JPH0488978A - 細菌の培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、活性の高い脱ハロゲン化酵素生産菌の培養法
に関するものである。該脱ハロゲン化酵素は、種々の医
薬品や生理活性物質の合成原料、例えば、Ｌ−力ルニチ
ンの合成原料などとして有用である（Ｒ）−（−）−３
−ハロー１．２−プロパンジオール製造に利用される（
特願平１−１００１７３号および特願平１−１００１７
４号明細書参照）。

（従来技術と問題点） 生物学的な手法による（Ｒ）−（−）−３−ハロー１，
２−プロパンジオールの製造法としてはラセミ体である
（Ｒ，５）−３−ハロー１．２−プロパンジオールに微
生物を作用させて（Ｓ）−（＋）−３−ハロー１，２−
プロパンジオールを選択的に代謝させ、（Ｒ）−（−）
−３−ハロー１．２−プロパンジオールを残存させる方
法（特開昭６２−１５８４９４号公報参照）、シュード
モナス属に属する細菌をラセミ体の（Ｒ，５）−２，３
−ジクロロ−１−プロパノールに作用させて（Ｒ）　−
（−）−３−ハロー１，２−プロパンジオールを分取す
る方法が知られているが（特開昭６２−６９９９３号公
報参照）、これらは、ラセミ体を原料としているために
取得できる（Ｒ）−（−）−３−ハロ１．２−プロパン
ジオールの対原料収率は５０％以下となり、経済的に有
利な製造法とはなり得ない。

本出願人は、先に、脱ハロゲン化酵素の作用により、安
価なブロキラル化合物１．３−ジハロ−２−プロパノー
ルから光学活性（Ｒ）−（−）−３−ハロー１．２−プ
ロパンジオールを理論光学収率１００％で製造する方法
について、特許出願したが（特願平１−１００１７３号
明細書参照）、この方法を工業的により有利なものとす
るため、脱ハロゲン化酵素生産菌の該酵素活性をさらに
高く発現させる有効な酵素誘導物質の開発が望まれてい
た。

（発明の概要） そこで本発明者らは、脱ハロゲン化酵素活性のより高い
該酵素生産菌を培養する培養条件を鋭意検討した結果、
培養液中に酵素誘導物質として、シクロヘキサノール、
２，３−ジハロ−１−プロパノール、ジクロロエタノー
ル等を添加することにより酵素活性の高い脱ハロゲン化
酵素生産菌が得られることを見いだし本発明を完成する
に至った。

また、さらなる検討の結果、これらの化合物は該脱ハロ
ゲン化酵素生産菌により資化され難く、これらの化合物
濃度を制御するという繁雑な操作を行う必要がないばか
りか、資化の結果生成するＨＣＩ　によるｐＨの低下に
よる該酵素の失活までをも回避できるという利点を有し
ていることが判明した。

すなわち、本発明は、培養液中にシクロヘキサノール、
２．３−ジハロ−１−プロパノールおよびジクロロエタ
ノールから選ばれた少なくとも１種の化合物を添加する
ことを特徴とする脱ハロゲン化酵素生産菌の培養法、で
ある。

（発明の詳細な説明） 本発明でいう脱ハロゲン化酵素とは１，３−ジハロ２−
プロパノールのハロゲン原子１個を最終的に水酸基に転
換し得る酵素である。具体的には、例えば、ミクロバク
テリウム属の）ｌ−４７０１株、コリネバクテリウム属
のＮ−６５３株およびＮ−１０７４株の産生ずる酵素を
挙げることができる。これらの微生物は、それぞれ、微
工研条寄第２６４４号（ミクロバ″クテリウムｓｐ、　
Ｎ−４７０１）、微工研条寄第２６４２号（コリネバク
テリウムｓｐ、　Ｎ−６５３）および微工研条寄第２６
４３号（コリネバクテリウムｓｐ、　Ｎ−１０７４）と
して工業技術院微生物工業技術研究所（微工研）に寄託
されており、その菌学的性質は以下の通りである。

Ｌ」１１１表 形態 集落の周辺細胞 ダラム染色性 芽胞 運動性 鞭毛 集落の色 オキシダーゼ カタラーゼ Ｆ 嫌気化での生育 細胞壁のジアミノ酸 グリコリル試験 デンプン分解 ゼラチン液化 硝酸塩還元 アルギニン利用 多形性桿菌 伸長せず ＋ 認めず ＋ 極〜側毛 黄橙色 ＋ ＋ リジン ＋　（グリコリル型） ＋ ＋ 尿素分解 スキムミルク培地中での 耐熱性 ６０℃、３０分間 酸の産生 イヌリン グリセロール グルコース シュークロース トレハロース ラフィノース 形態 集落の周辺細胞 ダラム染色性 芽胞 運動性 オキシダーゼ カタラーゼ Ｆ ＋ 多形性桿菌 伸長せず ＋ 認めず ＋ ＋ 硫化水素産生 嫌気化での生育 カタラーゼ ＋ 細胞壁のジアミノ酸 グルコリル試験 デンプン分解 ゼラチン液化 セルロースの分解 尿素分解 抗酸性 スキムミルク培地中での 耐熱性 ６３°Ｃ１３０分間 ７２°Ｃ１１５分間 ［川１ 形態 集落の周辺細胞 ダラム染色性 芽胞 運動性 オキシダーゼ ジアセチル酪酸 （アセチル型） ＋ 多形性桿菌 伸長せず ＋ 認めず ＋ Ｆ 嫌気化での生育 細胞壁のジアミノ酸　　　　ジアミノ酪酸グルコリルｇ
験−（ｙセチＩＬ型） デンプン分解　　　　　　　　十 ゼラチン液化 セルロースの分解 尿素分解 抗酸性 スキムミルク培地中での 耐熱性 ６３°Ｃ１３０分間 ７２°Ｃ３１５分間 以上の菌学的性質をノ＼−ジエーズ・マニュアル・オプ
・システマチ・ツク・バクテリオロジーＶｏ１２　（１
９８６）　（Ｂｅｒｇｙ’ｓ　ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓ
ｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏ
ｌ、２　（１９８６）　　）に従って検索すると、Ｎ−
４７０１株はミクロノ＜クテリウム属に、Ｎ−６５３株
およびＮ−１０７４株はコリネバクテリウム属に属する
細菌としてそれぞれ同定された。

本発明に使用する培養液組成としては、通常、上記微生
物が生育しうるちのならば何でも使用できる。例えば、
炭素源としてグルコース、フラクトース、シュークロー
ス、マルトース等の糖類、酢酸、クエン酸等の有側Ｌエ
タノール、グリセロール等のアルコール類など、窒素源
としてペプトン、肉エキス、酵母エキス、蛋白質加水分
解物、アミノ酸等の一般天然窒素源の他に各種無機、有
機酸アンモニウム塩類などが使用でき、この他無機塩、
微量金属塩、ビタミンなどが必要に応して適宜使用され
る。

本発明で使用されるシクロヘキサノール、２．３ジハロ
−１−プロパノール（２，３−ジクロロ−１−プロパノ
ール、２，３−ジブロモ−１−プロパノールなど）、ジ
クロロエタノールの添加濃度は、特に限定するものでは
ないが、０．０１〜１．０（ＩＩ／Ｖ）％が好ましく、
これらは−括して添加するかあるいは分割添加すること
ができる。また、これらの化合物は単独で添加しても２
種以上組み合わせて添加してもかまわない。また、これ
らの化合物の添加する時期についても培養の始めから添
加してもあるいは培養の途中から添加してもよい。

上記培養液を用いた脱ハロゲン化酵素生産菌の培養は常
法によればよく、例えば、温度２０〜４５”Ｃ１ｐＨ４
〜１０の範囲で好気的に１０〜９６時間培養する。

本発明の培養法によれば、高活性な脱ハロゲン化酵素を
有する該酵素生産菌を製造することができるので、本発
明は（Ｒ）−（−）−３−ハロー１．２−プロパンジオ
ールの製造に有用な脱ハロゲン化酵素生産菌の工業的な
生産に大いに貢献し得る。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本
発明はこれらの例のみに限定されるものではない。

実施例１ グルコース１％、ペプトン０．５％、肉エキス０．３％
、酵母エキス０．３％からなる培地をｐＨ７，０に調整
して、５００−三角フラスコに１００ｄづつ分注し、１
２０°Ｃで１５分間殺菌後、メンプランフィルターにて
除菌したシクロヘキサノール、２，３−ジクロロ−１−
プロパノール、ジクロロエタノールの溶液を所定濃度と
なるように添加した。また、対照としてこれらの化合物
を添加しなかった場合およびこれらの化合物に代えてメ
ンブランフィルタ−で除菌した３−クロロ−１，２−プ
ロパンジオールを添加した場合についても同様の操作を
行った。

上記培地に脱ハロゲン化酵素生産菌ミクロバクテリウム
Ｎ−４７０１株（微工研条寄第２６４４号）を接種し、
３０°Ｃにて４８時間振盪培養を行った。このようにし
て得られた脱ハロゲン化酵素生産菌に対して、以下のよ
うにして脱ハロゲン化酵素活性を測定した。

すなわち、この培養液４０ｄから遠心分離により菌体を
集め、５０ＩＩＭトリスーＨ１ＳＯ，緩衝液（ｐＨ８，
０）４０ｄで２回洗浄後、２Ｍ）リス−１１ｃＩ　ｌｌ
ｌ液液ｐｉ（８，０）２０ｄに懸濁し菌体懸濁液を得た
。この菌体懸濁液に２（縁／Ｖ）％の１．３−ジクロロ
−２−プロパノール溶液２０ｉを添加することにより反
応を開始し２時間後に生成した３−クロロ−１，２−プ
ロパンジオールをガスクロマトグラフィーにて定量した
。

その結果を表−１に示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、培養液中にシクロヘキサノール、２，３−ジハロ−
   １−プロパノールおよびジクロロエタノールから選ばれ
   た少なくとも１種の化合物を添加することを特徴とする
   脱ハロゲン化酵素生産菌の培養法２、脱ハロゲン化酵素
   生産菌がミクロバクテリウム属またはコリネバクテリウ
   ム属に属する細菌である請求項１記載の培養法。