JPH0491097A - 新規なペプチド及びアンジオテンシン変換酵素阻害剤 - Google Patents
新規なペプチド及びアンジオテンシン変換酵素阻害剤Info
- Publication number
- JPH0491097A JPH0491097A JP2205000A JP20500090A JPH0491097A JP H0491097 A JPH0491097 A JP H0491097A JP 2205000 A JP2205000 A JP 2205000A JP 20500090 A JP20500090 A JP 20500090A JP H0491097 A JPH0491097 A JP H0491097A
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- Japan
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- peptide
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は新規なペプチドおよび該ペプチドまたはその塩
を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤に関
する。
を有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤に関
する。
［従来の技術］
血圧上昇をもたらす代表的な生体内因子としテレコン・
アンジオテンシン基が、また血圧降下に働く代表的な生
体内因子としてカリクレイン、キニン系が知られている
が、アンジオテンシン変換酵素（以後ｒＡＣＥＪという
）はこのいずれの系にも大きく関与している。
アンジオテンシン基が、また血圧降下に働く代表的な生
体内因子としてカリクレイン、キニン系が知られている
が、アンジオテンシン変換酵素（以後ｒＡＣＥＪという
）はこのいずれの系にも大きく関与している。
その機構を簡単に説明する。まず、レニン・アンジオテ
ンシン系では、血中に分泌された腎臓の酵素レニンが血
中のアンジオテンシノーゲンに作用してデカペプチドで
あるアンジオテンシンＩを生成する。このアンジオテン
シンＩは血圧上昇作用を示さないが、これにＡＣＥが作
用するとオクタペプチドであるアンジオテンシン■を生
成する。このアンジオテンシン■は末梢血管を収縮させ
るとともに、副腎皮質に作用してアルドステロンの産出
を促し、アルドステロンは腎臓に作用してナトリウムの
再吸収・体液量増加を招いて心拍出量の増大をもたらし
、そのいずれもが血圧を大きく上昇させる。
ンシン系では、血中に分泌された腎臓の酵素レニンが血
中のアンジオテンシノーゲンに作用してデカペプチドで
あるアンジオテンシンＩを生成する。このアンジオテン
シンＩは血圧上昇作用を示さないが、これにＡＣＥが作
用するとオクタペプチドであるアンジオテンシン■を生
成する。このアンジオテンシン■は末梢血管を収縮させ
るとともに、副腎皮質に作用してアルドステロンの産出
を促し、アルドステロンは腎臓に作用してナトリウムの
再吸収・体液量増加を招いて心拍出量の増大をもたらし
、そのいずれもが血圧を大きく上昇させる。
一方、カリクレイン・キニン系では血中の前駆体タンパ
ク質であるキニノーゲンに血中酵素のカリクレインが作
用してキニンを遊離産出するが、このキニンは末梢血管
を拡張させるとともにホスホリパーゼＡ２を活性化して
プロスタグランジンの合成を促進して血圧を降下させる
。
ク質であるキニノーゲンに血中酵素のカリクレインが作
用してキニンを遊離産出するが、このキニンは末梢血管
を拡張させるとともにホスホリパーゼＡ２を活性化して
プロスタグランジンの合成を促進して血圧を降下させる
。
ところがこのカリクレイン・キニン系にＡＣＥが働くと
、ＡＣＥは末梢血管の拡張作用およびホスホリパーゼＡ
、の活性化作用を有する上記キニンを分解・不活性化し
てしまうために、血圧の降下が生じなくなる。
、ＡＣＥは末梢血管の拡張作用およびホスホリパーゼＡ
、の活性化作用を有する上記キニンを分解・不活性化し
てしまうために、血圧の降下が生じなくなる。
したがって、ＡＣＥの上記のような働きを阻害する物質
（ＡＣＥ阻害剤）が存在すると、血圧上昇物質であるア
ンジオテンシン■の生成が抑制され、且つ血圧降下物質
として働くキニンの分解が防止されて、血圧の上昇抑制
および血圧降下が可能になる。
（ＡＣＥ阻害剤）が存在すると、血圧上昇物質であるア
ンジオテンシン■の生成が抑制され、且つ血圧降下物質
として働くキニンの分解が防止されて、血圧の上昇抑制
および血圧降下が可能になる。
かかる点から近年ＡＣＥ阻害剤の研究開発が色々行われ
ており、天然タンノくり質由来の、またハ合成ニヨる特
定のペプチド類がＡＣＥ阻害作用ヲ有スることが報告さ
れている。これまでｌこ報告された天然タンパク質由米
のＡＣＥ阻害ペプチドトシては、マムン由来のブラジキ
ニン・ボテンンエーターＢ （Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒ。
ており、天然タンノくり質由来の、またハ合成ニヨる特
定のペプチド類がＡＣＥ阻害作用ヲ有スることが報告さ
れている。これまでｌこ報告された天然タンパク質由米
のＡＣＥ阻害ペプチドトシては、マムン由来のブラジキ
ニン・ボテンンエーターＢ （Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒ。
−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ）およびブラジキニ
ン、ボテンシェークーＣ（Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒ。
ン、ボテンシェークーＣ（Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒ。
−Ｐｒｏ−Ｉ １ｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ） ［いずれもＨ
，Ｋａｔｏ ａｎｄ ＴＳｕｚｕｋｉ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ、 １０． ｐ、９７２（１９７１）
に把載されている］、牛乳カゼイン由来のペプチドであ
るＰｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａ ｌ−Ａ Ｉａ−Ｐｒｏ−Ｐｈ
ｅ−Ｐｒｏ−Ｇ Ｉｕ−Ｖａ ＩＰｈｅ−Ｇ １ｙ−Ｌ
ｙｓ（特公昭６０−２３０８５号公報）、Ｐ ｈ ｅＰ
ｈｅ−Ｖａ ｌ−Ａ １ａ−Ｐｒｏ（特開昭５９−４４
３２３号公報）、Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅ［−Ｐｒｏ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｒｐ（特開平２−２０２６３号公報）、Ａ １
ａ−Ｖａ １−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇ Ｉｎ−Ａ
ｒｇ、魚類タンパク質由来のペプチドであるＴｙｒ−Ｌ
ｙｓ−５ｅｒ−Ｐｈｅｌｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ
−Ｐｒｏ−Ｖａｔ−Ｍｅｔ、 ）ウモｏ＝＋シγ−ゼ
イン由来のペプチドであるＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｖ
ａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、 Ｖａｌ−
Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒ。
，Ｋａｔｏ ａｎｄ ＴＳｕｚｕｋｉ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ、 １０． ｐ、９７２（１９７１）
に把載されている］、牛乳カゼイン由来のペプチドであ
るＰｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａ ｌ−Ａ Ｉａ−Ｐｒｏ−Ｐｈ
ｅ−Ｐｒｏ−Ｇ Ｉｕ−Ｖａ ＩＰｈｅ−Ｇ １ｙ−Ｌ
ｙｓ（特公昭６０−２３０８５号公報）、Ｐ ｈ ｅＰ
ｈｅ−Ｖａ ｌ−Ａ １ａ−Ｐｒｏ（特開昭５９−４４
３２３号公報）、Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅ［−Ｐｒｏ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｒｐ（特開平２−２０２６３号公報）、Ａ １
ａ−Ｖａ １−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇ Ｉｎ−Ａ
ｒｇ、魚類タンパク質由来のペプチドであるＴｙｒ−Ｌ
ｙｓ−５ｅｒ−Ｐｈｅｌｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ
−Ｐｒｏ−Ｖａｔ−Ｍｅｔ、 ）ウモｏ＝＋シγ−ゼ
イン由来のペプチドであるＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｖ
ａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、 Ｖａｌ−
Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒ。
Ｐｒｏ等を挙げることができるが、その大半はアミノ酸
が５個以上結合したペプチドである。
が５個以上結合したペプチドである。
［発明の内容］
上記のような状況下に本発明者らもＡＣＥ阻害作用を有
する物質について研究を進めてきた。
する物質について研究を進めてきた。
その結果、上記既知のＡＣＥ阻害ペプチドとは異なった
アミノ酸配列を有する、ロインンーグルタミンーブロリ
ンーアルギニンが配列した新規なテトラペプチドＬｅｕ
−Ｇｌｎ −Ｐｒｏ −Ａｒｇを小麦グルテンの加水分
解物から単離することができ、そしてこのテトラペプチ
ドがＡＣＥ阻害作用を有することを見出した。
アミノ酸配列を有する、ロインンーグルタミンーブロリ
ンーアルギニンが配列した新規なテトラペプチドＬｅｕ
−Ｇｌｎ −Ｐｒｏ −Ａｒｇを小麦グルテンの加水分
解物から単離することができ、そしてこのテトラペプチ
ドがＡＣＥ阻害作用を有することを見出した。
したがって、本発明は、下記の式
％式％
で表されるペプチドおよびその塩である。
更に、本発明は上記式で表されるペプチドまたはその塩
を有効成分とするＡＣＥ阻害剤を包含する・ 本発明の上記ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドは、最初
はグルテンのプコテアーゼによる加水分解処理生成物と
して発見されたものであり、その場合には上記４種のア
ミノ酸 Ｌｅｕ、 Ｇｌｎ、ＰｒｏおよびＡｒｇはいず
れもＬ−アミノ酸である。
を有効成分とするＡＣＥ阻害剤を包含する・ 本発明の上記ＡＣＥ阻害活性を有するペプチドは、最初
はグルテンのプコテアーゼによる加水分解処理生成物と
して発見されたものであり、その場合には上記４種のア
ミノ酸 Ｌｅｕ、 Ｇｌｎ、ＰｒｏおよびＡｒｇはいず
れもＬ−アミノ酸である。
しかしながら、それに限定されず上記のアミノ酸配列を
有するテトラペプチドであればいずれの光学異性体であ
ってもよく、該４種のアミノ酸の全部がＤ−アミノ酸か
らなるテトラペプチドおよび４種のアミノ酸のうちのい
ずれか１個、２個または３個がＬ−アミノ酸であって残
りがＤ−アミノ酸からなるテトラペプチドも包含され、
それらは化学合成により製造することができる。
有するテトラペプチドであればいずれの光学異性体であ
ってもよく、該４種のアミノ酸の全部がＤ−アミノ酸か
らなるテトラペプチドおよび４種のアミノ酸のうちのい
ずれか１個、２個または３個がＬ−アミノ酸であって残
りがＤ−アミノ酸からなるテトラペプチドも包含され、
それらは化学合成により製造することができる。
本発明のテトラペプチドの調製法の例を挙げると以下の
とおりである。
とおりである。
小麦グルテンの加水分解による方法
小麦グルテンをプロテアーゼを使用して加水分解して水
溶性のグルテン由来ペプチド混合物を調製する。この場
合に、該ペプチド混合物は、まず小麦グルテンを希塩酸
等の酸性溶液中ｌ二分散溶解させた状態で、酸性で作用
するプロテアーゼで加水分解し、中和後、中性で作用す
るプロテアーゼで更に加水分解する方法により調製する
のがよい。
溶性のグルテン由来ペプチド混合物を調製する。この場
合に、該ペプチド混合物は、まず小麦グルテンを希塩酸
等の酸性溶液中ｌ二分散溶解させた状態で、酸性で作用
するプロテアーゼで加水分解し、中和後、中性で作用す
るプロテアーゼで更に加水分解する方法により調製する
のがよい。
酸性で作用するプロテアーゼとしては、特に酵素の活性
中心にアスパラギン酸残基とアス／くラギン酸のカルボ
ン酸イオンが関与するアスノくルティックブロテイナー
ゼを使用するのがよ１．ｔ、。
中心にアスパラギン酸残基とアス／くラギン酸のカルボ
ン酸イオンが関与するアスノくルティックブロテイナー
ゼを使用するのがよ１．ｔ、。
そのようなプロテアーゼの例としては、ペプシン、ヒイ
ロタケ起源のアスパルテイ・ノクフロティナーゼ１．ア
スペルギルス起源のアスノくルティノクプロテイナーゼ
、ペニジリウム起源の７１バルテイツクズロテイナーゼ
を挙げることができる。中性で作用するプロテアーゼと
してはトリプシン、キモトリプシン、プラスミン、トロ
ンビン等のセリンプロテアーゼを挙げることができる。
ロタケ起源のアスパルテイ・ノクフロティナーゼ１．ア
スペルギルス起源のアスノくルティノクプロテイナーゼ
、ペニジリウム起源の７１バルテイツクズロテイナーゼ
を挙げることができる。中性で作用するプロテアーゼと
してはトリプシン、キモトリプシン、プラスミン、トロ
ンビン等のセリンプロテアーゼを挙げることができる。
特に酸性で作用するプロテアーゼとしてペプシンを使用
し、且つ中性で作用するプロテアーゼとしてトリプシン
および／またはキモトリプシンを使用すると目的物を高
収率で得ることができ好ましい。酸性で作用するプロテ
アーゼおよび中性で作用するプロテアーゼは、それぞれ
１種類のみを使用しても、またはプロテアーゼ同士がお
互いに悪影響を及ぼさなし）かぎりは複数種を併用して
もよい。複数のプロテアーゼを使用する場合は、複数の
プロテアーゼを同時に存在させて加水分解を行っても、
または１種類ずつ逐次に用いて加水分解を行ってもよい
。また、プロテアーゼはフリーの状態で使用しても、固
定化して使用してもよい。プロテアーゼの使用量はいず
れの場合も乾燥したグルフン１００ｇ当たりグロテアー
ゼ約５．０００〜］００．０００ｕｎｉｔｓを用いるの
がよい。
し、且つ中性で作用するプロテアーゼとしてトリプシン
および／またはキモトリプシンを使用すると目的物を高
収率で得ることができ好ましい。酸性で作用するプロテ
アーゼおよび中性で作用するプロテアーゼは、それぞれ
１種類のみを使用しても、またはプロテアーゼ同士がお
互いに悪影響を及ぼさなし）かぎりは複数種を併用して
もよい。複数のプロテアーゼを使用する場合は、複数の
プロテアーゼを同時に存在させて加水分解を行っても、
または１種類ずつ逐次に用いて加水分解を行ってもよい
。また、プロテアーゼはフリーの状態で使用しても、固
定化して使用してもよい。プロテアーゼの使用量はいず
れの場合も乾燥したグルフン１００ｇ当たりグロテアー
ゼ約５．０００〜］００．０００ｕｎｉｔｓを用いるの
がよい。
ここで本明細書中のプロテアーゼ活性（ｕｎｉｔ）はす
べて下記の方法により測定したものである。
べて下記の方法により測定したものである。
プロテアーゼ活性の測定法
基質として米国メルク社製のハマーステインノノゼイン
１％溶液を用い、アンソン−萩原変法［赤堀四部編゛′
酵素研究法″第２巻笥２３７頁（昭和３６年１月ｌＯ日
、朝倉書店発行）１により測定した。反応は３０°Ｃで
３０分間行い、１分間にｌμｇのチロノン相当量を遊離
するのに要する酵素量を１ｕｎｉｔ と し プニ
。
１％溶液を用い、アンソン−萩原変法［赤堀四部編゛′
酵素研究法″第２巻笥２３７頁（昭和３６年１月ｌＯ日
、朝倉書店発行）１により測定した。反応は３０°Ｃで
３０分間行い、１分間にｌμｇのチロノン相当量を遊離
するのに要する酵素量を１ｕｎｉｔ と し プニ
。
プロテアーゼ処理は、各々の状況（例えばプロテアーゼ
の種類、プロテアーゼの使用形態等）に応して最適のｐ
Ｈ，温度、プロテアーゼ量、処理速度、処理時間等の条
件を選択して行うのがよく、例えば上で挙げたプロテア
ーゼを使用する場合、まず酸性で作用するプロテアーゼ
をｐＨ約１５〜５，０、温度約３０〜５０°Ｃで作用さ
せ、その後ｐＨを約６０〜８．０とした後、中性で作用
するプロテアーゼを温度約３０〜５０°Ｃで作用させて
０．７５Ｍトリクロロ酢酸への溶解率が約４０〜８０％
になるまで加水分解を行うとよい。
の種類、プロテアーゼの使用形態等）に応して最適のｐ
Ｈ，温度、プロテアーゼ量、処理速度、処理時間等の条
件を選択して行うのがよく、例えば上で挙げたプロテア
ーゼを使用する場合、まず酸性で作用するプロテアーゼ
をｐＨ約１５〜５，０、温度約３０〜５０°Ｃで作用さ
せ、その後ｐＨを約６０〜８．０とした後、中性で作用
するプロテアーゼを温度約３０〜５０°Ｃで作用させて
０．７５Ｍトリクロロ酢酸への溶解率が約４０〜８０％
になるまで加水分解を行うとよい。
目的とする加水分解状態が達成された時点で加熱および
／またはｐＨ調整してプロテアーゼを失活させ、失活し
た酵素、未分解グルテン等の不溶性固形物を遠心分離等
の適当な手段で分離除去し、残留液中に含まれているペ
プチド混合物を乾燥等により回収する。
／またはｐＨ調整してプロテアーゼを失活させ、失活し
た酵素、未分解グルテン等の不溶性固形物を遠心分離等
の適当な手段で分離除去し、残留液中に含まれているペ
プチド混合物を乾燥等により回収する。
次いで、このペプチド混合物を水等に溶解させた状態で
高速液体クロマトグラフィー（例えば逆相カラムを用い
た高速液体クロマトグラフィー等）等により処理して上
記テトラペプチドを純粋な形態で単離する。
高速液体クロマトグラフィー（例えば逆相カラムを用い
た高速液体クロマトグラフィー等）等により処理して上
記テトラペプチドを純粋な形態で単離する。
上記したペプチド混合物を含有する水溶液の分離精製お
よびテトラペプチドの単離は、例えば次の（ａ）〜（ｄ
）の工程からなる方法で行うことができる。
よびテトラペプチドの単離は、例えば次の（ａ）〜（ｄ
）の工程からなる方法で行うことができる。
（ａ） ペプチド混合物を高速液体クロマトグラフィ
ー（例えばナカライテスク株式会社製のＯＤＳ−Ｃｏｓ
ｍｏｓｉｌ ５Ｃ＋ａ）に通過させ、吸着成分を０．
１％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）と０．１％トリフ
ルオロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）にて
Ｂ液の濃度が０％から５０％まで直線的に増加する直線
濃度勾配溶離液を用いて溶離すると、アセトニトリルの
濃度が約１５〜１６％の範囲の溶離液区分に高吸収ピー
クが現れ、この画分のＡＣＥ阻害活性を測定確認して回
収する、 （ｂ） 必要に応じて上記（ａ）の工程を繰返す、（
ｃ） （ｂ）工程で得られた画分から溶媒を乾燥等に
より除夫して白色の固体を回収し、そして （ｄ） 上記白色固体として得られた生成物のアミノ
酸配列を例えばアブライドバイオシステムズ社製のプロ
ティンシーケンサ−（４７７−Ａ型）等を使用して調べ
、Ｌｅｕ −Ｇｉｎ −Ｐｒｏ −Ａｒｇからなるテト
ラペプチドであることを確認する。
ー（例えばナカライテスク株式会社製のＯＤＳ−Ｃｏｓ
ｍｏｓｉｌ ５Ｃ＋ａ）に通過させ、吸着成分を０．
１％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）と０．１％トリフ
ルオロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）にて
Ｂ液の濃度が０％から５０％まで直線的に増加する直線
濃度勾配溶離液を用いて溶離すると、アセトニトリルの
濃度が約１５〜１６％の範囲の溶離液区分に高吸収ピー
クが現れ、この画分のＡＣＥ阻害活性を測定確認して回
収する、 （ｂ） 必要に応じて上記（ａ）の工程を繰返す、（
ｃ） （ｂ）工程で得られた画分から溶媒を乾燥等に
より除夫して白色の固体を回収し、そして （ｄ） 上記白色固体として得られた生成物のアミノ
酸配列を例えばアブライドバイオシステムズ社製のプロ
ティンシーケンサ−（４７７−Ａ型）等を使用して調べ
、Ｌｅｕ −Ｇｉｎ −Ｐｒｏ −Ａｒｇからなるテト
ラペプチドであることを確認する。
マタ、本発明のテトラペプチドを化学合成により製造す
る場合は、例えば次の方法を採用することができる。
る場合は、例えば次の方法を採用することができる。
本発明のテトラペプチドの化学合成法
米国パイロサーチ社のＳＡＭ ＴＷＯ型自動ペプチド
合成装置を使用して同装置の標準プロトロル！こしたが
って合成を行う。すなわち、Ｂｏｃ（ブトキシカルボニ
ル） −Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−樹脂を４５％トリフルオロ
酢酸を含むデブロック液で処理した後、Ｂｏｃ −Ｐｒ
ｏをジイソプロピルカルボジイミドの存在下でカップル
させる。以下、上記と同様にデブロッキングした後、Ｂ
ｏｃ−ＧｌｎおよびＢｏｃ−Ｌｅｕを順次カップルさせ
てＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ −Ａｒｇ（Ｔｏｓ
）−樹脂を得る。このペプチド樹脂を１０％アニソール
を含むフッ化水素中に入れて０℃で１時間撹拌する。フ
ッ化水素を留去した後、エーテルで残渣を洗浄し１０％
酢酸でペプチドを抽出する。得られた粗ペプチドをＯＤ
Ｓカラムによる液体クロマトグラフィーを使用して精製
して、Ｌｅｕ −Ｇｉｎ −Ｐｒｏ −Ａｒｇを得る。
合成装置を使用して同装置の標準プロトロル！こしたが
って合成を行う。すなわち、Ｂｏｃ（ブトキシカルボニ
ル） −Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−樹脂を４５％トリフルオロ
酢酸を含むデブロック液で処理した後、Ｂｏｃ −Ｐｒ
ｏをジイソプロピルカルボジイミドの存在下でカップル
させる。以下、上記と同様にデブロッキングした後、Ｂ
ｏｃ−ＧｌｎおよびＢｏｃ−Ｌｅｕを順次カップルさせ
てＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ −Ａｒｇ（Ｔｏｓ
）−樹脂を得る。このペプチド樹脂を１０％アニソール
を含むフッ化水素中に入れて０℃で１時間撹拌する。フ
ッ化水素を留去した後、エーテルで残渣を洗浄し１０％
酢酸でペプチドを抽出する。得られた粗ペプチドをＯＤ
Ｓカラムによる液体クロマトグラフィーを使用して精製
して、Ｌｅｕ −Ｇｉｎ −Ｐｒｏ −Ａｒｇを得る。
本発明のＡＣＥ阻害剤は人間および種々の動物に投与す
ることができ、少量の投与によって顕著な血圧降下およ
び上昇抑制を達成することができる。
ることができ、少量の投与によって顕著な血圧降下およ
び上昇抑制を達成することができる。
本発明のＡＣＥ阻害剤の好適な投与量は、投与される人
間や動物の年令、体重、性別、症状、動物の種類等の種
々の条件によって異なる。
間や動物の年令、体重、性別、症状、動物の種類等の種
々の条件によって異なる。
そして、本発明のＡＣＥ阻害剤は経口投与および非経口
投与のいずれによっても投与可能であり、更に単独で投
与しても、また製薬工業におぃテ通常使用されている固
体担体や液状担体と−ｇに投与してもよく、或は他の薬
剤と混合または組合わせて使用することかでさる。また
投与形態は、錠剤、火剤、顆粒剤、カプセル、散剤、水
溶液、注射剤等の任意の形態が可能である。
投与のいずれによっても投与可能であり、更に単独で投
与しても、また製薬工業におぃテ通常使用されている固
体担体や液状担体と−ｇに投与してもよく、或は他の薬
剤と混合または組合わせて使用することかでさる。また
投与形態は、錠剤、火剤、顆粒剤、カプセル、散剤、水
溶液、注射剤等の任意の形態が可能である。
更に、本発明のＡＣＥ阻害剤は、食品や飼料中に添加し
て、またはそれらと−緒に投与することもでき、その場
合には天然タンパク質に由来するＬ−Ｌｅｕ −Ｌ−Ｇ
ｉｎ −Ｌ−Ｐｒｏ −Ｌ−Ａｒｇが望ましい。
て、またはそれらと−緒に投与することもでき、その場
合には天然タンパク質に由来するＬ−Ｌｅｕ −Ｌ−Ｇ
ｉｎ −Ｌ−Ｐｒｏ −Ｌ−Ａｒｇが望ましい。
以下に、本発明を例を挙げて具体的に説明するが本発明
はそれらによって限定されない。
はそれらによって限定されない。
実施例 ｌ
［小麦グルテンの加水分解Ｉこよるテトラペプチドの調
製］ 小麦グルテン５ｇを０．０３Ｎ塩酸１００ｍＱに分散溶
解させた後、蒸留水を加えて全ｊ１２００ ｍ Ｑにし
た。ＩＮ塩酸を加えてｐＨを２０に調整した後、ペズシ
ン（米国シグマ社製）５０００ｕｎｉ ｔｓを加えて、
３７°Ｃで１５時間反応させた。次に、５Ｎ水酸化ナト
リウム水溶液でｐＨを７．０に調整した後、トリプシン
とキモトリプシン（米国シグマ社製）を各々１０００ｕ
ｎｉｔｓずつ加えて３７°Ｃ’ｔ’５時間反応サセた。
製］ 小麦グルテン５ｇを０．０３Ｎ塩酸１００ｍＱに分散溶
解させた後、蒸留水を加えて全ｊ１２００ ｍ Ｑにし
た。ＩＮ塩酸を加えてｐＨを２０に調整した後、ペズシ
ン（米国シグマ社製）５０００ｕｎｉ ｔｓを加えて、
３７°Ｃで１５時間反応させた。次に、５Ｎ水酸化ナト
リウム水溶液でｐＨを７．０に調整した後、トリプシン
とキモトリプシン（米国シグマ社製）を各々１０００ｕ
ｎｉｔｓずつ加えて３７°Ｃ’ｔ’５時間反応サセた。
次いで、９０°Ｃで２０分間加熱して酵素を失活させる
とともに未溶物を沈澱させた。室温に冷却した後、１０
０ＯＯＧで２０分間遠心分離して固形物を分離除去した
。上澄液を回収し凍結乾燥してペプチド混合物４．０ｇ
を得た。
とともに未溶物を沈澱させた。室温に冷却した後、１０
０ＯＯＧで２０分間遠心分離して固形物を分離除去した
。上澄液を回収し凍結乾燥してペプチド混合物４．０ｇ
を得た。
上記のペプチド混合物２０ｍｇをナカライテスク株式会
社製の高速液体クロマトグラフィー：ＯＤＳ−Ｃｏｓｍ
ｏｓｉｌ ５Ｃ＋ｇ（２０Ｘ２５０ｍｍ）にｌｏｍ＜
１／分の流速で通過させた後、吸着成分を０．１％トリ
フルオロ酢酸水溶液（Ａ液）と０．１％トリフルオロ酢
酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）にてＢ液の濃
度が、０％から５０％まで直線的に増加する直線濃度勾
配溶離液をＩＯｍｆ２／分の流速で通しテｆｌ離すると
同時にその溶離してきた液の波長２１５ｎｍにおける吸
光度を測定すると第１図に示す多数のピークのあるフロ
ーチャートを得た。
社製の高速液体クロマトグラフィー：ＯＤＳ−Ｃｏｓｍ
ｏｓｉｌ ５Ｃ＋ｇ（２０Ｘ２５０ｍｍ）にｌｏｍ＜
１／分の流速で通過させた後、吸着成分を０．１％トリ
フルオロ酢酸水溶液（Ａ液）と０．１％トリフルオロ酢
酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ液）にてＢ液の濃
度が、０％から５０％まで直線的に増加する直線濃度勾
配溶離液をＩＯｍｆ２／分の流速で通しテｆｌ離すると
同時にその溶離してきた液の波長２１５ｎｍにおける吸
光度を測定すると第１図に示す多数のピークのあるフロ
ーチャートを得た。
ここで第１図の左側縦軸は溶離してきた液の波長２１５
ｎｍにおける吸光度（ＯＤ、、、）を、右側縦軸は溶離
液中のアセトニトリル濃度（％）を示す。
ｎｍにおける吸光度（ＯＤ、、、）を、右側縦軸は溶離
液中のアセトニトリル濃度（％）を示す。
各ピークを分取してそのＡＣＥ阻害活性を調べたところ
、アセトニトリルの濃度が１５〜１６％の溶離液区分に
ある高吸収ピークが高いＡＣＥ阻害活性を有していた。
、アセトニトリルの濃度が１５〜１６％の溶離液区分に
ある高吸収ピークが高いＡＣＥ阻害活性を有していた。
そこでこの両分を回収して、上記高速液体クロマトグラ
フィー処理を再度繰返しｔ二。
フィー処理を再度繰返しｔ二。
得られた画分から溶媒を乾燥除去して白色の固体２０μ
ｇを回収した。この白色固体をアプライ。
ｇを回収した。この白色固体をアプライ。
トバイオシステム社のプロティンシーケンサ−４７７−
Ａ型を使用してそのアミノ酸配列を調べたところ、Ｎ末
端から順次Ｌ−Ｌｅｕ、 Ｌ−Ｇｉｎ、 Ｌ−Ｐｒ。
Ａ型を使用してそのアミノ酸配列を調べたところ、Ｎ末
端から順次Ｌ−Ｌｅｕ、 Ｌ−Ｇｉｎ、 Ｌ−Ｐｒ。
およびＬ−Ａｒｇが遊離してきた。このことから式％式
％ るテトラペプチドであることが確認された。
％ るテトラペプチドであることが確認された。
ンリカゲルプレートによる薄層クロマトグラフィーでＲ
ｆ値を求めたところ、ブタノール：酢酸：ピリジン・水
−１５，３： １０： １２の展開溶媒を使用した場合
のＲｆ値は０．３４であった。
ｆ値を求めたところ、ブタノール：酢酸：ピリジン・水
−１５，３： １０： １２の展開溶媒を使用した場合
のＲｆ値は０．３４であった。
［ペプチドのＡＣＥ阻害活性の測定］
実施例１で得たテトラペプチドのＡＣＥ阻害活性の測定
をＢｉｏｃｈｍｉｃａｌ Ｐｈａｒａｍａｃｏｌｏｇ
ｙ ２０＋ ｐ。
をＢｉｏｃｈｍｉｃａｌ Ｐｈａｒａｍａｃｏｌｏｇ
ｙ ２０＋ ｐ。
１９３７（１９７１）に記載のＣｈｅｕｎｇ ＆ Ｃｕ
ｓｈｍａｎの方法に準じて以下の方法によって行った。
ｓｈｍａｎの方法に準じて以下の方法によって行った。
酵素基質： Ｂｚ（ベンジル）−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅ
ｕ ８６ｍｇを水８ｍｆｆとリン酸緩衝液８ｍ（ｌに溶
解した溶液。
ｕ ８６ｍｇを水８ｍｆｆとリン酸緩衝液８ｍ（ｌに溶
解した溶液。
酵 素：うさぎの肺のアセトンパウダー（シグマ社製
Ｎｇを５０ｍｍｏ ｌのリン酸緩衝液１０ｍ１２中で粉
砕した後、遠心分離した上澄液。
Ｎｇを５０ｍｍｏ ｌのリン酸緩衝液１０ｍ１２中で粉
砕した後、遠心分離した上澄液。
上記の酵素基質１００μｇ、酵素溶液１２μａおよび実
施例１で製造したテトラペプチドの所定量を混合し、水
を加えて全体の液量を２５０μｇとした後、３７°Ｃで
３０分間反応させた。次いで、ＩＮ塩酸２５０μｇを加
えて反応を停止させた後・酢酸エチル１．５ｍＱを加え
てＶｏｒｔｅｘミキサーで１５秒撹拌し、それを遠心分
離した。
施例１で製造したテトラペプチドの所定量を混合し、水
を加えて全体の液量を２５０μｇとした後、３７°Ｃで
３０分間反応させた。次いで、ＩＮ塩酸２５０μｇを加
えて反応を停止させた後・酢酸エチル１．５ｍＱを加え
てＶｏｒｔｅｘミキサーで１５秒撹拌し、それを遠心分
離した。
酢酸エチル層から１．０ｍＱを分取して酢酸エチルを留
去し、残渣に蒸留水１ｍＱを加えて溶解させた。溶解液
の２２８ｎｍにおける紫外吸収値（ＯＤ！！Ｉ）を測定
した。
去し、残渣に蒸留水１ｍＱを加えて溶解させた。溶解液
の２２８ｎｍにおける紫外吸収値（ＯＤ！！Ｉ）を測定
した。
阻害率は、阻害剤なしで上記と同様に反応させたときの
００２２ｍを１００％とし且つ反応開始前（反応時間０
分の時）のＯＤ２□を０％とした時に、阻害率が５０％
になる時の阻害剤（実施例１のテトラペプチド）の濃度
ＩＣ，、とじて求めた。
００２２ｍを１００％とし且つ反応開始前（反応時間０
分の時）のＯＤ２□を０％とした時に、阻害率が５０％
になる時の阻害剤（実施例１のテトラペプチド）の濃度
ＩＣ，、とじて求めた。
その結果を下記の表に示す。
また、参考のため既知の阻害剤であるブラジキニン・ボ
テンシエーターＣについても上記と同様にして阻害率を
求めた。その結果を下記の表に併記する。
テンシエーターＣについても上記と同様にして阻害率を
求めた。その結果を下記の表に併記する。
［ペプチドのＡＣＥ阻害活性（＋Ｃ，。）］ペプチド
Ｉｃ、。（μＭ）
Ｈ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｇｉｎ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ａｒｇ
−ＯＨ（本発明） １７ブラジキニン・ポテン
シエーターＣ２０上記表の結果から、本発明のＡＣＥ阻
害剤は既知のＡＣＥ阻害剤ブラジキニン・ポテンシェー
ク−Ｃに比べて低濃度でＩＣ，。を達成できることがわ
かる。
−ＯＨ（本発明） １７ブラジキニン・ポテン
シエーターＣ２０上記表の結果から、本発明のＡＣＥ阻
害剤は既知のＡＣＥ阻害剤ブラジキニン・ポテンシェー
ク−Ｃに比べて低濃度でＩＣ，。を達成できることがわ
かる。
実施例 ２
［合成によるテトラペプチドの製造］
市販のＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−Ｒｅｓｉｎ（置換率
０．３ｍｅｑ／ｇ）１．ｏｇを、４５％トリフルオロ酢
酸および２．５％アニソールを含む塩化メチレン２０ｍ
（２を予め入れであるバイオサーチ社のペプチド合成装
置ＳＡＭ ＴＷＯ２の反応槽に入れ、室温で２５分間反
応させてＢｏｃ基を除去した。
０．３ｍｅｑ／ｇ）１．ｏｇを、４５％トリフルオロ酢
酸および２．５％アニソールを含む塩化メチレン２０ｍ
（２を予め入れであるバイオサーチ社のペプチド合成装
置ＳＡＭ ＴＷＯ２の反応槽に入れ、室温で２５分間反
応させてＢｏｃ基を除去した。
次ｌこ、Ｂｏｃ基の除去されたＡｒｇ（Ｔｏｓ） −Ｒ
ｅｓ ｉｎを塩化メチレンで洗浄し、次いで１０％のイ
ソプロピルエチレンアミンを含む塩化メチレンにより中
和した後、更に塩化メチレンで洗浄した。
ｅｓ ｉｎを塩化メチレンで洗浄し、次いで１０％のイ
ソプロピルエチレンアミンを含む塩化メチレンにより中
和した後、更に塩化メチレンで洗浄した。
この樹脂に０．４Ｍ Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ジメチルホルム
アミド溶液５ｍｏ、、０．４Ｍジイソプロピルカルボジ
イミド−塩化メチレン溶液５ｍ１２を混合して反応槽に
入れて室温で２時間撹拌下に反応させた。
アミド溶液５ｍｏ、、０．４Ｍジイソプロピルカルボジ
イミド−塩化メチレン溶液５ｍ１２を混合して反応槽に
入れて室温で２時間撹拌下に反応させた。
上記で得られた樹脂を、順にジメチルホルムアミド、塩
化メチレン、ジイソブロビルユチルアミンを１０％含有
する塩化メチレン、塩化メチレンおよび塩化メチレン／
ジメチルホルムアミド混合液で洗浄して、Ｂｏｃ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）を得Ｉこ。
化メチレン、ジイソブロビルユチルアミンを１０％含有
する塩化メチレン、塩化メチレンおよび塩化メチレン／
ジメチルホルムアミド混合液で洗浄して、Ｂｏｃ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）を得Ｉこ。
引き続き上記と同様にしてＢｏｃ基の除去、Ｂｏｃアミ
ノ酸のカップリングを繰り返してＬｅｕ−ＧｌｎＰｒｏ
−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−樹脂からなる生成物を得た。
ノ酸のカップリングを繰り返してＬｅｕ−ＧｌｎＰｒｏ
−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−樹脂からなる生成物を得た。
この樹脂を１０％のアニソールを含有するフッ化水素２
ＯｍＱ中でＯ′Ｃで１時間撹拌してペプチドを樹脂から
遊離させた。その後、フッ化水素を減圧留去し、残渣を
３０％酢酸で抽出し、それを凍結乾燥して粗ペプチド１
５０ｍｇを得た。これをＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉ
ｌ ５Ｃ＋ｍ）による逆相りＤ’？トゲラフイーによ
り精製して最終生成物７５ｍｇを得た。そのアミノ酸組
成（モル比）は、Ｌｅｕ ： Ｇｌｕ：Ｐｒｏ：Ａｒｇ
＝ １ ＋ ｌ ： １ ： ｌであった。更に、実施
例Ｉで使用したのと同じプロティン／−ケンサーにより
分析した結果、Ｈ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｐｒ。
ＯｍＱ中でＯ′Ｃで１時間撹拌してペプチドを樹脂から
遊離させた。その後、フッ化水素を減圧留去し、残渣を
３０％酢酸で抽出し、それを凍結乾燥して粗ペプチド１
５０ｍｇを得た。これをＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉ
ｌ ５Ｃ＋ｍ）による逆相りＤ’？トゲラフイーによ
り精製して最終生成物７５ｍｇを得た。そのアミノ酸組
成（モル比）は、Ｌｅｕ ： Ｇｌｕ：Ｐｒｏ：Ａｒｇ
＝ １ ＋ ｌ ： １ ： ｌであった。更に、実施
例Ｉで使用したのと同じプロティン／−ケンサーにより
分析した結果、Ｈ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｐｒ。
Ａｒｇ−ＯＨであることが判明した。
また、該生成物の薄層クロマトグラフィーのＲｆＨは実
施例１の生成物と同様１： ０ 、３４であっｌこ 。
施例１の生成物と同様１： ０ 、３４であっｌこ 。
［発明の効果〕
本発明のＡＣＥ阻害剤は、極めて少量の投与でＡＣＥの
活性を阻害して血圧降下および血圧上昇抑制を達成する
ことができる。
活性を阻害して血圧降下および血圧上昇抑制を達成する
ことができる。
また、本発明のＡＣＥ阻害剤は、白色の水溶性粉末であ
るために、そのままでまたは水等に溶解させて経口投与
および非経口投与のいずれの方法によっても極めて簡単
に投与することができる・ その上、本発明の新規なテトラペプチドＬｅｕ−Ｇｌｎ
−Ｐｒｏ−Ａｒｇは、４＠のアミノ酸が配列しただけの
極めて簡単な構造を有する低分子量化合物であるため、
化学合成ｊこよっても簡単Ｉこ製造することができ、し
かも投与した場合に体内での吸収性がよく高い血圧降下
作用を示す。
るために、そのままでまたは水等に溶解させて経口投与
および非経口投与のいずれの方法によっても極めて簡単
に投与することができる・ その上、本発明の新規なテトラペプチドＬｅｕ−Ｇｌｎ
−Ｐｒｏ−Ａｒｇは、４＠のアミノ酸が配列しただけの
極めて簡単な構造を有する低分子量化合物であるため、
化学合成ｊこよっても簡単Ｉこ製造することができ、し
かも投与した場合に体内での吸収性がよく高い血圧降下
作用を示す。
第１図は、実施例１において小麦グルテンを加水分解し
て得られたペプチド混合物を高速液体クロマトグラフィ
ーに通し、その吸着成分を直線濃度勾配を有する特定の
溶離液により溶離した時に溶離してくる成分の吸光度（
ＯＤ２１５）を測定したフローチャートである。
て得られたペプチド混合物を高速液体クロマトグラフィ
ーに通し、その吸着成分を直線濃度勾配を有する特定の
溶離液により溶離した時に溶離してくる成分の吸光度（
ＯＤ２１５）を測定したフローチャートである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）下記の式 Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ で表わされるペプチドおよびその塩。 ２）下記の式 Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ で表わされるペプチドまたはその塩を有効成分とするア
ンジオテンシン変換酵素阻害剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2205000A JP2871031B2 (ja) | 1990-08-03 | 1990-08-03 | 新規なペプチド及びアンジオテンシン変換酵素阻害剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2205000A JP2871031B2 (ja) | 1990-08-03 | 1990-08-03 | 新規なペプチド及びアンジオテンシン変換酵素阻害剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0491097A true JPH0491097A (ja) | 1992-03-24 |
| JP2871031B2 JP2871031B2 (ja) | 1999-03-17 |
Family
ID=16499794
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2205000A Expired - Fee Related JP2871031B2 (ja) | 1990-08-03 | 1990-08-03 | 新規なペプチド及びアンジオテンシン変換酵素阻害剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2871031B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007119590A1 (ja) * | 2006-03-31 | 2007-10-25 | Nisshin Pharma Inc. | 小麦由来の血圧低下用組成物 |
| JP2008037832A (ja) * | 2006-08-09 | 2008-02-21 | Nisshin Pharma Inc | 血圧低下作用を有するペプチド |
| WO2010082367A1 (ja) | 2009-01-19 | 2010-07-22 | キッコーマン株式会社 | アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド |
| JP2014524913A (ja) * | 2011-07-07 | 2014-09-25 | エージェンシー・フォー・サイエンス・テクノロジー・アンド・リサーチ | 抗アミロイド形成性αヘリックス破壊性超小型ペプチド治療薬 |
-
1990
- 1990-08-03 JP JP2205000A patent/JP2871031B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007119590A1 (ja) * | 2006-03-31 | 2007-10-25 | Nisshin Pharma Inc. | 小麦由来の血圧低下用組成物 |
| JPWO2007119590A1 (ja) * | 2006-03-31 | 2009-08-27 | 日清ファルマ株式会社 | 小麦由来の血圧低下用組成物 |
| JP2008037832A (ja) * | 2006-08-09 | 2008-02-21 | Nisshin Pharma Inc | 血圧低下作用を有するペプチド |
| WO2010082367A1 (ja) | 2009-01-19 | 2010-07-22 | キッコーマン株式会社 | アンジオテンシン変換酵素阻害ペプチド |
| US9006171B2 (en) | 2009-01-19 | 2015-04-14 | Kikkoman Corporation | Angiotensin converting enzyme inhibitory peptide |
| JP2014524913A (ja) * | 2011-07-07 | 2014-09-25 | エージェンシー・フォー・サイエンス・テクノロジー・アンド・リサーチ | 抗アミロイド形成性αヘリックス破壊性超小型ペプチド治療薬 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2871031B2 (ja) | 1999-03-17 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |