JPH0488998A - 腫瘍特異的ヒト型モノクローナル抗体 - Google Patents
腫瘍特異的ヒト型モノクローナル抗体Info
- Publication number
- JPH0488998A JPH0488998A JP2203476A JP20347690A JPH0488998A JP H0488998 A JPH0488998 A JP H0488998A JP 2203476 A JP2203476 A JP 2203476A JP 20347690 A JP20347690 A JP 20347690A JP H0488998 A JPH0488998 A JP H0488998A
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- JP
- Japan
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- human
- pancreatic cancer
- monoclonal antibody
- cancer
- antibody
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、特に膵癌、乳癌に対し特異的に反応するヒト
型モノクローナル抗体に関するものであり、本発明のヒ
ト型モノクローナル抗体は膵癌、乳癌の体内診断、体外
診断、治療薬として用いられる。
型モノクローナル抗体に関するものであり、本発明のヒ
ト型モノクローナル抗体は膵癌、乳癌の体内診断、体外
診断、治療薬として用いられる。
［従来の技ｗｆ４］
膵癌関連抗原と反応するモノクローナル抗体は、これま
でにＣＡ１９−９抗体［Ｈ，Ｋｏｐｌｏｗｓｋｉｅｔ
ａｌ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２１２．５３−５５
（１９８１）］、抗ＣＥＡ抗体［Ａ、 Ｈａｔｓｕｎａ
ｇａ ｅｔ ａｌ。
でにＣＡ１９−９抗体［Ｈ，Ｋｏｐｌｏｗｓｋｉｅｔ
ａｌ、、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２１２．５３−５５
（１９８１）］、抗ＣＥＡ抗体［Ａ、 Ｈａｔｓｕｎａ
ｇａ ｅｔ ａｌ。
ＣａｎＣｅｒ Ｒｅｓ、、 土ユ、５６−６１ （１
９７９）］が報告されている。これらはマウス型の抗体
であり、血中抗原の検出による膵癌等の癌の血清診断薬
として使用されている。又、マウス型抗ＣＥＡ抗体は、
ラジオアイソトープ標識し大腸癌等の体内診断薬として
の開発も進められている。
９７９）］が報告されている。これらはマウス型の抗体
であり、血中抗原の検出による膵癌等の癌の血清診断薬
として使用されている。又、マウス型抗ＣＥＡ抗体は、
ラジオアイソトープ標識し大腸癌等の体内診断薬として
の開発も進められている。
［発明が解決しようとする課題］
膵癌は体内深部に発生し、その診断、治療は他の癌に比
し難しく、その診断法、治療法の開発は臨床医の切望す
るところである。ラジオアイソトープ標識した抗ＣＥＡ
抗体を用いた、大腸癌等のＣＥＡ産生癌の体内診断法が
進められているが、抗体がマウス型でありヒトに抗原性
を持つことが問題となり、頻回投与を要する治療には、
更に適さない。膵癌の血清診断薬として用いられている
ＣＡ１９−９抗体は、その抗原が癌患者の血中に存在す
る一方、正常の膵臓組織にも存在することから、体内診
断薬や治療薬としては適していないことが分かった。一
方、抗ＣＥＡ抗体も膵癌に対する特異性の点で充分であ
るとは言えない。
し難しく、その診断法、治療法の開発は臨床医の切望す
るところである。ラジオアイソトープ標識した抗ＣＥＡ
抗体を用いた、大腸癌等のＣＥＡ産生癌の体内診断法が
進められているが、抗体がマウス型でありヒトに抗原性
を持つことが問題となり、頻回投与を要する治療には、
更に適さない。膵癌の血清診断薬として用いられている
ＣＡ１９−９抗体は、その抗原が癌患者の血中に存在す
る一方、正常の膵臓組織にも存在することから、体内診
断薬や治療薬としては適していないことが分かった。一
方、抗ＣＥＡ抗体も膵癌に対する特異性の点で充分であ
るとは言えない。
この様な問題点を解決するために、膵癌の体内診断、治
療に用いる抗癌モノクローナル抗体として、ヒト型で膵
癌特異性が高い抗体の取得が必要とされる。
療に用いる抗癌モノクローナル抗体として、ヒト型で膵
癌特異性が高い抗体の取得が必要とされる。
［！！題を解決するための手段］
本発明は、ヒト膵癌患者のヒトＢリンパ球とマウスミエ
ローマ細胞株とのヒト／マウス融合１ｌｌＩ胞株が産生
する腫癌特異的ヒト型モノクローナル抗体、及びそれを
使用する癌の検出方法を要旨とするものである。
ローマ細胞株とのヒト／マウス融合１ｌｌＩ胞株が産生
する腫癌特異的ヒト型モノクローナル抗体、及びそれを
使用する癌の検出方法を要旨とするものである。
本発明のヒト型モノクローナル抗体は特に膵癌に対して
特異的に反応する。従って本発明の膵癌特異的ヒト型モ
ノクローナル抗体の使用により、上記したような従来の
問題は解決される。即ち、ラジオアイソトープ標識した
本発明のモノクローナル抗体を患者に投与することによ
り癌のイメージングを可能にし、又、毒素や抗癌剤を結
合させた、あるいは非修飾の抗体を用いて膵癌の治療が
可能となる。
特異的に反応する。従って本発明の膵癌特異的ヒト型モ
ノクローナル抗体の使用により、上記したような従来の
問題は解決される。即ち、ラジオアイソトープ標識した
本発明のモノクローナル抗体を患者に投与することによ
り癌のイメージングを可能にし、又、毒素や抗癌剤を結
合させた、あるいは非修飾の抗体を用いて膵癌の治療が
可能となる。
本発明に関し以下に具体的に説明する。
Ｂリンパ球とマウスミエローマの
合細胞の作製
本発明のヒト型モノクローナル抗体を産生する細胞株の
作製は、ヒトＢリンパ球とマウスミエローマ細胞との融
合により行われ、その方法は既に諸処で明らかにされて
いる。例えばヒト−マウス融合細胞は、「実験医学」、
旦、（１０）、９０９（１９８８年）に述べられた方法
に従って行うことが出来る。先ず、膵癌患者より手術に
より癌と共に摘出されたリンパ節から８リンパ球を取り
出し適当な培地、例えばＲＰＭＩ−１６４０培地等で約
２０Ｉ１１に懸濁する。一方、１０％牛脂児血清含有Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地等で対数増殖期まで培養したミニ
０−マ細胞、例えば、マウスＰ３Ｘ６３−ＡＧ８ ・Ｕ
ｌ （Ｐ３Ｕ １ ） （Ｃｕｒｒ、 Ｔｏｐ。
作製は、ヒトＢリンパ球とマウスミエローマ細胞との融
合により行われ、その方法は既に諸処で明らかにされて
いる。例えばヒト−マウス融合細胞は、「実験医学」、
旦、（１０）、９０９（１９８８年）に述べられた方法
に従って行うことが出来る。先ず、膵癌患者より手術に
より癌と共に摘出されたリンパ節から８リンパ球を取り
出し適当な培地、例えばＲＰＭＩ−１６４０培地等で約
２０Ｉ１１に懸濁する。一方、１０％牛脂児血清含有Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地等で対数増殖期まで培養したミニ
０−マ細胞、例えば、マウスＰ３Ｘ６３−ＡＧ８ ・Ｕ
ｌ （Ｐ３Ｕ １ ） （Ｃｕｒｒ、 Ｔｏｐ。
Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｉ−ｍｕｎｏｌ、、 ８１
、１ ）を血清不含のＲＰＭＩ−１６４０培地等で懸濁
する。次いで、癌患者由来ヒトＢリンパ球とミニローマ
Ｉ［ｌｌ！を細胞比、５：１で混合し、１．０ＯＯｒｐ
−で５分間遠心分離してベレットを形成させ、上澄を吸
引により完全に除く。このベレットに３７℃に加温した
５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧＩ ５００）溶
液１１Ｉ！を拡拌しながら徐々に加え、約１分圓拡拌を
続ける。次いでＲＰＭＩ−１６４０，６−を拡拌しなが
ら６〜７分間にわたり徐々に加えた後、１．００ＯｒＤ
Ｉで約５分間遠心分離し、上澄を除いた後、新たにＲＰ
ＭＩ−１６４０を加えｉ＋ｎｉａ数２×１０６個／ｌ！
の細胞懸濁液を作る。この懸濁液を、９６大の組織培養
用プレートの８穴に０．１ｄずつ分注し、５％ＣＯ２培
養装置中で３７℃で培養する。２４Ｗ＃罰後からはＨＡ
Ｔ培地［ヒボキサンチン、アミノプテリン及びチミジン
含有ＲＰ Ｍ Ｉ −１６４０： Ｌｉｔｔｅｒｆｉｅ
ｌｄ、 ５ｃｉｅｎｃｅ。
、１ ）を血清不含のＲＰＭＩ−１６４０培地等で懸濁
する。次いで、癌患者由来ヒトＢリンパ球とミニローマ
Ｉ［ｌｌ！を細胞比、５：１で混合し、１．０ＯＯｒｐ
−で５分間遠心分離してベレットを形成させ、上澄を吸
引により完全に除く。このベレットに３７℃に加温した
５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧＩ ５００）溶
液１１Ｉ！を拡拌しながら徐々に加え、約１分圓拡拌を
続ける。次いでＲＰＭＩ−１６４０，６−を拡拌しなが
ら６〜７分間にわたり徐々に加えた後、１．００ＯｒＤ
Ｉで約５分間遠心分離し、上澄を除いた後、新たにＲＰ
ＭＩ−１６４０を加えｉ＋ｎｉａ数２×１０６個／ｌ！
の細胞懸濁液を作る。この懸濁液を、９６大の組織培養
用プレートの８穴に０．１ｄずつ分注し、５％ＣＯ２培
養装置中で３７℃で培養する。２４Ｗ＃罰後からはＨＡ
Ｔ培地［ヒボキサンチン、アミノプテリン及びチミジン
含有ＲＰ Ｍ Ｉ −１６４０： Ｌｉｔｔｅｒｆｉｅ
ｌｄ、 ５ｃｉｅｎｃｅ。
１４５．７０９〜７１０ （１９６４）］を加えて培養
することにより、融合細胞のみを生育させる。
することにより、融合細胞のみを生育させる。
その培養液を用い膵癌特異性を有する抗体のスクリーニ
ングを行う。
ングを行う。
抗体のスクリーニング
ヒト膵癌の表面抗原と反応し、ヒト正常細胞とは反応し
ない抗体を取得するために、ヒト膵癌樹立細胞株、例え
ばＰＡＮＣ−１細胞［８，Ｌｉｅｂｅｒｅｔ ａｌ、、
Ｉｎｔ、 Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ、 １５．７４１−７
４５（１９７５）］等と反応し、ヒト正常細胞、例えば
ヒト成人繊維芽細胞（初代培養細胞）等とは反応しない
抗体を、各々の細胞を抗原としたＥＬＩＳＡ法を用いて
スクリーニングする。次いで抗体により組織切片を染色
し、膵癌組織とは反応するが、複数のヒト正常組織、例
えば膵臓、胃、腸、肝臓、牌臓、腎臓、心臓、脳等とは
反応しない抗体をスクリーニングする。更に、得られた
抗体の中から、種々の培養細胞と蛍光標識抗体を用いた
フローサイトメトリーにより、その抗原が癌細胞表面に
存在するものを選択する。こうして得られたヒト型モノ
クローナル抗体は、この抗体と反応する癌ができた癌患
者に投与すると、該癌組織に特異的に集積し癌の体内診
断、治療などに有用である事が期待される。
ない抗体を取得するために、ヒト膵癌樹立細胞株、例え
ばＰＡＮＣ−１細胞［８，Ｌｉｅｂｅｒｅｔ ａｌ、、
Ｉｎｔ、 Ｊ、 Ｃａｎｃｅｒ、 １５．７４１−７
４５（１９７５）］等と反応し、ヒト正常細胞、例えば
ヒト成人繊維芽細胞（初代培養細胞）等とは反応しない
抗体を、各々の細胞を抗原としたＥＬＩＳＡ法を用いて
スクリーニングする。次いで抗体により組織切片を染色
し、膵癌組織とは反応するが、複数のヒト正常組織、例
えば膵臓、胃、腸、肝臓、牌臓、腎臓、心臓、脳等とは
反応しない抗体をスクリーニングする。更に、得られた
抗体の中から、種々の培養細胞と蛍光標識抗体を用いた
フローサイトメトリーにより、その抗原が癌細胞表面に
存在するものを選択する。こうして得られたヒト型モノ
クローナル抗体は、この抗体と反応する癌ができた癌患
者に投与すると、該癌組織に特異的に集積し癌の体内診
断、治療などに有用である事が期待される。
癌の検出方法
本発明のヒト型モノクローナル抗体を用いた癌の体内診
断（イメージング）は以下のようにして行うことができ
る。即ち、ヒト型モノクローナル１３１ １１
１ ９９園抗体を、 １１ Ｉ、 Ｔｃ
などの放射性同位元素（ＲＩ）で標識して生体内に投与
し、ガンマカメラでスキャンすることにより抗体が集積
した癌部位を映像化できる。核種の異なるＲ１で標識し
た血清アルブミンを投与し同様に測定しバックグランド
を引くことにより、より明瞭な映像を得ることもできる
。
断（イメージング）は以下のようにして行うことができ
る。即ち、ヒト型モノクローナル１３１ １１
１ ９９園抗体を、 １１ Ｉ、 Ｔｃ
などの放射性同位元素（ＲＩ）で標識して生体内に投与
し、ガンマカメラでスキャンすることにより抗体が集積
した癌部位を映像化できる。核種の異なるＲ１で標識し
た血清アルブミンを投与し同様に測定しバックグランド
を引くことにより、より明瞭な映像を得ることもできる
。
本発明のヒト型モノクローナル抗体を用いた癌の体外診
断は、以後の実施例において記述する組織切片の染色法
に準じて行うことができる。即ち、ヒトの臓器組織より
凍結切片を調製し、スライドグラス上に組織標本を作成
する。次いでヒト型モノクローナル抗体を反応させた後
、更にビオチン等で標識化した２次抗体を反応させた後
、標識パーオキシダーゼによる発色を行い、又、ヘマト
キシリン染色を行い、顕微鏡観察により癌細胞を検出す
ることができる。
断は、以後の実施例において記述する組織切片の染色法
に準じて行うことができる。即ち、ヒトの臓器組織より
凍結切片を調製し、スライドグラス上に組織標本を作成
する。次いでヒト型モノクローナル抗体を反応させた後
、更にビオチン等で標識化した２次抗体を反応させた後
、標識パーオキシダーゼによる発色を行い、又、ヘマト
キシリン染色を行い、顕微鏡観察により癌細胞を検出す
ることができる。
［発明の効果］
本発明のヒト型モノクローナル抗体は特に膵癌、乳癌に
対して特異的に反応する。従ってこの抗体はヒトの膵癌
などの体内診断、体外診断などに有効である。また抗体
に毒素や抗癌剤を結合させて得られるコンジュゲートは
モノクローナル抗体を用いた膵癌などの癌のミサイル振
払に利用することができる。
対して特異的に反応する。従ってこの抗体はヒトの膵癌
などの体内診断、体外診断などに有効である。また抗体
に毒素や抗癌剤を結合させて得られるコンジュゲートは
モノクローナル抗体を用いた膵癌などの癌のミサイル振
払に利用することができる。
［実施例］
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
実施例１ モノクローナル抗体の製造
１−１ 膵癌患者由来Ｂリンパ球の調製膵癌患者より手
術により癌と共に摘出したリンパ節をハサミで細切し、
ステンレスメツシュ（アぺ科学社製、２００メツシユ）
を通しＲＰＭ１１６４０培地に懸濁し、１ 、０００ｒ
ｐｉ＋ 、 ５分間遠心し上清を除き、２０−のＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地に細浮遊させ再度メツシュを通した後
リンパ球を計測し、１ 、０００ｒｐｍ 、５分間遠心
しＲＰＭＩ−１６４０培地で２０＋＋ｄに調製した。
術により癌と共に摘出したリンパ節をハサミで細切し、
ステンレスメツシュ（アぺ科学社製、２００メツシユ）
を通しＲＰＭ１１６４０培地に懸濁し、１ 、０００ｒ
ｐｉ＋ 、 ５分間遠心し上清を除き、２０−のＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地に細浮遊させ再度メツシュを通した後
リンパ球を計測し、１ 、０００ｒｐｍ 、５分間遠心
しＲＰＭＩ−１６４０培地で２０＋＋ｄに調製した。
１−２ マウスミエローマ細胞の調製
一方、１０％牛脂児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で
対数増殖期にまで培養したマウスミエローマ細胞、Ｐ３
Ｘ６３−ＡＱ８−Ｕｌ （Ｐ３Ｕ１）を自消不含のＲＰ
ＭＩ−１６４０培地で洗い、細胞数を計測し、血清不含
ＲＰＭＩ−１６４０培地で２０＋ｄに調製した。
対数増殖期にまで培養したマウスミエローマ細胞、Ｐ３
Ｘ６３−ＡＱ８−Ｕｌ （Ｐ３Ｕ１）を自消不含のＲＰ
ＭＩ−１６４０培地で洗い、細胞数を計測し、血清不含
ＲＰＭＩ−１６４０培地で２０＋ｄに調製した。
ヒト／マウス融合細胞の作製法は既に諸処で明らかにさ
れているが主として「実験医学］、６゜（１０）、９０
９ （１９８８年）の方法に従った。
れているが主として「実験医学］、６゜（１０）、９０
９ （１９８８年）の方法に従った。
１−１で調製した癌患者由来ヒトＢリンパ球と、１−２
で調製した上記のマウスミエローマ細胞懸濁液を細胞比
１：５になるように混合し、１．０００ ｒｐ−で５分
間遠心分離してベレットを形成させ、上澄を吸引により
完全に除いた。このベレットに３７℃に加温した５０％
ポリエチレングリコール（ＰＥＧＩ ５００）溶液１ｄ
を拡拌しなカラ徐々に加え、１分間拡拌を続ける。次い
でＲＰＭＩ−１６４０，６＋＋ｄを拡拌しながら６〜７
分間にわたり徐々に加え１．０ＯＯｒｌ）■で５分間遠
心分離し、上澄を除いた後、新たにＲＰＭＩ−１６４０
を加Ｊ！Ｊンハ球２ｘ１０６個／ｍｅ（７）懸’Ｆａ液
とした。
で調製した上記のマウスミエローマ細胞懸濁液を細胞比
１：５になるように混合し、１．０００ ｒｐ−で５分
間遠心分離してベレットを形成させ、上澄を吸引により
完全に除いた。このベレットに３７℃に加温した５０％
ポリエチレングリコール（ＰＥＧＩ ５００）溶液１ｄ
を拡拌しなカラ徐々に加え、１分間拡拌を続ける。次い
でＲＰＭＩ−１６４０，６＋＋ｄを拡拌しながら６〜７
分間にわたり徐々に加え１．０ＯＯｒｌ）■で５分間遠
心分離し、上澄を除いた後、新たにＲＰＭＩ−１６４０
を加Ｊ！Ｊンハ球２ｘ１０６個／ｍｅ（７）懸’Ｆａ液
とした。
１−４ ＨＡＴセレクション
１−３で調製した細胞懸濁液を、９６大の組織培養用プ
レートに多穴に０．１ａｄずつ分注し、５％ＣＯ２培養
装置中で３７℃で培養する。２４時間後後人穴培養液に
０． ｌａｄ！のＨＡＴ培地を加え、次に０．１ｄずつ
培養液を除き、培養を続ける。
レートに多穴に０．１ａｄずつ分注し、５％ＣＯ２培養
装置中で３７℃で培養する。２４時間後後人穴培養液に
０． ｌａｄ！のＨＡＴ培地を加え、次に０．１ｄずつ
培養液を除き、培養を続ける。
更に培養開始より２日、３日、５日、８日、１１日、１
４日、１７日、２１日毎に、上記の如く培養液の半量を
）ＩＡＴ培地で置換する操作を繰り返す。このＨＡＴセ
レクションによりマウスミエローマＩ［ｌ飽は死滅し、
融合細胞のみ生育してくる。
４日、１７日、２１日毎に、上記の如く培養液の半量を
）ＩＡＴ培地で置換する操作を繰り返す。このＨＡＴセ
レクションによりマウスミエローマＩ［ｌ飽は死滅し、
融合細胞のみ生育してくる。
生育してきたハイブリドーマを血清添加ＲＰＭＩ−１６
４０培地で培養し、その培養液を酵素免疫抗体法（ＥＬ
ＩＳＡ）［磯貝、「実験医学」、旦（１０）、９０９．
（１９８８）］の分析試料とする。
４０培地で培養し、その培養液を酵素免疫抗体法（ＥＬ
ＩＳＡ）［磯貝、「実験医学」、旦（１０）、９０９．
（１９８８）］の分析試料とする。
１−５ 艶薯Ｓａｔ生基
ヒト膵癌樹立細胞株であるＰＡＮＣ−１細胞、又、ヒト
正常肝細胞であるｃｈａｎｇ ｔｔｖｅｒ細胞［Ｒ。
正常肝細胞であるｃｈａｎｇ ｔｔｖｅｒ細胞［Ｒ。
Ｓ、 Ｃｈａｒ＋ａ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｓ
ｏｃ、 Ｅｘａ、 Ｂｉｏｌ、 ａｎｄＷｅｄ、、８７
．４４０−４４３ （１９５４）］を各６〇６穴培養プ
レートにて１０％ＦＣ８血清含有ＤＭＥＭｊＳ地を用い
培養し、０．２５％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ固定液
で固定後ＰＢＳで洗浄し、これを抗原としてバイプリド
ーマの培養上澄の抗体価を通常のＥＬＩＳＡにより測定
した。これにより、ＰＡＮＣ−１細胞と結合しＣｈａｎ
！ＩｆＬｉｖｅｒ細胞とは結合しないり０−ン、即ち、
抗ＰＡＮＣ−１細胞抗体陽性のクローン９８６株を選択
した。更にこれらのり０−ンの中から、同様にしてヒト
正常繊維芽細胞とは反応しないクローン２株を選択した
。
ｏｃ、 Ｅｘａ、 Ｂｉｏｌ、 ａｎｄＷｅｄ、、８７
．４４０−４４３ （１９５４）］を各６〇６穴培養プ
レートにて１０％ＦＣ８血清含有ＤＭＥＭｊＳ地を用い
培養し、０．２５％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ固定液
で固定後ＰＢＳで洗浄し、これを抗原としてバイプリド
ーマの培養上澄の抗体価を通常のＥＬＩＳＡにより測定
した。これにより、ＰＡＮＣ−１細胞と結合しＣｈａｎ
！ＩｆＬｉｖｅｒ細胞とは結合しないり０−ン、即ち、
抗ＰＡＮＣ−１細胞抗体陽性のクローン９８６株を選択
した。更にこれらのり０−ンの中から、同様にしてヒト
正常繊維芽細胞とは反応しないクローン２株を選択した
。
１−６ 組織切片の染色法
抗体による組織染色には癌及びヒト正常組織の凍結切片
を用いた。凍結切片は組織を０ＣＴＣＯ醜ｐｏｕｎｄ４
５８３ （マイルズ社製・米）に包埋後液体窒素で凍結
し、タライオスタット（ブライト社製・英）で約５μｍ
厚の切片を昨報し、予め１％Ｂｉｏｄｅｎ Ｈｅ５ｈｃ
ｅｓｅｎｔ／Ｔｏｌｕｅｎでコートしたスライドグラス
上にとり、直ちに冷風で強制風乾させた。
を用いた。凍結切片は組織を０ＣＴＣＯ醜ｐｏｕｎｄ４
５８３ （マイルズ社製・米）に包埋後液体窒素で凍結
し、タライオスタット（ブライト社製・英）で約５μｍ
厚の切片を昨報し、予め１％Ｂｉｏｄｅｎ Ｈｅ５ｈｃ
ｅｓｅｎｔ／Ｔｏｌｕｅｎでコートしたスライドグラス
上にとり、直ちに冷風で強制風乾させた。
次いでＰＢＳで２回洗浄しヤギ血清で２０分間ブロッキ
ングし、被検融合細胞の培養上滑（１倍〜５倍希釈液）
、又は、培養上清を精製して得られる調製抗体と４℃、
−晩反応させた。次ぎにＰＢＳで５回洗浄後ビオチン化
抗ヒトイムノグロブリンヤギ抗体と室１３０分反応させ
、ＰＢＳで５回洗浄後、ＡＢＣ試薬（ベクタスティン社
製・米）と室温、３０分反応させ、再びＰＢＳで３回洗
浄し、０，０１％過酸化水素を含むＤＡＢ （３，３ジ
アミノベンジダイン）飽和ＰＢＳ中で、室温５分間浸漬
した。これを流水にて洗浄後へマドキシリン染色を行い
、エタノール、キシレンにて脱水、乾燥しＥＵＫＩＴＴ
により封入し、顕微鏡観察を行った。これにより抗体の
癌組織との反応持具性を検討し、癌特異性の高いクロー
ンとして、ＭＢ０１３、及びＭＢ０５９を取得した。こ
れらの抗体クラスは両方ともＩｇＭであった。クローン
ＭＢ０１３及びＭＢ０５９は、工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託され、それぞれ受託番号として微工研菌
寄第１１６２０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１６２０）、微
工研菌寄第１１６２１号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１６２１
）が付与されている。
ングし、被検融合細胞の培養上滑（１倍〜５倍希釈液）
、又は、培養上清を精製して得られる調製抗体と４℃、
−晩反応させた。次ぎにＰＢＳで５回洗浄後ビオチン化
抗ヒトイムノグロブリンヤギ抗体と室１３０分反応させ
、ＰＢＳで５回洗浄後、ＡＢＣ試薬（ベクタスティン社
製・米）と室温、３０分反応させ、再びＰＢＳで３回洗
浄し、０，０１％過酸化水素を含むＤＡＢ （３，３ジ
アミノベンジダイン）飽和ＰＢＳ中で、室温５分間浸漬
した。これを流水にて洗浄後へマドキシリン染色を行い
、エタノール、キシレンにて脱水、乾燥しＥＵＫＩＴＴ
により封入し、顕微鏡観察を行った。これにより抗体の
癌組織との反応持具性を検討し、癌特異性の高いクロー
ンとして、ＭＢ０１３、及びＭＢ０５９を取得した。こ
れらの抗体クラスは両方ともＩｇＭであった。クローン
ＭＢ０１３及びＭＢ０５９は、工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託され、それぞれ受託番号として微工研菌
寄第１１６２０号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１６２０）、微
工研菌寄第１１６２１号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１６２１
）が付与されている。
１−７ フローサイトメトリー
７０−サイトメトリーにより、１−６で得られた抗体の
細胞表層との反応性を検討した。方法は通常の方法に従
った。膵癌ＰＡＮＣ−１、又は肝ｌＩ！１Ａｌｅｘａｎ
ｄｅｒ ［Ｇ、 Ｈ，Ｈａｃｎａｂ ｅｔ ａｔ、、
８ｒ、 ＪＣａｎｃｅｒ、 ３４ （５） 、 ５０９
−５１５ （１９７６）］の培養細胞をｌＸ１０７／ｄ
にＰＢＳにて懸濁し、小試験管に５０μオずつ分注し１
−６で得られた抗体を一次抗体（各２０μｇ／ｊ１１り
として加え、水中、３時間反応させ、ＰＢＳで３回洗浄
し２次抗体としてＦ Ｉ ＴＣＩ［ｌＥした抗ヒトμ鎖
ヤギ抗体（ＺＹＭＥＤ製：３８μ９７ｄ！＞を加え、氷
中３０分反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄し、２×１０
５／Ｍ＆に細胞を懸濁して、コールタ−社製（７）ＥＰ
ＩＣ８−ＥＬＩＴＥを用イＴ ７０− サイトメトリー
を行った。コントロールとしてヒト１０Ｍを用いた。第
１図に示すように当該抗体は膵癌細胞株、ＰＡＮＣ−１
１１胞の表面に高い結合性を持っていた。
細胞表層との反応性を検討した。方法は通常の方法に従
った。膵癌ＰＡＮＣ−１、又は肝ｌＩ！１Ａｌｅｘａｎ
ｄｅｒ ［Ｇ、 Ｈ，Ｈａｃｎａｂ ｅｔ ａｔ、、
８ｒ、 ＪＣａｎｃｅｒ、 ３４ （５） 、 ５０９
−５１５ （１９７６）］の培養細胞をｌＸ１０７／ｄ
にＰＢＳにて懸濁し、小試験管に５０μオずつ分注し１
−６で得られた抗体を一次抗体（各２０μｇ／ｊ１１り
として加え、水中、３時間反応させ、ＰＢＳで３回洗浄
し２次抗体としてＦ Ｉ ＴＣＩ［ｌＥした抗ヒトμ鎖
ヤギ抗体（ＺＹＭＥＤ製：３８μ９７ｄ！＞を加え、氷
中３０分反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄し、２×１０
５／Ｍ＆に細胞を懸濁して、コールタ−社製（７）ＥＰ
ＩＣ８−ＥＬＩＴＥを用イＴ ７０− サイトメトリー
を行った。コントロールとしてヒト１０Ｍを用いた。第
１図に示すように当該抗体は膵癌細胞株、ＰＡＮＣ−１
１１胞の表面に高い結合性を持っていた。
１−８ モノクローナル抗体の癌特異性前述の方法で取
得したヒト型モノクローナル抗体の特異性を、組織切片
染色により検討したところ、表１に示すように膵癌、乳
癌に対し高い特異性があることが分かった。
得したヒト型モノクローナル抗体の特異性を、組織切片
染色により検討したところ、表１に示すように膵癌、乳
癌に対し高い特異性があることが分かった。
表１０組織染色によるＭＢ０１３及びＭＢ０５９抗体の
癌特異性１−９ ヌードマウス移植節への抗体集積実験
抗体の １１１１はヨードグン法により以下の方法で
行った。ヨードゲン試薬１■／ｄのエーテル溶液をガラ
スの試験管に入れ、窒素ガスを通気してエーテルを蒸発
させ試薬をガラスにコートした。これに５００μ９の抗
体（約１■／ｄの抗体溶液）と Ｉ（ヨウ化ナトリウ
ム）１ｍＣｉを加え、水中で時々撹拌しながら約２０分
間反応させ、カラムＰＤ−１０（セファデックスＧ２５
、カラム容積９ｄ、フンルマシア社製）にかけ、燐酸緩
衝液（ＤＨ７）により溶出し、ｌａｅずつ分画し、３番
目と４番目のフラクション（合計２ａｅ）を分取し、未
反応 Ｉを除去した ■標識抗体を取得した。この
標識抗体溶液、２０μＣｉ（抗体的１０μｇ）を、ＰＡ
ＮＣ−１を移植したヌードマウス（Ｉ瘤の大きさは約１
９）に尾静脈投与した。その後、１，２．３．５日目に
腫瘍、及び各臓器を取り出し、重量当りの放射能量を求
め、その対血液比（Ｔ／Ｂ）の値を比較したところ、Ｍ
Ｂ０１３、及びＭＢ０５９抗体を用いた場合、各正常組
織ではＴ／Ｂ＝１以下、癌では５以上の値が得られた。
癌特異性１−９ ヌードマウス移植節への抗体集積実験
抗体の １１１１はヨードグン法により以下の方法で
行った。ヨードゲン試薬１■／ｄのエーテル溶液をガラ
スの試験管に入れ、窒素ガスを通気してエーテルを蒸発
させ試薬をガラスにコートした。これに５００μ９の抗
体（約１■／ｄの抗体溶液）と Ｉ（ヨウ化ナトリウ
ム）１ｍＣｉを加え、水中で時々撹拌しながら約２０分
間反応させ、カラムＰＤ−１０（セファデックスＧ２５
、カラム容積９ｄ、フンルマシア社製）にかけ、燐酸緩
衝液（ＤＨ７）により溶出し、ｌａｅずつ分画し、３番
目と４番目のフラクション（合計２ａｅ）を分取し、未
反応 Ｉを除去した ■標識抗体を取得した。この
標識抗体溶液、２０μＣｉ（抗体的１０μｇ）を、ＰＡ
ＮＣ−１を移植したヌードマウス（Ｉ瘤の大きさは約１
９）に尾静脈投与した。その後、１，２．３．５日目に
腫瘍、及び各臓器を取り出し、重量当りの放射能量を求
め、その対血液比（Ｔ／Ｂ）の値を比較したところ、Ｍ
Ｂ０１３、及びＭＢ０５９抗体を用いた場合、各正常組
織ではＴ／Ｂ＝１以下、癌では５以上の値が得られた。
又、コントロールとして非特異的ＩｇＭを用いた場合は
正常組織、癌共にＴ／Ｂは１以下であり、ＭＢ０１３、
及びＭＢ０５９抗体が癌に特異的に集積することが確認
された。
正常組織、癌共にＴ／Ｂは１以下であり、ＭＢ０１３、
及びＭＢ０５９抗体が癌に特異的に集積することが確認
された。
第１図は、本発明のヒト型モノクローナル抗体と細胞表
層との反応性をフローサイトメトリーにより測定した結
果を示す。
層との反応性をフローサイトメトリーにより測定した結
果を示す。
Claims (4)
- （１）ヒト膵癌患者のヒトＢリンパ球とマウスミエロー
マ細胞株とのヒト／マウス融合細胞株が産生する腫癌特
異的ヒト型モノクローナル抗体。 - （２）ヒト／マウス融合細胞株がＭＢ０１３（微工研菌
寄第１１６２０号）であり、産生されるヒト型モノクロ
ーナル抗体がＩｇＭであつて、ヒト正常繊維芽細胞に比
して樹立膵癌細胞に強い結合力を有し、正常組織と反応
せず膵癌と特異的に反応する請求項（１）項記載の腫癌
特異的ヒト型モノクローナル抗体。 - （３）ヒト／マウス融合細胞株がＭＢ０５９（微工研菌
寄第１１６２１号）であり、産生されるヒト型モノクロ
ーナル抗体がＩｇＭであつて、ヒト正常繊維芽細胞に比
して樹立膵癌細胞に強い結合力を有し、正常組織と反応
せず膵癌と特異的に反応する請求項（１）項記載の腫癌
特異的ヒト型モノクローナル抗体。 - （４）請求項（１）、（２）又は（３）項に記載のヒト
型モノクローナル抗体を使用する事からなる癌の検出方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2203476A JPH0488998A (ja) | 1990-07-31 | 1990-07-31 | 腫瘍特異的ヒト型モノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2203476A JPH0488998A (ja) | 1990-07-31 | 1990-07-31 | 腫瘍特異的ヒト型モノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0488998A true JPH0488998A (ja) | 1992-03-23 |
Family
ID=16474779
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2203476A Pending JPH0488998A (ja) | 1990-07-31 | 1990-07-31 | 腫瘍特異的ヒト型モノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0488998A (ja) |
-
1990
- 1990-07-31 JP JP2203476A patent/JPH0488998A/ja active Pending
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