JPH0476629B2 - - Google Patents
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- JPH0476629B2 JPH0476629B2 JP62046934A JP4693487A JPH0476629B2 JP H0476629 B2 JPH0476629 B2 JP H0476629B2 JP 62046934 A JP62046934 A JP 62046934A JP 4693487 A JP4693487 A JP 4693487A JP H0476629 B2 JPH0476629 B2 JP H0476629B2
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、特に血漿中のタンパク質Ｃまたはタ
ンパク質Ｓの活性を測光により測定する方法に関
する。 従来の技術 タンパク質Ｃは、血漿中の、ビタミンＫ依存性
の２本鎖の糖タンパク質である。その合成は肝臓
中で行なわれる。その際、まず初めに凝固生理的
に不活性の前駆物質（デカルボキシ−タンパク質
Ｃ）が形成される。ビタミンＫ依存性カルボキシ
ラーゼによりタンパク質中のγ−グルタミン酸基
をカルボキシル化すると、タンパク質Ｃが生じ
る。タンパク質Ｃ自体は酵素前駆体であり、トロ
ンビンにより活性タンパク質Ｃに変わる。該活性
タンパク質は、活性凝固因子およびのタンパ
ク質分解失活により、抗凝血物質として働く。活
性タンパク質Ｃの抗凝血作用は、補助因子タンパ
ク質Ｓにより強化される。タンパク質Ｓは、血漿
中の１本鎖の、同様にビタミンＫ依存性糖タンパ
ク質である。活性タンパク質Ｃおよびタンパク質
Ｓは、等モルの複合体を形成する。タンパク質Ｃ
ならびにタンパク質Ｓの血中濃度の低下は、肝臓
疾患、消費性凝固障害（DIC）の患者においてお
よびワルフアリン治療によつても報告されてい
る。タンパク質Ｃまたはタンパク質Ｓの先天性欠
乏は、静脈血栓塞栓症の危険を伴う。従つてタン
パク質Ｃ、ならびにタンパク質Ｓは、生理的止血
の場合ならびに多くの疾病、とくに血栓症におい
て重要である。 今まで市場で入手できるテスト方法では、血漿
中のタンパク質Ｃの量が酵素で標識された抗体に
より測定される。しかし、この方法は、測定に使
用された抗体が上記のデカルボキシタンパク質Ｃ
とも反応するという欠点を有する。デカルボキシ
タンパク質の血漿中濃度は、抗凝固剤処置の間に
しばしば強く増加するので、この方法は場合によ
つては間違つたまたは不十分な治療を生じる大き
な治療ミスをみたらす。 血漿中のタンパク質Ｃの免疫学的測定方法にお
ける欠点は、該方法がタンパク質Ｃ分子の生物学
的活性に関する情報を提供しないことである。著
しく減少した生物学的活性を有する異常なタンパ
ク質Ｃ（遺伝的変形）の存在は、このような方法
では見出すことができない。 R.B.フランシス（R.B.Francis）およびM.J・
パツチ（M.J・Patch）［“トロンボシス・リサー
チ（Thrombosis Research）”第32巻、第605頁
〜第613頁、1983年］は、ヒトの血漿からの活性
タンパク質Ｃを部分トロンボプラスチン時間の測
定（PTT−テスト）により測定する方法を示し
ている。この方法では、クエン酸バリウムに吸着
させて血漿から分離したタンパク質Ｃをトロンビ
ンの添加により活性化し、その後でトロンビンを
アンチトロンビンおよびヘパリンの添加により
阻害する。ヘパリンは再度、そのつど新規に測定
すべき正確な量の硫酸プロタミンにより中和す
る。その後、タンパク質Ｃは部分トロンボプラス
チン時間により測定される。この場合、指示薬反
応は、トロンビンにより惹起されるフイブリノー
ゲンの分解およびフイブリン凝血である。 R.M.ベルチナ・エ・アル（R.M.Bertina et
al）（“トロンボ・ヘモスタス（Thromb.
Haemostas）”第51巻、(1)第１頁〜第５頁、
1984）は、タンパク質Ｃ活性の測定のための分光
測光法を記載している。この方法は、３つの独立
した工程を包括している。 １ Al（OH）3吸着によるタンパク質Ｃの単離。 ２ 血漿から分離されたタンパク質Ｃのトロンビ
ンでの活性化、ならびに引続く等モル量のアン
チトロンビンおよびヘパリンによるトロンビ
ンの阻害。 ３ 色素原基質（S2366＝Ｈ pyro−Glu−Pro−
Arg−pNA）を用いる。単離された活性タン
パク質Ｃのタンパク質分解活性の測定。 この方法は、この基質が同様に他の凝血プロテ
アーゼによつても分解されるので、タンパク質Ｃ
の特異性に関して不十分である。それにより、不
正な結果が生じうる。 他の測光測定法においては、マムシ
（Agkistrodon contortrix）の蛇毒から得られる
タンパク質Ｃ活性剤プロタツク（Protac ）［ペ
ンタフアーム（Pentapharm）社製造、スイス
在］ならびに色素原タンパク質Ｃ基質（２
AcOH・Ｈ−Pro−Pro−Arg−pNA）が使用さ
れる。この方法の場合、試料の準備は必要ない。
しかし、この方法では、カルボキシル化されたタ
ンパク質Ｃとカルボキシル化されてないタンパク
質Ｃとを区別することができない。しかし、カル
ボキシル化されたタンパク質Ｃだけが生体内で有
効であることは公知である。従つて、この方法で
は、タンパク質Ｃ分子の生物学的活性についての
情報を得ることはできない。 タンパク質Ｃを測定するための他の公知の方法
では、同じくタンパク質Ｃ−活性剤としてプロタ
ツク が使用される。その際、タンパク質Ｃの測
定は、活性剤添加後、内在性凝血システムについ
て血餅形成試験（Clotting−Test）によつて行な
われる。この方法を用いると実際に、カルボキシ
ル化されたタンパク質Ｃとカルボキシル化されて
ないタンパク質Ｃとを区別することは可能である
が、この方法は、凝血形成（血餅形成）によつて
検出を行なわねばならないという欠点を有する。
従つて、この測定は、妨害を受けやすくかつ自動
化できないことが判明している特定の検出法［た
とえばヘツケル（Haekel）法または磁場法］に
よつて行なわれる。 本出願人の以前の提案によればPC−測定は、
差当りトロンビンを作用させて活性タンパク質Ｃ
を形成させ、その後このトロンビンを失活させ、
引続き凝固カスケードによつて新たに形成したト
ロンビンを、合成トロンビン基質を用いて測定す
ることによつて行なわれる。その場合実際に、タ
ンパク質Ｃなしで行なつた実験と比較してトロン
ビン形成の緩慢化が測定される。 血漿中のタンパク質Ｓの量は、たとえばベルチ
ナ・エ・アル（Bertina et al.）“トロンボ・ヘ
モスタス（Thromb Haemostas）”、第53巻(2)、
第268頁〜第272頁（1985年））により記載されて
いるような放射線免疫測定試験で測定することが
できる。しかしこの方法は、測定のために使用さ
れる抗体が、非機能性タンパク質Ｓ、つまりたと
えばデカルボキシタンパク質ＳまたはC4b−結合
したタンパク質により複合化されたタンパク質Ｓ
と反応するという欠点を有する。この欠点は、場
合によつては、不正のタンパク質Ｓ値およびそれ
により不十分な治療を生じる。 同じ論文中に著者ベルチナおよび協力者は、ヒ
トの血漿からの機能性タンパク質Ｓを測定するこ
とのできる方法も記載している：ヒトの血漿に活
性タンパク質Ｃを混合し、引続いてこの混合物の
部分トロンボプラスチン時間（PTT）を測定す
る場合、PTTは、機能性タンパク質Ｓの濃度が
大きければ大きいほどそれだけ長くなる。この場
合でも指示薬反応は、トロンビンにより惹起され
るフイブリノーゲンの分解およびフイブリン血餅
形成である。従つて、この方法は、妨害を受けや
すくかつ一般に自動化不可能な検出法である。該
方法は、精製された活性タンパク質Ｃを添加しな
ければならずかつ血漿中のタンパク質Ｃおよびタ
ンパク質Ｓを同時に測定することができないとい
う他の欠点を有する。 発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、上述した方法よりも簡単に実
施できかつ自動化可能な生物学的に有効なタンパ
ク質Ｃまたはタンパク質Ｓを測光により測定する
方法を提供することである。 問題点を解決するための手段 この課題は、タンパク質Ｃまたはタンパク質Ｓ
を測定するために、蛇毒からのタンパク質Ｃに対
する活性剤、凝固系に対する活性剤および色素原
トロンビン基質を同時に使用し、かつ凝固因子
およびに対するタンパク質Ｃおよびタンパク質
Ｓの作用を色素原トロンビン基質の分解によつて
測定することによつて解決される。 本発明は、蛇毒からのタンパク質Ｃ−活性剤が
他のタンパク質Ｃ−活性剤と異なり、トロンビン
基質を分解しないという意想外の認識に基づいて
いる。このことは、たとえばプロタツク
（Protac ）がその作用においてトロンビン類似
のタンパク質Ｃ−活性剤であるため意想外であつ
た。その結果、色素原トロンビン基質もまた蛇毒
−活性剤ないしは活性剤とタンパク質Ｃとの混合
物により変換されることも予想される。それとい
うのもトロンビンおよび他の場合に公知のタンパ
ク質Ｃ活性剤（たとえばプラスミン、トリプシ
ン）は色素原トロンビン基質を変換するからであ
る。従つて、この種のタンパク質Ｃ活性剤を使用
する場合、タンパク質Ｃの活性化の後に活性剤を
失活させなければならない。引続いてはじめて凝
固系に対する活性剤および色素原トロンビン基質
を添加することができる。しかし、蛇毒からのタ
ンパク質Ｃ活性剤を使用する場合、意想外に、こ
の失活工程を除外できることが示される。むし
ろ、凝固系に対する活性剤および色素原トロンビ
ン基質は既に測定開始の際に添加することが可能
である。 タンパク質Ｃ−活性剤としては、本発明の範囲
内で、毒蛇たとえばアグキストロドン コントル
トリクス コントルトリクス（Agkistrodon
contortrix contortrix）、A.C.モカセン（A.C.
mokasen）、A.C.ピクチガスター（A.C.
Pictigaster）、A.ピスシボウルス（A.
piscivours）、A.p.コイコストマ（A.p.
leucostoma）、A.ビリネアトウス（A.
bilineatus）、ボトロプス モオジエニ
（Bothrops moojeni）、B.プラドイ（B.pradoi）、
セラステス セラステス（Cerastes cerastes）、
ビペラ レベトリナ（Vipera lebetrina）または
V.ルセリイ（V.russellii）の蛇毒の溶液が使用さ
れる。しかし、有利には、マムシ（Agkistrodon
contortrix controtrix）の蛇毒から単離された
タンパク質Ｃ活性剤が使用される。 有利には、血漿中でタンパク質Ｃのみを活性化
する毒または毒成分が使用され、その際所望の毒
成分は蛇の毒から容易に分離することができる。 このためには、一般に常用の方法、たとえば陰
イオン交換体クロマトグラフイー、タンパク質Ｃ
を用いるアフイニテイークロマトグラフイーまた
は／および限外濾過を使用することができる。 活性剤は、活性剤溶液１mlあたりの単位(U)で
0.05〜5U／ml、有利には0.5〜1U／mlの濃度で使
用される。この場合タンパク質Ｃ活性剤１単位(U)
は、正常のヒトのクエン酸血漿１ml中に含まれて
いる量のタンパク質Ｃを37℃、PH７〜８で、血漿
１容量部とタンパク質Ｃ活性剤水溶液４〜８容量
部からなる反応混合液中で完全に活性化する量と
して定義されている。 活性タンパク質Ｃ（APC）は凝固因子および
をタンパク質分解により失活させ、その際タン
パク質Ｓは補助因子として働くので、本発明によ
る方法の場合には有利に凝固系は、凝固因子に対
する活性剤または凝固因子自身の添加によつて、
因子ないしの失活がトロンビン形成のできる
だけ顕著な減少において生じるように変えられ
る。 本発明方法の第１の実施態様によれば、これは
有利に、因子XIIに対する活性剤としてケフアリン
を添加したエラグ酸を添加することによつて達成
される。このすぐれた方法の第２の実施態様によ
れば、因子の活性剤としてトロンボプラスチン
および因子の活性剤が添加される。第３の実施
態様によれば、因子の活性剤として、ケフアリ
ンを添加した因子ａが添加される。通常は、こ
の場合に使用される緩衝液はなお付加的にカルシ
ウムイオンを含有する。 この有利な本発明の実施態様は、凝固パラメー
ターである因子XII、XI、、、およびの濃
度がトロンビン形成時間に影響を与え、これらの
因子の濃度が高ければ高いほど、特定のトロンビ
ン限界値の測定はますます速く達成されるという
事実を考慮する。 トロンビン形成は、本発明の範囲内では、自体
公知の方法で測定される。これに適しているのは
部分−トロンボプラスチン時間（PTT）法であ
る。これを実施する場合には有利に、因子XIIの活
性剤が添加される。トロンビン形成は、プロトロ
ンビン時間方法によつても測定することができ
る。この場合には、有利に因子の活性剤および
因子ａが添加される。 色素原トロンビン基質としては、本発明の範囲
内で、トロンビン測定に適した色素原基質が使用
される。有利には、本発明の範囲内でＨ−Ｄ−
Phe−Pip−Arg−pNAまたはTos−Gly−Pro−
Arg−nNA（式中pNA＝パラ・ニトロアミンを表
わす）が使用される。pNAは基質の色素原成分
でありかつトロンビン形成により分離されるの
で、測光により公知方法で測定することができ
る。 凝固系としては、たとえば因子〜XIIの混合物
または基質血漿（たとえばタンパク質Ｃ−ないし
タンパク質Ｓ欠乏血漿）が使用される。 本発明の範囲内では、さまざまな血漿を使用す
ることができ、有利にはクエン酸血漿が使用され
る。 この方法は、中性または弱アルカリ性PH値、と
くにPH６〜９の間のPH値において実施することが
できる。緩衝溶液としては、この範囲において有
効で生理的に懸念のない緩衝溶液、たとえば
Tris／HClが使用される。さらに、凝固試験に常
用の安定剤および保存剤、たとえば牛血清アルブ
ミン、メルチオレート等も同様に添加することが
できる。 本発明による方法を用いると、タンパク質Ｃお
よびタンパク質Ｓは一緒にかまたはタンパク質Ｃ
ないしはタンパク質Ｓをそれぞれ単独に測定する
ことができる。 タンパク質Ｃおよびタンパク質Ｓを一緒に測定
する場合には、患者の血漿を直接に測定のために
使用することができる。タンパク質Ｃを単独で測
定する場合には、試薬以外になおタンパク質Ｃを
添加しなければならない。これは有利に、タンパ
ク質Ｓを含有する、タンパク質Ｃ欠乏血漿の形で
行なわれる。この場合でも、少なくとも予想され
るタンパク質Ｓ濃度と同量のタンパク質Ｃが添加
しなければならない。 タンパク質Ｓ−ないしはタンパク質Ｃ−欠乏血
漿は、たとえばベルチナおよび協力者
“Thromb.Haemostas”（シユトツトガルト）第
51巻第１頁〜第５頁（1984年）ないしはベルチナ
およびR.M.、et al.“Thromb.Haemostas.“第53
巻第268頁〜第272頁（1985年）に記載されたよう
な免疫吸着クロマトグラフイーによつて製造でき
る。 実施例 本発明を以下の実施例は、添付図面（第１図）
と関連してさらに詳説するものである。添付図面
には、タンパク質Ｃ−活性測定の校正曲線が図示
されている。活性剤を有するかないしは有しない
部分トロンボプラスチン時間の割合（比）は、血
漿中のタンパク質Ｃのパーセンテージ濃度に対し
てプロツトされている。 例 １ マムシ毒からの高純度のタンパク質Ｃ活性剤製
剤の製造 マムシ（A.Contortrix）毒１ｇを水100mlに溶
解し、この溶液のPH値をｏ−リン酸0.3モル／
で3.0にし、酸性の蛇毒溶液を10分間水浴中で70
±２℃に保ち、引続き20℃に冷却し、PH値の苛性
ソーダ液（１モル／）で7.2にする。この溷濁
液を遠心分離し、上澄液を蒸留水で体積100mlに
希釈し、こうして予備精製した毒画分を得る。 予備精製した毒画分を、リン酸ナトリウム緩衝
液１ １あたり0.015モル（PH6.8）で平衡化した
DEAE−セフアデツクス（Sephadex ）Ａ−50
を有するサイズ2.6×90cmのカラム上に装入し、
リン酸ナトリウム緩衝液0.015モル／（PH6.8）
およびリン酸ナトリウム緩衝液0.015モル／
（PH6.8）中の塩化ナトリウム0.4モル／からな
る直線勾配の混合液で溶離しかつそれぞれ20mlの
画分を捕集する。個々の画分のタンパク質Ｃ活性
作用を、ヒトのクエン酸血漿0.1mlに、試料（水
に１：350に希釈した画分）0.1mlおよび試料・エ
ラグ酸試薬［アクチン（Actin ）］0.1mlおよび
0.025モル／の塩化カルシウム溶液0.1mlを加
え、すぐにストツプウオツチを作動させ凝固まで
の時間を測定することにより調べる。タンパク質
Ｃ活性剤を含有する試料は、活性剤含量に応じ
て、34秒〜200秒までの凝固時間の延長を生じさ
せる。 タンパク質Ｃを活性化する画分を合わせ、限外
濾過により溶出液の容量を1/10に濃縮し、酢酸ナ
トリウム緩衝液0.05モル／（PH5.0）にとり、
酢酸ナトリウム緩衝液0.01モル／（PH0.5）に
より平衡化したCM−セフアデツクス
（Sephadex ）Ｃ−50のカラム上に装入し、かつ
酢酸ナトリウム緩衝液0.05モル／（PH5.0）お
よび酢酸ナトリウム緩衝溶液0.05モル／中の塩
化ナトリウム0.4モル／からなる直線勾配の混
合液で溶離し、それぞれ20mlの画分を捕集し、該
画分を上記方法に従つてタンパク質Ｃ活性化作用
を調べる。 タンパク質Ｃ活性化画分を一緒に混合し、限外
濾過によりその容積を1/25に濃縮し、蒸留水中１
％の酢酸で25mlにし、蒸留水中１％の酢酸で平衡
化したセフアデツクス（Sephadex ）Ｇ−100の
カラム上に装入し、１％の酢酸で溶離し、かつそ
れぞれ20mlの画分を捕集し、この画分を再び上記
方法に従つてタンパク質Ｃ−活性作用を調べる。 タンパク質Ｃ−活性画分を合わせ、かつ凍結乾
燥する。無塩の活性剤製剤が得られ、このものは
ポリアクリルアミドゲル−電気泳動で唯一のバン
ドおよび35U／mgのタンパク質Ｃ活性化の活性を
示す。 タンパク質Ｃ−活性剤の単位(U)は、正常のヒト
のクエン酸血漿１ml中に含有されているタンパク
質Ｃの量を完全に活性化する量である。 例 ２ 部分トロンボプラスチン時間の延長による活性
タンパク質Ｃの測定（例１によるタンパク質Ｃ
−活性化剤の存在で） 希釈した血漿試料（0.9％の塩化ナトリウム溶
液により１＋４）25μ＋タンパク質Ｃ欠乏の標
準血漿25μおよび、トリス／HCl 10ミリモル／
（PH7.6）中のケフアリンおよびエラグ酸から
なる試薬500μを、プラスチツク製クベツト中
で37℃でインキユベートする。正確に１分後、 １ 例１によるタンパク質Ｃ−活性剤20μ（濃
度：フラスコ内容物＝0.9％のNaCl溶液３ml中
3U）または ２ 0.9％のNaCl溶液20μを添加し、混合しか
つさらにインキユベートする。正確に４分後、
クロモチム（Chromozym ）TH（Tos−Gly
−Arg−pNA）1.1ミリモル／および酢酸カ
ルシウム100ミリモル／からなる出発試薬
150μを添加しかつ光度計中405nｍで規定量
の基質が新しく生じたトロンビンによりTos−
Gly−Pro−Argとパラニトロアニリン（pNA）
とに変換されるまでの時間を測定する。変換さ
れた基質の測定量は、限界吸光値（たとえば△
Ｅ＝0.2）によつて定義される。 記載された条件下で、部分トロンボプラスチン
時間は、活性剤プロタツクを混合物中に添加した
場合、血漿試薬中のタンパク質Ｃの濃度に比例し
て増加する。部分トロンボプラスチン時間はとり
わけ血漿の因子含量に依存するので、0.9％の
NaCl−溶液により空値を一緒に測定するのが有
利である。活性剤を用いるPTT時間と活性剤な
しのPTT時間との割合は、タンパク質Ｃ含量の
尺度であるる。さまざまの公知タンパク質Ｃ濃度
の血漿試料を用いて得られる校正曲線により未知
の血漿試料のタンパク質Ｃ濃度を決定することが
できる。表には、３つの例、未知のタンパク質Ｃ
濃度の血漿試料が含まれている。 【表】
ンパク質Ｓの活性を測光により測定する方法に関
する。 従来の技術 タンパク質Ｃは、血漿中の、ビタミンＫ依存性
の２本鎖の糖タンパク質である。その合成は肝臓
中で行なわれる。その際、まず初めに凝固生理的
に不活性の前駆物質（デカルボキシ−タンパク質
Ｃ）が形成される。ビタミンＫ依存性カルボキシ
ラーゼによりタンパク質中のγ−グルタミン酸基
をカルボキシル化すると、タンパク質Ｃが生じ
る。タンパク質Ｃ自体は酵素前駆体であり、トロ
ンビンにより活性タンパク質Ｃに変わる。該活性
タンパク質は、活性凝固因子およびのタンパ
ク質分解失活により、抗凝血物質として働く。活
性タンパク質Ｃの抗凝血作用は、補助因子タンパ
ク質Ｓにより強化される。タンパク質Ｓは、血漿
中の１本鎖の、同様にビタミンＫ依存性糖タンパ
ク質である。活性タンパク質Ｃおよびタンパク質
Ｓは、等モルの複合体を形成する。タンパク質Ｃ
ならびにタンパク質Ｓの血中濃度の低下は、肝臓
疾患、消費性凝固障害（DIC）の患者においてお
よびワルフアリン治療によつても報告されてい
る。タンパク質Ｃまたはタンパク質Ｓの先天性欠
乏は、静脈血栓塞栓症の危険を伴う。従つてタン
パク質Ｃ、ならびにタンパク質Ｓは、生理的止血
の場合ならびに多くの疾病、とくに血栓症におい
て重要である。 今まで市場で入手できるテスト方法では、血漿
中のタンパク質Ｃの量が酵素で標識された抗体に
より測定される。しかし、この方法は、測定に使
用された抗体が上記のデカルボキシタンパク質Ｃ
とも反応するという欠点を有する。デカルボキシ
タンパク質の血漿中濃度は、抗凝固剤処置の間に
しばしば強く増加するので、この方法は場合によ
つては間違つたまたは不十分な治療を生じる大き
な治療ミスをみたらす。 血漿中のタンパク質Ｃの免疫学的測定方法にお
ける欠点は、該方法がタンパク質Ｃ分子の生物学
的活性に関する情報を提供しないことである。著
しく減少した生物学的活性を有する異常なタンパ
ク質Ｃ（遺伝的変形）の存在は、このような方法
では見出すことができない。 R.B.フランシス（R.B.Francis）およびM.J・
パツチ（M.J・Patch）［“トロンボシス・リサー
チ（Thrombosis Research）”第32巻、第605頁
〜第613頁、1983年］は、ヒトの血漿からの活性
タンパク質Ｃを部分トロンボプラスチン時間の測
定（PTT−テスト）により測定する方法を示し
ている。この方法では、クエン酸バリウムに吸着
させて血漿から分離したタンパク質Ｃをトロンビ
ンの添加により活性化し、その後でトロンビンを
アンチトロンビンおよびヘパリンの添加により
阻害する。ヘパリンは再度、そのつど新規に測定
すべき正確な量の硫酸プロタミンにより中和す
る。その後、タンパク質Ｃは部分トロンボプラス
チン時間により測定される。この場合、指示薬反
応は、トロンビンにより惹起されるフイブリノー
ゲンの分解およびフイブリン凝血である。 R.M.ベルチナ・エ・アル（R.M.Bertina et
al）（“トロンボ・ヘモスタス（Thromb.
Haemostas）”第51巻、(1)第１頁〜第５頁、
1984）は、タンパク質Ｃ活性の測定のための分光
測光法を記載している。この方法は、３つの独立
した工程を包括している。 １ Al（OH）3吸着によるタンパク質Ｃの単離。 ２ 血漿から分離されたタンパク質Ｃのトロンビ
ンでの活性化、ならびに引続く等モル量のアン
チトロンビンおよびヘパリンによるトロンビ
ンの阻害。 ３ 色素原基質（S2366＝Ｈ pyro−Glu−Pro−
Arg−pNA）を用いる。単離された活性タン
パク質Ｃのタンパク質分解活性の測定。 この方法は、この基質が同様に他の凝血プロテ
アーゼによつても分解されるので、タンパク質Ｃ
の特異性に関して不十分である。それにより、不
正な結果が生じうる。 他の測光測定法においては、マムシ
（Agkistrodon contortrix）の蛇毒から得られる
タンパク質Ｃ活性剤プロタツク（Protac ）［ペ
ンタフアーム（Pentapharm）社製造、スイス
在］ならびに色素原タンパク質Ｃ基質（２
AcOH・Ｈ−Pro−Pro−Arg−pNA）が使用さ
れる。この方法の場合、試料の準備は必要ない。
しかし、この方法では、カルボキシル化されたタ
ンパク質Ｃとカルボキシル化されてないタンパク
質Ｃとを区別することができない。しかし、カル
ボキシル化されたタンパク質Ｃだけが生体内で有
効であることは公知である。従つて、この方法で
は、タンパク質Ｃ分子の生物学的活性についての
情報を得ることはできない。 タンパク質Ｃを測定するための他の公知の方法
では、同じくタンパク質Ｃ−活性剤としてプロタ
ツク が使用される。その際、タンパク質Ｃの測
定は、活性剤添加後、内在性凝血システムについ
て血餅形成試験（Clotting−Test）によつて行な
われる。この方法を用いると実際に、カルボキシ
ル化されたタンパク質Ｃとカルボキシル化されて
ないタンパク質Ｃとを区別することは可能である
が、この方法は、凝血形成（血餅形成）によつて
検出を行なわねばならないという欠点を有する。
従つて、この測定は、妨害を受けやすくかつ自動
化できないことが判明している特定の検出法［た
とえばヘツケル（Haekel）法または磁場法］に
よつて行なわれる。 本出願人の以前の提案によればPC−測定は、
差当りトロンビンを作用させて活性タンパク質Ｃ
を形成させ、その後このトロンビンを失活させ、
引続き凝固カスケードによつて新たに形成したト
ロンビンを、合成トロンビン基質を用いて測定す
ることによつて行なわれる。その場合実際に、タ
ンパク質Ｃなしで行なつた実験と比較してトロン
ビン形成の緩慢化が測定される。 血漿中のタンパク質Ｓの量は、たとえばベルチ
ナ・エ・アル（Bertina et al.）“トロンボ・ヘ
モスタス（Thromb Haemostas）”、第53巻(2)、
第268頁〜第272頁（1985年））により記載されて
いるような放射線免疫測定試験で測定することが
できる。しかしこの方法は、測定のために使用さ
れる抗体が、非機能性タンパク質Ｓ、つまりたと
えばデカルボキシタンパク質ＳまたはC4b−結合
したタンパク質により複合化されたタンパク質Ｓ
と反応するという欠点を有する。この欠点は、場
合によつては、不正のタンパク質Ｓ値およびそれ
により不十分な治療を生じる。 同じ論文中に著者ベルチナおよび協力者は、ヒ
トの血漿からの機能性タンパク質Ｓを測定するこ
とのできる方法も記載している：ヒトの血漿に活
性タンパク質Ｃを混合し、引続いてこの混合物の
部分トロンボプラスチン時間（PTT）を測定す
る場合、PTTは、機能性タンパク質Ｓの濃度が
大きければ大きいほどそれだけ長くなる。この場
合でも指示薬反応は、トロンビンにより惹起され
るフイブリノーゲンの分解およびフイブリン血餅
形成である。従つて、この方法は、妨害を受けや
すくかつ一般に自動化不可能な検出法である。該
方法は、精製された活性タンパク質Ｃを添加しな
ければならずかつ血漿中のタンパク質Ｃおよびタ
ンパク質Ｓを同時に測定することができないとい
う他の欠点を有する。 発明が解決しようとする問題点 本発明の課題は、上述した方法よりも簡単に実
施できかつ自動化可能な生物学的に有効なタンパ
ク質Ｃまたはタンパク質Ｓを測光により測定する
方法を提供することである。 問題点を解決するための手段 この課題は、タンパク質Ｃまたはタンパク質Ｓ
を測定するために、蛇毒からのタンパク質Ｃに対
する活性剤、凝固系に対する活性剤および色素原
トロンビン基質を同時に使用し、かつ凝固因子
およびに対するタンパク質Ｃおよびタンパク質
Ｓの作用を色素原トロンビン基質の分解によつて
測定することによつて解決される。 本発明は、蛇毒からのタンパク質Ｃ−活性剤が
他のタンパク質Ｃ−活性剤と異なり、トロンビン
基質を分解しないという意想外の認識に基づいて
いる。このことは、たとえばプロタツク
（Protac ）がその作用においてトロンビン類似
のタンパク質Ｃ−活性剤であるため意想外であつ
た。その結果、色素原トロンビン基質もまた蛇毒
−活性剤ないしは活性剤とタンパク質Ｃとの混合
物により変換されることも予想される。それとい
うのもトロンビンおよび他の場合に公知のタンパ
ク質Ｃ活性剤（たとえばプラスミン、トリプシ
ン）は色素原トロンビン基質を変換するからであ
る。従つて、この種のタンパク質Ｃ活性剤を使用
する場合、タンパク質Ｃの活性化の後に活性剤を
失活させなければならない。引続いてはじめて凝
固系に対する活性剤および色素原トロンビン基質
を添加することができる。しかし、蛇毒からのタ
ンパク質Ｃ活性剤を使用する場合、意想外に、こ
の失活工程を除外できることが示される。むし
ろ、凝固系に対する活性剤および色素原トロンビ
ン基質は既に測定開始の際に添加することが可能
である。 タンパク質Ｃ−活性剤としては、本発明の範囲
内で、毒蛇たとえばアグキストロドン コントル
トリクス コントルトリクス（Agkistrodon
contortrix contortrix）、A.C.モカセン（A.C.
mokasen）、A.C.ピクチガスター（A.C.
Pictigaster）、A.ピスシボウルス（A.
piscivours）、A.p.コイコストマ（A.p.
leucostoma）、A.ビリネアトウス（A.
bilineatus）、ボトロプス モオジエニ
（Bothrops moojeni）、B.プラドイ（B.pradoi）、
セラステス セラステス（Cerastes cerastes）、
ビペラ レベトリナ（Vipera lebetrina）または
V.ルセリイ（V.russellii）の蛇毒の溶液が使用さ
れる。しかし、有利には、マムシ（Agkistrodon
contortrix controtrix）の蛇毒から単離された
タンパク質Ｃ活性剤が使用される。 有利には、血漿中でタンパク質Ｃのみを活性化
する毒または毒成分が使用され、その際所望の毒
成分は蛇の毒から容易に分離することができる。 このためには、一般に常用の方法、たとえば陰
イオン交換体クロマトグラフイー、タンパク質Ｃ
を用いるアフイニテイークロマトグラフイーまた
は／および限外濾過を使用することができる。 活性剤は、活性剤溶液１mlあたりの単位(U)で
0.05〜5U／ml、有利には0.5〜1U／mlの濃度で使
用される。この場合タンパク質Ｃ活性剤１単位(U)
は、正常のヒトのクエン酸血漿１ml中に含まれて
いる量のタンパク質Ｃを37℃、PH７〜８で、血漿
１容量部とタンパク質Ｃ活性剤水溶液４〜８容量
部からなる反応混合液中で完全に活性化する量と
して定義されている。 活性タンパク質Ｃ（APC）は凝固因子および
をタンパク質分解により失活させ、その際タン
パク質Ｓは補助因子として働くので、本発明によ
る方法の場合には有利に凝固系は、凝固因子に対
する活性剤または凝固因子自身の添加によつて、
因子ないしの失活がトロンビン形成のできる
だけ顕著な減少において生じるように変えられ
る。 本発明方法の第１の実施態様によれば、これは
有利に、因子XIIに対する活性剤としてケフアリン
を添加したエラグ酸を添加することによつて達成
される。このすぐれた方法の第２の実施態様によ
れば、因子の活性剤としてトロンボプラスチン
および因子の活性剤が添加される。第３の実施
態様によれば、因子の活性剤として、ケフアリ
ンを添加した因子ａが添加される。通常は、こ
の場合に使用される緩衝液はなお付加的にカルシ
ウムイオンを含有する。 この有利な本発明の実施態様は、凝固パラメー
ターである因子XII、XI、、、およびの濃
度がトロンビン形成時間に影響を与え、これらの
因子の濃度が高ければ高いほど、特定のトロンビ
ン限界値の測定はますます速く達成されるという
事実を考慮する。 トロンビン形成は、本発明の範囲内では、自体
公知の方法で測定される。これに適しているのは
部分−トロンボプラスチン時間（PTT）法であ
る。これを実施する場合には有利に、因子XIIの活
性剤が添加される。トロンビン形成は、プロトロ
ンビン時間方法によつても測定することができ
る。この場合には、有利に因子の活性剤および
因子ａが添加される。 色素原トロンビン基質としては、本発明の範囲
内で、トロンビン測定に適した色素原基質が使用
される。有利には、本発明の範囲内でＨ−Ｄ−
Phe−Pip−Arg−pNAまたはTos−Gly−Pro−
Arg−nNA（式中pNA＝パラ・ニトロアミンを表
わす）が使用される。pNAは基質の色素原成分
でありかつトロンビン形成により分離されるの
で、測光により公知方法で測定することができ
る。 凝固系としては、たとえば因子〜XIIの混合物
または基質血漿（たとえばタンパク質Ｃ−ないし
タンパク質Ｓ欠乏血漿）が使用される。 本発明の範囲内では、さまざまな血漿を使用す
ることができ、有利にはクエン酸血漿が使用され
る。 この方法は、中性または弱アルカリ性PH値、と
くにPH６〜９の間のPH値において実施することが
できる。緩衝溶液としては、この範囲において有
効で生理的に懸念のない緩衝溶液、たとえば
Tris／HClが使用される。さらに、凝固試験に常
用の安定剤および保存剤、たとえば牛血清アルブ
ミン、メルチオレート等も同様に添加することが
できる。 本発明による方法を用いると、タンパク質Ｃお
よびタンパク質Ｓは一緒にかまたはタンパク質Ｃ
ないしはタンパク質Ｓをそれぞれ単独に測定する
ことができる。 タンパク質Ｃおよびタンパク質Ｓを一緒に測定
する場合には、患者の血漿を直接に測定のために
使用することができる。タンパク質Ｃを単独で測
定する場合には、試薬以外になおタンパク質Ｃを
添加しなければならない。これは有利に、タンパ
ク質Ｓを含有する、タンパク質Ｃ欠乏血漿の形で
行なわれる。この場合でも、少なくとも予想され
るタンパク質Ｓ濃度と同量のタンパク質Ｃが添加
しなければならない。 タンパク質Ｓ−ないしはタンパク質Ｃ−欠乏血
漿は、たとえばベルチナおよび協力者
“Thromb.Haemostas”（シユトツトガルト）第
51巻第１頁〜第５頁（1984年）ないしはベルチナ
およびR.M.、et al.“Thromb.Haemostas.“第53
巻第268頁〜第272頁（1985年）に記載されたよう
な免疫吸着クロマトグラフイーによつて製造でき
る。 実施例 本発明を以下の実施例は、添付図面（第１図）
と関連してさらに詳説するものである。添付図面
には、タンパク質Ｃ−活性測定の校正曲線が図示
されている。活性剤を有するかないしは有しない
部分トロンボプラスチン時間の割合（比）は、血
漿中のタンパク質Ｃのパーセンテージ濃度に対し
てプロツトされている。 例 １ マムシ毒からの高純度のタンパク質Ｃ活性剤製
剤の製造 マムシ（A.Contortrix）毒１ｇを水100mlに溶
解し、この溶液のPH値をｏ−リン酸0.3モル／
で3.0にし、酸性の蛇毒溶液を10分間水浴中で70
±２℃に保ち、引続き20℃に冷却し、PH値の苛性
ソーダ液（１モル／）で7.2にする。この溷濁
液を遠心分離し、上澄液を蒸留水で体積100mlに
希釈し、こうして予備精製した毒画分を得る。 予備精製した毒画分を、リン酸ナトリウム緩衝
液１ １あたり0.015モル（PH6.8）で平衡化した
DEAE−セフアデツクス（Sephadex ）Ａ−50
を有するサイズ2.6×90cmのカラム上に装入し、
リン酸ナトリウム緩衝液0.015モル／（PH6.8）
およびリン酸ナトリウム緩衝液0.015モル／
（PH6.8）中の塩化ナトリウム0.4モル／からな
る直線勾配の混合液で溶離しかつそれぞれ20mlの
画分を捕集する。個々の画分のタンパク質Ｃ活性
作用を、ヒトのクエン酸血漿0.1mlに、試料（水
に１：350に希釈した画分）0.1mlおよび試料・エ
ラグ酸試薬［アクチン（Actin ）］0.1mlおよび
0.025モル／の塩化カルシウム溶液0.1mlを加
え、すぐにストツプウオツチを作動させ凝固まで
の時間を測定することにより調べる。タンパク質
Ｃ活性剤を含有する試料は、活性剤含量に応じ
て、34秒〜200秒までの凝固時間の延長を生じさ
せる。 タンパク質Ｃを活性化する画分を合わせ、限外
濾過により溶出液の容量を1/10に濃縮し、酢酸ナ
トリウム緩衝液0.05モル／（PH5.0）にとり、
酢酸ナトリウム緩衝液0.01モル／（PH0.5）に
より平衡化したCM−セフアデツクス
（Sephadex ）Ｃ−50のカラム上に装入し、かつ
酢酸ナトリウム緩衝液0.05モル／（PH5.0）お
よび酢酸ナトリウム緩衝溶液0.05モル／中の塩
化ナトリウム0.4モル／からなる直線勾配の混
合液で溶離し、それぞれ20mlの画分を捕集し、該
画分を上記方法に従つてタンパク質Ｃ活性化作用
を調べる。 タンパク質Ｃ活性化画分を一緒に混合し、限外
濾過によりその容積を1/25に濃縮し、蒸留水中１
％の酢酸で25mlにし、蒸留水中１％の酢酸で平衡
化したセフアデツクス（Sephadex ）Ｇ−100の
カラム上に装入し、１％の酢酸で溶離し、かつそ
れぞれ20mlの画分を捕集し、この画分を再び上記
方法に従つてタンパク質Ｃ−活性作用を調べる。 タンパク質Ｃ−活性画分を合わせ、かつ凍結乾
燥する。無塩の活性剤製剤が得られ、このものは
ポリアクリルアミドゲル−電気泳動で唯一のバン
ドおよび35U／mgのタンパク質Ｃ活性化の活性を
示す。 タンパク質Ｃ−活性剤の単位(U)は、正常のヒト
のクエン酸血漿１ml中に含有されているタンパク
質Ｃの量を完全に活性化する量である。 例 ２ 部分トロンボプラスチン時間の延長による活性
タンパク質Ｃの測定（例１によるタンパク質Ｃ
−活性化剤の存在で） 希釈した血漿試料（0.9％の塩化ナトリウム溶
液により１＋４）25μ＋タンパク質Ｃ欠乏の標
準血漿25μおよび、トリス／HCl 10ミリモル／
（PH7.6）中のケフアリンおよびエラグ酸から
なる試薬500μを、プラスチツク製クベツト中
で37℃でインキユベートする。正確に１分後、 １ 例１によるタンパク質Ｃ−活性剤20μ（濃
度：フラスコ内容物＝0.9％のNaCl溶液３ml中
3U）または ２ 0.9％のNaCl溶液20μを添加し、混合しか
つさらにインキユベートする。正確に４分後、
クロモチム（Chromozym ）TH（Tos−Gly
−Arg−pNA）1.1ミリモル／および酢酸カ
ルシウム100ミリモル／からなる出発試薬
150μを添加しかつ光度計中405nｍで規定量
の基質が新しく生じたトロンビンによりTos−
Gly−Pro−Argとパラニトロアニリン（pNA）
とに変換されるまでの時間を測定する。変換さ
れた基質の測定量は、限界吸光値（たとえば△
Ｅ＝0.2）によつて定義される。 記載された条件下で、部分トロンボプラスチン
時間は、活性剤プロタツクを混合物中に添加した
場合、血漿試薬中のタンパク質Ｃの濃度に比例し
て増加する。部分トロンボプラスチン時間はとり
わけ血漿の因子含量に依存するので、0.9％の
NaCl−溶液により空値を一緒に測定するのが有
利である。活性剤を用いるPTT時間と活性剤な
しのPTT時間との割合は、タンパク質Ｃ含量の
尺度であるる。さまざまの公知タンパク質Ｃ濃度
の血漿試料を用いて得られる校正曲線により未知
の血漿試料のタンパク質Ｃ濃度を決定することが
できる。表には、３つの例、未知のタンパク質Ｃ
濃度の血漿試料が含まれている。 【表】
第１図は、活性剤を有する場合と有しない場合
の部分トロンボプラスチン時間の比を、血漿中の
タンパク質Ｃの濃度（％）に対してプロツトした
タンパク質活性測定の校正曲線図である。
の部分トロンボプラスチン時間の比を、血漿中の
タンパク質Ｃの濃度（％）に対してプロツトした
タンパク質活性測定の校正曲線図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ タンパク質Ｃ−またはタンパク質Ｓ−活性を
測光測定する方法において、測定すべきタンパク
質Ｃまたはタンパク質Ｓを含有する試料を、蛇毒
からのタンパク質Ｃ−活性剤と共に、活性タンパ
ク質Ｃまたはタンパク質Ｓの形成下にインキユベ
ートし、因子XII、因子または因子の活性剤を
添加し、かつ凝固因子およびその活性剤により媒
介される、プロトロンビンからのトロンビンの形
成の減少を、色素原トロンビン基質を使用して測
定することを特徴とするタンパク質Ｃ−またはタ
ンパク質Ｓ−活性を測光測定する方法。 ２ タンパク質Ｃ−活性剤としてマムシ（アグキ
ストロドン コントルトリクス コントルトリク
ス）の蛇毒またはそれらの成分の溶液を使用する
特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ タンパク質Ｃ−活性剤として蛇毒A.C.モカ
ゼン、A.C.ピクチガスター、A.ピスチボウルス、
A.P.ロイコストマ、A.ビリネアトウス、ボトロ
プス−モオジユニ、B.プラドイ、セラーステス
−セラステス、ビペラ−レベトリナまたはV.ル
セリイを使用する特許請求の範囲第１項記載の方
法。 ４ 色素原トロンビン基質としてＨ−Ｄ−Phe−
Pip−Arg−pNAまたはTos−Gly−Pro−Arg−
pNAを使用する特許請求の範囲第１項から第３
項までのいずれか１項記載の方法。 ５ ケフアリンおよびエラグ酸を添加する特許請
求の範囲第１項から第４項までのいずれか１項記
載の方法。 ６ 因子ならびに因子の活性剤としてトロン
ボプラスチンを添加する特許請求の範囲第１項か
ら第５項までのいずれか１項記載の方法。 ７ ケフアリンおよび因子ａを添加する特許請
求の範囲第１項から第６項までのいずれか１項記
載の方法。 ８ タンパク質Ｃ−欠乏血漿を添加する特許請求
の範囲第１項から第７項までのいずれか１項記載
の方法。 ９ タンパク質Ｓ−欠乏血漿を添加する特許請求
の範囲第１項から第７項までのいずれか１項記載
の方法。
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