JPH0477435A - 癌転移抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は癌転移抑制剤に関し、更に詳細には生体中油性
ポリペプチドであるフィブロネクチン分子中の機能性ド
メインの癌転移抑制剤としての用途に関する。

〔従来の技術〕

癌治療においては種々の薬物療法や外科療法が行われて
いるが、その効果は十分とは言えない。

特に外科療法における術後の再発は深刻な問題となって
いる。癌の再発は癌の転移に起因するものでありそのた
め癌転移抑制剤の開発が行われできた。

癌の転移に関しては癌細胞自体の有する血小板凝集活性
が関与することが知られており、血小板凝集抑制剤チク
ロピジンが癌転移抑制効果を有することが知られている
。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、血小板凝集抑制剤は癌細胞のみならず一
般の血小板凝集抑制の作用も有するため弊害がある。

本発明の目的は、血小板凝集抑制を有さない新たな癌転
移抑制剤を提供することにある。

〔課題を解決するだめの手段〕

本発明を概説すれば、本発明は、癌転移抑制剤に関し、
フィブロネクチン分子中のヘパリン結合ポリペプチドに
相当するポリペプチドを含有することを特徴とする。

本発明者らは生体内物質であるフィブロネクチン（以下
、ＦＮと略称する）の機能性ドメインに関し鋭意研究を
行った結果、ヘパリン接合ポリペプチドが顕著な癌転移
抑制効果を有すること及び血小板凝集を抑制しないこと
を見出し、本発明を完成した。

以下、本発明の詳細な説明する。

ＦＮは、分子量約２５万のポリペプチドがＣ末端付近で
Ｓ−８結合で２量体を形成している。

分子内アミノ酸配列は、繰返し構造を有し、■、■、■
型に分けられる。更に、種々の機能を有するドメイン構
造を有し、細胞接着、コラーゲン、ヘパリン及びフィブ
リン等に対する結合活性を示す。

本発明者らはＦＮの機能性ドメインの新たな用途につい
て研究を行った結果、ヘパリン結合ポリペプチドが顕著
な癌転移抑制作用を有することを見出した。

本発明においてヘパリン結合ポリペプチドとは、ＦＮの
ヘパリン結合ドメインに含有され、かつヘパリン結合活
性を有するポリペプチドに相当するポリペプチドであれ
ばよく特に限定はない。

上北ポリペプチドの例としては、本発明者らが創製した
特願平１−１３１４５３号明細書中に開示されているヘ
パリン結合ポリペプチド力（挙げられる。該明細書中記
載のポリペプチド′（まる。

以下にヘパリン結合ポリペプチドの一例とし述する。

２７１アミノ酸残基ポリペプチド ７　ｈｒ　ｌ　９６０）は下記式Ｉ： 人！ａ’ｌｌｅ　　Ｐｒ。　ＡＩａ　　ｐｒ。Ｔｈｒ　
　ＡｓｐＴｈｒ　Ｇｌｎ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔ
ｈｒ　５ｅｒＧｉｎ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ
＾ｓｎ　ＶａｌＧｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｒ−ｇ　Ｖａｌ　Ａ
ｒｇ　Ｖａｌ　ＴｈｒＬｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ
　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　ＧｌｕＡｌａ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｓ
ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＶａｌＧｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ｍ
ｅｔ　　Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　ＬｙｓＳｅｒ
　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　ＡｓｐＳ
ｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｖａ
ｌＬｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　
Ｐｒ。

（Ａｌａ１６９０ しｅｕ しｅｕ １ｎ Ｐｒ。

１ｅ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ 八ｒｇ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ 八ｓｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ 八ｒｇ Ｐｈｅ 八１ａ Ｔｈｒ Ｇｌｕ しｅｕ Ｓｅｒ νａ） Ｔｈｒ Ｔｈｒ ＡＩａ Ａｒｇ　　Ｖａｌ Ｔｈｒ　　ｌ１ｅ ｌｉｅ　　Ｔｈｒ Ａｌａ　　Ａｓｎ １ｉｅ　　Ｌｙｓ Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ ｌｉｅ　　Ｔｙｒ Ａｒｇ　５ｅｒ Ｔｈｒ　　Ａｌａ Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ Ｖａｔ　　５ｅｒ Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ Ｇｌｙ　　５ｅｒ Ｐｒｏ　　Ａｒｇ Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ ｌｉｅ　　Ｔｙｒ Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ ｔｙ Ｐｒ。

Ｌｅｕ しｅｕ Ｓｅｒ ｌｉｅ ＡＩａ ｒｐ Ｔｙｒ Ｐｒ。

Ｐｒ。

Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｐ ｒｐ Ｐｈｅ Ｇ１口 Ａｓｐ Ｇｉｎ Ｔｙｒ Ｐｒ。

Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｉｎ １ｅ Ｐｒ。

１ｙ Ｇｌｕ １ｅ Ｐｒ。

ＡＩａ Ａｒｇ Ｇｉｎ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒ。

Ｔｈｒ Ｖａｌ ＡＩａ Ｔｈｒ Ｐｒ。

１ｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｐｒ。

ＡＩａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒ。

Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｒ。

Ｐｒ。

Ｐｒ。

Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ ｌｉｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ ｌｉｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ ｌｉｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｈｒ ＡＩａ Ｇｉｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｓｅｒ ＡＩａ Ｇｌｕ Ｖａｌ ＡＩａ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｓｎ ＡＩａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｐｒ。

Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｓｎ しｙｓ １ｅ Ｔｈｒ Ｐ’ｒ　。

Ｔｈｒ ｌｉｅ Ｌｙｓ ＡＩａ Ｓｅｒ Ａｒ）Ｈ Ｌｅｕ １ｅ Ｐｒ。

Ａｒｇ ｌｉｅ Ｔｈｒ Ｇｉｎ しｙｓ ［Ｉ） で表されるアミノ酸配列で示されることを特徴とする。

なお、本明細書において、アミノ酸に付された頁数字は
、ＥＮＢＬデータバンク（ＥＭＢＬ　ＤＡＴＡ　ＢＡＮ
Ｋ）のＦＮのｃＤＮＡ配列を駐訳して得られるアミノ酸
に付与されたＮ末からのアミノ酸残基数を示す。

その製造方法は特願平１−１３１４５３号明細書に示さ
れており、以下具体的に説明する。

ヒトＦＮのヘパリン結合ドメインをコードするｃＯＮＡ
断片を含むプラスミドｐＬＦ　２４３５はバイオケミス
トリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、第２５巻、第
４９３６〜４９４１頁（１９８６）に記載されている、
ｐＬＦ　２．４．３及び５のコード領域を連結させて再
構築されたプラスミドである。

このプラスミドｐＬＦ　２４３５から必要なｃＤＮＡ断
片を制限酵素で切出し、５′側に開始コドンを含む合成
りＮＡを、また、３′側には、終止コドンを含む合成り
ＮＡをＤＮＡ！Ｊガーゼで連結した後、適当な発現ベク
ターに接続することにより、ヘパリン結合ドメインの２
７１アミノ酸残基ポリペプチド（Ａ１ａ＋５ｓｏ−Ｔｈ
ｒ＋５ｓｏ）を発現するプラスミドｐ）ｌ［ｌ　１０１
が構築される。

発現ベクターとしては、既存のものはすべて利用するこ
とができるが、例えばｐ［Ｊｃ　１１８Ｎ／ｐＵＣ１１
９Ｎ　［フェブス　レターズ（ＦＢＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ）第２２３巻、第１７４〜１８０頁（１９８７）及び
その誘導体を用いることにより好結果を得ることができ
る。このプラスミドを大腸菌に導入することにより、ヘ
パリン結合ポリペプチドを発現させ、その性質を調べる
ことができる。

２７１アミノ酸残基ポリペプチド（Ａｌａ１６９０Ｔｈ
ｒ””）を発現するプラスミドを導入した大腸菌Ｂｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｈｅ　１０１／ｐＨ０１
０１は微工研条寄第２２６４号（ＦＩｌｉＲＭ　ＢＰ−
２２６４）として寄託されている。

組換え体からこのヘパリン結合ポリペプチドの精製は、
例えば次のように行う。組換え大腸菌をＬ　（ｉｉＤグ
ロス等の培地に培養し、集菌した後、超音波処理により
、菌体破砕液を得、これを遠心分離して上清を得る。上
清を透析後、Ｄ８ＡＩＥイオン交換体のカラムを通過さ
せ、次いでＣＭイオン交換体及び／又はヘパリン−アガ
ロース等のアフィニティクロマトを行う。以上の操作に
より、目的のポリペプチドを精製することができる。

以上のようにして得られた本発明のポリペプチドを医薬
として使用する場合、必要に応じて医薬用担体と共に常
法により製剤化し、経口投与または非経口投与すればよ
い。賦形剤あるいは担体としては薬理学的に許容される
ものが選ばれ、その種類及び組成は投与経路や投与方法
によって異なる。例えば液状担体として水、アルコール
類若しくは大豆油、オリーブ油、ミネラル油等の動植物
油、又は合成油が用いられる。

固体担体としてマルトース、スクロースなどの糖類、ア
ミノ酸類、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロ
ース誘導体、ステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩
などが使用される。

注射剤の場合は溶解液は生理食塩液、各種緩衝液、クル
コース、イノシトール、マン、ニドール、ラクトースな
どの糖類溶液、エチレングリコール、ポリエチレングリ
コールなどのグリコール類カ望マしい。またイノシトー
ル、マンニトール、ラクトース、スクロース等の糖類、
フェニルアラニン等のアミノ酸等の賦形剤と共に凍結乾
燥製剤とし、それを投与時に注射用の適当な溶剤、例え
ば滅菌水、生理食塩液、ブドウ糖液、電解質溶液、アミ
ノ酸溶液等静脈投与用液体に溶解させて投与することも
できる。製剤中における本発明のポリペプチドの含量は
製剤により異なるが、通常０．１〜１００重量％好まし
くは１〜９８重量％である。例えば注射液の場合には、
通常０．１〜３０重量％、好ましくは１〜１０重量％の
有効成分を含むようにすることが望ましい。経口投与す
る場合には前記固体担体若しくは液状担体と共に、錠剤
、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、液剤、ドライシロップ剤
等の形態で用いられる。カプセル、顆粒、粉剤は一般に
５〜１００重量％、好ましくは２５〜９８重量％の有効
成分を含む。

投与量は、患者の年令、体重、症状、治療目的等により
決定されるが治療量は一般に、非経口投与で１〜１００
　ｍｇ／　ｋｇ／日、経口投与で５〜５００■／　ｋｇ
　／日である。

〔作用〕

次に本発明のポリペプチドの生理活性を実験例により示
す。

実験例１　癌転移抑制作用 ＣＤＦ、マウス（１群５匹）の静脈内に、Ｌ５１７８Ｙ
−ＭＬ２５白血病１１胞４ｘｌ（１’個を、各濃度の２
７１アミノ酸残基ポリペプチドと混合し、移植する。ま
た、対照として白血病細胞のみを移植する。

白血病細胞移植後１４日口紅各群マウスを処分し、肝臓
、膵臓を摘出し、その重量を比較する。その結果を表１
に示す。

表 ５００　　１．４２±ＯＪ５　０．１１±０．０２以上
のように、本発明のポリペプチド投与群で、白血病細胞
の肝臓、膵臓への転移が抑制さ制作用の検討 血小板凝集惹起物質として最終濃度５μＭＡＤＰ及び１
００μｇ／−のコラーゲンを用し）だ。ヒト血小板（５
ｘｌ　Ｏ５／μＡ）　０．２５ｍに最終濃度１００μｇ
／ｒｒＬｌの本発明ポリペプチドを添加し、その３０秒
後にＡＤＰ又はコラーゲンを添加した。

本発明ポリペプチドにおいても、ＡＤＰ及びコラーゲン
による血小板凝集に対する抑制作用は認められなかった
。

実験例３　急性毒性試験 ＣＤＦ、マウスに本発明ポリペプチドを静脈内投与した
。１００■／　ｋｇ投与においで毒性は認島られなかっ
た。

以上本発明ポリペプチドは、以上の実験例に示した通り
、血小板凝集阻止の効果がないにもかかわらず、Ｌ５１
７８Ｙ白血病細胞を用いる転移のモデル系にて有意な転
移防止効果を示すもので、胃癌、肺癌、大腸癌、乳癌、
前立腺癌、子宮頚癌、腎癌など癌細胞に対して良好に転
移を防止せしめてなる有用なものである。

〔実施例〕

次に実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明
の範囲は実施例に限定されるものではない。

なお、各側において、部は重量部を意味する。

製剤例１ ２７１アミノ酸残基ポリペプチド３０部に対しＰＢＳを
加え、全量を２０００部としてこれを溶解後、ミリポア
フィルタ−ＧＳタイプを用いて除菌ろ過する。このろ液
２ｇを１０艷のバイアル瓶にとり凍結乾燥し、１バイア
ルに該ポリペプチド３０ｍｇを含む凍結乾燥注射剤を得
た。

製剤例２ ２７１アミノ酸残基ポリペプチド５０部、乳糖６００部
、結晶セルロース３３０部及びヒドロキシプロピルセル
ロース２０部をよく混和し、ロール型圧縮機（ローラー
コンパクタ−）を用いて圧縮し、破砕して１６〜６０メ
ツシユの間に入るように篩過し、顆粒とした。

〔発明の効果〕

本発明のポリペプチドは生体内関連物質であり安全性が
高く、癌転移抑制剤として有用である。また遺伝子工学
的に大量に供給可能である点で顕著な効果を有する。

手続補正書（自発） 平成２年８月２ε　日 特許庁長官　　植　松　　　敏　殿 １、事件の表示　　平成２年特許願第１８７１３７号２
、発明の名称　癌転移抑制剤 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住　所　　京都府京都市伏見区竹中町６０９番地名称　
賓酒造株式会社 代表者　　１）辺　　　哲 ５、補正命令の日付 ６、補正の対象 自発補正 ７、補正の内容 明細書の発明の詳細な説明の欄を下記のとおり補正する
。

（１）　　明細書第７頁下から３行のｒＬ　（ｉｎ）プ
ロス」を「Ｌ−ブロス」と補正する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、フィブロネクチン分子中のヘパリン結合ポリペプチ
   ドに相当するポリペプチドを含有することを特徴とする
   癌転移抑制剤。