JPH0489500A - アフィニティクロマトグラフィーによる物質の精製法および精製装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 〈産業上の利用分野〉 本発明は、バイオテクノロジー技術によって生産される
医薬品等の各種タンパク質関連物質、ポリヌクレオチド
、糖脂質、多糖類等の、アフィニティクロマトグラフィ
ーによって分離できる物質の精製に関し、更に具体的に
は、分離精製効率の高いアフィニテイクロマトグラフイ
ーに基づくタンパク質関連物質等の精製方法および精製
装置に関するものである。

〈従来の技術〉 アフィニテイクロマトグラフイーは、タン（り質等の物
質の持つ分子間の特異的相互作用に基づく分離方法であ
り、選択性か高く収率も優れ、バイオテクノロジー分野
で生産される各種生理活性物質等の分離、精製に広く利
用されている。

アフィニテイクロマトグラフイーによるタンパク質等の
分離精製においては、通常ゲル状の吸着体にリガンドを
結合させてこれをカラムに充填し、カラムクロマトグラ
フィーにより一連の分離精製操作が行なわれる。すなわ
ち、まず特異性の高いリガンドを固定化した担体を充填
したカラムに、目的物質を含む溶液を供給することによ
り、カラム内を流れる間に目的物質は選択的かつ可逆的
にリガンドに結合し、はとんどの不純物はカラム外に流
出する。引き続き、緩衝液てカラム中に残留する不純物
を洗い出す。その後、適当な溶出液をカラムに流すこと
により、不純物が除かれたリガンドと結合した目的物質
を解離、溶出させ、これを回収する。

ここで使用されるゲル材質としては、セルロース、デキ
ストラン、アガロース、ポリアクリルアミド、多孔質ガ
ラスのほか、ビニルポリマー、ナイロンおよびポリスチ
レン、アミノ酸共重合物、ウルトラゲル（Ｕｌｔｒａｇ
ｅｌ）などが使用されている。

〔発明の概要〕

〈発明が解決しようとする課題〉 しかし、上記したような従来のカラムクロマトグラフィ
ーによるタンパク質等の分離精製法では、次のような点
でスケールアップが難しく、工業規模で使用するには経
済的に不利である。

・アガロース系では、圧密化が激しく、圧損の増大およ
び分離効率の低下をきたす。

・シリカ系では、圧密化は低減されるが、分離効率を向
上させるため粒子径を小さくする必要があり、これによ
って高圧下での運転となるために設備費か嵩む。

・物質移動か律速となるため、リガンド使用量が増大し
、経済的でない。

このような欠点を克服するため、次のような特徴を有す
る膜アフィニティ法が最近報告されている。

・吸着体の充填高さか最小であり、操作圧が小さく処理
能力が最大になる。

・膜面積を大きくすることで、リガンド導入量と目的物
質の吸着容量が増加する。

・物質移動が大きく、これによってリガンドの利用効率
が増大する。

しかしながら、ここで使用されている膜材質は、セルロ
ース系、ナイロン等の有機膜であるため、次の様な欠点
を有する。

・耐薬品性に劣り、これによって脱吸着体の活性化方法
が制限される。

・耐熱性に劣り、これによってスチーム滅菌は不可能で
、サニタリー性の点で問題がある。

・膜の強度が低く、膜の寿命か短い。

本発明は、上記問題点を解決し、分離効率の優れた経済
的なタンパク質関連物質等の工業的精製方法および精製
装置を提供することを目的としてなされたものである。

〈課題を解決するための技術的手段〉 本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を
重ねた結果、多孔質ガラスを膜状に成形したものをアフ
ィニティ吸着体として使用することにより、タンパク質
関連物質を効率よくかつ経済的に分離できることを見出
し、この知見をもとに本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明による物質の精製法は、アフィニティ
クロマトグラフィーを用いた物質の精製法において、多
孔質ガラスを管状またはプレート状に成形した膜状担体
に、目的とする物質に対して適度な親和性を有するリガ
ンドを結合させてこれを分離膜体とし、該分離膜体に対
して分離用試料液を通過させること、を特徴とするもの
である。

また、本発明によるアフィニティク口マトグラフィーに
よる物質の精製装置は、目的とする物質に対して適度な
親和性を有するリガンドを担体に結合させて構成した分
離膜体を、分離用試料液の供給用ケーシング内に保持さ
せて成る物質の精製装置であって、上記担体を、多孔質
ガラスを管状またはプレート状に成形して構成したこと
、を特徴とするものである。

く効　果〉 本発明は下記のような効果を有する。

（１）　　管状またはプレート状の膜吸着体の採用によ
って低圧化での運転か可能になり、また圧密化の問題か
ない。

（２）　　細孔径がコントロールされた多孔質ガラス膜
を採用しているため、従来のゲル法で問題となっていた
物質移動の低下を防止することができ、リガンドの有効
利用と物質の経済的な分離、精製が可能となる。

（３）　　無機膜の採用によって吸着体か耐薬品性に優
れ、従ってリガンド結合のための膜吸着体の活性化方法
が制限されず、この方法として種々のものを利用するこ
とかできる。

（４）　　耐熱性にすくれているため、オートクレーブ
滅菌か可能となってサニタリー性が向上し、更に膜強度
にすぐれており、寿命か長く経済的である。

〔発明の詳細な説明〕

く精製法〉 本発明による物質の精製法は、アフイニテイクロマトグ
ラフィーを用いた物質の精製法において、多孔質ガラス
を管状またはプレート状に成形した膜状担体に、目的と
する物質に対して適度な親和性を有するリガンドを結合
させてこれを分離膜体とし、該分離膜体に対して分離用
試料液を通過させること、を特徴とするものであること
は前記したところであり、多孔質ガラス膜をアフイニテ
イクロマトグラフィーの担体として目的物質を分離する
ことを基本原理とするものである。

本発明において、分離の対象となる目的の物質は、アフ
ィニティクロマトグラフィー、すなわち物質の示す特異
的な相互作用である親和性を利用したクロマトグラフィ
ー、によって分離できるものであり、このような物質と
しては、バイオテクノロジーによって生産される医薬品
等の各種タンパク質関連物質（たとえば種々のホルモン
、酵素、抗体、アルブミンなど）をはじめ、ポリヌクレ
オチド、糖脂質、多糖類なとがあげられる。

また、これらの目的物質を含む分離用試料液としては、
たとえば発酵液、破砕菌体等の抽出液、あるいはこれら
の精製液などがあげられる。

担体は、前記のように多孔質ガラスを管状またはプレー
ト状に成形した膜状のもので、その厚さが好ましくは０
．３〜４．０ｗｍ程度、より好ましくは、管状の場合に
は０．３〜２．　０ｗｍ、プレート状の場合には０，３
〜１．０１のもの、細孔容積が好ましくは０．３〜１．
０ｃｃ／ｇ程度、より好ましくは０．３〜０．６ｃｃ／
ｇのもの、比表面積が好ましくは１〜５００ｉ／ｇ程度
、より好ましくは１００〜４００ｒｒｆ／ｇのもの、細
孔径が好ましくは０．０５〜５０μｍ程度、より好まし
くは０．１〜１０μｍのものである。

担体としての多孔質ガラスは、ＳｉＯっ、Ａｌ２Ｏ３、
Ｂ２Ｏ３等の一般的な無機ガラス成分から選ばれる１種
または複数種の成分から焼成されるものであり、この多
孔質カラスの焼成方法については、一般的な文献、たと
えば「ファインセラミックスハンドブック」浜野健也編
集（朝倉書店）、「バイオセラミックス」　（技報堂出
版）、などを参照することかできる。

目的とする物質は、担体に結合させたりガントによって
吸着されるか、リガンドとしては、一般的な文献、たと
えば「実験と応用　アフィニティクロマトグラフィー」
　（講談社）などに記載されているように、種々のホル
モンタンパク質に対する特異的リセプター、種々の酵素
に対する基質、種々の抗原（または抗体）に対する抗体
（または抗原）、ＩｇＧに対するプロティンＡ１ポリヌ
クレオチドに対する相補的ポリヌクレオチド、ＮＡＤ（
Ｐ）関連酵素、ＡＴＰ関連酵素、血清アルブミン等に対
する合成色素、糖タンパク質、糖脂質、多糖類などに対
するレクチン、血液凝固因子などに対するヘパリンなど
が一般にあげられる。

リガンドの担体への結合は共有結合によるのか普通であ
り、担体にシアノ基、エポキシ基、アミノ基などを結合
させたものにリガンド（タンパク質もしくはペプチドか
多い）の−ＮＨ２、−ＣＯＯＨあるいは−○Ｈなどを常
法によって共有結合させることにより担体にリガンドを
固定することができる。また、共有結合によってリガン
ドを担体に固定させるためには、担体としての多孔質ガ
ラスを活性化しておく必要がある。このような担体の活
性化方法および共有結合によるリガンドの固定化方法に
ついては一般的な文献、たとえば「実験と応用　アフィ
ニティークロマトグラフィー」　（講談社）、などを参
照することができるが、活性化方法の例の概要は下記の
ように説明される。

まず、多孔質ガラスをシラン誘導体、たとえばγ−アミ
ノプロピルトリエトキシシランなど、で処理し、アルキ
ルアミノガラスを調製する。このアルキルアミノガラス
は、リガンドの種類や分離・精製の目的に応じて、芳香
族アミノ誘導体、イソシアン酸語導体、カルボン酸誘導
体、あるいは酸クロリド誘導体、などの形に調製するこ
とができる。

また、アルキルアミノガラスは、カルボキシル基を有す
るリガンド（タンパク質もしくはポリペプチドがその代
表例である）、あるいはグルタルアルデヒドのような架
橋試薬を用いてアミノ基を固定化することも可能である
。

更に、リガンドと担体の間に適当な長さのスペーサー（
たとえば−（ＣＨ２）。−など）を導入することにより
、より有利にアフィニティクロマトグラフィーを行なう
ことができる。スペーサーを導入する方法として、スペ
ーサーをあらかじめ結合させた担体にリガンドを固定化
する方法と、あらかじめリガンドとスペーサーの結合体
を形成し、これを担体に固定化する方法があるが、どち
らも採用することか可能である。スペーサーを導入する
方法については、一般的な文献、たとえば「実験と応用
　アフィニティークロマトグラフィー」（講談社）を参
照することかできる。

本発明においては、多孔質ガラスの上記各種活性化方法
のうち、目的物質に応して、最も効率的な方法を適宜選
択することができる。

担体にリガンドを結合させる方法の好ましい具体例につ
いては、後記実験例に詳細に示されている。

上述のようにして、多孔質ガラス製の担体にリガンドを
結合させることにより、目的物質を吸着、分離するだめ
の分離膜体が構成される。この分離膜体については、管
状のものが後述する第２図の精製装置に、プレート状の
ものが第３図の精製装置にそれぞれ示されている。

この分離膜体を用いて目的物質を分離、精製するために
は、従来の膜アフィニティクロマトグラフィーの場合の
方法と基本的には同じでよく、まず、適当な容器内に組
み込んだ分離膜体に対して目的物質を含む分離用試料液
を適当な圧力を加えながら供給、通過させて目的物質を
分離膜体に吸着させる。次に適当な緩衝液で分離膜体に
残留する不純物を洗い出し、その後、リガンドに結合し
た目的物質を適当な溶出液で解離、溶出させて回収する
。実際に分離膜体を利用するには、後述するような、第
２図に示した管状の分離膜体を組み込んだ精製装置、あ
るいは第３図に示したプレート状の分離膜体を組み込ん
だ精製装置などを用いればよい。また、上記緩衝液およ
び溶出液は、目的とする物質に応して従来と同様適宜適
当なものを選択すればよい。

分離膜体を用いて目的の物質を分離、精製するための方
法は、一般的な文献、たとえばＳ、　Ｂｒａｎｄｔ　ｅ
ｔ　ａｔ　、、　Ｂｉｏ／ｌｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　ｖ
ｏｌ　６゜Ｐ７７９（１９８８）、などを参照すること
ができるが、本発明における具体例については後記実験
例に詳細に示されている。

〈精製装置〉 本発明による物質の精製装置は、目的とする物質に対し
て適度な親和性を有するリガンドを担体に結合させて構
成した分離膜体を、分離用試料液の供給用ケーシング内
に保持させて成る物質の精製装置であって、上記担体を
、多孔質ガラスを管状またはプレート状に成形して構成
したことを特徴とするものであることは前記したところ
であり、上述の本発明による精製方法を基本原理とする
ものである。本発明による精製装置は、分離膜体以外の
構成については、この種の目的に用いられている公知の
ものを採用することができる。

第２図には、分離膜体として管状に成形されたちの１を
組み込んだ精製装置の基本構成の例か、また第３図には
、プレート状に成形された分離膜体１′を組み込んた精
製装置の基本構成の例がそれぞれ示されている。これら
の分離膜体については精製方法の項ですてに詳細に説明
されている。

また、分離膜体の多孔質ガラスを担体として実際に使用
する時の大きさは、メツシュのような適当な支持体によ
って膜面を支持して用いる場合には特に制限はないが、
支持体を用いない場合には、強度の点から管状担体ては
内径が２〜１５ｍｍ程度、長さが５０〜５００　ｍｍ程
度か好ましく、プレート状担体では面積が３〜１００ｃ
−程度のものか好ましい。

第２図の精製装置は、複数の管状の分離膜体１を軸方向
に平行に配置した状態で筒状に形成した試料液供給用ケ
ーシング２内にその両端部において開口ａを維持させて
固定したものである。ケーシング２はポリプロピレン、
ポリカーボネート、テフロンなどの一般に用いられてい
る合成樹脂、あるいはステンレスなとの一般に用いられ
ている金属などが使用できる。

この精製装置によって目的物質を分離、精製するには、
試料液を適当な圧力を加えなから一端側の分離膜体１の
管内に供給して不要の液を管外（ケーシング２の筒内）
に流出させ、流出入口３から排出するか、またはこの流
出入口３から試料液を供給して分離膜体２の管外から管
内に流出させ、その後、試料液と同様にして洗浄用の緩
衝液および溶出液を供給し、流出口３側または他端側か
ら目的物質を回収する。この場合、開口ａ側端部には試
料の供給または目的物質回収のための供給口（または回
収口）を有する適当な長さの筒部をケーシング２に延設
しておけばよい。

第３図の精製装置は、プレート状の分離膜体１′を１対
のケーシング２′、　　２’　に挟持状態で内設したも
のである。このような精製装置の場合は、図示されてい
るように、複数の分離膜体１′を、同心円状にかつ放射
状に流路溝５，５′が設けられ中心に流通孔６を設けた
複数のデイストリビューター４、およびメツシュ状のス
ペーサー７と共に対称的に配置して重ねた状態でケーシ
ング２’、２’　に内設することかより望ましい。ケー
シング２′、デイストリビューター４、スペーサ７は、
ポリプロピレン、ポリカーボネート、テフロンなどの一
般に用いられている合成樹脂等によって成形することか
できる。この精製装置によって目的物質を分離、精製す
るには、試料液を適当な圧力を加えながら一方のケーシ
ング２′の供給口８から供給して不要の液を他方の流出
口８′から排出し、その後試料液と同様にして洗浄用の
緩衝液および溶出液を供給し、流出口８′から目的物質
を回収する。

〔実　施　例〕

以下は、本発明の実施例を示すものであるか、これによ
って本発明は限定されるものではない。

実施例 以下の実施例は、多孔質ガラス膜として、旭硝子（株）
製の管状膜を使用した例を示すものである。内径２ｍｍ
、内厚０．　３ｍｍ、長さ１００ｍｍの多孔質ガラス膜
チューブを３本使用し、分離精製実験に供した。多孔質
ガラス膜の細孔径は１．０μｍ、膜面積は外径基準で２
１．７ｃ４、膜容積は０　、　３０４　ｃＩｌｌのもの
を使用した。膜の活性化は、次のような手順によって実
施した。まず、多孔質ガラス膜をγ−アミノプロピルト
リエトキシシランのトルエン溶液（１０％ｖ　／　ｖ）
中で３時間還流し、その後メタノールを用いて過剰のシ
ランを洗浄除去することによりアルキルアミノガラスを
得た。ここでは、さらにこのアルキルアミノガラスを下
記のような反応により２種の誘導体、すなわち、芳香族
アミノ誘導体（１）およびカルボン酸誘導体（２）を得
た。

（１）芳香族アミノ誘導体 （２）カルボン酸誘導体 担体ＨＨ ↓ 分離精製のケースとして、本実施例ではプロティンＡを
リガンドとしたヒトＩｇＧの群特異的アフィニティクロ
マトグラフィーによる分離、精製を行なった。、なお、
プロティンＡとしては黄色ブドウ球菌Ｃｏｗａｎ　１株
由来のプロティン産生遺伝子を組み込んだ組換え大腸菌
産生のものを使用した。

一連の分離・精製試験の流れは次の様なものである。

脱吸着体の平衡化 ↓ プロティンＡの固定化 ↓ 脱吸着体のブロキッング ↓ 洗　　浄 ↓ 平衡化 ↓ ＩｇＧフラクションの吸着 ↓ 洗浄 ↓ ＩｇＧの溶出 なお、この一連の操作は、第１図に示す様なプロセスフ
ロー図によって実施することができる。

まず、２種の脱吸着体を活性化させる。吸着体（１）の
場合は、０．２．５％のグルタルアルデヒドを含む０．
１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，２）を循環（２時間）させ
ることにより活性化膜を作製した。同じ緩衝液で過剰の
グルタルアルデヒドを洗浄後、プロティンＡ　（５ｍｇ
　／　ｍｌ　）を同じ緩衝液に溶解したリガンド溶液を
５時間循環させ、プロティンＡを固定化させた。その後
、Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈ４で還元し、１％グリシンエチルエス
テルハイドロクロライド（ｐｉ（８，１）で過剰の活性
基をブロッキングした。この操作は１．０時間継続した
。

さらに、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，６，０，２
５ＭＮａＣ１含有）、０．２Ｍグリシン−ＨＣ１緩衝液
（ｐＨ１２，３）で洗浄し、最終的に０．０５Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，６，０，２５ＭＮａＣ１含有）で平衡
化し、ＩｇＧの吸着、溶出試験に供した。

吸着体（２）の場合は、次の様に分離を実施した。プロ
ティンＡを５　ａ＋ｇ　／　ｍｌとなるよう蒸留水に溶
解し、０．１ＭＨＣｌにてｐＨ４，５に調整する。

一方、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
）カルボジイミド塩酸塩を１０ｍｇ／ｍｌとなるように
蒸留水に溶解し、ｐＨ４，５とする。これら２種の溶液
を混合し、循環させることにより、プロティンＡの固定
化を行なう。さらに、吸着体（１）と同様に、ブロッキ
ング洗浄および平衡化操作を行なった。

ヒト血清を部分精製したＩｇＧフラクションは、１０ｍ
１／分の流量で循環させ、ＩｇＧの吸着を行なった。ま
た、ＩｇＧの溶出はグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２，
３）で実施した。なお、タンパク質量はローリ−（Ｌｏ
ｖｒｙ）法（循環中はＯＤ　　　　）２８０ｎ匝 で測定した。また溶出されたＩｇＧの純度検定は、５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥにより行なった。

吸着体（１）と（２）で得られたプロティンＡの吸着ｆ
ｆｉ　（ｍｇ　　ＰｒｏｔｃｉｎＡ／ｃＪ−膜）および
ＩｇＧの回収率の結果を表１および表２に示す。なお、
５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、溶出されるタンパク質は９８
％以上かＩｇＧであることが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は分離膜によるアフィニティクロマトグラフィー
システムの概要を示す説明図である。 第２図は、管状に成形した分離膜体を用いた、本発明に
よる精製装置の基本構成の一例を示す一部切欠図である
。 第３図は、プレート膜状に成形した分離膜体を用いた、
本発明による精製装置の基本構成の一例を示す構成図で
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アフィニティクロマトグラフィーを用いた物質の精
   製法において、多孔質ガラスを管状またはプレート状に
   成形した膜状担体に、目的とする物質に対して適度な親
   和性を有するリガンドを結合させてこれを分離膜体とし
   、該分離膜体に対して分離用試料液を通過させることを
   特徴とする、物質の精製法。 ２、担体の細孔容積が０．３〜１．０ｃｃ／ｇ、比表面
   積が１〜５００ｍ＾２／ｇ、細孔径が０．０５〜５０μ
   ｍ、膜の厚さが０．３〜４．０ｍｍである、請求項１記
   載の精製法。 ３、目的とする物質がタンパク質である、請求項１また
   は２記載の精製法。 ４、目的とする物質に対して適度な親和性を有するリガ
   ンドを担体に結合させて構成した分離膜体を、分離用試
   料液の供給用ケーシング内に保持させて成る物質の精製
   装置であって、上記担体を、多孔質ガラスを管状または
   プレート状に成形して構成したことを特徴とする、アフ
   ィニティクロマトグラフィーによる物質の精製装置。 ５、担体の細孔容積が０．３〜１．０ｃｃ／ｇ、比表面
   積が１〜５００ｍ＾２／ｇ、細孔径が０．０５〜５０ｐ
   ｍ、膜の厚さが０．３〜４．０ｍｍである、請求項４記
   載の精製装置。 ６、目的とする物質がタンパク質である、請求項４また
   は５記載の精製装置。