がほぼ−様に揃うことである。

第２表に実施例１〜３及び比較例１〜３の微孔性多孔膜
についてのピーク間隔の相対比を示す。

第２表 に残った跡（塗布残渣）を観察したところ、本発明であ
る実施例１〜３の微多孔性電気泳動膜では残渣がほとん
ど見られなかったのに対し、従来技術である比較例１〜
３の微多孔性電気泳動膜では残渣が多ｍに観察された。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１〜３（本発明）及び比較例１〜３（従
来技術）による微多孔性皮膜を用いてヒト血清を電気泳
動し染色して得られた泳動パターンの光学濃度変化をデ
ンシトメーターによりを測定した光学濃度変化曲線の模
式図である。曲線は血清蛋白成分＾ＬＢ、α１．α２、
β、γのピークとピーク間隔＾ＬＢ−α１．α１−α２
、α２−βを表わす。 第２表のピーク間隔の相対比の値から本発明による微孔
性多孔膜（実施例１〜３）が従来技術である比較例１〜
３による微孔性多孔膜に比べＡＬＢ−α１、α１−α２
．α２−βそれぞれのピーク間隔の相対比がｌ：　１：
　Ｉに近く１分離性能が良いこと明らかである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）添加剤としてヒドロキシプロピルセルロース、ト
   リフェニルホスフェート又はトリクレシルホスフェート
   を含有し、電気浸透度が０ｍｍから＋１０ｍｍの範囲内
   にあることを特徴とする高分子微多孔性皮膜からなる電
   気泳動用支持体。
2. （２）前記高分子微多孔性皮膜をなす高分子がセルロー
   スエステル、ポリアミド、ポリ塩化ビニルからなる群か
   ら選択された少なくとも１種の高分子であり、前記添加
   剤の高分子に体する含有量が重量比で０．１％から３．
   ０％の範囲である請求項１に記載の電気泳動用支持体。