JPH0488988A

JPH0488988A - 酵母プロモーター

Info

Publication number: JPH0488988A
Application number: JP2280557A
Authority: JP
Inventors: Andrew R Goodey; アンドリュー　ロバート　グッディ; Darrell Sleep; スリープダレル; Dina Vakeria; ディナ　バケリア
Original assignee: Delta Biotechnology Ltd
Current assignee: Albumedix Ltd
Priority date: 1989-10-18
Filing date: 1990-10-18
Publication date: 1992-03-23
Anticipated expiration: 2017-12-24
Also published as: DE69027970D1; EP0424117A1; GB8923521D0; ES2093635T3; JP3359341B2; KR0156935B1; DE69027970T2; KR910008137A; IE75373B1; CA2027355C; GB9022507D0; GB2237021A; ATE140975T1; EP0424117B1; GR3020730T3; AU6452590A; JP2003125791A; IE903733A1; CA2027355A1; GB2237021B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は酵母プロモーター、即ち酵母（例えばサツ力ロ
ミセスセレビッシｘ　（５ａｃｃｈａｒｏｓ＋ｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｃｅａｅ）　）のコード配列の発現を指令
するヌクレオチド配列に関する。既に酵母から数種のこ
のようなプロモーターが単離されており、酵母の異種コ
ード配列（ＣＯｄｉｎｇ　５ｅｑＵｅｎＣｆ！　）の発
現を指令するのに有用であることが証明されている。本
明細書で「異種」とは、該コード配列はプロモーターの
存在する野生型微生物の中のプロモーターにより発現が
指令されるものではないという意味である；普通類コー
ド配列は野生型微生物には全く存在しないものである。

われわれはこうして使用できる酵母プロモーター及びそ
の断片を見いだし、それらは予測できなかった利点を有
していた。

本発明は、ＤＮＡプロモーター配列５ＥＱＩ又はその変
種又は機能性部分を、野生型のサツ力ロミセスセレビッ
シエ中で通常該配列に隣接するであろうコード配列から
分離された形で与える。

異種蛋白を発現させるためにプロモーターを使用すると
融合蛋白が産生きれるため普通は好ましくはないが、本
発明のプロモーターは、通常隣接するコード配列の一部
分を伴っていてもよい。

該配列の「変種又は機能性部分」とは、それぞれヌクレ
オチド配列が少し変化したもの及び／又は長さが短いも
のであるか、比較されている２つの発現系の他のパラメ
ーター（例えば３′制御領域）は同じで、前記の配列の
下流に位Ｗ１するコード配列の転写を促進する該配列の
能力の少なくとも１０％（好ましくは８０％、９０％、
９５％又は９９％）を保持しているものである。該配列
の一部の場合、このような制御活性はその部分のみ（即
ち他の５′制御配列はなし）について、又はその部分の
５′又は３′に位置する別の５′制御配列とともに測定
される。好ましくは「変種」は該配列と８０％、９０％
、９５％又は９９％の相同性を有する。

好ましくは、配列の「機能性部分」は該配列の最も相同
性のある領域と、８０％、９０％、９５％、９９％又は
１００％の相同性を有する。好ましくはこの部分は少な
くとも１００ヌクレオチドの長さであり、さらに好まし
くは少なくとも２００．３００．４００．５００．１０
００又は第５００ヌクレオチドの長さである。「機能性
部分」は、複合炭素Ｗ（例えばブドウ糖又はショ糖）の
存在下では抑制され、このような炭素源が存在しない場
合は、グリセロール又はエタノールの存在の有無にかか
わらず脱抑制されるような該配列の能力を保持している
ことが適当である。

任意の「機能性部分」の３′未満は５ＥＱ１の３′未満
に対応し、該部分は３′から５′方向に連続的に約１．
３５又は１．４０に塩基対まで延長していることが適当
であり、ここから先は（本来の環境中ｒハ）　Ａ　ｌ　
ａ−ｔＲＮＡ６０ＬＩの遺伝子のようである。天然の形
では５ＥＱ１の３′未満はＡＴＧｆｔｆ！始コドンのす
ぐ前にある。

機能性部分は５ＥＱ３　（即ちＡ、　Ｔ　Ｇ開始コドン
のすぐ上流の３７９塩基対領域）からなり、随時さらに
配列の５′部分を含むことが有利である。

前述した５ＥＱ１、その変種、その一部分そして配列を
変更したものは、以後本発明の１０（−ターと称する。

このプロモーターはサツカロミセスセレビツシェのグリ
セロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼのプロモ
ーターであるようである（ＧｕＴ２、ジー・エフ・スプ
レーグとアール・クロナン（Ｓｐｒａｇｕｅ、　Ｇ、Ｆ
、　ａｎｄ　Ｃｒｏｎａｎ、　Ｒ）　、ジャーナル・オ
ブ番バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔ、）第１２９巻、
１３３５−１３４２頁、（１９７７年））。グリセロー
ル−３−ホスフエートデヒド０ゲナーゼコード領域は、
マウス、ウサギ、そしてショウジヨウバエ（Ｄｒｏｓｏ
ｐｈｉｌａ　ｓａｌａｎｏｇａｓｔｅｒ　）のグリセロ
ール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼと相同性があ
り、それらに対してそれぞれ６４％、６０％、そして５
６％の相同性がある。グリセロール−３−ホスフェート
デヒドロゲナーゼはグリセロールをジヒドロキシアセト
ンホスフェートに変換するのに必要な２つの酵素のうち
の１つである；グリセロールを単一の炭素源として与え
たときは、これらは必須の遺伝子である。

５ＥＱ２は、ＧＵＴ２のプロモーターの横に位置する５
′領域の一部を示し、５Ｅ０１領域とその蒸留の１２３
塩基対そしてＡＴＧｌｔｆｌ始コドンにより構成される
。

異種コード配列がプロモーターの下流に位置し、翻訳開
始コドンに関して正しいリーディングフレーム（ｒｅａ
ｄｉｎｇ　ｆｒａｇ＋ｅ　）中に存在するように、本発
明のプロモーターは制限部位に隣接して、クロニングベ
クター又は発現ベクター中に位置していてもよい。開始
コドンはベクター上（例えばプロモーターのすぐ横の３
′　）で供給してもよいし、又は異種コード配列の５′
末端として挿入してもよい。必要であれば本発明のプロ
モーターと開始コドンの間にリンカ−を加えることもで
きる。

３′制御領域も同様にベクター上で供給するか、又はコ
ード配列とともに挿入することができる。

転写停止シグナルは、菌類の転写停止とポリアデニル化
（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ　）の正しいシグナ
ルを含有する真核細胞遺伝子の３′隣接配列（３’　ｆ
ｌａｎｋｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　）であることが好
ましい。適当なフランキング配列としては、例えば０Ｕ
Ｔ２遺伝了のフランキング配列であるか、又は別のもの
でもよい。好ましくは停止シグナルはサツカロミセスセ
レビッシエＰＧＫ１又はＡＤＨｌのものである。本発明
のＤＮＡ構成体は、この構成体のクローニングベクター
中への挿入とクローニングを可能にする合成オリゴヌク
レオチドリンカーを両端に有する形で与えられることが
好ましい。本発明のプロモーター、ＤＮＡコード配列そ
して菌類の転写停止シグナルは、機能的な形で結合され
る。即ちそれらの正常なｌｌ燵が維持されるように隣接
して配列される。即ちその並び方は、発現制御配列はコ
ード配列の正しい発現を可能にし、転写停止シグナルは
転写とポリアデニル化の正しい停止を可能にするような
ものである。

これらの配列は、エンドヌクレアーゼのＨＭ配列を有す
る合成オリゴヌクレオチドリンカーにより結合されるこ
とが好ましい。

本発明ではさらに、それぞれ本発明のプロモーターより
なる１つ又は複数のＤＮＡ挿入体、目的のポリペプチド
をコードするＤＮＡ配列よりなるプロモーターの転写の
制御下にあるＤＮＡ断片、そして真核細胞転写停止シグ
ナルを含有するＤＮＡ配列を有するハイブリッドベクタ
ー（ｈｙｂｒｉｄ　ｖｅｃｔｐｒ　）が与えられる。

本発明のハイブリッドベクターは、ハイブリッドプラス
ミツド又は線状ＤＮＡベクターであり、形質転換される
予定の宿主生物により選択される。

本発明はまた特に、発現制御配列、上記のＤＮＡ断片、
そして転写停止シグナルを含有する配列とは別に、プロ
モーターの機能（即ち目的のポリペプチドの発現）には
必須ではないか又はそれはと重要ではないが、例えばハ
イブリッドプラスミツドで形質転換した細胞の増殖にお
いて重要な役割を果たす追加のＤＮＡ配列を含むハイブ
リッドプラスミツトに関する。この追加のＤＮＡ配列は
、原核細胞及び／又は真核細胞でもよく、染色体ＤＮＡ
及び／又は染色体外ＤＮＡ配列を含んでいてもよい。例
えば追加のＤＮＡ配列は、プラスミツトＤＮＡ　（例え
ば細菌性又は真核細胞プラスミツドＤＮＡ）　、ウィル
スＤＮＡ及び／又は染色体ＤＮＡ　（例えば細菌、酵母
又は高等真核細胞の染色体ＤＮＡ）由来でも（又は、よ
り構成されていても）よい。好適なハイブリッドプラス
ミツトは、細菌性プラスミツド（特に大腸菌（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）プラスミツドｐＢＲ３２２
又は関連プラスミツド）、バクテリオファージ、酵母２
μプラスミツド、及び／又は酵母染色体ＤＮＡ由来の追
加のＤＮＡ配列を含む。

本発明の好適なハイブリッドプラスミツドにおいて、追
加のＤＮＡ配列は酵母の複製開始点と酵母の選択的遺伝
マーカーを有する。酵母の複製開始点を含むハイブリッ
ドプラスミツト（例えば自律的に複製する断片（ａｒｓ
）　）は、形質転換後に酵母細胞中で染色体外で維持さ
れ、糸状分裂で自律的に複製される。ＩＩ母の２μプラ
スミツドＤＮＡに相同性のある配列を含むハイブリッド
プラスミツドを使用することもできる。これらのハイブ
リッドプラスミツトはすでに細胞内に存在する２μプラ
スミツド中に組換えにより取り込まれるか、又は自律的
に複製される。取り込みベクターであるヨーロッパ特許
出願第２５１７４４号の取り込みベクター（ｉｎｅｇｒ
ａｔｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　）又はヨーロッパ特許出願
第２８６４２４号の「分解」ベクター（ｄｉｓｉｎｔｅ
ｇｒａｔｉｏｎ”　ｖｅｃｔｏｒ）を使用することもで
きる。

酵母の選択的遺伝マーカーについては、マーカーの表現
型発現による形質転換体の選択を促進する任意のマーカ
ー遺伝子が使用できる。酵母の適当なマーカーとしては
特に抗生物質耐性を示すもの、又は栄養要求性（ａｌｌ
ＸＯｔｒｏｐｈｉｃ　）酵母突然変異体の場合は宿主の
障害を補正する遺伝子である。

対応する遺伝子は、例えば抗生物質サイクロへキシミド
に対する耐性を与え、栄養要求性酵母突然変異体（例え
ばＵＲＡｌ、ＵＲＡ３、ＡＲＧ４、ＬＥＵ２、ＨＩＳ４
、ＨＩＳ３、ＴＲＰ５又はＴＲＰＩ遺伝子）に無機物か
ら栄養を取る能力（ブｏｏトロフィー　（ｐｒｏｔｏｔ
ｒｏｐｈｙ　）　）を与える。

本発明のハイブリッドプラスミツト中に存在する追加の
ＤＮＡ配列はまた、複製開始点と細菌宿主（特に大ｌ！
菌）の選択的遺伝マーカーを有することが有効である。

酵母のハイブリッドプラスミツド中に大腸菌のｌＩ製開
開始点大ＷＡ菌のマーカーが存在することには有用な特
色がある。まず大腸菌中での増殖と増幅により大量のハ
イブリッドプラスミツトＤＮＡが得られること、第２に
大ｔｔｍに基づく全範囲のクローニング技術が利用でき
るため大ｍ菌中でのハイブリッドプラスミツトの作成が
便利であることである。大ｌｉｍプラスミツド（例えば
ｐＢＲ３２２など）は、大腸菌複製開始点と抗生物質（
例えばテトラサイクリンやアンピシリン）耐性を与える
大腸菌遺伝マーカーを含み、酵母のハイブリッドベクタ
ーの一部として有効に使用できる。

本発明のハイブリッドベクターは、特にそれぞれ発現制
御配列と、目的の蛋白をコードするＤＮＡ配列よりなる
１つ又は複数のＤＮＡ挿入体を含む。もしハイブリッド
ベクターが複数のＤＮＡ挿入体（例えば２つから４つの
ＤＮＡ挿入体）を含む場合、これらはハイブリッドベク
ター中で一列に並んで、又は異なる位置に存在する。

好適なハイブリッドベクターは一列に並んだ１つ又は複
数のＤＮＡ挿入体を含む。ＤＮＡ挿入体は特に頭から尾
に配列している。

本発明のハイブリッドプラスミツトは当業者に公知の方
法で調製される。ハイブリッドベクターの調製法は、本
発明のプロモーター、目的のポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列よりなり発現制御配列の転写制御下にあるＤ
ＮＡ断片、そして菌類の転写停止シグナルを含有するＤ
ＮＡ配列を含有する１つ又は複数のＤＮＡ作成体をその
まま、又は該ＤＮＡ作成体の成分をあらかじめ決められ
た順序で、ベクターに導入することよりなる。

本発明のハイブリッドプラスミツトは従来の結合法を応
用することにより作成される。プラスミツトの成分は通
常の制限部位及び／又は合成リンカ−分子及び／又はプ
ラント末端結合法により結合される。

本発明のプロモーターは、形質転換した酵母（例えばサ
ッカロミセスセレビツシエ又はシゾサツカロミセスボン
ベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｓｂ
ｅ　）　、又はプロモーターが有効である他の任意の宿
主）中で使用できる。菌類細胞としては、ピキア（Ｐｉ
ｃｈｉａ）属、サツカロミセス（５ａｃｃｈａｒｏｓｙ
ｃｅｓ　）属、クルイヘロミセス（にＩｕｙｖｅｒｏｓ
ｙｃｅｓ　）　ｊ１１キャンデイダ（Ｃａｎｄｉｄａ　
）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、ハン
ゼニュラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　）属、シゾサツカロミ
セス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　）属
、シテロミセス（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ　）　ｊｉ、
バキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属、デバロミセス
（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ　）　ｊｉｇ、メチユニコピ
ア　（Ｈｅｔｓｈｕｎｉｋｏｗｉａ　）属、０−ドスボ
リジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｓ）属、ロイコ
スボリジウム（ＬｅＵＣＯ３ｐＯｒｉｄｉＵＩ）属、ポ
ツリオアスカス（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ　）属、スボ
リジオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ　）属、エ
ンドミコプシス（Ｅｎｄｏｓｙｃｏｐｓｉｓ＞　ＩｊＡ
などがある。好適な属は、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、
サツカロミセス（ｓａｃｃｈａｒｏｇ＋ｙｃｅｓ　）属
、クルイベロミセス（にＩｕｙｖｅｒｏｓｙｃｅｓ　）
属、ヤロビア（Ｖａｒｒｏｗｉａ　）属そしてハンゼニ
ュラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　）属よりなる群から選択さ
れるものである。その理由は、現在これらの酵母のＤＮ
Ａを操作する能力は、上記の他の属の酵母より充分に開
発されているからである。

サツカロミセスの例としては、サッカロミセスセレビツ
シエ、サッカ０ミセスイタリカス（５ａｃｃｈａｒｏａ
ｙｃｅｓ　１ｔａｌｉｃｕｓ）そしてサツカロミセスル
ーキシ−（ｓａｃｃｈａｒｏｓｙｃｅｓ　ｒｏｕｘｉｉ
）がある。

クルイベロミセスの例としては、クルイベロミセスフラ
ジリス（に１ｕｙｖｅｒｏａｙｃｅｓ　ｆｌａｏｉｌｉ
ｓ）とクルイベロミセスラクテイス（に＋ｕｙｖｅｒｏ
ｍＶｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ）がある。ハンゼニュラの例
としては、ハンゼニュラボリモルフ７　（Ｈａｎｓｅｎ
ｕｌａ　ｐｏｌｙｓｏｒｐｈａ）とハンセニュラアノマ
ラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ａｎｏｗａｌａ　）そしてハ
ンゼニュラカブスラータ（ＨａｎＳｅｎＵｌａｃａｐｓ
ｕｌａｔａ　）がある。ヤ０ビアリボリテイ力（Ｙａｒ
ｒｏｗｉａ　ｌ１ｐｏｌｙｔｉｃａ　）は適当なり０ビ
ア種の例である。糸状性の菌類としては、アスペルギル
スニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　）が
ある。

菌類細胞は、（ａ）細胞壁を消化してスフェロプラスト
（５ｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ　）を産生し：（ｂ）スフェ
ロプラストを形質転換ＤＮＡ　（種々の供給源から入手
されたものであり、天然又は非天然のＤＮＡ配列を含む
）と混合し；そして（Ｃ）形質転換細胞を再生させるこ
とにより形質転換される。次に再生した細胞を、形質転
換ＤＮＡの導入のためにスクリーニングする。

ピキア属、サツカロミセス属、クルイベロミセス属、ヤ
ロビア属そしてハンゼニュラ属の―類細胞は、細胞壁を
酵素で消化してスフェロプラストを産生させて形質転換
し：次にスフェロプラストを形質転換ＤＮＡと混合し、
カルシウムイオンとポリエチレングリコールの存在上で
インキュベートし、形質転換したスフェロプラストを再
生培地中で再生することにより、形質転換できることが
証明されている。

サツ力ロミセスセレピッシェの形質転換法は、ヨーロッ
パ特許第２５１７４４号、第２５８０６７号、そしてＷ
０９０１０１０６３号に一般的に記載されており、これ
らは全て参考のため本明細書に引用されている。

又はヒンネン（旧ｎｎｅｎ）らの方法（ブ０シーデイン
グズオブナショナルアカデミーオブサイエンシーズオブ
’ｌ−Ｘ　スＩ　−（Ｐｒ０Ｃ，Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、
ｓｃｉ。

ＵＳＡ）！７５１．１９２９頁（１９７８年））ニよる
、ハイブリッドベクターで酵母を形質転換することがで
きる。この方法は３つの段階に分類できる：（１）　　例えばカタツムリの消化管液（ｏｕｔ　ｊｕ
ｉｃｅｓ）（例えばグルスラーゼ（Ｇｌｕｓｕｌａｓｅ
　’　）　又ハヘ’Ｊカーゼ（ＨｅｌｉｃａｓｅＲ）　
）のような種々のグルコシダーゼ調製物、又は微生物よ
り得られた酵素混合物（例えばザイモリアーゼ（Ｚｙｍ
ｏｌｙａｓｅ　Ｒ）　）を用いて、浸透圧を安定化させ
た溶液（例えば１Ｍンルビトール）中で、酵母の細胞壁
又はその一部を除去。

（２）　　ポリエチレングリコールとＣａ２＋イオンの
存在下でＤＮＡベクターによる「裸の」酵母細胞（スフ
ェロプラスト）の処理。

（３）　　細Ｉ！壁の再生と寒天の固体層での形質転換
した細胞の選択。この再生はスフェロプラストを寒天中
に埋め込んで行うのが便利である。例えば溶解した寒天
（約５０℃）をスフェロプラストと混合する。溶液を酵
母の増殖温度（約３０℃）に冷却して固体層を得る。こ
の寒天層は、スフェロプラストからの必須高分子の急速
な拡散と消失を防ぐためであり、従って細胞壁の再生を
促進する。

しかしスフェロプラストをあらかじめ作成した寒天−の
表面に広げることによっても、（効率は低いが）細Ｉ！
壁の再生は可能である。

好ましくは、形質転換した細胞の再生と選択が同時にで
きるように、再生寒天を調製する。選択マーカー（−同
上）としてアミノ酸生合成経路の酵素をコードする酵母
遺伝子が一般的に使用されるため、再生は好ましくは酵
母の最小培地寒天中で行われる。非常に効率の＾い再生
が必要な場合は、以下の２段階法が有効である：（１）　　栄養豊富な複合培地（ｒｉｃｈ　ｃｏｓｐｌ
ｅｘ■ｅｄｉｕｍ）中での細胞壁の再生、そして（２）
　　選択寒天平板への細胞層のレプリカ平板法による形
質転換細胞の選択。

ＤＮＡベクターが真核宿主の細胞の形質転換に使用され
る線状ＤＮＡベクターの場合、形質転換は好ましくは、
酵母の選択マーカーを含む第２のベクターの存在下で行
われる。この共形質転換（ｃｏｔｒａｎｓｒｏｒｓａｔ
ｔｏｎ）により、直接には選択することができないＤＮ
Ａを取り上げた宿主細胞を濃縮することができる。コン
ビタントな（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　）細胞は任意の型のＤＮＡを取
り上げるため、選択ベクターで形質転換した大多数の細
胞は追加のＤＮＡ　（例えば上記の線状ＤＮＡベクター
）を持っている。目的のポリペプチドの産生に当たって
は、当業者に公知の方法を用いて突然変異や選択により
、形質転換宿主細胞を改良することができる。突然変異
は例えば紫外線照射又は適当な化学試薬により行うこと
ができる。プロテアーゼＡ又はＢの欠損した株が特に好
ましく、このような株は一般的に入手することができる
。

異種コード配列は任意のポリペプチド（オリゴペプチド
を含む）をコードする。ポリペプチドとしては、フィブ
ロネクチン又はその一部（例えばヨーロッパ特許２０７
５１号に記載のコラーゲン又はフィブリン結合部分）、
ウロキナーゼ、ブローウロキナーゼ、ＣＤ４の１−３６
８部分（デイ−・スミス（Ｄ、５Ｉｉｔｈ　）ら、サイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）第３２８巻、１７０４−１
７０７頁（１９８７年））、血小板由来増殖因子（コリ
ンズ（Ｃｏｆｆｉｎｓ　）ら、ネーチｔ−（Ｎａｔｕｒ
ｅ）第３１６巻、７４８−７５０頁（１９８５年））、
形質転換増殖因子β（プリンク（Ｄｅｒｙｎｃｋ　）ら
、ネーチｔ　−（Ｎａｔｕｒｅ）第３１６巻、７０１−
７０５頁（１９８５年））、ホンビルプラント因子（Ｖ
ｏｎ　Ｎｉ１ｌｅｂｒ　ａｎｄ’ｓ　Ｆａｃｔｏｒ）の
１−２７２部分（ボンタム（８０ｎｔｈａ■）ら、ヌク
レイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、　）第１４５巻、７１２５−７１２７頁）、フィ
ブロネクチンのカテプシンＤ断片（５８５−第５７８）
、α１−アンチトリプシン、プラスミノーゲンアクティ
ベーターインヒビター、第■因子、α−グロビン、β−
グロビン、ミオグロビン、神経増殖因子、ＬＡＣ！（リ
ポ蛋白関連凝固インヒビター）（ジー・ジエイ・ブロー
ス（Ｂｒｏｚｅ、　Ｇ、Ｊ、　）　、バイオケミストリ
ー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２９巻、７５３９−
７５４６頁（１９９０年））、ラクトフェリン（ジエイ
・フレンチｔ　−（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ、　Ｊ、）、「免
疫、腫瘍、炎症における鉄Ｊ　（’　Ｉｒｏｎ　ｉｎ　
Ｉｍ−ｕｎｉｔ■Ｃａｎｃｅｒ　畠１ｎｆｌａｇ＋ｎａ
ｔｉｏｎ“）、１９８９年、ウィリーアンドサンズ（賛
ｉｅｙ　＆　Ｓｏｎｇ）　、エム・デソウサとジェイ・
エイチ・ブロック（ｄｅ　５ｏｕｓａ、　Ｈ。

嘉Ｂｒｏｃｋ、　Ｊ、Ｈ，）編）又は血小板由来内皮細
胞増殖因子（ＰＤＥＣＧＦ）（エフ・イシカワ（Ｉｓｈ
ｉｋａｗａ、　Ｆ、）、ネーチ１ｙ　−（ｎａｔｕｒｅ
）第３３８巻、５５７−５６２頁（１９８９年））、又
はこれらの保存的変種がある。ポリペプチドはまた、Ｈ
８Ａ又はそのＮ−末端部分と他のポリペプチド（例えば
上記したもの）との融合物でもよい。好ましくはポリペ
プチドは天然に存在するヒト血清アルブミン、修飾ヒト
血清アルブミン又はこれらのいずれかの断片（このよう
な修飾型や断片が１変種」である）、又はα−又はβ−
グロビンである。これらの変種は、Ｈ８Ａの少なくとも
１つの生理学的機能を果たし、（当業者によりＨ８Ａの
型又は断片と見なされる）構造的（特に３次元構造）に
Ｈ８Ａに充分類似の全ての型のＨ８Ａ又はＨ８Ａの断片
を含む。

特に、そのリガンド結合能（例えばビリルビン又は脂肪
酸に関して）の少なくとも５０％（好ましくは８０％、
又は９５％）、及び／又はその作用の少なくとも５０％
（好ましくは８０％又は９０％）を保持するＨ８Ａの変
種又は断片が含まれる。このような性質はジェイ・アー
ル・ブラウンとビー・シ３ツクレイ（Ｂｒｏｗｎ、　Ｊ
　Ｒ＆　５ｈｏｃｋｌｅｙＰ　）（１９８２年）、脂質
−蛋白相互作用（Ｌｉｐｉｄ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｎｔ
ｅｒａｃｔｉｏｎ　）第１巻、２６６８頁、ビー・シー
・ジョストとオー・エイチ・グリフイス（Ｊｏｓｔ、　
Ｐ　Ｃ＆　ＧｒｉＨｉｔｈ、　ＯＨ）編）に討論されて
いる。

ヨー０ツバ特許第３２２０９４号に開示されているＨ８
Ａの部分は、本発明のプロモーターの使用により発現さ
れる有用なＨ８Ａ断片の例である。

ポリペプチドは最初は分泌リーダー配列との融合物とし
て発現される。）ＩＳＡの場合はこれは例えば、天然の
Ｈ８Ａリーダー、サツ力ロミセスセレビッシェのαメー
ティング因子（−ａｔｉｎｌＪｆａｃｔｏｒ）　、クル
イベロミセスラクティス（にｌｕｙｖｅｒｏｗｙｃｅｓ
　１ａｃｔｉｓ）キラー毒素リーダー又は天然のＨ８Ａ
リーダーと上記酵母リーダーのいずれかとの融合物であ
る。即ちリーダーは５ＥＱ４と５ＥＱ５のいずれか、又
はいずれかの配列の保存的に修飾された変種（ＷＯ９０
１０１０６３に記載）である。

宿主細胞は公知の方法で目的のポリペプチドを発現させ
るために発酵される。ポリペプチドは公知の方法（例え
ば（もしポリペプチドが分泌されない場合）細胞を分離
し、溶解し、上澄液を集め、濃縮しそしてクロマトグラ
フィーでポリペプチドを分離）により精製される。

本発明のプロモーターは複合炭素源が存在しないところ
で（グリセロールとエタノールの存在にかかわらず）脱
抑制され、これは酵母の大量培養に有用である。即ち本
発明は形質転換した酵母を大量に増殖させ、培地から複
合炭素域を枯渇させて単純な炭素源（例えばグリセロー
ル又はエタノール）を添加して目的のポリペプチドの発
現を誘導する方法を与える。

本発明の好適な点を実施例と添付の図面に関して説明す
る。

図１から９は、それぞれプラスミツドｐＸＬ５、ｐＡＹ
Ｅ２７４、ｐＡＹＥ２７５、ｐＡＹＥ３３４、ｐＡＹＥ
２７６、ｐＡＹＥ３２３、ｐＡＹＥ３２４、ｐＳＡＣ３
５そしてｐＡＹＥ３２１の制限酵素地図である。

図１０は、異なる時間に撮ったＩｉ識ＲＮＡを示すゲル
の写真である。

図１１は、図１０に対応するグリセ０−ルー３＝ホスフ
エートデヒドロゲナーゼのプロモーターの発現の経時変
化を示す写真である。

図１２はプラスミツドｐＤＸＬ２００の制限酵素地図で
ある。

図１３はプラスミツドｐＤＶＸ２の制限酵素地図である
。

図１４はプラスミツドｐＤＶＸ４の制限酵素地図である
。

株と培養条件プラスミツド作成のために、大轟菌ＤＨ５α（Ｆ−１φ
８０ｄｌａＣＺデルタＭ第５、デルタ（ｌ　ａｃＺＹＡ
−ａｒａＦ＞　Ｕｌ　６９、ｒｅｃＡｌ、ｅｎｄＡＩ、
ｈｓｄＲ１７（ｒｋ　−ｍｋ”　＞、５ＬＩｐＥ４４、
ラムダ、ｔｈｉ−１、ＱｙｒＡ、ｒｅｌＡｌ）を使用し
た。Ｍ１３ベクターの増殖のために、大腸菌Ｘ　Ｌ、　
１−ブルー（ストラータジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
）　、ｅ　ｎ　ｄ　Ａ　１、ｈｓｄＲ１７（ｒ　　−１
ｍ　　＋）、５ｕｐＥ４４、ｋｔｈｉ−１、ラムダ、ｒｅｃＡｌ、ＱｙｒＡ９６、ｒｅ
ｌＡｌ、（ｌａｃ−）、［Ｆ’　　１）ｒＯＡＢ。

１ａｃｉＱ７デルタＭ第５、ＴｎｌＯｌ（ｔｅｔｌ）］
）を使用した。組換えアルブミン発現の宿主としてサツ
カロミセスセレビッシよりＢｌｃｉｒ”　　（ａ、１ｅｕ２）を使用した。使用
した他のサツ力ロミセスセレビッシエ株はＡＨ２２ｃ　
ｉ　ｒ”　　（ａ、ｃａｎｌ、１ｅｕ２、ｈｉｓ４）：
ＢＪ１９９１ｃ　ｉ　ｒ”　　（ｃｒ、ｐｒｂｌ−１１
２２、ｐｅｐ４−３．１ｅｕ２、ｔｒｐｌ、ｕｒａ３−
５２）と５２２ｃ　ｉ　ｒ”　　（ａ、ａｄｅｌ、ａｄ
ｅ２、ｕｒａｌ、ｈｉｓ７、ｔｙｒｌ、Ｉｙｓ７、ｇａ
ｌ　１、Ｑｕｔ２）である。酵母細胞は３０℃で、適当
な炭素源を補ったＹＥＰ　（１％（賛／Ｖ）！Ｉ母エキ
ス、２％（Ｗ／Ｖ）バタトベプトン）栄養寒天（ｎｕｔ
ｒｉｅｎｔ　ａｇａｒ　）上で行った。サツ力ロミセス
セレビッシエ形質転換体は、５０−の円錐形振盪フラス
コ中の１０ｄＹＥＰ、２％（Ｉｌｌ／ｖ）ショ糖中で、
３０℃、２００ｒｐ−で７２ＦＲ間増殖さセタ。１％（
Ｗ／Ｖ）電気泳動品質のアガロースを含有するＹＥＰを
５０℃に冷却してＨ８Ａ抗体平板を調製した。次に適当
な炭素源と共に２．５％（Ｖ／Ｖ）になるようにウサギ
抗−ヒトアルブミン抗血清（キャンビオ（Ｃａｍｂｉｏ
）　、ケンブリッジ（Ｃａ−ｂｒｉｄｇｅ　）　、英国
）を加え、栄養培地（ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｍｅｄｉｕｍ
　）をシャーレのなかに注ぎ、冷却させた。

ＤＮＡ操作標準的ＤＮＡ操作法を使用した（マニアテイス（Ｈａｎ
ｉａｔｉｓ）ら、１９８２年、モレキュラークロニング
、実験室マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ、＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　；　］
−］ルドスブリングハーパーＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ）　；サンプルーフ（５ａｓｂｒｏｏｋ）
ら、１９８９年（第２版））。

ＤＮＡ断片は遠心分離によりアガロースゲルからなるル
ーチン的に回収した（ビー・フォーゲルスタイン（Ｖｏ
ｇｅｌｓｔｅｉｎ、　Ｂ、）　、アナリテイカルバイオ
ケミストリ−（Ａｎａｌ、　Ｂ１０Ｃｈｅｌ　）　、第
１６０＠、１第５−１１８頁（１９８７年））。放射標
識ＤＮＡは［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰ（アマ−ジャムイン
ターナショナル（Ａｍｅｓｈａ−１ｎｔｅｒｎａ口ｏｎ
ａｌ　）ＰＬＯ）とランダムブライマー′ｌ！ＡＩＥ払
（ニー・ビー・フエインバーグとビー・フォーゲルスタ
イン（Ｆｅ１ｎｂｅｒｏ、　Ａ　Ｐ　ａｎｄ　Ｖｏｏｅ
ｌｓｔｅｉｎ、　Ｂ、　）　、７ナリテイカルバイオケ
ミストリー（Ａｎａｌ、　８ｉｏｃｈｅ置）第１３７巻
、２６６−２６７頁（１９８４年））を用いて行った。

制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４　
　ＤＮＡポリメラーゼそして大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
■（フレノウ断片）はベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒ−Ｈａｎｎｎｈｅｉｇ＊）社より入手し
た。

グリセ０−ルー３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｏ
ＵＴ２）Ｉ母プロモーター断片は、酵母ＤＮＡのＢＱＩ
ＩＩ制限により得られた断片のゲノムライブラリーから
得た。Ｂｑ　ｌ　Ｉ［ＩＩＩ限断片は、単、純ヘルペス
（Ｈｅｒｐｅｓ　Ｓｉｍｐｌｅｘ）のチミジンキナーゼ
（丁Ｋ）遺伝子を含むプラスミツトの単一のＢｑｌＩ［
部位に挿入された。プロモーター断片がチミジンキナー
ゼ遺伝子の前にクローン化される場合のみ、このプラス
ミツトで形質転換した酵母は葉酸アンタゴニスト（例え
ばスルファニルアミドとアメトプテリン）の存在下で増
殖する（グツデイ（Ｇｏｏｄｅｙ　）ら、モレキュラー
アンドジエネラルジエネテイツクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　ａｎｄ　ＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ）第２０
４巻、５０５−５１１頁（１９８６年）、参考のため本
明細書中に引用されている）。

細胞抽出物中のチミジンキナーゼ活性を測定することに
より、活性プロモーターを有するプラスミツドを選択し
た。

プロモーター断片はプラスミツドｐＸＬ５のＢＩＩ［制
限断片中に封じ込めた（図１）。グリセロール−３−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼプロモーターの１．４８に
塩基対の断片の配列を決定した（ＳＥＱ２＞。酵母プロ
モーターの３′末端上に５ｆｉＩ制限工ンドヌクレアー
ゼ部位を導入してプロモーター断片を修飾した。

天然のＡＴＧ環境ＴＡＭＧＡＴＧｅｔ翻訳修飾したこれらの２つの配列はそれぞれ５ＥＱ６と５ＥＱ７であ
る。

１：　換えヒト血　アルブミン　ｒ　ＨＡの発現ＧＵＴ２プロモーターの２８２塩基対のＰｓｔＩ−Ｒｓ
ａＩ断片（即ち５ＥＱ１１７）１０３１−１０３６位の
ＣＴＧＣ八Ｇかへ１３１４−１３１７位のＧＴＡＣまで
）と５６塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドリンカ− ５′− ＴＡＴＡＡＡＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＧＧ　ＧＴＡ−５
′ ＴＣＧＡ−３’ （この５１　３１鎖は５ＥＱ１２を構成する）をＭ１３
ｍｐ１８のｐｓｔ■とｌ−１ｉ　ｎ　ｄ　Ｉ［［部位に
挿入しくＶニツシューベロン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒ
ｒｏｎ）ら、ジーン（Ｇｏｎｅ）第３３巻、１０３−１
０９頁（１９８５年））プラスミツドｐＡＹＦ２７４　
（図２）を作成し、単一のＳｆ’ｉ丁５’　部位を翻訳
開始部位に導入した。ＥＣ０ＲＩとＰｓｔＩでｐＡＹＥ
２７４を線状化し、ｐＸＬ５　（図１）からの２．３ｋ
ｂのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断ハで再び環状化し、ｐＡＹ
Ｅ２７５を作成した（図３）。これをＥ、Ｃ０ＲＴ−Ｈ
ｉｎｄｌｌで消化し２．３ｋｂの０ＵＴ２プロモ一ター
断片を精製した。

プラスミツドｐＡＹＥ３３４　（本実験の次の段階で使
用される）の作成は、同時継続出願第８９２７４８０．
７号に記載されているが、本明細書でも繰り返して記載
する。

プラスミツドｐＡＡｌｉ５（グツデイ（Ｇａｏｄｙンら
、１９８７年：イーストバイオテクノロジー（Ｙｅａｓ
ｔ　ＢｉｏＬｅｃｈｎｏｌｏｇＶ　）　、４０１−４２
９　頁、デイ−・アール・べり−、アイ・ラッセルとシ
ー・ジー・スヂュア−１−（Ｂｅｒｒｙ、　Ｄ、Ｒ，、
Ｒｕ５ｓｅｌｌ　　Ｉ。

ａｎｄ　Ｓｔｅｗａｒｔ、　Ｇ、Ｇ、　）編、７　Ｌ／
　ン−／’　＞　ドア　ンウィン社（八１ｌｅｎｎ　ａ
ｎｄ　Ｕｎｗｉｎ）発行）をＢ　ａ　ｍ　ＬＩ　Ｉ　テ
部分消化して線状化した。５′の突き出た末端を１４Ｄ
ＮＡポリメラーゼでプラント末端にし、二本鎖オリゴヌ
クレオチドリンカー：５　’　−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’ ３　’−ＣＧＣＣＧＧＣＧ−５　’ Ｌ−−−−−」ＮｏｔＩで結合させた。ＡＤＨＩターミネータ−（ｔｅｒｖｉｎ
ａｔｏｒ）の３′末端でＢａｍＨＩ部位がＮｏｔＩ制限
部位に置き変わっている組換えプラスミツドｐＡＹＥ３
３４　（図４）を選択した。

ｐＡＹＥ２７５（図３）からの修飾断片とｐＡＹＥ３３
４からの４５０塩基対のＨｉｎｄｌｌｌ−ＮｏｔＩ　　
ＡＤＨＩターミネータ−断片を、それ自身のＮｏｔＩＨ
１部位（ｂ　　’　　　　　　（］　　ＣＧ　　Ｇ　　ＣＣＧ
　　Ｃｔ　　　　　３　　’　　　）　　が　Ｂ　　ａ
　　ｍ　　ＨＩ部位に導入されＢａｍ１１１部位を破壊
しているｐ△丁第５３に結合しくライラグとシエラット
（Ｔｗｉｇｇ　　ａｎｄ　　５ｈｅｒｒａｔｔ）　　、
　１　９　８　０　年　）　、ｐΔＹＩＥ２７６を作成
した（図５）。

プラスミツドｐΔＹＥ２７６をＥＣ０ＲＩ３Ｓｔｌで線
状化し、３′のへこんだ（ｒｅｃｅｓｓｅｄ　）末端を
１“４ＤＮΔポリメラービとｄＮＴＰで埋め、過剰のＮ
ｏｔｌリンカ− （５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’　）で再環状化してプ
ラスミツドｐＡＹＥ３２３を作成したく図６）。このプ
ラスミツドをＨｉｎｄｌｌで線状化し、二本鎖オリゴヌ
クレオチドリン力ｍ：ＨｉｒｘｉＸＸＸＡＡＧＡ−３’ ＴＴＣＴ−５’ （この５’　−３’　鎖は５ＥＱ１３を構成する）と、
ＸｈｏＩｒ線状化したｒｎｐ１９．７　（ｍｌ−０ツバ
特許出願第２０１２３９号）から放出される１、９に塩
基対のＨＡｃＤＮＡ断片で再環状化し、Ｓ１ヌクレアー
ゼでプラント末端にしだ後Ｈｉｎｄｕで消化してプラス
ミドｐＡＹＥ３２４を作成した（図７）。プラスミツド
ｐＡＹＥ３２４（図７）中に作られた３、７２に塩基対
のＮＯ１■制限断片は、次に単一のＮｏｔｌ制限部位を
含有する適当な酵母複製ベクター（例えばＤＳＡＣ３５
、図８）に移し、ｐＡＹＥ３２１（図９ンのようなプラ
スミツドを作成することができる。

プラスミツドｐＳＡＣ３５はチネリとヒンチュ！Ｊ　７
　ｘ　（Ｃｈｉｎｅｒｙ　ａｎｄ　Ｈｉｎｃｈｌｉｆｆ
ｅ）　（カレントジｘ　ネ−ｒ　イ’ｙ　ス（Ｃｕｒｒ
、Ｇｅｎｅｔ、　）第１６巻、２１−２５頁（１９８９
年））とヨーロッパ特許第２８６４２４号に記載された
Ｅ）ＳＡＣ３の誘導体である。ＬＥＵ２選択マーカーは
、ｐＳＡＣ３の５ｎａＢＩ部位に挿入されたＹＥＰ１３
（ジェイ−７−ル・ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ　Ｊ　Ｒ）
ら、セル（Ｃｅｌｌ）第１６巻、８２７−８３９頁（１
９７９年））からのＩ　、　９５　ｋＪ忌基対の５ａｓ
ＩＩＩ　Ｄ　ａ　Ｉ　ｌｌｌｉ片である。ＬＥＬＪ２ｍ
伝子は単一の’ｒ　ｔ　ｂ　Ｉ−１１Ｉ部位をｆ′１す
る。このＷ９素で処理した後人ａ菌ＤＮ△ポリメラーゼ
■のフレノウ断片で処理して５′の突き出た末端を除去
した。プラント末端と線状化したＤＮＡを配列５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’ ３’−ｃｃｃｃｃｃｃｃ−ｓ’ の二本鎖オリゴヌクレＡチドと結合させて、Ｎｏ　ｔ　
Ｉ、ｌ識部位を挿入してｐｓＡｃ３５を作成した。

Ｓｆｉ■制限部位への挿入のために、広範囲の蛋白をコ
ードづるＤＮＡ断片を修飾するのに、多くの方法がある
ことが当業者には認識できるであろう。

本例では本発明のプロモーターを導入するＨ　Ｓ　Ａ分
泌ベクター（ｐＡＹＥ３２１）について記載する。この
ベクターは５つの異なる酵母株を形質転換づるのに使用
されている：これら５つの全ての株は培養上澄液中にｌ
−１８Ａを分泌した。プロモーターの制御下にあるＨ８
Ａの発現のタイミングも調べた。細胞が後期対数増殖期
に達すると、まずＨ３Ａ　　ｍＲＮＡが検出された。培
養物が静止用に入ってからち高レベルのＨ８Ａ　　ｍＲ
ＮＡが維持された。

プラスミツドｐＡＹＥ３２４　（図７）は、ＮＯｔ工制
限部位がその横に存在する全プロモーター／Ｈ８Ａ分泌
カセットを有するｐＡ７第５３ベースのベクターである
。この３．１７５に塩基対の分泌カセットは以下の特徴
を有する：１）上記したように（ＳＥＱ７）ＡＴＧの上
流の３０から４０塩基対の間の部位で４つのヌクレオチ
ドの置換が導入されている以外は、天然のプロモーター
ＡＴＧ環境を含む１．３５ｋｔｌ基対のプロモーター断
片。

２）成熟Ｈ８Ａの分泌を指令する天然のＨ８Ａ／α−因
子融合リーダー配列（ＷＯ９０１０１０６３）。

３）酵母アルコールデヒドロゲナーゼＡＤＨ１ターミネ
ータ−ａＩ域。

３．１７５に塩基対のＮｏｔＩブ０モーター／Ｈ８Ａ分
秘カセットを精製しｐｓＡｃ３５　（図８）（７）１１
−のＮ０ｔＩり０−ニング部位に挿入してプラスミツド
ｐＡＹＥ３２１を作成した（図９）。

５つの［ｃｉｒ’］株をプラスミツトｐＡＹＥ３２１でロイシンのプロトトロフィー（ｐｒｏ
ｔｏｔｒｏｐｈｙ　）にした：即ち株１［ｃｉｒ”　コ
、株２［ｃｉｒ’ｌ、株３［ｃｉｒ’］、株４［ｃｉｒ
’］、株５［ｃｉｒ’］、形質転換は基本的にベッグズ
（Ｂ１３１１１１１１Ｓ　）の記載する方法（ネーチャ
−（Ｎａｔｕｒｅ）第２７５巻、１０４−１０９頁（１
９７８年））に従い実施したが、以下の変更を行った。

１．２Ｍのソルビトール、１０＊Ｈｃａｃ　１２　ト１
２．５μｌ　ｆ）２０％　（Ｗ／Ｖ　）ポリエチレング
リコール３３５０　（シグマ）、１０ｍＨＣａＣｌ　　
、１０ｍＭトリス／塩１（ｐＨ７，５＞中で、１０μｍ
Ｎ！２イオン水中の形質転換ＤＮＡを５０μｍのスフェ
ロプラストと静かに混合させ、氷の上に第５分間保持し
た。さらに５００μｍの２０％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレン
グリコール３３５０（ジグｖ）、１０ｍ？４　０ａＣ１
，１０ｍ１リス／塩１１（ｐｔ１７，５）を添加してか
ら、スフェロプラストを５１の１．２Ｍソルビトール選
択寒天培地と静かに混合し、平板に広げた。各棟からの
２つの独立の形質転換体を、１０−ＩのＹＥＰ　（１％
ｗ／ｖ　ｉｌｌｌｌ生エキス％−／Ｖバクトベブトンそ
して２％−／Ｖブドウ糖）中で、２００　ｒｐ−で攪拌
して３０℃で７２時間増殖させた。

すべての形質転換体の培養上澄液中にＨ８Ａが検出され
、プロモーターは酵母中の異種蛋白の発現／分泌を指令
することができることを示していた。　　　２：　　の
タイミン４００１のＹＥＰ、２％　＜Ｗ／Ｖ　）ｆ）７ドウｍ’
Ｆ：含む１リツトルのシェークフラスコに株１ｐＡＹＥ
３２１を接種し、３０℃、２０　Ｏｒｐｍでインキュベ
ートした。接種後２４時間目、４８時間目、７２時間目
、９６時図目、１２０時間目に試料（２０ｍｌ）を採っ
た。各時間で培養物の光学密度と分泌されたＨ８Ａを測
定した。次に遠心分離により試料をＳ胞ベレットと培養
上澄液に分離した。上澄液に分泌されたＨ８Ａの濃度は
ロケットゲル電気泳動で測定し、細胞ベレットがらＲＮ
Ａを抽出した。ゲル電気泳動で各ＦＲ間でのＲＮＡを各
成分に分離し、ノーザンプロットを行い、ＰＧＫと）Ｉ
ｓＡＩ造遺伝子に相同性のある放射標ｌＤＮＡをプロー
ブとして検出した。リンゲイスト（Ｌｉｎｇｕｉｓｔ）
　ノ方Ｆ１．　（ネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）第２９
３巻、３１１−３１４頁（１９８１年））により酵母細
胞からＲＮＡを抽出した。１０μ９の全酵母ＲＮＡを１
．０％アガロース−ホルムアルデヒドグル上で溶解し、
２０ＸＳＳＰＥからポールバイオダイン（Ｐａｕｌ　ｂ
ｉｏ−ｄｙｎｅ　）ナイロン膜上にバキュームプロット
し、クロチエツクとシーペット（にｒｏｃｚｅｋ　ａｎ
ｄ　５ｉｅｂｅｔ）の方法（アナリテイ力ルバイオケミ
ストリ−（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｇ＋）第１８４巻、
９０−９５頁（１９９０年））に従い、紫外線で架橋さ
せた。６ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハルツ（Ｄｅｎｈａｒｄ
ｔｓ　）　、０．１％（１／Ｖ）ＳＯ８゜１００μｇ／
■１の変性したニシンの精子ＤＮＡ中で５０℃で１８時
時間イブリダイゼーションを行った。洗浄のストリンジ
ャンシー（ｗａｓｈｉｎｇ　　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）　　は０
．　２ＸＳＳＰＥ。

０．１％　（Ｗ／Ｖ　）ＳＤＳ、５０℃であった。

その結果を図１０に示す。図１１は、実験中の光学密度
とｒｉ−ＩＡのレベルを示す。接種後最初の時間の２４
１１間目では、ＰＧＫ　　ｍＲＮＡが観察されたが、Ｈ
８Ａの分泌もｌ−Ｉ　Ｓ　Ａ　　ｍ　ＲＮ　Ａも検出さ
れなかった。接種後４８時間目では、ＰＧＫとＨ８Ａの
ｍＲＮＡが細胞内に検出される。分泌されたＨ８Ａは培
養上澄液中に観察されるため、Ｈ８Ａ　　ｍＲＮＡは翻
訳に使用することができる。

次の３つの時間点（接種後７２時間目、９６詩問目、１
２０時間目）では、Ｈ８Ａ　　ｍＲＮＡのみが観察され
、ＰＧＫ　　ｍＲＮＡは消失していた。

培養上澄液中に観察されるＨ８Ａのレベルは、これより
前の時間より増加していたが、それ以上の増加は見られ
なかった。従って以下の結論が得られる：１）増殖の初期にＨ８Ａ遺伝子は発現されず、ＰＧＫの
発現を反映していない。

２）後期対数期と静止増殖期にはＨＳ　Ａ遺伝子が発現
され、Ｈ８Ａが分泌される。

３）静止期中Ｈ８Ａ　　ｍＲＮＡのレベルは維持される
。

さらにバッチ培養であろうが、フェッドーパッチ（ｆｅ
ｄ　ｂａｔｃｈ　）であろうが、又は連続培養であろう
が、発酵容器の調節された環境中では発現のタイミング
は操作することができる。単一の炭素源として抑制性の
炭素源（例えばショ糖又はブドウ糖）を与えると、異種
蛋白の発現は抑制される。

従って宿主生物の増殖は異種蛋白の合成により妨げられ
ない。オペレーターがあらかじめ決めた点でショ糖又は
ブドウ糖を非抑制性の炭素源（例えばグリセ０−ル又は
エタノール）に交換することができる。これらの条件下
では、異種蛋白の発現は脱抑制される。従って目的の生
成物の合成を最適化するように産生を調節することがで
きる。

３：種々の炭素源による発現種々の炭素源を補足した１ｏ−１のＹＥＰ中で、株１　
ｐＡＹＥ３２１を３０℃ｔ”２００ｒｐｌｔ”７２時間
増殖させた。対照実験でブドウ糖の代わりにショ糖を与
えたが、最終的なＨ８Ａ分鄭レベルは同じである。他の
すべての実験で）ＩＳＡ分泌の刺激が観察される。その
結果を以下の表１に示す。

最適な炭素源は１％（Ｖ／Ｖ）エタノールと１％（Ｖ／
Ｖ）グリセロールの組合せのようである。−目では刺激
効果はそれほど大きくないようであるか、ショ糖を炭素
源として得られた値はショ糖とエタノールを炭素源とし
て得られた値であることに注意すべきである。ショ糖を
過剰にして培養を続けると、分泌されるＨ８Ａのレベル
は大きく低下するであろう。

Ｌ−−ユ２７．５２　　　　　　　　　　　　　　　　　９．０２　　　
　　　　　　９．５ｉ、ｓ　　　　　　　ｏ、ｓ　　　　　　　　ｉｏ、ｓ
ｌ、０　　　　　　１．０　　　　　　　１２．５０．
５　　　　　　１．５　　　　　　　１１．０大１１引
Ａ本例ではサツ力ロミセスセレピツシエのジアスタテイカ
ス（ｄｉａｓｔａｔｌｃｕｓ　）変種のグルコアミラー
ゼを発現し、分泌させるためのプラスミツドｐＤＶＸ４
について記載する。

プラスミツドｐＤＶＸ４の最初の段階は、−船釣な醸造酵母ベクターｐＤＸＬ２０
０　（図１２）の作成ｔ’あり、コｔ’Ｌ　Ｌｔ以下の
ＤＮＡ配列を含んでいた：ａ）修飾したＧＵＴ２ＵＯ２Ｆ２ター（ｐＡＹＥ２７５
ンの０．３４ｋＪｉ基対の３ｒｎａ　１．−８　ｆ　ｉ
　１断片ｂ）ＳｆｉＩ、ＢｕｌｌそしＴＨｉｎｄｍのｉｌＪ限酵
素部位を含む合成オリゴヌクレＡヂドリン力−合成Ａリ
ゴヌクレＡチドリンカ− Ｆｌ　　ＩＢｇｌ　　Ｕ　　　Ｈｌｎｄ　ｍＤｅｒｉｖｅｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅオリゴ　　　　５−　　　ＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＴＡ　
　３−　　（１２）合成：　　　　　　３　’ＧＧＧＧ
ＣＣＧＧＴＣＴΔＧＡＴＴＣＧＡ　　５″５’　−３’
　修飾領域と２つのＡリボヌクレオチドはそれぞれ５Ｅ
Ｑ１４．５ＥＱ８．５ＥＱ９として記載されている。

ｃ）０．４５ｋｊ！基対のへＤト１１ターミネータ−（
アール・ニー・ヒッツエマン（ｕ　ｒ　ｔｚｅＩｌａｎ
、　Ｒ＾）ら、ネーチャー（ｎａｔｕｒｅ）第２９３巻
、７１７頁（１９８１年））。

ｄ）サッ力ロミセスセレビツシエのｃｕｐ−ｉ遺伝子と
そのフランキング配列（ｆｌａｎｋｉｎａｓｅｑｕｅｃ
ｎｃｅｓ　）はそれぞれ０．７に塩基対のＫｐｎＩ−Ｘ
ｂａＩ断片と０．３８に塩基対のＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ
断片上に存在した（エム・カリシ（にａｒｉｎ、　Ｈ）
ら、プロシーデイングズオブナショナルアカデミーオブ
サイエンシーズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｃｌ、Ｓ
ｃｉ、　）第８１巻、３３７頁（１９８４年））。ｃｕ
ｐ−ｉ遺伝子は醸造酵母の形質転換の選択的遺伝マーカ
ーとして使用した。

ｆ３）　　ｐＳ　Ａ　Ｃａ上に存在する２、７に塩基対
の細菌性ＤＮＡ　（ｐＬＪＣ９）（チネリとヒンチュリ
フｘ　（Ｃｈｉｎｅｒｙ　ａｎｄ　Ｈｉｎｃｈｌｉｆｆ
ｅ）　、カレントジエネチツクス（Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅ
ｔ、　）第１６巻、２１−２５頁（１９８９年））。

ｆ）　　２μｍＤＮＡ　：　２μｍ複製開始点を含有す
る２、２に塩基対Ｈｉｎｄｌ断片（ジエイ・アール・ブ
ローチ（Ｂｒｏａｃｈ　Ｊ　Ｒ）　（１９８２年）。「
酵母サツカロミセスセレビッシエの分子生物学：生活史
と遺伝」　（″”　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ
ｏｌｏｏｙ　ｏｒｔｈｅ　　　ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｗｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：ＬｉｆｅＣ
ｙｃｌｅ　ａｎｄ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　″）中の
酵母プラスミツド２ｔｔｍサークル（Ｔｈｅ　ｙｅａｓ
ｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　２μｍｃｉｒｃｌｅ）。ジエイ・
エフ・ストラーサーン、イー・ダブリュー・ジミーンズ
とジェイ・アール・ブローチ（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ、　
Ｊ　Ｎ、　Ｅ　ＨＪｏｎｅｓ　ａｎｄ　ＪＲＢｒｏａｃ
ｈ）編、コールドスプリングハーバ−（ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ）　、４４５頁）ｏ　２μｍＤ
ＮＡの全ＤＮＡ配列も知られている（ジエイ・エル・ハ
ートレイとジェイ・イー・ドネルソン（ｔ＋ａｒｔ＋ｅ
ｙ。

ｊ　Ｌ　ａｎｄＤＯｎｅｌＳＯｎ、　Ｊ　Ｅ　）　、ネ
ーチｔｙ　−（Ｎａｔｕｒｅ）第２２６巻、８６０頁、
（１９８０年））グルコアミラーゼをコードするＤＥＸ
Ｉ遺伝子はサツ力ロミセスセレビッシェのジアスタテイ
カス変種から単離した（ビー・ター・ミーデン（Ｈｅａ
ｄｅｎ　Ｐ　Ｋ）ら、ジーン（ａｅｎｅ）第３４巻、３
２５頁（１９８５年）　、ＰＣＴ／ＧＢ８５１００５９
９：バルド（ＰａｒｄＯ）　’３、（エフ・イー・ヒー
ーＩス−し９−ズ（ＦＥＢＳ、　Ｌｅｔｔ　）第２３９
巻、１７９−１８４頁（１９８８年）はＤＥＸＩプ０モ
ーターとそのオーブンリーディングフレームの一部につ
いて記載している）。ＤＥＸ１遺伝子を有する２、７５
に塩基対のＢｇＩｍ断片をｐＤＸＬ２００中の単一のＢ
ａｌＩＩ部位にクローン化し、ＤＮＡ配列を５ＥＱ１０
とし、そのコードする蛋白はを５ＥＱＩ　１として現れ
た。、得られたプラスミツト、ｐＤＶＸ２　（図１３）
をＸｂａＩで消化して、細菌性ＤＮＡを含有する小さい
断片（２，７に塩基対）を除去した。ゲル精製の後大き
いＸｂａ■断片を醸造酵母中に形質転換し、このプラス
ミツドをｐＤＶＸ４とした（図１４）。

仄旦及１Ｌ１１プラスミツドｐＤＶＸ４で銅に対して耐性にした醸造酵
母株を、ヘキソキナーゼ−ｖＵ定量法（ベーリンガーマ
ンハイム社（ＢｏｅｈｒｉｎｏｅｒＭａｎｎｈｅｉｓ）
　）を用いて、グルコアミラーゼ産生について測定した
。すべての例で銅耐性形質転換体は多量の細胞外グルコ
アミラーゼを産生した。

［配　列　表１（２）配列ＮＱＩ　（ＳＥＱｌ）の情報（ｉｌ　　配列
の特徴（＾）長さ：１３５７１基対（８）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（０）トポロジー：直鎖状（ｉｉｌ　　分子の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉ　ハイボ
セテイカル：ＮＯ（転）　アンチセンス＝ＮＯ簡）　起源（＾）生物芯：　５ａｃｃｈａｒｏａｙｃｅｓ　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キーニブ０モーター（Ｂ）位置：４２．．５２（Ｄ）他の情報：／機能＝ＲＮＡ　　ＰＯＬＩＩ［プロ
モーター　ボックスＡ（ｉｘ）特徴：（＾）名称／キーニブＯモーター（８）位置：８６．．９６（０）他の情報：／機能＝ＲＮＡ　　ＰＯＬＩ［［プロ
モーター　ボックスＡ（１ｘ）特＠：（＾）名称／キ一二プロモーター（８）位１ｆ：１１３．．１１８（Ｄ）他の情報：／機能＝ＲＮＡターミネータ− ０ＬＢＩ（ｉｘ）特徴：（＾）名称／キー：蛋白結合（Ｂ）位１！：１０９１．．１１０３（Ｄ）他の情報：／結合部分＝ＲＡＰＩ／ＧＲＦＩ／Ｔ
ＵＦＩ（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：蛋白結合（Ｂ）位置：１１０６．．１１１８（０）他の情報：／結合部分−ＲＡＰＩ／ＧＲＦＩ／Ｔ
ＵＦＩ（ｉｘ）特徴：（＾）名称／キー：ｍ１ｓｃシグナル（Ｂ）位置：１１７６、．１２４１（Ｄ）他の情報　／１Ｎ能−ビリミジン（０丁）ブロッ
ク（ｉＸ）特徴：（Ａ）名称／キー：　ＴＡＴＡシグナル（Ｂ）位［：１
３２６．．１３３５（Ｄ）他の情報：（１ｘ）特徴：（＾）名称／キー：ｍ１ｓｃシグナル（Ｂ）位置：　１３６９．．１４０６（Ｄ）他の情報：／機能−ビリミジン（ＣＴ）ブロック（ｉｘ）特徴：（＾）名称／キー：ｍ１ｓｃシグナル（８）位置：１４１８．．１４２１（０）他の情報二様能＝ＣＡＡＧボックス（ｉＸ）特徴
：（Ａ）名称／キー：ｍ１ｓｃシグナル（Ｂ）位置：１４２５．．１４２９（Ｄ）他の情報：／機能＝ＣＣＡΔ■ボックス（ｉｘ）特徴：（＾）名称／キー：ｍ１ｓｃ特徴（Ｂ）位１：１０３１．．１０３６（Ｄ）他の情報：／機能＝ｐｓ　ｔ　■制限酵素部位（ｉｘ）特徴：＾）名称／キー：ｍ１ｓｃ特徴Ｂ）位置：１３１４．．１３１７Ｄ）他の情報：５ＥＱ１の配列（ｘｉ（２）配列順２　（ＳＥＱ２）の情報：（ｉｌ　　配列
の特徴：（Ａ）長さ：　１４８３塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（０）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）　　配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ）特
徴：（Ａ）名称／キー：ｍ１ｓｃ特徴（Ｂ）位置：１２３．．１２４（Ｄ）他の情報：／機能−３ｓｔｌ［制限酵素部位（ｘｉ）ＳＥＱ２の配列：（２）配列Ｎｎ３　（ＳＥＱ３）の情報：（１）　　配
列の特Ｗ１：（Ａ）長さ：３８０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポ０ジー二直鎖状（ｉｉ）　　配列の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉ　へイボ
セテイカル二ＮＯ ■　アンチセンス二Ｎ０（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ｍ１ｓｃ特徴（８）位１：５４．．５９（Ｄ）　Ｉ！Ｉの情報：／機能−ｐｓｔ４制限酵素部位（Ａ）名称／キー：ｍ１ｓｃ特徴（Ｂ）位Ｍ：３３７．．３４０（０）他の情報：／４ＩＮ能−ＲｓａＩ制限酵素部位（ｘｉ）ＳＥＱ３の配列：（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー二ｍｉｓｃｇＲ徴（Ｂ）位１！：５４．．５９（Ｄ）他の情報：／機能＝ｐｓｔ■制限酵素部位（ｉｘ）特徴： Σ− （２）配列ＮＣ１４（ＳＥＱ４）の情報：（ｉｔ　　配
列の特ｍ：（Ａ）長さ＝２４アミノ酸（８）型ニアミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（０）トポロジー＝Ｍ鎖状（ｉｉ）　　配列の型：ペプチドｉ）　ハイボセテイカル：Ｎ０ＯＶｌ　　アンチセンス＝ＮＯ（ｖ）　　フラグメント型：Ｎ−末端（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ペプチド（８）位１１：１．．２４（Ｄ）他の情報：／ラベル＝リーダー／ノート＝合成分泌リーダー配列（ｘｉ）ＳＥＱ４の配列：（２）配列ＮＱ５　（ＳＥＱ５）の情報：（１）　　配
列の特徴：（Ａ）長さ：２１アミノ酸（Ｂ）型ニアミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）　　配列の型：ペプチド（ｉｔ　　ハイボセテイカル二ＮＯＣＭ　　アンチセンス：Ｎｏ（ｖｌ　　フラグメント型：Ｎ−末端（ｉｘ）特Ｉ！：（Ａ）名称／キー：ペプチド（Ｂ）位＠：ｉ、、２ｉ（Ｄ）他の情報：／ラベル＝リーダー／ノート＝合成分泌リーダー配列（ｘｉ）ＳＥＱ５の配列：工Ｈ（１）（ｉｌ　　配列の特徴：（Ａ）長さ：４７塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（０）トポロジー：直鎖状（ｉ：）　　配列の型：ＤＮＡ（ゲノム）（１ハイボセ
テイカル：ＮＯ（Ｍ　アンチセンス：Ｎｏ（ｉｘ　　特徴：Ａ）名称／キー：修飾塩基Ｂ）位１ｆ：５Ｄ）他の情報：（ｉｘ　　特徴：＾）名称／キー：修飾塩基Ｂ）位ｗ：６（Ｄ）　Ｉ！！の情報：（ｉｘ）特徴：（＾）名称／キー：修飾塩基（Ｂ）位１ｆ：１４（２）配列Ｎｏ、６（ＳＦＱ６）の情報：ｆｉｌ　　配
列の特＠：（八）長さ二４７塩基対（Ｂｌ型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー・本鎖（Ｄ）１−ボ【Ｊジー：直鎖状配列の型：ＤＮＡ（ゲノム）ハイボセテイカル：ＮＯアンチセンス＝ＮＯ起源八）生物上：　５ａｃｃｌ＋ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ（ｉｘ）特ｍ：＾）名称／キー：エクソンＢ）位１ｔ！！ｔ：１．　、４７Ｄ）他の情報：／ノートーＧＬＩＴ２プロモーターの天
然ＡＴＧ環境（ｘｉ）ＳＥＱ６の配列：ＧＴＡＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴｅＣＡＣＡ　ＡＡＣＡ
ＣＡＡＡＴＡ　ＴＴＧＡＴＡＡＴＡＴ　ＡＡＡＧＡＴＧ
ｌ））他の情報：（ｉｘ　　特ｙｉ：＾）名称／４−：修ｍ堤葛Ｂ）位置：第５０）他の情報：（ｉｘ　　特徴：＾）名称／キー：Ｂ）位置：５．．１７０）他の情報：／ラベル＝Ｓｆｉｌ／ノート＝Ｓｆ　ｉ　Ｉ制限酵素部位（ｘｉ）ＳＥＱ７の配列：ＧＴＡＣＧＧＣＣＣＣＣＣＣＧＧＣＣＡＣＡ　ＡＡＣＡ
ＣＡＡＡＴＡ　ＴＴＧＡＴＡＡＴＡ’Ｉ’　ＡＡＡＧＡ
ＴＧ（２）配列Ｎｎ８（ＳＥＱ８）の情報：（ｉｔ　　
配列の特ｍ：（＾）長さ：１２塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー・木鎖（Ｄ）　ｌ−ボ１］ジー：　ｉ：ｊ鎖状（ｉｉｌ　　配
列の型：ｃＤＮＡ（ｉｌ　　ハイボヒテイカル二ＮＯ（Ｍ　アンチセンス：Ｎ０（ｉｘ）特徴：（八）名称／↓−：ｍ１ｓｃ特徴（Ｒ）位置：１．．１２（０）他の情報：／機能＝ＳＥＱ１４の横築に用いる合
成オリゴ（ｘｉ）ＳＥＱ８の配列：ＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＴＡ　　　　］−２配列Ｎｆ１９
　（ＳＥＱ９）の情報：ｌｉｔ　　配列の特徴：（＾）長さ：１９塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（０）ｌ−ボロジー：直鎖状（ｉｉ）　　配列の型：　ｃＤＮＡ（ｉｘ）特徴；（八）名称／４−：…１ｓｃｆｉ徴（Ｂ）位置：　ｉ　、　、　’＋　９（Ｄ）他の情報：／機能＝＝　Ｓ　ｒ−Ｑ　’＋　４の
横築に用いる合成Ａリボ／ノートーこのオリゴはＳ　Ｌ　Ｑ　８に相補性（Ｘｉ）ＳＥＱ９の配列：ＡＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＧＧＣＣＧＧＧＧ　　　１９（
２）配列Ｎｕ　１０　（Ｓ　Ｅ　Ｑ　１０　）の情報：
（Ｈ配列の特ｙｉ＝（＾）長さ：２７５４塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎮（Ｄ）トポロジー：直鎖状１ｉｉ）　　配列の型：ＤＮＡ（ゲノム）禰）　ハイボ
セテイカル：ＮＯ（Ｍ　アンチセンス＝ＮＯＭ）起源（Ａ）生物名：　Ｓａｃｃｈａｒｏｗｙｃｅｓ　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ（Ｂ）株：　Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
　ｖａｒ、ｄｉａｓｔａｔｔｃｕｓ５１０６−９Ａ（ｉｘ）特ｔ！：（＾）名称／キー：ｍ１ｓｃ特徴（Ｂ）位１！：９８．．１０３（Ｄ）他の情報：／機能＝ＳｔｕｌＩ／ＢＱＪＩＩ部位（ｉｘ）特ｔ！＝（＾）名称／キー：　Ｃ０５（Ｂ）位置：　１２６．．２５４３（Ｄ）他の情報：（ｘｉ）ＳＥＱＩＯの配列：＋１＋８１４ｃＪ仁ｃ＋ｃＪ１ｗ　　　　υト屍陪　８
沫　藁浜　８田５１　む月　ｊ８＝　８虱ベト　　　＜Ｉ−Ｉ　　　Ｕ−ヘ　　トＵ１１　拐ｈ　
１１８精目（！ｌ＞　　　　ｅｇｏ　　　　（ｊ＞　　　　＜ｕ＞
ｒｑ■　韮　目μ　韮８′；！目　Ｅ品　筒３第５８月　８モ　３Ｈｒ、２ｇベト　　　トリへ　ベＥ−Ｉ　　　　ＣＪＪＩ　韮　１
韮１芭韮　引Ｊ　ｕ　吋右舅泪　藁ｆ　淀α　詣３擬託耘ｄ　９召　訪Ｆお　本蓄睡召　目 ≦只　８月　８月ま　藁才ＬＩＬＩ　　　　＜ｈ　　　　＜Ｅ−１へ　　のべ８四
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、−＋ｗ　　！−，１Ｂｇ　口≧Ｅ−１−！−１１１１
１ＬＩ−１（Ｊｌ−Ｉ　　　　Ｌｌｌ−１＜１−ＩＣＥ
ｌペヘ　　トψ　　　べ−＜Ｐ４（ＪＱＩ　　　　（Ｊ
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　（ＪＯＥ屑　　１≧　６四　　８と！−４−ロ　ベ一　　（Ｊｕｌ　　　ｏ＞ｌ−Ｉψ閂　
０〉　　υ−ｕＯＵト　　じ−哨　Ｌｌα　　トΦ ｏＩ−１ｈＩＩＩＩＣ＋４ｃｐｙ　　　Ｅ−１，−ＩＣ
！＋０　　　　　じ〉「つ　　Ｅ−４ト　　　　　ベＨ
ＣＪＨ＜Ｉ−Ｉ　　　Ｃ！ｌクロ　トに２５　　×陪　
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Ｉ′Ｉ　　　ベニ　　　　Ｏペ　　　　ベＨベ一　　〇
コｏ　１−ＩＩ−１＜い第５　　肛３薫　躍α　　舅曝赳々　？ｚ　　ｕお粗　ゴ只ａａ　　　　　ｏ＞　　　　　＜ｕ’ｒｒ”＋　　　０
Ｇ（２）配列順１１　（ＳＥＱｌ　１　）の情報＝１ｉ
）　　配列の特ｉ！：（＾）長さ二８０６アミノ酸（Ｂ）型ニアミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉｌ　　配列の型：蛋白質（ｘｉ）ＳＥＱｌｌの配列：四駒日と百〇ａＩ −り　よじい　　ρ４石日角　　　　−ロリ　　　　　■す＜　　　　切り（２）配列ＰＩＱ１２　（ＳＥＱｌ　２）の情報：（ｉ
ｌ　　配列の特ＷＩ：（Ａ）長さ＝５４塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）　　配列の型：ＤＮＡ（ゲノム）（２）　ハイ
ポセテイカル：ＮＯ（Ｍ　アンチセンス＝ＮＯ（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キ一二（８）位１ｆ：１．．５４（０）他の情報：／ラベル＝リンカー／ノートーｐＡＹＥ２７４の構築に用いるリンカ− （ｘｉ）ＳＥＱｌ２の配列：（２）配列ＮＱ１３　（ＳＥＱｌ３）の情報：（ｉ）　
　配列の特ｗｌ：（＾）長さ：６０塩基対（８）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（０）トポロジー：直鎖状（ｉｉｌ　　配列の型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ）特！
！：（Ａ）名称／キー：（Ｂ）位置：１．．６０（０）他の情報：／ラベルーリンカー／ノート＝ｐＡＹＥ３０９の構築に用いる合成オリゴヌクレオジチドリン力− ８ＥＱＩ　３の配列：（ｉｘ）（２）配列Ｎｏ１４（Ｓｔ：（ＪＩ４）の情報：（ｉｔ
　　配列の特ｆｆｉ：（八）長さ：２９Ｊ！基対（Ｂｌ型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（０）１−ボロジー：直鎖状１ｉｉ１　　配列の型＝ＤＮＡ（ゲノム）１ｉ１　　ハ
イボセデイカル：Ｎ。

（Ｍ　アンチセンス＝Ｎ。

（ｉｘ）特ｒ！Ｉｉ：（Ａ）名称／キー：　ｍ　ｉ　ｓ　ｃ特徴（Ｂ）位置：
１．．１９（０）他の情報：／機能−リンカー／ノートーｒ）ＤＸＬ２００の構築に用いるリンカ− ８ｆｉＩ、ｅｇｚＩＦ及び）１ｉｎｄｌｌｌ１１位を含む（ｘｉ）ＳＥＱ１４の配列：

【図面の簡単な説明】

第１図から第９図は、それぞれプラスミツドｐＸＬ５．
１）ＡＹＥ２７４、ｐＡＹＥ２７５、ｐＡＹＥ３３４、
Ｅ）ＡＹＥ２７６、Ｅ）ＡＹＥ３２３、ｐＡＹＥ３２４
、ｐＳＡＣ３５そしてＥ）ＡＹＥ３２１の制限酵素地図
である。第１０図は、異なる時間に撮った標識ＲＮＡを示すゲル
の写真である。第１１図は、第１０図に対応するグリセロール−３−ホ
スフェートデヒドロゲナーゼのプロ干−ターの発瑣の経
時変化を示す写真である。第１２図はプラスミツドｐＤＸＬ２００の制限酵素地図
である。第１３図と第１４図は、それぞれプラスミツドｐＤＶＸ
２とＥ）ＤＶＸ４の鯖限酵素地図である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）野生型のサッカロミセスセレビッシエ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で通常隣
接するであろうコード配列（ｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ）から分離している、ＤＮＡプロモーター配列ＳＥ
Ｑ１又はその変種又はその機能性部分。
（２）特許請求の範囲第１項に記載のプロモーターにお
いて、プロモーターはその変種であるか又は機能性部分
であり、その下流に位置するコード配列の転写を促進す
る該配列の能力の少なくとも８０％を有する、上記プロ
モーター。
（３）該配列と少なくとも８０％の相同性を有する、特
許請求の範囲第１項又は第２項に記載のプロモーター。
（４）少なくとも２００ヌクレオチドの長さがある、特
許請求の範囲第１項から第３項までのいずれか１項に記
載のプロモーター。
（５）上記特許請求の範囲のいずれか１項に記載のプロ
モーターよりなるクローニングベクター又は酵母発現ベ
クターにおいて、異種コード配列はプロモーターの下流
に位置し、翻訳開始コドンに対して正しいリーディング
フレーム（ｒｅａｄｅｉｎｇｆｒａｍｅ）中にあるよう
に制限部位に隣接する、上記ベクター。
（６）特許請求の範囲第５項に記載されたように挿入さ
れた異種コード配列よりなる、特許請求の範囲第５項に
記載の酵母発現ベクター。
（７）異種コード配列はヒト血清アルブミン又はその変
種又はその一部をコードし、随時分泌リーダー配列を有
する、特許請求の範囲第６項に記載の酵母発現ベクター
。
（８）異種コード配列はサッカロミセスセレビツシエの
ジアスタテイカス（ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）変種のグ
ルコアミラーゼをコードする、特許請求の範囲第６項に
記載の酵母発現ベクター。
（９）特許請求の範囲第６項、７項又は８項に記載の発
現ベクターで形質転換した酵母。
（１０）特許請求の範囲第９項に記載の酵母を発酵させ
て、該異種コード配列で発現されるポリペプチドを少な
くとも部分的に精製することよりなる、ポリペプチドの
調製方法。
（１１）特許請求の範囲第１０項に記載の方法において
、最初、母をポリペプチドの発現を抑制する１つ又は複
数の炭素源中で増殖させ、次に炭素源を非抑制性の化合
物又はこのような化合物の混合物に変えることよりなる
、上記方法。