JPH0476580B2 - - Google Patents

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JPH0476580B2
JPH0476580B2 JP61007167A JP716786A JPH0476580B2 JP H0476580 B2 JPH0476580 B2 JP H0476580B2 JP 61007167 A JP61007167 A JP 61007167A JP 716786 A JP716786 A JP 716786A JP H0476580 B2 JPH0476580 B2 JP H0476580B2
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light
emission
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JP61007167A
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Bii Wagunaa Danieru
Ei Batsufui Robaato
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Becton Dickinson and Co
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Becton Dickinson and Co
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Publication of JPH0476580B2 publication Critical patent/JPH0476580B2/ja
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Description

【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野） 本発明は被分析体のイムノアツセイ法およびそ
れに用いる材料、より詳細には結合画分および遊
離画分の分離を必要としないイムノアツセイ法お
よびそれに用いる材料に関する。 （従来技術） 流体中のある物質の濃度を測定するための迅速
なかつ高感度の多種多様なアツセイ系が開発され
ている。イムノアツセイ法は特定の抗体に対する
抗原またはハプテンの結合によるものであり、こ
れらは高水準の特異性および感度を与えるので特
に有用である。これらのアツセイ法では一般に上
記試薬のうち１種を標識された形で使用し、この
標識された試薬はしばしばトレーサーと呼ばれ
る。イムノアツセイ操作は溶液中でまたは固体支
持体上で行うことができ、不均質であつてもよ
く、均質であつてもよい。不均質アツセイ法で
は、結合したトレーサーを遊離の（結合していな
い）トレーサーから分離する必要がある。均質ア
ツセイ法は分離工程を必要とせず、従つて不均質
アツセイ法よりも迅速性、簡便性、および自動化
の容易さの点で著しく有利である。 ラジオイムノアツセイ（RIA）法では放射性同
位体を標識として使用し、高水準の感度および再
現性を与え、多数の試料を迅速に処理するための
自動化を行いやすい。しかし、測定されるパラメ
ータ（核の壊変）をアツセイ条件または成分の変
更により制御し得ないため、RIA法はすべて分離
工程を必要とする。さらに、同位体は高価であ
り、保存寿命が比較的短かく、高価で複雑な装置
を必要とし、それらの取扱いおよび廃業に関して
種々の安全性基準に従わなければならない。 酵素もイムノアツセイにおける標識として用い
られている。酵素イムノアツセイ（EIA）は均質
となすことが可能であり、放射能に対する警戒の
必要がない。酵素と蛋白質の結合は通常簡単であ
り、生成する蛋白質−酵素結合体は一般に安定で
ある。しかしEIAは、酵素結合体とある物質が反
応して発色し、これを測定することによるもので
あり、従つて酵素基質を供給するという付加的な
工程を必要とする。さらに発色するのに十分な時
間が与えられねばならず、色彩の変化を測定する
ための分光光度計を備えなければならない。 RIAまたはEIAに付随する上記の欠点のうちの
幾つかは、イムノアツセイにおける標識として、
螢光色素を用いることにより克服された。螢光イ
ムノアツセイ（FIA）は標識を直接に検出し、容
易に均質アツセイ操作に適用できる。しかし有機
螢光色素、たとえばフルオレセインまたはローダ
ミン誘導体を用いる既知の均質FIA法は、主とし
てアツセイ媒質中に懸濁した不純物による光の散
乱のため、またはアツセイ媒質中に存在する他の
螢光物質からのバツクグラウンド螢光放出のた
め、RIAまたはEIAがもつ高い感度を達成しなか
つた。散乱は短かい（50nm以下）ストークスシ
フト（吸光と発光の波長の差）をもつ螢光色素に
ついては特に問題である。たとえばイソチオシオ
ン酸フルオレセインのストークスシフトはわずか
20〜30nmである。アツセイ媒質が血清である場
合に特にバツクグラウンド螢光が問題となる。血
清中におけるアツセイの感度は緩衝液中における
同等のアツセイに比べて100分の１倍までも低下
する可能性がある。 時間分解螢光イムノアツセイ（time−resolved
fluoroimmunoassay、TR−FIA）の開発はこれ
らの問題の克服に寄与した。この方法では、螢光
発光減衰時間の比較的長い螢光色素標識を光のパ
ルスで励起し、そしてあらかじめ定めた時間（遅
れ）ののちこの標識からの螢光発光を測定する。
減衰時間の短かいバツクグラウンド発光（一般に
10n秒以下）はこの遅れの間に本質的に消失し、
このため標識からの特異的な発光の測定を妨害す
ることはない。TR−FIAは螢光標識が100〜
1000n秒の減衰時間および大きいストークスシフ
ト（100nm以上）をもつ場合にきわめて有効であ
る。 TR−FIAの要件に適合する一群の標識はラン
タニドキレート類である。ランタニドイオン、特
にユーロピウムおよびテルビウムのイオンは有機
リガンド、特にβ−ジケトンとストークスシフト
の大きい（250nmに及ぶ）高螢光キレートを形成
する。このキレートのリガンド部分が励起光線を
吸収し、吸収されたエネルギーをキレート形成金
属イオンへ伝達する。この金属イオンがエネルギ
ーを減衰時間の著しく長い（１ｍ秒）の螢光とし
て放出する。ランタニドキレートをTR−FIAに
用いることについての考案はアナリテイカル・バ
イオケミストリー、137、335（1984）に示されて
いる。 米国特許第4058732号明細書（ウイーダー）に
は、分析的螢光分光分析法においてランタニドキ
レートを使用し、時間分解するための方法および
装置が示されている。 米国特許第4283382号明細書（フランクら）に
は、ランタニドキレート標識をポリマービーズ格
子内へ取込んで、水により起こされる標識の螢光
発光の消失を除くことによるTR−FIAの改良法
が示されている。 米国特許第4734120号明細書（ソイニら）には、
ランタニド、β−ジケトン、およびキレートを蛋
白質に結合させるために有用な官能基をもつアミ
ノポリカルボン酸同族体の１：１：１キレートに
より達成されるランタニドキレートの安定性の増
大が示されている。 欧州特許出願EP 0064484−A2明細書には、測
定すべき物質をアミノカルボン酸同族体によりラ
ンタニドに結合させ、インキユベーシヨンののち
このランタニドを測定すべき物質から離脱させ、
β−ジケトンにキレート結合させたのち検出する
ことによるTR−FIA法が示されている。 以上の各方法によりFIAは改良されたが、結合
画分と遊離画分を分離する必要なしに迅速に実施
しうる高感度のFIAがなお求められている。 （発明が解決しようとする問題点） 本発明の一観点は、結合画分と遊離画分の分離
を行わない被分析体の固相イムノアツセイ法から
なる。固体支持体の表面に結合した抗−被分析体
を、被分析体を含有する液体、吸光物質、および
被分析体に対するトレーサー（吸光および発光す
る標識が結合したもの）と接触させる。アツセイ
混合物のインキユベーシヨン後に、励起光線を与
え、発光を時間分解により測定する。測定された
発光の大きさを、本質的に等しい条件下で１種ま
たは２種以上の既知量の被分析体を測定した際に
測定された発光の大きさと比較する。 本発明方法の好ましい実施態様においては、標
識は比較的長い減衰時間をもつ蛍光色素であり、
吸光物質はトレーサーの発光帯、より好ましくは
トレーサーの吸光帯及び発光帯の両方と重なる吸
光帯をもつUV化合物である。 本発明方法の特に好ましい実施態様において
は、被分析体は血清試料中にあり、吸光物質はア
リールアミノナフタリンスルホン酸であり、トレ
ーサーは被分析体に付着したポリマー粒子に取込
まれたランタニドキレートであり、トレーサーと
被分析体が不十分な数の抗−被分析体結合部位に
対して競合する。 本発明方法の他の実施態様においては、実質的
にすべての被分析体がサンドイツチアツセイにお
いて抗−被分析体とトレーサーの双方に競合す
る。 本発明の他の観点には、本発明方法を実施する
ための材料のキツトが含まれる。 本発明方法によれば、結合画分と未結合画分を
分離する必要なしに固相TR−FIAが行われ、こ
れにより均質アツセイの操作の簡潔性、迅速性お
よび簡便性が達成される。標識は検出可能な物質
を発生させるための付加的な基質またはインキユ
ベーシヨン期間なしに直接に検出される。本発明
方法は本質的に他の螢光物質からの妨害発光がな
く、これによりきわめて低い濃度で存在する被分
析体を正確に測定することができる高感度の均質
アツセイ法を提供する。本方法は実施するのがき
わめて容易であり、測定の自動化に適用しやす
い。 第１図は本発明方法により競合イムノアツセイ
に用いられる試験管その他の構成部品を示す。 第２図は本発明方法によるジゴキシンアツセイ
の標準曲線である。 第３図は本発明方法によるヒト絨毛性ゴナドト
ロピン（HCG）アツセイの標準曲線である。 （発明の構成） 本発明は種々の形の実施態様により満たされる
が、ここに好ましい実施態様を代表例として詳述
する。ただしこれらの記述は本発明の原理の例示
と考えるべきであつて本発明をここに示す実施態
様に限定することを意図するものでないことは理
解すべきである。本発明の範囲は特許請求の範囲
の記載のおよびその均等範囲により判断されるで
あろう。 本発明方法によれば、流体中に存在するある物
質の濃度を免疫学的反応によつて測定することが
できる。この物質（以下被分析体と呼ぶ）は抗
原、ハプテンまたは抗体のいずれであつてもよ
く、適切ないかなる液体中に存在してもよい。た
とえば液体は緩衝液、食塩液、または体液（たと
えば血清または尿）であつてもよい。場合により
被分析体は体液から分離され、次いで検出のため
に他の液体、たとえば緩衝液に導入されてもよ
い。 ここで用いる“免疫学的反応”という語は、抗
原と抗体、ハプテンと抗体、または同様に特異的
に結合する抗原、抗体もしくはハプテンの適宜な
同族体の特異的結合反応を意味する。 本発明方法の免疫学的反応は固体支持体の表面
で行われる。当該技術分野で知られているよう
に、固体支持体はアツセイを妨害しないいかなる
支持体であつてもよい。使用できる固体支持体の
例はガラスおよびポリマー材料、たとえばポリエ
チレン、ポリスチレンなどである。これらの支持
体はシート、板、穴（well）または好ましくは管
など適宜な形状のいずれに加工されていてもよ
い。本発明のきわめて好ましい実施態様において
は免疫学的反応は一端が閉じられた管、好ましく
はプラスチツク管の内壁または底で行われる。 抗−被分析体を固体支持体の表面に結合させ
る。抗−被分析体は被分析体と特異的に反応する
抗原または抗体であつてもよく、あるいは被分析
体と特異的に反応するこれらの適宜な同族体のい
ずれであつてもよい。固体支持体への抗−被分析
体の結合は常法（たとえば吸着または共有結合）
のいずれによつても行うことができる。これらの
方法は当技術分野で周知であり、本発明を完全に
理解するためにこれらの点についてより詳細な説
明は不必要であると考える。 固体支持体に結合させる抗−被分析体の量は、
実施すべきアツセイの種類による。ここで最初に
述べる競合イムノアツセイ法の場合、限られた量
の抗−被分析体を結合させ、これにより不十分な
結合部位が得られ、後記のように被分析体および
被分析体のトレーサーがこの得られた部位に対し
て競合する。次に述べるサンドイツチアツセイ法
の場合、過剰の抗−被分析体を結合させ、これに
より本質的にすべての被分析体が抗−被分析体に
結合する。 本発明による競合アツセイ法の場合、固体支持
体に結合した抗−被分析体を液体中の既知の量の
被分析体と接触させ、アツセイ媒質を後記のよう
にインキユベートして被分析体と抗−被分析体の
免疫学的反応を誘発する。次いで被分析体に対す
るトレーサーを添加し、後続のインキユベーシヨ
ンを行い、その結果アツセイ媒質は遊離の被分析
体、遊離のトレーサー、結合した被分析体および
結合したトレーサーを含有する。あるいは、好ま
しくは被分析体とトレーサーを同時に添加し、１
回のインキユベーシヨンを行う。固体支持体上の
抗−被分析体に結合した被分析体およびトレーサ
ーを以下結合画分と呼び、抗−被分析体に結合し
ていない被分析体およびトレーサーを以下遊離画
分と呼ぶ。 トレーサーは免疫学的反応の過程を追跡する手
段を提供し、競合アツセイ法においては標識と結
合した既知量の被分析体またはその適宜な同族体
からなる。標識は吸光して発光し、かつ被分析体
に結合しうるいかなる物質であつもよい。好まし
い標識は減衰時間の長い光を発し、きわめて好ま
しくは減衰の長い螢光を発し、これにより競合ト
レーサーをアツセイ系内の他の発光物質により実
質的に妨害されることなく検出することができ
る。きわめて好ましい標識は約280〜375nmの波
長の励起光線を吸収し、約580〜630nmの螢光を
発し、約200〜250nmのストークスシフトを示す。
きわめて好ましい螢光発光の減衰時間は約0.5〜
1.0ｍ秒である。 本発明方法に有用な長い減衰時間の螢光を発す
る標識はピレン誘導体、および好ましくはランタ
ニドキレートである。後者の群の標識は、有機リ
ガンドたとえばβ−ジケトンとキレート結合した
ランタニドイオン、たとえばユーロピウムまたは
テルビウムのイオンのようなランタニドイオンか
らなる。使用できるβ−ジケトンの例は、ベンゾ
イルアセトン、ジベンゾイルメタン、テノイルト
リフルオルアセトン、ベンゾイルトリフルオルア
セトン、ナフトイルトリフルオルアセトン、アセ
チルアセトン、トリフルオルアセチルアセトン、
ヘキサフルオルアセチルアセトンなどである。β
−ジケトンとランタニドイオンのキレート形成
は、これらの試薬を適宜な時間インキユベートす
ることによつて常法により行われる。トレーサー
の製造に用いられるランタニドキレートの量は実
施されるアツセイの種類、および液体中の被分析
体の量に依存し、当業者に周知である。 ランタニドキレート標識を常法により被分析体
に直接に結合させてトレーサーを製造することが
できる。あるいは、好ましくは標識を粒子に取込
ませ、この粒子を被分析体に結合させてトレーサ
ーを得る。粒子はポリマー粒子、たとえばビーズ
であつてもよい。標識を取込ませ、かつ被分析体
に結合させうるポリマーはいずれも使用できる。
好ましいポリマーは励起光線および螢光発光の双
方に対して本質的に透明であり、被分析体以外の
蛋白質（たとえば血清中の他の蛋白質）と実質的
数量の被特異的な表面反応を行わない。標識を取
込むために特に好ましいポリマーはポリアクリレ
ート、たとえばポリメタクリル酸メチルである。 標識は常法により粒子内に取込まれる。たとえ
ば標識を含むポリマー粒子は、標識成分を含有す
る溶液中でモノマーを乳化重合することによつて
製造できる。同様に常法により、好ましくは被分
析体上および粒子表面上の適宜な官能基を共有結
合させることにより、粒子を被分析体に付着させ
る。標識を粒子内に取込み、また被分析体を粒子
に付着させるための常法は当業者に周知でありか
つその理解の範囲内であると思われ、本発明を完
全に理解するためにこれらの要素につきこれ以上
詳述する必要はない。 支持体上の抗−被分析体を含むアツセイ媒質、
被分析体を含む液体、およびトレーサーは、免疫
反応を行わせ、これにより前記の結合画分および
遊離画分を得るのに適したいずれかの温度におい
て、これに適したいずれかの期間インキユベート
される。インキユベーシヨンは約０〜50℃、好ま
しくは約30〜40℃の温度で行うことができ、それ
によりこれらの画分は平衡となるのであろうが、
必ずしも平衡となる必要はない。 吸光物質は免疫学的反応の前又は後にアツセイ
系に添加する。かかる吸光物質は、トレーサーの
発光帯、好ましくは吸光帯及び発光帯の両方と重
なる吸光帯をもち、免疫学的反応を妨害しない物
質であればいかなるものであつてもよい。適切な
吸光物質はたとえばスチルベン類、ベンゾキサゾ
ール類、ナフタリン類、およびそれらの誘導体で
あるが、これらに限定されない。好ましい群はア
リールアミノナフタリンスルホン酸類、たとえば
２−（ｐ−アニシジニル）ナフタリン−６−スル
ホン酸または１−アニリノナフタリン−８−スル
ホン酸（１，８−ANS）である。アツセイ媒質
中の吸光物質の濃度は約10-12〜10-6Ｍ、好まし
くは約10-3〜10-4である。 結合トレーサーは、励起光線を与え、吸光物質
の存在下で標識からの発光を測定することによつ
て検出される。励起光線は、使用した標識の吸光
範囲内の波長をもつことが好ましい。標識ガラン
タニドキレートである場合、励起光線は約280〜
375nm、きわめて好ましくは約343nmの波長をも
ち、不連続である。すなわち光のパルスと光源が
消えている期間とが交互に生じる。光のパルスは
持続時間約0.1〜10μ秒、好ましくは約3μ秒であつ
てもよい。光源が消される期間は約0.1〜2.0ｍ
秒、好ましくは約0.9ｍ秒であつてもよい。 発光は各パルス終了から約0.1〜0.5ｍ秒、好ま
しくは約0.5ｍ秒の遅れののちにタイムゲート
（time−gating）により測定される。発光の波長
は使用する標識により異なる。標識がランタニド
キレートである場合、発光の波長は一般に約580
〜630nmである。きわめて好ましくは、発光は約
614nmの波長で測定される。 本発明の好ましい方法に従つたタイムゲートに
よる発光測定は、一般の分光光度計、たとえばゲ
ート化光子検出器を備えたスペツクス（Spex）
Ｌ−111螢光計（スペツクス・インダストリーズ
社、ニユージヤージ州エジソン）により行うこと
ができる。発光は励起光線のビームに対しいかな
る角度においても測定することができる。好まし
くは発光は励起光線のビームから約２〜20度の角
度で測定される。 アツセイ系の液体相中の吸光物質は、液体相を
通過する発光光線、好ましい態様においては励起
光線及び発光光線の両者をすべて吸収し、これに
より遊離トレーサーからの発光による測定への影
響を効果的に防止する。他方、結合トレーサーは
液体相を通過しなかつた光を吸収し、次いで検出
可能な光を発する。 本発明の方法および構成要素を第１図に示す。
ここでアツセイ系１０には開放端１１および閉鎖
端１２をもつ好ましくはポリスチレン製の試験管
１３が含まれる。試験管１３には結合画分１５お
よび液体相１７が含まれる。結合画分１５には試
験管１３の内壁に結合した抗−被分析体１９、な
らびに結合被分析体２１および結合トレーサー２
３が含まれる。結合トレーサー２３は、螢光色素
標識２７を取込んだポリマー粒子２５が結合した
結合被分析体２１からなる。液体相１７には遊離
被分析体２１ａ、遊離トレーサー２３ａおよび吸
光物質２９が含まれる。 参考線３１で模式的に示した励起光線が試験管
１３を貫通し、物質２９により吸収されるか、あ
るいは試験管１３を貫通して結合トレーサー２３
または、遊離トレーサー２３ａにより吸収され
る。結合トレーサー２３からの螢光発光には、液
体相１７中へ発光されてここで物質２９により吸
収される光線３３ａ、および液体相１７を通過す
ることなく試験管１３の外側へ通過し、ここで螢
光計３５により検出される光線３３ｂが含まれ
る。遊離トレーサー２３ａから液体相１７中へ放
出される発光３３ｃは物質２９により吸収され
る。 固体支持体から反射される励起光線は結合トレ
ーサーからの発光の測定を妨害しない。何故な
ら、発光は励起光源が消されたのちに測定される
からである。アツセイ媒質中の血清その他の螢光
物質に伴随する減衰時間の短かいバツクグラウン
ド発光（固体支持体自体に付随する発光を含む）
は、時間分解型の発光測定によつて本質的に除か
れる。従つて本発明方法によれば、検出される唯
一の発光は固体支持体の表面に結合したトレーサ
ーからのものである。 前記の競合アツセイ法においては、発光の大き
さは結合トレーサーの量に正比例し、従つて液体
中に存在する被分析体の量に反比例する。液体中
の被分析体の濃度は、被分析体のアツセイに際し
て測定された発光の強さを、本質的に等しい条件
下でアツセイされる一定範囲の既知量の被分析体
のアツセイに際して測定される発光と比較するこ
とによつて測定できる。 本発明方法は固相サンドイツチアツセイ法にも
適用できる。この型のアツセイ法は高分子被分析
体、たとえば蛋白質のアツセイに特に有用であ
る。固相サンドイツチアツセイ法のいかなる変法
も採用できる。たとえば十分な量の抗−被分析体
を固体支持体の結合させて、本質的にすべての被
分析体を被分析体上の第１決定因子により結合さ
せる。この支持体上の抗−被分析体を被分析体、
吸光物質、およびトレーサー（被分析体上の第２
決定因子に対して特異的な標識リガンドよりな
る）と共にインキユベートする。リガンドは抗
原、抗体、または結合抗原−抗体複合体のいずれ
であつてもよい。 好ましい標識物質および吸光物質、ならびに好
ましい励起法および発光検出法は、競合アツセイ
に関して上記に述べたものと同様である。しかし
本発明の上述の実施態様におけるサンドイツチア
ツセイにおいては、液体中に存在する被分析体の
濃度は発光の大きさに正比例する。 本発明の他の観点においては、本発明方法に従
つて被分析体のアツセイを行うための材料の試薬
キツトまたはパツケージが提供される。このキツ
トには、被分析体に特異的な抗−被分析体が結合
した固体支持体、吸光物質、および被分析体に対
するトレーサー（励起光線を吸収し、検出可能な
光線を発しうる標識が結合したもの）が含まれ
る。キツトには被分析体に対する標準物質、たと
えば既知濃度の被分析体試料１種または２種以上
が含まれていてもよく、あるいはアツセイを行う
のに有用な他の標識された、または標識されてい
ない特異的な抗原、抗体、またはそれらの複合体
が含まれていてもよい。キツトの各構成部品は別
個の容器、たとえばバイアルに入れた状態で供給
されてもよく、あるいはこれらの構成部品のうち
２種以上が１個の容器中に組合せられていてもよ
い。 以下のジゴキシンに関するモデル系およびアツ
セイ法の実施例は本発明をより詳細に記述するた
めの提示され、何らかの形で本発明を限定するこ
とを意図するものではない。 実施例 １ ナフトイルトリフルオルアセトン−ロピウムキ
レート（NTFA3Eu）約１％含有する約150nmの
ポリメタクリル酸メチルビーズを水に懸濁し、ポ
リスチレン製キユベツトの表面に吹付けた。キユ
ベツトを周囲温度で一夜乾燥させ、これによりビ
ーズは表面に固着し、水洗によつて除去されなか
つた。こうして被覆したキユベツトをTR−FIA
の結合画分、すなわち抗−被分析体およびトレー
サーが結合した固体支持体に該当するものとして
用いた。 ビーズ約１×104個／mlの水性懸濁液を、遊離
トレーサーを含有するTR−FIA液体相に該当す
るものとしてすべてのキユベツトに添加した。 表に示す濃度の１，８−ANSの水溶液をキ
ユベツトに添加した。対照キユベツト１個には水
のみを入れた。 ゲート化光子検出器を備えたスペツクスＬ−
111螢光計により343nmのパルス励起光線をキユ
ベツトに直角に与えた。0.5ｍ秒の遅れののち、
励起光線のビームに対し11°および90°の角度で
614nmにおける螢光発光を測定した。結果を表
に示す。これは懸濁したビーズの螢光発光に対し
て１，８−ANSの濃度が与える影響を示す。
【表】 １×10-3Ｍの濃度をもつ１，８−ANSが結合
ビーズに帰因するものを除くすべての発光を除去
したことが認められる。 実施例 ２ 各３個のキユベツトの２群を実施例１に述べた
と同様に２種の異なる濃度のビーズで被覆した。
各群において１個のキユベツトには水のみを入
れ、TR−FIAの結合画分に該当させた。各群に
おいて３番目のキユベツトには５×10-3Ｍの１，
８−ANSを含むビーズ懸濁液を入れた。 励起により、11°における螢光発光測定を実施
例１に記載したと同様に行つた。結果を表に示
す。
【表】 吸光物質の存在下では、キユベツト表面のビー
ズ（結合画分）のみが懸濁液中の大過剰のビーズ
（遊離画分）の存在下で選択的に励起され、それ
らの螢光発光が検出されたことが認められる。 実施例 ３ Ａ 螢光ポリマー粒子の製造 NTFA3Eu １％を含有する92：６：２の比率
のメタクリル酸ブチル：メタクリル酸グリシジ
ル：メタクリル酸スルホエチルからなるポリマー
ビーズを下記の方法で製造した。ビスメチレンア
クリルアミド（0.05ｇ）およびポリエチレンオキ
シド（0.1ｇ）を脱イオン水（25ml）およびアセ
トン（４ml）に溶解した。メタクリル酸ブチル
（0.78ml）、メタクリル酸スルホエチル（0.2ｇ）、
メタクリル酸グリシジル（0.5ml）およびNTFA3
Eu（25mg）を含有する第２溶液を調製した。これ
ら２つの溶液を混合し、1N・NaOHによりPHを
5.5に調製した。N2下で十分に攪拌したのち、混
合物を7.05Mr／時間で12時間照射した。白色乳
濁液を遠心分離機で速度を連続的に高めながら遠
心分離した。30000rpmで採取されたペレツトを
リン酸塩緩衝化食塩液（PBS−0.15M・NaCl中
の．01Mリン酸モノおよびジナトリウム混合物）
中の0.1％ポリオキシエチレンソルビタンモノラ
ウレート（ツウイーン（Tween）20）で３回洗
浄した。このペレツトを最終的に１，３−ジアミ
ノプロパンの10％溶液に懸濁し、ここで1N・
HClによりPHを10に調整した。懸濁液を一夜攪拌
し、次いで３回洗浄し、PBS30mlに懸濁した。 Ｂ BSA−ジゴキシン粒子結合体の製造 Ａに記載した粒子懸濁液の試料（1.0ml）を最
終濃度１％のグルタルアルデヒドの添加により活
性化した。４時間のインキユベーシヨンののち
PBS中で３回洗浄した。活性化されたビーズ１
mlにウシ血清アルブミン（BSA）−ジゴキシン結
合体５mgを添加した。混合物を室温で一夜攪拌し
た。ビーズを３回洗浄し、PBS25mlに懸濁し、
４℃に保存した。 Ｃ 家兎抗ジゴキシン免疫グロブリンによるポリ
スチレン製キユベツトの被覆 家兎抗ジゴキシン免疫グロブリンの2000倍希釈
を0.1M炭酸塩緩衝液（PH9.5）中で行つた。この
溶液を各キユベツトに３mlの目盛に達するまでピ
ペツトで移した。室温で４時間インキユベートし
たのち、キユベツトをアスピレーターで吸引し、
PBS中の２％BSA溶液で、最後にPBS中で順次
洗浄した。キユベツトを乾燥させ、４℃に保存し
た。 Ｄ リン酸塩緩衝液中のジゴキシンに関する標準
曲線の決定 BSA（２％）およびツウイーン20（0.5％）を含
有するPBS中において１〜10000nｇ／mlの範囲
の二重希釈系列のジゴキシンを調製し、次いでこ
れらの溶液およびブランクPBS各３mlを、あら
かじめＣに記載したように被覆したキユベツトに
ピペツトで分取した。これらのキユベツトそれぞ
れにＢ項で製造したBSA−ジゴキシン粒子結合
体30μを添加した。キユベツトを37℃で45分間
インキユベートした。各キユベツトに0.1M・１，
８−ANS（30μ）を添加し、0.5ｍ秒の遅れのの
ち、励起光線のビームに対し11°の角度で614nm
における螢光発光を測定した。結果を表および
第２図に示す。 表 ジゴキシン濃度(nｇ/ml) 強度(光子数) ０ 8700 １ 8700 10 8200 100 7000 1000 6100 10000 4500 実施例 ４ Ａ 抗HCG免疫グロブリン粒子結合体の製造 実施例3Aに記載した粒子懸濁液の試料（1.0
ml）を最終濃度１％のグルタルアルデヒドの添加
により活性化した。４時間のインキユベーシヨン
ののちPBS中で３回洗浄した。活性化されたビ
ーズ１mlに、HCGに対して常法により産生させ
たモノクローナル抗体（HCG−13と表示）の１
mg／ml溶液（PBS中）50μを添加した。混合物
を室温で一夜攪拌した。ビーズを３回洗浄し、
PBS25mlに懸濁し、４℃に保存した。 Ｂ モノクローナル抗体HCG−４免疫グロブリ
ンによるポリスチレン製キユベツトの被覆 HCGに対して産生させた第２のモノクローナ
ル抗体（HCG−４と表示）の5000倍希釈を0.1M
炭酸塩緩衝液（PH9.5）中で行つた。この溶液を
各キユベツトの３mlの水準にまでピペツトで分取
した。湿温で４時間インキユベートしたのち、キ
ユベツトをアスピレーターで吸引し、PBS中の
２％BSA溶液で、最後にPBS中で、順次洗浄し
た。キユベツトを乾燥させ、４℃に保存した。 Ｃ リン酸塩緩衝液中のHCGに関する標準曲線
の決定 0.15〜1.5×105ｍIU／mlの範囲の二重希釈系列
のHCGを10倍濃度のPBS中で調製した。これら
の溶液およびブランクPBSを、あらかじめＢに
記載したように被覆したキユベツトにピペツトで
分取した。37℃で１時間インキユベートしたの
ち、Ａに記載したミクロビーズ（50μ）を添加
し、インキユベーシヨンをさらに１時間続けた。
各キユベツトに0.1M・１，８−ANS（30μ）を
添加し、0.5ｍ秒の遅れののち励起光線のビーム
に対し11°の角度で614nmにおける螢光発光を測
定した。結果を表および第３図に示す。 表 HCG濃度(mIU/ml) 強度(光子数) ０ 1000 0.15 1380 15 1750 1500 2000 150000 2600 以上のように、本発明によれば固相螢光イムノ
アツセイ法はアツセイ系の液体相に吸光物質を添
加することを含む。吸光物質は、結合トレーサー
により吸収される励起光線及び結合トレーサーに
より直接系外に放射される発光光線を除いた、液
体相中を通過する発光光線、好ましい態様におい
ては励起光線及び発光光線の両者をすべて吸収す
るのでこれにより大過剰の遊離トレーサーの存在
下でも結合トレーサーからの発光のみを検出し、
測定することが可能となる。こうして結合画分と
遊離画分を分離する必要性が避けられ、均質アツ
セイの簡潔性および簡便性が達成される。時間分
解法を採用して結合トレーサーからの発光を測定
することによつて、反射された励起光線ならびに
光散乱およびバツクグラウンド発光による妨害を
最小限に抑え、これによりいつそう高いアツセイ
感度を達成しうる。本発明の方法は、固相競合型
およびサンドイツチ型のアツセイ系のすべての変
法に容易に適用できる。本発明には手動アツセイ
法または自動アツセイ法のいずれかに使用できる
アツセイ材料キツトが含まれる。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明方法による競合イムノアツセイ
に用いられる試験管その他の構成要素を示す。第
２図は本発明方法によるジゴキシンアツセイの標
準曲線である。第３図は本発明方法によるヒト絨
毛性ゴナドトロピン（HCG）アツセイの標準曲
線である。 １０……アツセイ系、１１……試験管の開放
端、１２……試験管の閉鎖端、１３……試験管、
１５……結合画分、１７……流体相、１９……抗
−被分析体、２１……結合被分析体、２１ａ……
遊離被分析体、２３……結合トレーサー、２３ａ
……遊離トレーサー、２５……ポリマー粒子、２
７……螢光色素標識、２９……吸光物質、３１…
…励起光線、３３ａ，ｂ，ｃ……発光光線、３５
……螢光計。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ (a) 固体支持体の表面に結合した抗−被分析
    体を、未知量の被分析体、蛍光色素を有してな
    るトレーサー、及び該トレーサーの蛍光発光帯
    と重なる吸光帯を有する吸光物質を含む液体と
    接触させることによつて、混合物を調製し； (b) 該混合物をインキユベートし； (c) 該混合物に、励起光線の一部が上記トレーサ
    ーにより吸収されるのに十分なパルス強度およ
    び持続時間で励起光線のパルスを与え； (d) 前記固体支持体の表面に抗−被分析体を介し
    て結合したトレーサーからの蛍光発光を検出
    し、その際該発光は上記光線のパルスが終止し
    たのちに、かつ該混合物中の結合トレーサー以
    外の成分による発光が実質的にすべて減衰した
    のちに検出されるのに十分な長い減衰時間をも
    つものであるよう前記蛍光色素が選択されてお
    り；そして (e) 上記蛍光発光の強さを既知量の被分析体に関
    して確認された蛍光発光の強さと比較すること
    によつて液体中の被分析体の量を測定する； ことを特徴とする液体中に存在する未知量の被分
    析体の測定法。 ２ 該吸光物質が、該トレーサーの吸光帯及び蛍
    光発光帯と重なる吸光帯を有するものである特許
    請求の範囲第１項記載の測定法。 ３ 被分析体が、抗原、ハプテンおよび抗体より
    なる被分析体の群から選ばれ、抗−被分析体が抗
    原および抗体よりなる抗−被分析体の群から選ば
    れる特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ４ トレーサーが蛍光色素と結合した被分析体か
    らなり、該トレーサーが抗−被分析体と特異的に
    反応する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ５ 限られた量の抗−被分析体が支持体に付着し
    ており、被分析体およびトレーサーが該抗−被分
    析体に競合的に結合する特許請求の範囲第４項に
    記載の方法。 ６ トレーサーが、蛍光色素と結合した抗原、抗
    体および抗原−抗体結合複合体よりなるトレーサ
    ーの群から選ばれ、該トレーサーが被分析体と特
    異的に反応する特許請求の範囲第１項に記載の方
    法。 ７ 実質的にすべての被分析体が抗−被分析体に
    結合し、トレーサーが該被分析体と結合する特許
    請求の範囲第６項に記載の方法。 ８ 蛍光色素がランタニドキレートである特許請
    求の範囲第１項に記載の方法。 ９ ランタニドキレートがポリマー粒子に取込ま
    れている特許請求の範囲第８項に記載の方法。 １０ 液体が血清である特許請求の範囲第１項に
    記載の方法。 １１ 吸光物質が、アリールアミノナフタレンス
    ルホン酸である特許請求の範囲第１項に記載の方
    法。 １２ パルスの強度が、光子約１×1040〜２×
    1040個である特許請求の範囲第８項に記載の方
    法。 １３ パルスの持続時間が約１〜10μ秒である特
    許請求の範囲第８項に記載の方法。 １４ パルスが約280〜375nmの波長をもつ特許
    請求の範囲第８項に記載の方法。 １５ 蛍光発光が約580〜630nmの波長をもつ特
    許請求の範囲第８項に記載の方法。 １６ 蛍光発光が約0.5〜1.0ｍ秒の減衰時間をも
    つ特許請求の範囲第８項に記載の方法。 １７ 蛍光発光が連続パルスの間に測定される特
    許請求の範囲第１項に記載の方法。 １８ 蛍光発光が１つのパルスの終了後に0.5〜
    0.75ｍ秒の間に測定される特許請求の範囲第１項
    に記載の方法。 １９ 蛍光発光が励起光線のパルスの方向から２
    〜20°の角度で測定される特許請求の範囲第１項
    に記載の方法。 ２０ (a) 固体支持体の表面に結合した抗−被分
    析体を、未知量の被分析体、吸光および発光し
    うる検出可能な標識剤を有してなる被分析体用
    トレーサー、及び該トレーサーの発光帯と重な
    る吸光帯を有する吸光物質を含む液体と接触さ
    せることによつて混合物を調製し； (b) 被分析体およびトレーサーが抗−被分析体に
    結合するのに十分な時間を経過させ； (c) 該混合物に励起光線を与え； (d) 前記混合支持体の表面に抗−被分析体を介し
    て結合したトレーサーからの時間分解された
    （time−resolved）発光を検出し；そして (e) 検出された発光の強さを既知量の被分析体に
    対して確認された発光の強さと比較することに
    よつて、液体中の被分析体の量を測定する； ことを特徴とする液体中の未知量の被分析体の測
    定法。 ２１ 該吸光物質が、該トレーサーの吸光帯及び
    発光帯と重なる吸光帯を有するものである特許請
    求の範囲第２０項記載の測定法。 ２２ 被分析液体が血清試料であり、 (a) 全ての被分析体を結合させるには不十分な量
    の抗−被分析体を固体支持体の表面に結合さ
    せ、この抗−被分析体を、未知量の被分析体に
    含有する血清試料、吸光物質としてのアリール
    アミノナフタリンスルホン酸、およびランタニ
    ドキレート系標識剤を取り込んだ粒子と結合し
    た被分析体を有してなる被分析体用トレーサー
    と接触させることによつて混合物を調製し； (b) 該混合物をインキユベートし； (c) 該混合物に、光子約１×1040〜２×1040個の
    強度および約１〜10μ秒の持続時間で、約280
    〜375nmの波長の励起光線のパルスを与え； (d) 前記固体支持体の表面に抗−被分析体を介し
    て結合したトレーサーから発せられる約580nm
    〜630nmの波長および約0.5〜10ｍ秒の減衰時
    間をもつ蛍光発光を検出し、その際該発光は連
    続励起パルスの間でパルス方向から約２〜20°
    の確度においてパルス終止の約0.50〜0.75ｍ秒
    後に測定され；そして (e) 上記蛍光発光の強さを、既知量の被分析体を
    含有する混合物が工程(a)〜(e)に従つて測定され
    た場合に検出される蛍光発光の強さと比較する
    ことによつて、血清試料中の被分析体の量を測
    定する； ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の測
    定法。 ２３ 粒子がポリマー粒子である特許請求の範囲
    第２２項に記載の方法。 ２４ ランタニドキレートがβ−ジケトンにキレ
    ート結合したユーロピウム又はテルビウムイオン
    である特許請求の範囲第２２項に記載の方法。 ２５ 被分析液体が血清試料であり、 (a) 実質的に全ての被分析体を結合させるのに十
    分な量の抗−被分析体を固体支持体の表面に結
    合させ、この抗−被分析体を、未知量の被分析
    体に含有する液体、吸光物質としてのアリール
    アミノナフタリンスルホン酸、およびランタニ
    ドキレート系標識剤を取り込んだ粒子が結合し
    ている被分析体に特異的なリガンドを有してな
    る被分析体用トレーサーと接触させることによ
    つて混合物を調製し； (b) 該混合物をインキユベートし； (c) 該混合物に、光子約１×1040〜２×1040個の
    強度および約１〜10μ秒の持続時間で、約280
    〜375nmの波長の励起光線のパルスを与え； (d) 約580〜630nmの波長および約0.5〜10ｍ秒の
    減衰時間をもつ蛍光発光を検出し、その際発光
    は連続励起パルス間にパルスの方向から約２〜
    20°の確度においてパルス終止の約0.50〜0.75ｍ
    秒後に測定され；そして (e) 上記蛍光発光の強さを、既知量の被分析体を
    含有する混合物が工程(a)〜(e)に従つて測定され
    た場合に検出される蛍光発光の強さと比較する
    ことによつて血清試料中の被分析体の量を測定
    する； ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の測
    定法。 ２６ 粒子がポリマー粒子である特許請求の範囲
    第２５項に記載の方法。 ２７ リガンドが抗原、抗体、および結合抗原−
    抗体複合体よりなるリガンドの群から選ばれる特
    許請求の範囲第２５項に記載の方法。 ２８ ランタニドキレートがβ−ジケトンにキレ
    ート結合したユーロピウム又はテルビウムイオン
    である特許請求の範囲第２５項に記載の方法。 ２９ 被分析体に特異的な抗−被分析体が結合し
    た固体支持体；吸光および発光しうる標識剤を有
    してなる被分析体用トレーサー、及び該トレーサ
    ーの発光帯と重なる吸光帯を有する吸光物質から
    なる、液体中の未知量の被分析体に関するアツセ
    イを行うための材料のキツト。 ３０ 該吸光物質が、該トレーサーの吸光帯及び
    発光帯と重なる吸光帯を有するものである特許請
    求の範囲第２９項記載のキツト。 ３１ さらに、既知濃度の被分析体試料少なくと
    も１種を含む特許請求の範囲第２９項に記載のキ
    ツト。
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