JPH048034B2

JPH048034B2 -

Info

Publication number: JPH048034B2
Application number: JP58131097A
Authority: JP
Inventors: Aaru Taisu Toomasu; Ii Meiaazu Uiriamu
Original assignee: Stolle Research and Development Corp
Current assignee: Stolle Research and Development Corp
Priority date: 1983-07-20
Filing date: 1983-07-20
Publication date: 1992-02-13
Also published as: JPS6025929A

Description

【発明の詳細な説明】この発明はカプセル化した生細胞、その製造方
法およびその用途に関する。

試験管中での細胞（動物又は植物源のいずれを
問わず）の使用は最近の技術進歩にともなつて新
らたに注目されつつある。たとえば試験管中での
ハイブリドマ類の培養は特異性の高いモノクロー
ナル抗体の製造に今日、日常的に利用されてい
る。ガン細胞ラインが試験管中でこのようなハイ
ブリドマ類の形成および潜在的発ガス性および抗
ガン性化合物の選別および試験のために利用され
る。又、すい臓細胞がインシユリンの製造および
導出のために試験管中および生体中で利用され
る。さらに、分離された非可動化細胞の工業的利
用が注目を集めている。なぜならば、これらは生
化学反応の触媒として用いることができ、これら
の反応が合成および分析判定に重要な手段として
使用できるからである（Venkatsubramanian，
“非可動化微生物細胞”，106ASCシンポジウムシ
リーズ（1979）参照）。

多くの場合、宿主への外来細胞の直接的導入は
宿主中にきびしい免疫応答を生じさせる。たとえ
ば、宿主、たとえばマウスの腹水にハイブリドマ
細胞を生育させる場合、マウスは免疫応答を防止
するため予備処理しなければならない。全インシ
ユリン細胞をヒトに注射すると、複雑な様相の免
疫応答が現われる。したがつて、宿主にそのよう
な細胞を導入することを容易にし、試験管中で細
胞の操作を容易にする対策が要請される。

生細胞ではないが生物学的に活性な物質のカプ
セル化又は捕捉について多くの方法が提案されて
いる。

たとえば、米国特許No.4251387；No.4255411；No.
4257884には界面重合により半透膜マイクロカプ
セルの製造法、および免疫分析およびクロマトグ
ラフイにおける利用が開示されている。カプセル
化される物質および親水性モノマーを疎水性連続
相中で乳化し、重合はこの連続相中に第２のモノ
マーを溶解させることによつて開始され、重合は
親水性滴状体と疎水性連続相との界面でのみ形成
され、その結果、マイクロポーラスで不明確なカ
プセル膜が形成される。親水性モノマーに対する
連続相の親和性は連続相の極性を変えることによ
り変化させることができ、均一なカプセル膜およ
び所定の透過性を有するマイクロカプセルがつく
られる。米国特許No.3780195には活性物質のカプ
セル化が開示されている。それによれば、殻組成
物用溶媒中に活性物質と殻組成物とを分散させて
カプセル組成物を形成し、これを分散相中に活性
物質を含む粒子となし、ついで低分子ポリグリコ
ールを添加することにより殻組成物から溶媒を除
去する。この脱溶媒化操作は最初にカプセル組成
物を粘性の白鉱物油に分散させて個々に分離した
粒子を形成させ、ついで無水ポリグリコールを添
加することにより促進される。この殻物質として
は卵白アルブミンおよび血液アルブミン等のタン
パク質が用いられる。その他米国特許No.
2889252；No.3691090；No.3714065；No.3516942；No.
3664936；No.3642978；No.3137631に薬剤のカプセ
ル化が開示されている。米国特許No.3137631には
アルブミンの如き天然物質中にてカプセル化をお
こない、ついでホルムアルデヒド、グリオキサー
ル等の架橋剤で処理してカプセル膜の安定性を向
上させる方法が開示されている。

各種薬剤を均質に分散させて軟質固形マイクロ
粒子（カプセルではない）を形成する方法が米国
特許No.4187285（アルブミン中にテクネチウム−
99mを分散させたもの）；No.4147767（血清アルブ
ミン中に薬剤を分散させたもの）；No.4107288（架
橋された血清アルブミン粒子に薬剤を分散させた
もの）；No.3937668（薬剤、殺虫剤、染料等を含有
させたアルブミン粒子）；No.4024233（錫を分散さ
せたマイクロ凝集化ヒト血清アルブミン）；No.
4094965等に開示されている。

又、種々の微生物、たとえばバクテリア、ウイ
ルス等の抗原を含む多種の物質のマイクロカプセ
ル化が本願発明と同時に係属する米国特許出願No.
194127に記載されている。その出願の方法は溶媒
中に活性剤を溶解又は分散させ、この溶媒中にさ
らに膜壁形成物質を溶解させる方法、すなわち、
活性剤と膜壁形成物質を含む溶媒を連続相加工媒
体中に分散させ、分散工程からの溶媒の一部を揮
散させて、懸濁液中に活性物質を含むマイクロカ
プセルを形成させ、最後に、マイクロカプセルか
ら溶媒の残りを抽出させる方法である。

これらの多くの公知技術を生細胞に適用すると
なると多くの問題が生ずる。すなわち、公知技術
の多くは生細胞の生存を維持させるのには条件が
きびしすぎる。たとえば、有機溶媒、高温、反応
性モノマー、架橋条件の使用は生細胞の生存を危
くする。さらに細胞の脱水又は浸透圧破損を避け
るのも容易ではない。さらに大きい問題は栄養分
と排出生成物の透過を膜壁に具備させることの必
要性である。もし、細胞がマイクロ分子又は生物
学的集団、たとえば抗体又はヴイリオンの源とし
て使用される場合、このようなマイクロ分子の排
出を許容する大きさの孔を膜壁に具備させなけれ
ばならない。細胞がカプセル化され、それが宿主
に注射されたときは、これらが、マイクロ分子又
は生物学的集団の源とならなければならず、その
孔はマイクロ分子又は集団の排出を許容し得る正
しい直径のもので、かつ宿主の免疫システムのた
めにマイクロカプセル化された細胞を破壊するよ
うな宿主の分子又は細胞の浸入を防止し得る径の
ものでなければならない。

そのため、生細胞の生活力を維持させ得るゆる
い条件下で生細胞をカプセル化することができ、
かつカプセルの膜壁に適当に制御された孔を形成
し得る方法が要望されていた。

この発明は上記事情に鑑みてなされたものであ
つて、生細胞のカプセル化を提供することを目的
とする。

すなわち、この発明は架橋化タンパク質壁から
なるカプセル中に生細胞の水性懸濁液を収容して
なる生細胞含有カプセルを提供するものである。

さらに、この発明は (a) 生細胞をカプセル壁形成タンパク質の水溶液
中に分散させる工程と； (b) 水性非混和性、細胞適合性連続的処理媒体中
にて上記細胞含有媒体の水性滴状物を形成する
工程と； (c) 該処理媒体に可溶で上記水性滴状物に実質的
に不溶性の架橋剤で上記タンパク質を架橋させ
る工程と；を具備する生活細胞のカプセル化法を提供するも
のである。

本発明は生細胞含有カプセルの穏やかで、かつ
効率的な製造を提供するものであり、これは制御
された多孔質カプセル膜壁の形成に適した条件を
見出したことに基づくもので、その結果、ハイブ
リドマ生育、薬剤導出等種々の領域においてカプ
セル化細胞の使用が可能となる。

上述の如く本発明の方法は３つの段階、すなわ
ち、 (a) 生細胞をカプセル壁形成タンパク質の水溶液
中に分散させる工程と； (b) 水性非混合性、細胞適合性連続的処理媒体中
にて上記細胞含有媒体の水性滴状物を形成する
工程と； (c) 該処理媒体に可溶で上記水性滴状物に実質的
に不溶性の架橋剤で上記タンパク質を架橋させ
る工程と；からなるものである。

この方法の第１の工程は最終的にカプセル膜壁
を形成するタンパク質溶液の形成である。したが
つて、この膜壁物質は水または実質的に水性の溶
液に可溶でなければならず、架橋されてカプセル
を形成し得るものでなければならない。この水溶
性タンパク質の適当な例としてはカゼイン、コラ
ーゲン、ゼラチン、大豆タンパク、グルテン、ア
ルブミン、免疫グロブリン、又はこれらの変性物
あるいは誘導体である。この殻形成タンパクは水
性溶媒中に、好ましくはその実用的最少量を用い
て、溶解する。その溶媒量は装置で取扱い可能な
粘度を超えるものであつてはならない。さらに、
その粘度は細胞の良好な分散が得られる程度とし
なければならない。たとえばタンパク質を５〜95
重量％、好ましくは５〜25重量％含むようにす
る。この段階で、抗酸化剤、保存剤、界面活性剤
を含めてもよい。

このタンパク質含有殻形成溶液に対し、カプセ
ル化されるべき細胞の懸濁液を加える。これら細
胞は後述の如く、適当な栄養含有媒体、たとえば
塩、還元剤、抗生物質、血清、緩衝剤等を含む培
養媒体に添加して用いられる。試験管中での動物
細胞ラインのための、又は微生物のための培養媒
体は公知である。細胞は破壊を防止するため、穏
やかな方法を用いて殻形成タンパク含有溶液に均
一に分散される。他の方法としては、殻形成タン
パク含有溶液を最初に適当な培養媒体に添加し、
この中間溶液を滅菌し、これに生細胞を含むペレ
ツトその他の適当な形状のものを添加する。これ
らの細胞をついで懸濁液中に分散させる。添加さ
れる細胞の数はマイクロカプセル中の所望濃度に
よつて定められるが、一般に溶液１ml当り10³〜
10¹²個、好ましくは10⁴〜10⁸個の範囲で使用され
る。

この発明の方法の第２の段階は連続的処理媒体
（又は加工媒体）中に水相を分散させることであ
る。この処理媒体は水相と混和しないものでなけ
ればならない。この水性非混和相の例としては鉱
油又は非鉱質油であつて、生細胞と、この連続媒
体が適合性を有することが条件とされる。すなわ
ち、この連続相は製造中において、細胞代謝を害
しないか妨害しないことが必要とされる。この水
性非混合相の例としては、シリコーンオイル、ピ
ーナツ油、綿実油、ゴマ油等である。界面活性剤
（乳化剤）をこの連続的処理媒体に加えて、マイ
クロカプセルが凝集するをを防止したり、エマル
ジヨン中でのマイクロ滴状体の大きさを制御する
ようにしてもよい。この分散体はコロイドミル、
ホモジナイザー等の装置によつて連続相処理媒体
を機械的に撹拌することによつて得られる。簡単
な機械的撹拌器を用いることもでき、又そのよう
なものはより好ましいと云える。その理由は細胞
の破壊を防止するために十分にゆるやかな撹拌が
要請されるからである。エマルジヨンはこの連続
相処理媒体に水溶液の小滴を添加することによつ
て形成することもできる。この分散工程の好まし
い例としては水溶液をゴマ油中に分散させること
である。

水溶液の形成およびこの水溶液の処理媒体中へ
の分散における温度は特に制限はないが、マイク
ロカプセルの大きさ、品質に影きようを与える。
さらに、用いられる連続相処理媒体の種類によつ
ては、この温度は低過ぎてはならない。低過ぎる
と水性溶媒および処理媒体が固化するか重粘にな
り過ぎて実用的に取扱い不能となるからである。
他方、この温度が高すぎても、処理媒体が蒸発し
て細胞の生活力が失われることになる。したがつ
て、この分散工程は安定な操作条件に維持し得る
温度、好ましくは０℃ないし40℃の範囲、特に好
ましくは25℃ないし37℃の範囲とすべきである。

第２の工程において、安定なエマルジヨンを維
持し得るものであれば水性滴状体の量についての
制限はない。しかし、その量が大きすぎて２つの
異なる滴状体間で架橋が生じたり、逆に小さすぎ
て処理後にマイクロカプセルが回収できなくなつ
ても良くない。理想的には水相対処理媒体の割合
は0.1〜99容量部対100容量部の範囲、より好まし
くは１〜50容量部対100容量部の範囲とすべきで
ある。

処理媒体中の水性滴状体の安定なエマルジヨン
に対して架橋剤が次に添加される。この架橋剤は
官能基および構造について多くの条件が必要であ
る。第１に架橋剤は連続的処理媒体に実質的に可
溶であり、水性滴状体に不溶でなければならな
い。この条件は極めて重要である。なぜならば、
これが水性滴状体への架橋剤の導入を防止し、し
たがつて細胞相互の広範な架橋又は細胞とカプセ
ルの内壁との架橋の可能性を防止するための制御
要素となるからである。ほとんどの細胞が表面に
タンパク質を含み、これらのタンパク質が架橋剤
と架橋し得る基を有するから、架橋剤の水溶性は
回避されなければならない。この架橋剤がほとん
ど排他的に非水性連続相に可溶であるため、架橋
反応は水性滴状体と非水性連続相との間の界面で
ほとんど起り、界面型架橋が得られる。

第２の条件は架橋剤の架橋能が適当な製造温度
で起ることである。第３の条件は少なくとも二官
能価のものであつて、タンパク質殻物質上で少な
くとも２以上の架橋可能域で架橋できるものであ
ることである。第４の条件は架橋剤が安定なエマ
ルジヨンの条件の下でタンパク質の天然の官能基
と容易に反応する基を有することが必要とされ
る。このような官能基の例は水酸基、アミノ基、
カルボキシル基、チオール基である。より好まし
くは末端アミノ基又はリシンのε−基の如きタン
パク質のアミノ基が利用される。

本発明における架橋剤の好ましい例としては油
溶性ハロゲン化二酸であつて、タンパク質アミノ
基とアミド結合を形成し得るものである。たとえ
ば、XOC−（CH₂）_o−COX（ただし、Ｘはハロゲ
ン、好ましくはふつ素、臭素、塩素、ｎは一般の
４〜12の整数）で表わされる化合物である。最も
好ましい例はアジポイルクロリド又はセバコイル
クロリドである。一般に、ヒドロキシ又はアミン
−反応性多官能価油溶性架橋剤の全てのものを使
用できる。第５の条件は架橋剤が連続相処理媒体
と反応しないことである。

この処理媒体中の架橋剤の濃度は任意に調整で
き、その下限はカプセル膜壁が自己支持力を形成
し得ない濃度であり、上限は架橋が多過ぎて固く
なりすぎ、不透過性となる濃度である。この上限
は連続相処理媒体中での架橋剤の溶解度によつて
も左右される。この架橋剤の濃度は当業者が容易
に判断し易るものであり、一般に0.001〜10mg／
100ml（処理媒体）の範囲で用いられる。

殻形成タンパク質に対する架橋剤の割合は所望
とする架橋剤の緊張度、使用するタンパク質の活
性架橋性官能基の数、滴状体のサイズ、反応時
間、膜厚によつても左右される。一般にこの適当
な割合はタンパク質１モル当り架橋剤１〜1000モ
ルであろう。

架橋剤の添加後、得られた懸濁液を連続的に撹
拌して、エマルジヨン中の滴状体を所望の架橋が
得られるまで維持する。架橋剤の反応温度条件は
前述の如く維持し、又は架橋を促進させるために
若干上昇させる。この時間は一般に数分ないし数
時間、好ましくは５〜10分ないし２時間、より好
ましくは15分ないし１時間である。

多くの場合、処理媒体中に得られるマイクロカ
プセルの懸濁液を、たとえばカプセル化ハイブリ
ドマスの注射において動物の腹膜に直接使用でき
る。この方法は処理媒体が反応終了時に架橋剤を
全く含まない場合、およびカプセルの形成に生物
との相容性を有する処理媒体、たとえばゴマ油を
利用した場合に特に好ましい。この方法によれ
ば、現場でマイクロカプセルを作り、その得られ
たカプセル分散物を動物中に注射することができ
る。

そのほか、処理媒体からカプセルを分離し、水
性又は非水性洗浄液で洗うようにしてもよい。こ
の分離は撹拌を中断し、ついでデカンテーシヨン
又は遠心分離によつておこなうことができる。さ
らに、処理媒体を水相上に層として形成させ、こ
の二層構造物を遠心分離してマイクロカプセルを
処理媒体から水相へ強制的に移すようにしてもよ
い。この場合の水相はカプセル化細胞の生育を促
す培養媒体であることが好ましい。

上記のようにして製造された本発明の生細胞含
有カプセルにおいては、架橋剤で架橋されたアル
ブミンからなるカプセル内に、水性媒質中に懸濁
された状態の生細胞が収容されている。カプセル
壁の架橋に用いた架橋剤は、一般的に生細胞に対
して毒作用を及ぼすから、これが細胞壁から溶出
すると細胞の死滅といつた致命的な欠点を生じ
る。しかし、既述したように本発明で用いる架橋
剤、特に塩化セバコイルは水は不溶性であるか
ら、本発明によれば、上記のような致命的な問題
を回避することができる。

本発明の好ましい具体例として、出発タンパク
質溶液は水溶性ポラーゲン化合物（すなわち孔形
成又は孔発生化合物）、たとえばポリ（ビニルア
ルコール）、カルボキシメチルセルロース、ポリ
（ビニルピロリドン）、でん粉、最も好ましくは多
価グリコール等のグリコールを含むものであつて
もよい。この化合物の存在はカプセル化の際に細
胞を保護し、カプセル膜壁中に多くの孔を形成さ
せる。このポラーゲン化合物は架橋工程におい
て、タンパク質分子相互間に捕促され、水溶液と
カプセルとの接触の際に除去され、カプセルの膜
壁に多くの孔を形成させるものと思われる。この
ポラーゲン化合物の添加量は比較的広範囲で変え
ることができ、細胞の数、所望とする多孔度、ポ
ラーゲンの溶解度、カプセル組成物の量等によつ
ても左右される。一般に、その水溶液中の濃度は
１mg／mlないし1g／ml、好ましくは200〜600
mg／mlであろう。ポラーゲンのタンパク質に対す
る割合は１：10〜10：１（重量）である。本発明
で用いられるポリグリコールは分子量が100〜
10000のものである。このうち、ポリエチレング
リコール、特に分子量4000〜6000のもの（より好
ましくはこの上限に近いもの）が用いられる。

本発明の他の好ましい態様は形成されたカプセ
ルにカプセル膜壁分解酵素（又は劣化酵素）を接
触させることによりカプセルの膜壁の孔径を調節
する方法である。カプセルの膜壁が主としてタン
パク質からなる場合はタンパク質分解酵素、たと
えばトリプシン、キモトリプシン等をカプセルの
緩衝水性懸濁液に加えて十分な時間繁殖させて所
望のサイズに孔を拡大させる。一般にこの時間は
１〜２分から１〜２時間、好ましくは１〜２分か
ら30分の間である。この酵素消化は、酵素抑制
剤、たとえばタンパク分解抑制剤、たとえば大豆
トリプシン抑制剤をカプセル分散体に加えるか、
又はカプセルから酵素を洗い流すことによつて中
止させることもできる。

他の他ましい態様として、カプセルの壁がタン
パク質のみで構成されているのではなく、これに
加えて0.1〜80重量％の他の酵素分解性物質、た
とえばポリサツカライド、ケラチン、DNA，
RNA、コラーゲン等の物質で形成されている場
合である。タンパク質および他の酵素分解性物質
で膜壁がつくられているカプセルの形成後、カプ
セルの孔径はこの他の酵素分解性物質を分解する
酵素で処理することにより拡大させることができ
る。この物質がポリサツカライドの場合はポリサ
ツカライド分解酵素が用いられる。セルロース、
コラーゲン、DNA，RNA、でん紛、ケラチンが
添加された場合はセルラーゼ、コラナーゼ、DN
アーゼ、RNアーゼ、アミラーゼ、ケラチナーゼ
等を用いて孔径を拡大し得る。この分解酵素によ
る処理時間は上述のタンパク分解酵素の場合と同
様にして調節し得る。

本発明のカプセルは球形粒子であり、場合によ
つては不規則な形状としてもよい。カプセルは
1μm以下から数ミリの直径に変えることができ
る。標準注射針での投与のためには1μm以下ない
し250μmの径のもの（マイクロカプセル）が好ま
しい。

膜壁の孔径は少なくとも細胞の生育および生活
力を維持するために必要な栄養の出入りを許容し
得る大きさを有し、かつ細胞自体の排出を防止し
得る程度に小さくなくてはならない。理想的には
分子量10000〜500000のマイクロ分子（公知の免
疫グロブリン又はヴイリオンを含めて）の排出を
許容し得る孔径のものが好ましい。ヴイリオンは
通常約3000Å以下の直径を有するから、孔径は５
Å〜15μm、より好ましくは20Å〜0.3μmとする。

本発明でカプセル化可能な細胞の性質、種類に
ついて特に制限はなく、動物からのもの、植物か
らのもの、微生物からのもののいずれであつても
よい。又細胞はハイブリドマ細胞の如く人工のも
のであつてもよい。この人工のものはカプセル化
にとつて好ましいものの一つである。細胞ライン
から得られる他の細胞、たとえばミエロマ
（myeloma）細胞もカプセル化可能である。さら
に、バクテリヤ細胞の如き微生物細胞もカプセル
化可能である。これらのうち最も好ましいバクテ
リヤ細胞は薬理学的に有用な物質を分泌するもの
およびDNA組換え技法によりつくられる新規な
バクテリヤ種であつて哺乳動物、ドナー等の異質
物からの遺伝子によつてコードされた物質を表わ
すバクテリヤである。この異質の遺伝子を表わす
バクテリヤ細胞の例としてはインターフエロン、
生育ホルモン、インシユリン（すい臓細胞自体に
よつてつくり得るものであることはもちろんであ
る）、その他のホルモン、プロホルモン型分子等
である。

１カプセル当りの細胞の数はカプセルの大きさ
にもよるが、１〜1000，好ましくは１〜100程度
であろう。生育および再生によりカプセル内の細
胞密度は増大し、生育は飽和レベルに達すること
になる。この飽和レベルは細胞の種類、カプセル
のサイズによつても異なる。これらは実験的に、
特定の細胞／カプセルサイズについての飽和限度
を知ることができよう。

なお、本発明の範囲に取り込むことを意図する
ものではないが、本発明は、所望の細胞のカプセ
ル化のために使用者に利用されるキツトとして応
用することが可能である。このキツトは一般に試
験管、薬ビン、グラス、球状物等を収容するため
に区分した容器を１以上有するキヤリヤーからな
る。この容器はさらにポラゲン、その他の酵素分
解可能物質、栄養媒体、界面活性剤等とともに膜
壁形成タンパク質からなる第１の容器手段を具備
するものであつてもよい。この膜壁形成物質は溶
液又は凍結乾燥した状態で存在させることができ
る。第２の容器手段として、適当な架橋剤を収容
するもの、第３の容器手段として、水非混和性処
理媒体を収容するものが考えられる。他の容器手
段としては所望の細胞、分解酵素、他の膜壁形成
物質等を収容するものが挙げられる。このキツト
は通常カタログ、小冊、パンフレツト等による指
示書を収容させる。このキツトを利用する場合、
使用者は第１の容器手段内の物質の溶液をつく
り、カプセル化すべき細胞の分散体を形成し、上
記溶液を処理媒体に加え、水性の滴状体を分散さ
せて安定なエマルジヨンを形成し、架橋剤を加え
て膜壁形成を生じさせるだけでよい。もちろん、
その他の任意の工程をさらに付加してもよい。

本発明のカプセルは特に動物の、細胞に対する
免疫応答を最少限にしたい場合に、その動物への
該細胞の投与に特に適している。したがつて、ハ
イブリドマ細胞を含むカプセルを動物中に注射す
ることにより、該細胞を該動物内で生育させるこ
とができる。薬剤投与も、薬理学的活性物質を生
成させる細胞を含むカプセルを動物に注射するこ
とにより、著るしく容易となる。インシユリンを
生成させたり、生長ホルモン又はインターフエロ
ンを生成させたりして、これらの活性物質の速効
的および連続的供給源を与える再結合バクテリヤ
を動物中に注射することもできる。カプセル化し
たすい臓細胞を糖尿病患者に注射してインシユリ
ンの供給源とすることもできる。抗体、酵素、そ
の他生物学的活性物質を生成させる細胞を投与す
ることもできる。

ここで興味深いことは投与の対象又は宿主とし
て使われる動物からのタンパク質を用いてマイク
ロカプセル又はカプセルの製造をおこなう方法で
ある。これによつて、免疫応答の問題は減少す
る。たとえばBSA壁の使用は受理主として牛科
動物の使用を容易にする。ヒト血清アルブミンか
らなるタンパク質膜壁の使用はヒトへのカプセル
の投与を容易にする。

カプセルの投与は局部投与、静脈投与、腹膜内
注射、筋肉注射、輸液、環流等によつておこなう
ことができる。

そのほか、本発明のカプセルは他の用途を有す
る。たとえば、従来の非可動化微生物細胞又は酵
素の代りに触媒物質として役立てることができ
る。又、分解カプセル化微生物を利用して酸素等
のガスを解放させ、これを酸素電極によりモニタ
ーすることなどにより分析等に使用することもで
きる。

マイクロカプセルを治療を目的として用いる場
合、投与量は年令、性別、患者の状態、他の同時
投与薬剤、副作用等を考慮して決定される。たと
えば、一定時間当り循環系などの程度インシユリ
ン、インターフエロンを放出させるかは所定の対
象につき容易に計算することができ、これにより
所定の細胞を含むマイクロカプセルの適量を注射
することができる。

タンパク壁形成物質の一部又は全体に免疫グロ
ブリンからのものを用いたカプセルは特に有用で
ある。免疫グロブリンの特定の種類のものを選
び、膜壁含有抗体の補助として抗原部に向けられ
るカプセルをつくることができ、このカプセルを
生細胞の指定されたキヤリアシステムに変えるこ
とができる。

（実施例）ハイブリドママイクロカプセルの製造例すべてのマイクロカプセル化用装置を消毒した
のち、ウシ血清アルブミン、BSA（100mg）を
RPM1 1640培養基（重炭酸ソーダ、２−メルカ
プトエタノール、ペニシリン、ストレプトマイシ
ン、カビ菌帯および10％の熱不活性化ウシ胎児血
清を含む）１ml中に溶解させた。この溶液をミリ
ポアフイルタ（タイプHA，0.45μm、ミリポア社
Bedford，マサチユーセツト州、米国）を介して
滅菌試験管に通過させることにより滅菌した。次
にポリエチレングリコール（PEG，
Carbowax6000（商品名）Fisher Scientific社，
ピツツバーグ、米国）200mgをこのBSA溶液に溶
解させ、約10⁶ハイブリドマ細胞を含むペレツト
をBSA−PEG媒体混合物0.5ml中に懸濁させた。

この懸濁液を、50ml樹脂釜に収容した滅菌ゴマ
油20mlに、温度37℃、撹拌速度1200rpm.で滴下
しながら加えた。その結果、BSA，PEG、細胞
および培養基からなる水性マイクロ滴状体を含む
水／オイルエマルジヨンが得られた。この水相を
ゴマ油に添加した１分後に塩化セバコイル（２ml
のゴマ油に0.2ml溶解させたもの）を上記樹脂釜
に添加した。この添加ののち２分後撹拌速度を
1200rpm.から900rpm.に減少させた。この状態で
40分間維持し、塩化セバコイルをBSAに架橋さ
せてマイクロカプセル壁を形成させた。さらに40
分後、樹脂釜を静かに遠心分離してマイクロカプ
セルを沈降させた。上澄液を除去したのち、マイ
クロカプセルを新しい滅菌ゴマ油で洗浄し、残留
する塩化セバコイルを除去した。

このマイクロカプセルを培養基に移すため、マ
イクロカプセルを再び遠心分離し、上澄液を除去
した。さらにヘプタン２mlをマイクロカプセルペ
レツトに加え、さらに直ちに５mlの培養基と混合
した。この混合物をついて遠心分離し、上澄液を
除去し、マイクロカプセルペレツトを新しい培養
基で再度洗浄し、適当なPHに調節した。

マイクロカプセル化後の細胞生存能をこのマイ
クロカプセルを中性赤中で培養することにより実
証することができた。すなわち、このマイクロカ
プセル化細胞はこの中性赤を汚ごし生存能を有す
ることを示した。第２の手段として、このマイク
ロカプセルを開き、露出した細胞をトリパン青で
培養した。その結果、細胞の染色が見られず、こ
れによつて細胞の生存能が認められた。この細胞
は少なくとも２ケ月間生活力を示した。

Claims

【特許請求の範囲】１塩化セバコイルで架橋されたアルブミン壁か
らなるカプセル中に生細胞を収容してなる生細胞
含有カプセル。２該アルブミン壁がさらに水溶性ポラーゲン化
合物を含む特許請求の範囲第１項記載の生細胞含
有カプセル。３該アルブミン壁がさらに酵素劣化物質を含む
特許請求の範囲第１項記載の生細胞含有カプセ
ル。４酵素劣化物質がポリサツカリド、タンパクま
たは核酸である特許請求の範囲第３項記載の生細
胞含有カプセル。５塩化セバコイルで架橋されたアルブミン壁が
多孔質であつて、細胞養分の通過を許容し得るも
のである特許請求の範囲第１項記載の生細胞含有
カプセル。６塩化セバコイルで架橋されたアルブミン壁が
多孔質であつて、分子量500000以下の分子又は粒
子を通過させ得るものである特許請求の範囲第１
項記載の生細胞含有カプセル。７該分子が免疫グロブリンである特許請求の範
囲第６項記載の生細胞含有カプセル。８免疫グロブリンがモノクローナル抗体である
特許請求の範囲第７項記載の生細胞含有カプセ
ル。９該分子がヴイリオンである特許請求の範囲第
６項記載の生細胞含有カプセル。１０該アルブミン壁が直径５オングストローム
ないし15μmの孔を多数有する特許請求の範囲第
１項記載の生細胞含有カプセル。１１該細胞が動物、植物、微生物、および人工
の細胞から選ばれるものである特許請求の範囲第
１項記載の生細胞含有カプセル。１２該細胞がハイブリドーマ細胞である特許請
求の範囲第１１項記載の生細胞含有カプセル。１３該細胞がウイルス感染細胞である特許請求
の範囲第１１項記載の生細胞含有カプセル。１４該細胞がバクテリヤ細胞である特許請求の
範囲第１１項記載の生細胞含有カプセル。１５該バクテリヤ細胞が該バクテリヤ細胞の
DNAに組換えられた非バクテリヤ遺伝子によつ
てコードされた生成物を生産する特許請求の範囲
第１４項記載の生細胞含有カプセル。１６該非バクテリヤ遺伝子が哺乳動物遺伝子で
ある特許請求の範囲第１５項記載の生細胞含有カ
プセル。１７該細胞のための栄養媒体と組み合わされて
いる特許請求の範囲第１項記載の生細胞含有カプ
セル。１８栄養媒体が試験官内媒体である特許請求の
範囲第１７項記載の生細胞含有カプセル。１９栄養媒体が生体内媒体である特許請求の範
囲第１７項記載の生細胞含有カプセル。２０生体内媒体が動物の腹水である特許請求の
範囲第１７項記載の生細胞含有カプセル。２１該カプセルが平均直径250μm以下のもので
ある特許請求の範囲第１項記載の生細胞含有カプ
セル。２２ (a) 生細胞をカプセル壁を形成するアルブ
ミンの水溶液中に分散させる工程と； (b) 水非混和性で且つ細胞適合性の連続的処理媒
体中にて上記細胞含有媒体の水性滴状物を形成
する工程と； (c) 塩化セバコイルで前記アルブミンを架橋させ
る工程と；を具備する生細胞のカプセル化法。２３該アルブミンの水溶液が該細胞のための栄
養を含む特許請求の範囲第２２項記載の方法。２４該溶液がさらに酵素劣化物質を含む特許請
求の範囲第２２項記載の方法。２５酵素劣化物質がポリサツカリド、タンパク
または核酸である特許請求の範囲第２４項記載の
方法。２６該細胞が動物、植物、微生物、および人工
の細胞から選ばれるものである特許請求の範囲第
２２項記載の方法。２７該細胞がハイブリドーマ細胞である特許請
求の範囲第２６項記載の方法。２８該細胞がバクテリヤ細胞である特許請求の
範囲第２６項記載の方法。２９該バクテリヤ細胞が、該バクテリヤ細胞の
DNAに組換えられた非バクテリヤ遺伝子によつ
てコードされた生成物を生産する特許請求の範囲
第２８項記載の方法。３０該非バクテリヤ遺伝子が哺乳動物遺伝子で
ある特許請求の範囲第２９項記載の方法。３１該カプセルが平均直径250μm以下のもので
ある特許請求の範囲第２２項記載の方法。３２処理媒体が植物油又は鉱物油である特許請
求の範囲第２２項記載の方法。３３処理媒体がピーナツツ油、ゴマ油、綿実油
から選ばれるものである特許請求の範囲第２２項
記載の方法。３４架橋化されたカプセルを、水不溶性溶媒で
洗浄する工程をさらに含む特許請求の範囲第２２
項記載の方法。３５カプセル壁を形成するアルブミンの水性溶
液がさらに水溶性ポラーゲン化合物を含む特許請
求の範囲第２２項記載の方法。３６該ポラーゲン化合物を該溶液中に1mg〜
1g／ml含む特許請求の範囲第３５項記載の方法。３７該ポラーゲン化合物がポリ（ビニルアルコ
ール）、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビ
ニルピロリドン）、でん粉又はグリコールである
特許請求の範囲第３５項記載の方法。３８該ポラーゲン化合物が、分子量100ないし
10000のポリグリコールである特許請求の範囲第
３５項記載の方法。３９塩化セバコイルで架橋されたアルブミンか
らなるカプセル壁に、カプセル壁劣化酵素を十分
な時間添加して該壁中の孔を所定の平均サイズに
拡大させる工程を含む特許請求の範囲第２２項記
載の方法。４０該酵素がタンパク質分解酵素である特許請
求の範囲第３９項記載の方法。４１塩化セバコイルで架橋されたアルブミンか
らなるカプセル壁に、カプセル壁劣化酵素を十分
な時間添加して、該壁中の孔を所定の平均サイズ
に拡大させる工程をさらに含む特許請求の範囲第
２４項または第２５項の何れかに記載の方法。４２該酵素がポリサツカリド分解酵素、DNア
ーゼ、RNアーゼ、ケラチナーゼ、セルラーゼ、
アミラーゼ、コラーゲナーゼから選ばれるもので
ある特許請求の範囲第４１項記載の方法。