JPH0479326B2 - - Google Patents
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- JPH0479326B2 JPH0479326B2 JP60017077A JP1707785A JPH0479326B2 JP H0479326 B2 JPH0479326 B2 JP H0479326B2 JP 60017077 A JP60017077 A JP 60017077A JP 1707785 A JP1707785 A JP 1707785A JP H0479326 B2 JPH0479326 B2 JP H0479326B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
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- C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
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Description
〔利用分野〕
本発明は、プラスミノーゲンアクチベーター前
駆体（以下、前駆体という）の安定化方法に関す
る。 前駆体は生体内に存在する線維素溶解酵素の一
種であり、その詳細は特開昭58−170354号明細書
に記載されている。前駆体はそのままでは不活性
であるが、プラスミン処理することによる酵素活
性を発現する、いわゆるチモゲンである。この前
駆体はヒト腎細胞の無血清培地中にて生成でき
る。 〔従来技術〕 本前駆体は、アミノ酸411個からなる１本の鎖
状構造を有する分子量50000の蛋白である。本前
駆体は上記の如く酵素活性を示さないが、プラス
ミン処理により発現するプラスミノーゲンアクチ
ベータ活性は、抗ウロキナーゼ抗体により完全に
阻害されることから、本前駆体はウロキナーゼの
前駆体である。本前駆体はフイブリンに対して特
異的な親和性を有し、また血栓を構成する線維で
あるフイブリンを選択的に分解するなど、従来の
ウロキナーゼ（以下、UKと略す）とは異なる血
栓溶解特性を有する。UKとは異なる優れた特性
を有する本前駆体は線維素溶解酵素として臨床上
の幅広い利用が期待される。 〔発明が解決しようとする問題点〕 一般に蛋白は、溶液中においては不安定な状態
となる。前駆体に関しても同様の可能性がある。
このため、精製工程中あるいは急速凍結融解時に
前駆体の変性、分解、力価の低下等の問題が危倶
される。 前駆体用の安定化剤としては、アルブミンが知
られているが、アルブミンは、時として重合体を
形成する場合があり、これが最終製剤中に含まれ
ている場合、抗原性の点で危倶される。 従つて、本発明の目的は、抗原性の問題のな
い、前駆体の安定化方法を提供することである。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、かかる問題点を解決すべく、
種々研究を重ねた結果、ポリアルキレングリコー
ル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共
重合体、マンデル酸塩、トリエタノールアミン、
アセチルグリシルリジンメチルエステルの酸付加
塩、グアニジン塩、チオシアン酸塩、ヨウ化アル
カリ金属塩、セリンが前駆体に対して安定化作用
を有することを見い出し、本発明を完成した。 即ち、本発明は、前駆体溶液に、ポリアルキレ
ングリコール、ポレオキシエチレンポリオキシプ
ロピレン共重合体、マンデル酸塩、トリエタノー
ルアミン、アセチルグリシルリジンメチルエステ
ルの酸付加塩、グアニジン塩、チオシアン酸塩、
ヨウ化アルカリ金属塩、セリンより選ばれた少く
とも１種類の安定化剤を添加することを特徴とす
るプラスミノーゲンアクチベーター前駆体の安定
化方法に関する。 本発明で用いられる前駆体はその由来を限定さ
れるものではなく、たとえば血漿由来、ヒト腎細
胞を無血清培地中で培養する方法にて得られたも
の、遺伝子工学に基づくものなどが挙げられる。
このうち、腎細胞培養法および前駆体の回収・精
製法は、特願昭58−170354に開示されている。 また、本発明において、前駆体の純度は特に限
定されないが、一般に濃度（活性）は低い方が本
発明の安定化効果が大である傾向がみられる。例
えば、100〜2000IU／ml程度の濃度が例示される
〔なお、IUはUKの国際単位の略である。前駆体
１mlをプラスミン処理した時のUK活性に相当す
る1IU／mlは前駆体溶液１mlをプラスミン処理と
た時に、UK1IUと同等の活性を有することを意
味する。以下同様〕 本発明にて使用されるポリアルキレングリコー
ルにおけるアルキレンとしては、メチレン、エチ
レンなどの炭素数１〜５のものが好ましい。ま
た、当該アルキレングリコールはその分子量が
4000〜8000であることが好ましい。 ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重
合体は分子量2000〜20000のものが好ましく、具
体的にはプルロニツクF68が例示される。 マンデル酸塩としては、例えばナトリウム塩、
カリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩があ
げられる。 アセチルグリシルリジンメチルエステルの酸付
加塩における酸付加塩としては、酢酸塩等の有機
酸塩、塩酸塩、硫酸塩等の無機酸塩が例示され
る。 グアニジン塩としては、塩酸塩、硫酸塩などの
酸付加塩、特に鉱酸塩が好ましいものとして例示
される。 チオシアン酸塩としては、ナトリウム塩、カリ
ウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、
カリウム塩などのアルカリ土類金属塩が例示され
る。 また、ヨウ化アルカリ金属塩としては、ナトリ
ウム塩、カリウム塩などが例示される。 本発明で用いられる安定化剤は、好ましくは前
駆体100〜20000IU／ml当り1.5〜20w／ｖ％程度
配合することによつてその安定化効果を発揮す
る。 本発明において、前記安定化剤は、前駆体の精
製時、前駆体の製剤化時、前駆体製剤の保存時な
ど前駆体が不活性化されうる条件下に置かれる任
意の時期に添加される。 なお、本発明において、他の安定化剤を加える
ことも当然可能である。例えば、無機塩（例えば
塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム等）や有機
塩（例えば、アスコルビン酸、グルタミン酸等）
の添加は好適である。 〔作用・効果〕 本発明にて使用される安定化剤は、前駆体に対
して強力な安定化作用を有するものである。従つ
て、本発明の方法によれば、溶液中でも前駆体が
活性を失うこともなく、また、凍結乾燥・融解を
行つても前駆体の安定性がたもたれる。 実施例 １ 特願昭58−170354の方法によつて得られた前駆
体（210IU／mlに相当）と各種濃度のKSCNを混
合後、二分し、一方は５℃で30分保存後、力価を
測定した。 他方は、ドライアイス・エタノール（約−30
℃）と37℃恒温槽中で３分ずつ５回凍結融解を繰
り返した後、力価を測定した。 それぞれの力価測定結果は、第１表に示す通り
である。なお、第１表中に示した力価は、前記処
理を行う前の力価を100とした場合に対する残存
活性である。 力価測定方法は次の通りである。 検体0.1mlとプラスミン溶液0.1mlを加え、37℃
で10分間インキユベーシヨンを行つた。さらに、
Glt−Gly−Arg−MCA（ｐ−MCA）溶液１ml加
え、37℃で20分間インキユベーシヨンを行つた。
この溶液に18％酢酸1.5mlを加え、励起波長
370nm、蛍光波長460nmで蛍光強度を測定した。 力価測定（ｐ−MCA法）用試薬 (1)ゼラチンバツフアー トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
6.06g、NaC5.84g，ゼラチン（Difco社製）
10.0gを蒸留水で溶かし、2N−HCでPH8.60に
調整した後、１とし、121℃、20分オートクレ
ーブで滅菌した。 (2)ｐ−MCA溶液 大阪大学タンパク質奨励会製造のGlt−Gly−
Arg−MCA1バイアルに、ジメチルスルホキシド
（DMSO）１mlを加え溶解し、(1)のバツフアーで
希釈し、100ml fill upした。その際、MCA濃度
は0.1mMであり、当該溶液は用時に調整された。 (3)プラスミン溶液 ラボケム用プラスミン（ミドリ十字社製）１バ
イアル（25CU）を５mlの(1)のバツフアーで溶液
し、その0.1mlずつを凍結保存し、用時2.4mlの(1)
のバツフアーを加えて希釈し、（0.2CU／ml）使
用した。 (4)18％酢酸 18ml酢酸を蒸留水で希釈し、100mlとした。
駆体（以下、前駆体という）の安定化方法に関す
る。 前駆体は生体内に存在する線維素溶解酵素の一
種であり、その詳細は特開昭58−170354号明細書
に記載されている。前駆体はそのままでは不活性
であるが、プラスミン処理することによる酵素活
性を発現する、いわゆるチモゲンである。この前
駆体はヒト腎細胞の無血清培地中にて生成でき
る。 〔従来技術〕 本前駆体は、アミノ酸411個からなる１本の鎖
状構造を有する分子量50000の蛋白である。本前
駆体は上記の如く酵素活性を示さないが、プラス
ミン処理により発現するプラスミノーゲンアクチ
ベータ活性は、抗ウロキナーゼ抗体により完全に
阻害されることから、本前駆体はウロキナーゼの
前駆体である。本前駆体はフイブリンに対して特
異的な親和性を有し、また血栓を構成する線維で
あるフイブリンを選択的に分解するなど、従来の
ウロキナーゼ（以下、UKと略す）とは異なる血
栓溶解特性を有する。UKとは異なる優れた特性
を有する本前駆体は線維素溶解酵素として臨床上
の幅広い利用が期待される。 〔発明が解決しようとする問題点〕 一般に蛋白は、溶液中においては不安定な状態
となる。前駆体に関しても同様の可能性がある。
このため、精製工程中あるいは急速凍結融解時に
前駆体の変性、分解、力価の低下等の問題が危倶
される。 前駆体用の安定化剤としては、アルブミンが知
られているが、アルブミンは、時として重合体を
形成する場合があり、これが最終製剤中に含まれ
ている場合、抗原性の点で危倶される。 従つて、本発明の目的は、抗原性の問題のな
い、前駆体の安定化方法を提供することである。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、かかる問題点を解決すべく、
種々研究を重ねた結果、ポリアルキレングリコー
ル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共
重合体、マンデル酸塩、トリエタノールアミン、
アセチルグリシルリジンメチルエステルの酸付加
塩、グアニジン塩、チオシアン酸塩、ヨウ化アル
カリ金属塩、セリンが前駆体に対して安定化作用
を有することを見い出し、本発明を完成した。 即ち、本発明は、前駆体溶液に、ポリアルキレ
ングリコール、ポレオキシエチレンポリオキシプ
ロピレン共重合体、マンデル酸塩、トリエタノー
ルアミン、アセチルグリシルリジンメチルエステ
ルの酸付加塩、グアニジン塩、チオシアン酸塩、
ヨウ化アルカリ金属塩、セリンより選ばれた少く
とも１種類の安定化剤を添加することを特徴とす
るプラスミノーゲンアクチベーター前駆体の安定
化方法に関する。 本発明で用いられる前駆体はその由来を限定さ
れるものではなく、たとえば血漿由来、ヒト腎細
胞を無血清培地中で培養する方法にて得られたも
の、遺伝子工学に基づくものなどが挙げられる。
このうち、腎細胞培養法および前駆体の回収・精
製法は、特願昭58−170354に開示されている。 また、本発明において、前駆体の純度は特に限
定されないが、一般に濃度（活性）は低い方が本
発明の安定化効果が大である傾向がみられる。例
えば、100〜2000IU／ml程度の濃度が例示される
〔なお、IUはUKの国際単位の略である。前駆体
１mlをプラスミン処理した時のUK活性に相当す
る1IU／mlは前駆体溶液１mlをプラスミン処理と
た時に、UK1IUと同等の活性を有することを意
味する。以下同様〕 本発明にて使用されるポリアルキレングリコー
ルにおけるアルキレンとしては、メチレン、エチ
レンなどの炭素数１〜５のものが好ましい。ま
た、当該アルキレングリコールはその分子量が
4000〜8000であることが好ましい。 ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重
合体は分子量2000〜20000のものが好ましく、具
体的にはプルロニツクF68が例示される。 マンデル酸塩としては、例えばナトリウム塩、
カリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩があ
げられる。 アセチルグリシルリジンメチルエステルの酸付
加塩における酸付加塩としては、酢酸塩等の有機
酸塩、塩酸塩、硫酸塩等の無機酸塩が例示され
る。 グアニジン塩としては、塩酸塩、硫酸塩などの
酸付加塩、特に鉱酸塩が好ましいものとして例示
される。 チオシアン酸塩としては、ナトリウム塩、カリ
ウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、
カリウム塩などのアルカリ土類金属塩が例示され
る。 また、ヨウ化アルカリ金属塩としては、ナトリ
ウム塩、カリウム塩などが例示される。 本発明で用いられる安定化剤は、好ましくは前
駆体100〜20000IU／ml当り1.5〜20w／ｖ％程度
配合することによつてその安定化効果を発揮す
る。 本発明において、前記安定化剤は、前駆体の精
製時、前駆体の製剤化時、前駆体製剤の保存時な
ど前駆体が不活性化されうる条件下に置かれる任
意の時期に添加される。 なお、本発明において、他の安定化剤を加える
ことも当然可能である。例えば、無機塩（例えば
塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム等）や有機
塩（例えば、アスコルビン酸、グルタミン酸等）
の添加は好適である。 〔作用・効果〕 本発明にて使用される安定化剤は、前駆体に対
して強力な安定化作用を有するものである。従つ
て、本発明の方法によれば、溶液中でも前駆体が
活性を失うこともなく、また、凍結乾燥・融解を
行つても前駆体の安定性がたもたれる。 実施例 １ 特願昭58−170354の方法によつて得られた前駆
体（210IU／mlに相当）と各種濃度のKSCNを混
合後、二分し、一方は５℃で30分保存後、力価を
測定した。 他方は、ドライアイス・エタノール（約−30
℃）と37℃恒温槽中で３分ずつ５回凍結融解を繰
り返した後、力価を測定した。 それぞれの力価測定結果は、第１表に示す通り
である。なお、第１表中に示した力価は、前記処
理を行う前の力価を100とした場合に対する残存
活性である。 力価測定方法は次の通りである。 検体0.1mlとプラスミン溶液0.1mlを加え、37℃
で10分間インキユベーシヨンを行つた。さらに、
Glt−Gly−Arg−MCA（ｐ−MCA）溶液１ml加
え、37℃で20分間インキユベーシヨンを行つた。
この溶液に18％酢酸1.5mlを加え、励起波長
370nm、蛍光波長460nmで蛍光強度を測定した。 力価測定（ｐ−MCA法）用試薬 (1)ゼラチンバツフアー トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
6.06g、NaC5.84g，ゼラチン（Difco社製）
10.0gを蒸留水で溶かし、2N−HCでPH8.60に
調整した後、１とし、121℃、20分オートクレ
ーブで滅菌した。 (2)ｐ−MCA溶液 大阪大学タンパク質奨励会製造のGlt−Gly−
Arg−MCA1バイアルに、ジメチルスルホキシド
（DMSO）１mlを加え溶解し、(1)のバツフアーで
希釈し、100ml fill upした。その際、MCA濃度
は0.1mMであり、当該溶液は用時に調整された。 (3)プラスミン溶液 ラボケム用プラスミン（ミドリ十字社製）１バ
イアル（25CU）を５mlの(1)のバツフアーで溶液
し、その0.1mlずつを凍結保存し、用時2.4mlの(1)
のバツフアーを加えて希釈し、（0.2CU／ml）使
用した。 (4)18％酢酸 18ml酢酸を蒸留水で希釈し、100mlとした。
【表】
実施例 ２
特願昭58−170354の方法によつて得られた前駆
体（740−IU／mlに相当）と各種添加剤を混合し
た後、実施例１と同様にして安定化効果を調べ
た。その結果は第２表に示す通りである。
体（740−IU／mlに相当）と各種添加剤を混合し
た後、実施例１と同様にして安定化効果を調べ
た。その結果は第２表に示す通りである。
Claims (1)
- １ プラスミノーゲンアクチベーター前駆体溶液
に、ポリアルキレングリコール、ポリオキシエチ
レンポリオキシプロピレン共重合体、マンデル酸
塩、トリエタノールアミン、アセチルグリシルリ
ジンメチルエステル酸付加塩、グアニジン塩、チ
オシアン酸塩、ヨウ化アルカリ金属塩、セリンよ
り選ばれる少くとも１種類の安定化剤を添加する
ことを特徴とするプラスミノーゲンアクチベータ
ー前駆体の安定化方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60017077A JPS61176532A (ja) | 1985-01-30 | 1985-01-30 | プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−前駆体の安定化方法 |
| KR1019860000415A KR940000540B1 (ko) | 1985-01-30 | 1986-01-23 | 플라스미노겐 활성화제 전구체의 안정화 방법 |
| ES551324A ES8802582A1 (es) | 1985-01-30 | 1986-01-28 | Un metodo para estabilizar un precursor de activador de plasminogeno. |
| CA000500493A CA1283047C (en) | 1985-01-30 | 1986-01-28 | Stabilized plasminogen activator precursor and method of producing the same |
| EP86300596A EP0190041A3 (en) | 1985-01-30 | 1986-01-29 | Stabilized plasminogen activator precursor and method of producing the same |
| US07/512,511 US5075230A (en) | 1985-01-30 | 1990-04-20 | Stabilized plasminogen activator precursor and method of producing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60017077A JPS61176532A (ja) | 1985-01-30 | 1985-01-30 | プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−前駆体の安定化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61176532A JPS61176532A (ja) | 1986-08-08 |
| JPH0479326B2 true JPH0479326B2 (ja) | 1992-12-15 |
Family
ID=11933913
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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