JPH0489000A - 細胞培養キットおよび細胞傷害試験法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は医薬品、化粧品、食品添加物、殺虫剤、工業試
薬などの種々の被検物質や物理的刺激が細胞あるいは細
胞の集合状態に与える影響を簡便にかつ鋭敏に測定する
ことが可能な細胞培養キ７）およびそれを用いた細胞傷
害試験法に関する。さらに詳しくは細胞の化１１性およ
び細胞間相互作用■ に対する被検物質　連理的刺激の影響を測定することに
より細胞毒性、細胞傷害性および薬理活性の機予などを
怒度良く測定することが可能な細胞培養キントおよびそ
れを用いた細胞傷害試験法に関する。

〔従来の技術〕

て細胞あるいは器官の培養系が最も盛んに用いられてき
た。さらには温度、放射線、電場、磁場などの物理的刺
激の生体への傷害あるいは生理的作用の評価としても上
記の細胞あるいは器官の培養系は有効であると考えられ
てきた。

器官培養系は種々の組織成分および種々の細胞間の関係
が生体とほぼ同様に維持されていて、細胞培養系と比較
して被検物質に対するより生理的な試験法であるという
大きな長所をもつ反面、生きている器官の大量供給が困
難であること、器官の複製が困難であること、組織など
の大きさのバラッキあるいは細胞の不均一性により薬剤
の効果を定量化することが困難であること、複数の細胞
から成っているため標的細胞のみに対する効果を特定す
ることが困難であること、さらには長期間の培養が困難
であるといった多（の欠点を有していて現状では一般的
な細胞傷害試験法として実用に供せられる段階ではない
。

一方、細胞培養系としては以下に示す種々の培養系が細
胞傷害試験法として実用化されている。

１）　浮遊培養系 本培養系は１個１個の細胞をバラバラにして培養液中に
浮遊させて培養する系である。今日、細胞培養系に使用
されている動物細胞は接着非依存性細胞と接着依存性細
胞の２種類に分類される。

接着依存性細胞は生存、増殖、物質産生能などの細胞機
能が細胞の足場である基質が存在しなくては正常に発現
されない細胞であり初代培養細胞をはじめとした大部分
の正常二倍体細胞、さらには無限に増殖可能な樹立細胞
系にも接着依存性を示すものが多い。一方、接着非依存
性細胞は生存、増殖といった細胞機能が基質がなくても
発現される細胞であり、血液系細胞、癌細胞などが接着
非依存性である。したがって浮遊培養系は接着非依存性
細胞にのみ適用が可能で組織、器官を形成する細胞の大
部分は本培養系の適用外である。被検物質の標的細胞が
多くの場合、接着依存性細胞であることを考えると本性
は細胞傷害試験法として致命的な欠点を有している。

２）　単層培養系 接着依存性細胞の培養系として今日、最も一般的に用い
られている系が単層培養系である。単層培養系は細胞数
が少なくても多数の被検物質を簡便に検定することがで
きかつ必要に応して細胞を、罐 増殖、蝋代することも可能である。しかし単層培養系の
最大の問題点は多くの臓器実質細胞の場合は生体内では
単層では存在せず３次元的な構築を形成していて単層培
養系が実際の生体中の細胞構築と著しく異なっていると
いうことである。生体内で単層状で存在している上皮系
、内皮系細胞であっても単層培養系で用いられている人
工基質上に接着させられた状態は生体内の環境と著しく
異なっている。多くの実験事実が示すように単層培養系
は栄養物の補給、老廃物の除去が効率的に行われるため
細胞の増殖には最も適した系であるものの細胞の特異的
機能の発現、即ち細胞の分化を誘導する系としては不適
当であると考えられている。被検物質の標的細胞に与え
る生理的影響を検定する時に標的細胞の特異的機能が低
下あるいは消失している単層培養系は細胞傷害試験法と
しては著しく感度が低下してしまい不適当である。

３）　ゲル培養系 すでにのべたように臓器実質細胞は生体内では単層状で
は存在せず３次元的な構築を形成していることから考え
るとゲル培養系は単層培養系よりもより生体内の環境に
近く生理的であると考えられる。また多くの実験事実か
らゲル培養系では単層培養系と比較して細胞の特異的機
能の発現、即ち細胞の分化誘導がより活発であることが
証明されている（榎並淳平ら、組織培養研究、ｉ、７６
゜１９８５）。今日、ゲル培養系にはコラーゲンゲル、
寒天ゲルなどが用いられているが、ケル培養系の大きな
問題点は特にゲルの内部の細胞に対する酸素をはじめと
した栄養物の供給および老廃物の除去の効率がそれぞれ
低下し細胞が壊死してしまうということである。さらに
ケル培養系では添加した被検物質がゲル内部の細胞まで
シこ拡散する過程が律速となり定量的な検定が困難であ
る。

４）　塊状培養系 塊状培養系は細胞同志がお互いに凝集し３次元構造を形
成している点で単層培養系と比較すると生体内の状態に
近くより生理的なモデルであると考えられる。

多くの癌細胞では浮遊培養によって細胞同志が凝集し塊
状体が形成される（Ｒ，Ｍ、５ｕｔｈｅｒｌａｎｄ。

５ｃｉｅｎｃｅ、２４０，１７７．１９８８）　、これ
に対して正常二倍体細胞の場合には浮遊培養によって塊
状体を形成することはほとんど不可能である。唯一、正
常二倍体細胞で塊状体が得られたケースは特殊な培養基
質上で肝細胞を単層培養中に偶然に形成されたものであ
る（Ｎ、Ｋｏｉｄｅ、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　ａｎｄ１９８９）。しかし従来の塊状体は癌細
胞であれ正常細胞であれ偶然に形成されたものであり一
定の径を有する塊状体を大量に得ることは困難であった
。

更にまたゲル培養系と同様に塊状培養系の場合も塊状体
の内部の細胞に対する酸素をはじめとした栄養物の供給
および老廃物の除去の効率がそれぞれ低下し細胞が壊死
してしまうという大きな問題点があると同時に被検物質
がゲル内部の細胞までに拡散する過程が律速となり定量
的な検定が困難である。

以上に細胞傷害試験法として従来、用いられてきた種々
の細胞培養系について概観してきたがそれぞれの系につ
いての問題点を以下に要約する。

１）　浮遊培養系は多くのｍ織、器官を形成する実質細
胞の場合には適用できないこと、２）　単層培養系では
各種の組織器官を形成する細胞の特異的機能の発現、即
ち細胞の分化誘導が困難であること、３）　ゲル培養系
ではゲルの内部への栄養物の供給不足および老廃物の蓄
積による細胞の壊死が生ずることおよび被検物質のゲル
内部への拡散が律速であること、４）　塊状培養系は正
常細胞にはほとんど適用できないこと、径が一定で大量
の塊状体を作製することが困難であること、塊状体の内
部がゲル培養系と同時に壊死し易いこと、さらに被検物
が塊状体の内部にまで拡散することができず薬剤の効果
などを定量化することが困難であることなどそれぞれの
培養系に付随した解決すべき問題点がある。

一方、細胞傷害性の目安として、細胞死、増殖能および
ＤＮＡ合成能などの細胞機能が用いられ、エリスロキン
、アルキアンプル−などの色素を用いた色素排除試験法
が最も一般的である。またあらかしめ細胞に取り込ませ
ておいた（５１にｒ３Ｈ１ロイシン、［３旧プロリンな
どの細胞膜からの再放出によって細胞の傷害性の目安と
する方法も開発されている。細胞の増殖能の測定法とし
ては生存細胞数および細胞形態の測定が代表的である。

ＤＮＡ合成能も細胞の増殖能の良い指標であり［１旧チ
ミジンのＤＮＡ内への取り込みを測定する方法も行われ
ている。また細胞傷害性の目安として核、ミトコンドリ
アなどの細胞内器官の形態変化を測定する方法も行われ
ている。本発明における細胞傷害試験法としては上記の
従来の方法も適用が可能である。

［発明が解決しようとする課題１ 本発明の目的は上述した従来の細胞培養系を用いた細胞
傷害試験法の種々の問題点を解決し、多くの組織、臓器
を形成している正常細胞のみならず癌細胞にも通用が可
能でかつ被検物質あるいは物理的刺激の細胞に対する影
響を高感度で簡便にそして定量的に測定することができ
る細胞傷害試験法を提供することにある。また、本発明
はかかる細胞傷害試験に用いる新しい細胞培養キットを
提供することも目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

上記の目的は新規な細胞培養キ７）および細胞傷害試験
法を提供する本発明によって達成された。

本発明の細胞培養キットは、温度感応性高分子化合物か
らなる第一培養器と細胞非接着性材料からなる第二培養
器からなる。また、本発明の細胞傷害試験法は、第一培
養器で培養した細胞を細胞間接触を保持した細胞シート
の状態で該第一培養器から遊離させた後、第二培養器に
移し、物理的刺激を印加または被検物質を添加して浮遊
培養することにより、細胞集合体の形態変化を測定する
ことを特徴とする。

本発明の細胞傷害試験法では、まず接着依存性細胞の増
殖に適した単層培養系からなる第一培養器内で細胞を培
養し、培養した細胞を１個１個バラバラにせずに細胞シ
ートの形で遊離する（第一段階）。単層培養した細胞シ
ートの遊離は、セルスフレイバーなどによって機械的に
基材表面から剥離させる方法や、特願平２−４９１５５
号明細書に開示される温度感応性化合物からなる基材上
に細胞を培養し温度変化のみによって細胞シートを基材
表面から剥離させる方法などを用いて行うことができる
。細胞に与える傷害が少ないという点を考慮すれば、後
者の方法を用いるのが好ましい。

遊離した細胞ソートは次に第二培養器に移し、物理的刺
激を印加または被検物質を添加して非接着性基質上で浮
遊培養する（第二段階）。細胞シートは、浮遊培養する
ことによって塊状などの３次元細胞集合体に変化する。

このような細胞集合体の形態変化は印加された物理的刺
激や添加された被検物質に依存するため、細胞集合体の
形態変化を測定することによって細胞傷害性の評価を行
うことができる。なお、本明細書において使用される「
形態変化」という言葉は、細胞の大きさ、形などの外見
（外観）の変化のみならず、細胞内器官および細胞間結
合など何らかの手段により検知可能な変化をすべて含む
ものである。

ここで培養系に印加される「物理的刺激」とは、温度、
放射線、電場、磁場、光、マイクロ波などを広く含むも
のである。また、培養系に添加される「被検物質」とは
、医薬品、化粧品、食品添加物、殺虫剤、工業用試薬な
どの化学物質を広く含むものである。さらに、酸素濃度
、ｐＨ２栄養条件といった培養条件の設定・変化も「物
理的刺激の印加または被検物質の添加」という表現に含
まれる。

上述したように多くの組織、臓器を形成する正常細胞、
さらには無限に増殖が可能な樹立細胞は接着依存性細胞
であり単層培養系が細胞の増殖には絶対的に必要である
。そこで本発明の第１段階は細胞を単層培養することに
より細胞傷害試験に必要な量の細胞数を増殖させるとい
う役割を果たしている。しかし単層培養系では基質上に
接着し増殖した細胞は実際の生体中の細胞構築とは著し
く異なっていて、個々の細胞の特異的機能を発現させ、
細胞の分化機能を誘導する系としては不適当である。即
ち、被検物質の標的細胞に与える物理的影響を検定する
時に標的細胞としての特異的機能が低下あるいは消失し
てしまい細胞傷害試験法としては感度が著しく低下して
しまう。本発明の第２段階は単層培養系で低下した細胞
の特異的機能発現を賦活化するプロセスである。即ち生
体の環境と異なった単層状態に細胞を束縛していた基質
から細胞を解放し細胞を単層状態から生体内の１＠境に
より近い３次元培養系に移行させることにより細胞の分
化機能を誘導し細胞傷害試験法としての感度を向上させ
るプロセスである。

一方、すでにのべたように従来のゲル培養法、塊状培養
法などの３次元培養法の致命的な問題点である１）　被
検物質が３次元培養系の内部にまで到達できず薬効を定
量的に評価することが困難である、２）　栄養物質の供
給あるいは老廃物の除去が３次元培養系の内部では効率
的には行われず、壊死してしまうなどが本発明の培養系
を用いることによって解決される。即ち１）の問題点は
被検物質の添加を本発明の第１段階、即ち単層培養系で
行うことによって被検物質をすべての細胞に均一に到達
させることが可能となり解決される。

一方、２）の問題点は本発明の第２段階に於て細胞シー
トが基質から解放され、徐々に３次元構造が形成される
ため、最初からタイトな３次元構造が形成されている従
来のゲル培養系、塊状培養系と比較して内部細胞の壊死
の危険性は著しく低下する。更に本発明の試験法は主と
して細胞ソートから３次元構造体が形成されるまでの遷
移状態中に行われ、完全な３次元構造体が形成される時
には試験が終了しているため、さらに細胞壊死の危険性
が低下する。

さらに本発明の細胞傷害試験に用いる培養系−の特徴は
培養細胞を基質表面から解放する際に従来使用されてき
た細胞！ｉ離剤であるトリプシン、ＥＤＴＡなどを使用
しないことである。トリプシン、ＥＤＴＡなどの脱離剤
は細胞と基質間の結合を破壊するのみならず細胞と細胞
間の結合であるタイトジャンフシボン、デスモゾーム、
ギャップジャンクションなども破壊し細胞をバラバラに
分離する。したがって細胞のシートあるいは塊を形成さ
せることは不可能である。さらにこれらの細胞脱離剤は
細胞膜表面に存在する各種の膜リセプターも破壊しホル
モン、ケミカルメデイエータ−などの信号分子に対する
細胞の感受性に著しく損傷を与える。したがって従来の
脱離剤による細胞の遊離は細胞傷害試験としての感度を
著しく低下させることになる。

一方、本発明の細胞傷害試験法には、すでにのべたよう
に従来の細胞死、増殖能、ＤＮＡ合成能などの細胞機能
を測定する方法が当然ρことながら応用できる。しかし
これらの細胞機能は主として細胞個々に対する傷害性の
目安であり細胞の集合体に対する傷害性という点では間
接的である。

細胞は生体では単独に存在しているわけではなく細胞間
の強い相互作用により社会を形成しその一員として機能
している。本発明における細胞傷害試験法は細胞個々に
対するよりは細胞集合体（細胞社会）に対する傷害性の
測定に適しており、生体内で実際に生じている細胞傷害
性により近い評価が可能である。特に従来、行われてき
た細胞機能測定以外にも本発明の培養系を用いると被検
物質の細胞シートから塊状体への遷移過程における細胞
集合体全体の形態変化に与える影響、細胞集合体内の細
胞間結合および細胞内器官の形態変化に与える影響、染
色法による集合体中の染色細胞の分布などに与える影響
などが測定でき、多くの組織、臓器の傷害性モデルを提
供することが可能である。

以上に記載した本発明の目的を有効に達成しうるならば
、本発明の細胞傷害試験法に当業者に自明な改良・変更
を加えることができる。また、本発明の目的を有効に達
成することができるさまざまな細胞培養キットを使用す
ることができる。温度感応性高分子化合物からなる第一
培養器と細胞非接着性材料からなる第二培養器から構成
される本発明の細胞培養キットは、本発明の細胞傷害試
験法に用いることができる好ましいキットの一つである
。従って、本発明の細胞傷害試験法は該細胞培養キット
を用いなければ行うことができないものではないことを
注記しておく。例えば、前述のように温度感応性高分子
化合物を使用しない第一培養器を用いて本発明の細胞傷
害試験法を実施することも可能である。

以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明の範囲はかかる実施例によって制限されるも
のではない。

実施前ユ土：　Ｎ−イソプロピルアクリルアミドモノマ
ー（Ｎ　Ｉ　ＰＡＡｍ）５０　ｇをヘンゼン５００１ｄ
ｌに溶解し２．２°−アゾビスイソブチルニトリル（Ａ
　Ｉ　ＢＮ）　０．２ｇを重合開始剤として使用し６０
゛Ｃで１２時間、窒素気流中、攪拌下に重合を行った。

重合物はヘンガン中で沈澱するためデカンテーションし
た後、沈澱物をテトラヒドロフランにｆ４解しエチルエ
ーテルを用いて沈澱精製を行った。上記の方法で得られ
たポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮ　Ｉ　
ＰＡＡｍ）を用いて０．５　Ｗ／Ｖχ水溶液を作製し０
．４５μｍのフィルターを用いて濾過滅菌した後、該ポ
リマー水溶液とウシの真皮ペプシン可溶化タイプＩコラ
ーゲン（滅菌済、高研（株）製）　０．５Ｗ／Ｖχ水溶
液を等量混合しＰＮｒＰＡＡｍとコラーゲンの混合溶液
を作製した。該混合溶液を市販の組織培養用プラスチッ
クディッシｓ　（Ｆａｌｃｏｎ社製、３５５ｍΦ）の底
面に注入しクリーンベンチ内で常温で無菌的に風乾した
。上記の方法によりブラインシュ底面にコラーゲンとＰ
ＮＩＰＡＡｍの１：１混合物が約１．０　μｍの厚みに
コーティングされたデイ・−工を作製した。次いでヒト
の真皮由来の線維芽細胞をダルへ、コ改変イーグル培地
（ＤＭＥＭ　：Ｇ　Ｉ　ＢＣＯ社製、１０％牛脂児血清
含有）中に縣濁分散した液（細胞濃度：約２Ｘ１０’細
胞／Ｉｄ）２ｄを３７°ｃに保温した後、３７゛ｃにあ
らがしめ保温された該コーティングディノンユ中に注入
し、３７°Ｃで空気１５％炭酸ガスインキュヘーター中
で５日間培養した。５日後に培養細胞が完全にデイツシ
ュ底面を被覆したところで該デイツシュを３７°Ｃのイ
ンキュヘーターから取り出し常温に放置した。細胞シー
トが完全にディノソユ底面から脱離したところで古い培
地を捨て、２回新しい培地で洗浄することにより溶解し
たポリマーとコラーゲンを除去した後、２ｄの新鮮培地
を含む疎水性デイツシュ（Ｆａｌｃｏｎ社製、３５ｍｍ
Φ）に移し培養した。該培養系で細胞ソートは徐々に収
縮し最終的には外径約９００μｍの球状の塊状細胞集合
体になった。

該収縮過程において細胞集合体を経時的に位相差顕微鏡
によって観察した。細胞シートの径（長径と短径の平均
値）を測定し脱離直後の細胞ソートの径を１００％とし
た相対値である収縮率を算出して時間と共にプロットし
た結果を第１図に示す。第１図かられかるように収縮過
程は３つの相に分類される。即ち細胞シートの脱離時か
ら約０．５日の間の非常に強い収縮期（第１相）、約０
．５日後から約２日の間の弱い収縮期（第■相）および
２日以降の収縮が認められない安定期（第■相）である
。第２図（ａ）、　Ｑ））、　（Ｃ）、　（ｄ）ニ脱離
直後、０．５日後、１日後、２日後の細胞集合体の位相
差顕微鏡による観察像をそれぞれ示す。

実ＪＬＩ殊二」一 実施例−１で用いたＰＮ　Ｉ　ＰＡＡｍとコラーゲンの
混合物をコーティングしたデイツシュ上で実施例−１と
全く同様の条件でヒトの真皮由来の線維芽細胞を５日間
培養した後、同様に脱離した疎添加した後の脱離細胞シ
ートの収縮過程を位相差ｉ！ｌｉ微鏡下に観察した。そ
の結果、上記の濃度範囲では第１相の急激な収縮過程に
はコントロールとの差異は認められなかったが濃度が０
．３　μｇノー以上で第■相の弱い収縮は完全に阻止さ
れ最終的には球状の塊状細胞集合体の形成が認められな
かった。第３図（ａ）、　（ｂ）、　（ｃ）、　（ｄ）
にシクロへキンミドを０．３μｇ／ａの濃度で添加した
時の脱離直後、０．５日後、１日後、２日後の細胞集合
体の形態変化をそれぞれ示す。ノクロヘキンミドの薬理
活性はＤＮＡの蛋白合成能の阻害であることから考えて
第■相の収縮過程はＤＮＡの蛋白合成プロセスと密接に
関連している。

１隻班ニュ 実施例−２と全く同様にヒトの真皮由来の線維芽細胞を
５日間培養し、脱離して作製した細胞シートにアクチノ
マイシンＤを０．００３，０．０３，３．１０μｇ／　
ｍの培地の濃度になるように添加し細胞シートの形態変
化を位相差顕微鏡によって観察した。

その結果、上記の濃度範囲では第１相の収縮過程に関し
てはコントロールとの差異は認められなかっだのに対し
て第■相の収縮挙動は０．０３μｇ／ｌｎＱ以りのアク
チノマインンＤの添加によって完全に阻止され球状の塊
状細胞集合体の形成は認められなかった。アクチノマイ
シンＤの第■相の［濃度はシクロへキノミドのそれの約
１７１ｏであった。

アクチノマイソンＤはＤＮＡのｍＲＮＡ合成能の阻害剤
であることから考えて第■相の収縮過程はＤＮＡのｍＲ
ＮＡ合成プロセスとも密接に関連している。

止較桝二上 実施例−１で用いられたヒトの真皮由来の線維芽細胞を
組織培養用プラスチンクディンンユ（Ｆ　ａｌｃｏｎ社
製、　３５ｍｍΦ）上で実施例−１と全く同様に５日間
培養した後シクロへキシミドおよびアクチノマイシンＤ
を培地濃度が１０ａｇ／ｄになるようにそれぞれ添加し
、細胞の形態変化を位相差顕微鏡下で観察した結果、形
態変化は全く認められなかった。実施例−２，３に示し
たように本発明の細胞傷害試験法ではシクロへキシミド
の場合は０．３　μｇ／　ｄ、アクチノマインンＤの場
合は０．０３μｇ／−でそれぞれ細胞傷害性が認めらた
のに対して本比較例に示すように従来の単層培養系によ
る細胞傷害の検出濃度は１０μｇ　／　ｔｎ１以上で本
発明の培養系と比較して著しく感度が低かった。

（発明の効果〕 本発明の細胞培養系を用いた細胞傷害試験法は従来法と
比較して前便でかつ感度が良い。さらに従来法では評価
が困難であった細胞と細胞の相互作用、即ち細胞の集合
体への影響をも感度よく測定することが可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、細胞シートから球状塊への遷移過程における
収縮率の経時変化を示すグラフである。 第２図は、細胞シートの脱離時から球状塊への形態変化
の位相差顕微鏡写真である。 第３図は、シクロへキシミドを０．３　μｇ／　ａ添加
した時の脱離後の細胞シートの形態変化を示す写真であ
る。 、ｒ）う 面の？７＋書（内容に変更なし） 第 図 （ｆ、ン （？ゴ） 図面の浄書（内容に変更な （乙１） ｒｂ） 手 続 補 止 １、事件の表示 平成 ２年特許願第１１６６８７号 ２、発明の名称 ２６発明の名称 細胞培養キットおよび細胞傷害試験法 補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 名　称　　ダブりニー・アール拳グレース・アンド−カ
ンパニー−コーン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、温度感応性高分子化合物からなる第一培養器と細胞
   非接着性材料からなる第二培養器からなる細胞培養キッ
   ト。 ２、第一培養器で培養した細胞を細胞間接触を保持した
   細胞シートの状態で該第一培養器から遊離させた後、第
   二培養器に移し、物理的刺激を印加または被検物質を添
   加して浮遊培養することにより、細胞集合体の形態変化
   を測定することを特徴とする細胞傷害試験法。