JPH049254B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、生化学的に感度の高い半導体センサ
ー、測定装置および該センサーを使用するアナラ
イトの測定方法に関する。

（従来の技術および解決すべき課題） 免疫検定法は、ハプテン、抗原および抗体〔す
べて広くアナライト（analyte）と称される〕の
同定と定量用として通常使用されている。すべて
の免疫検定法の基本原理は、反応対（例えば、抗
原／抗体、ハプテン／抗体等）の成分間の特異結
合に示され、そしていくつかの場合に、一成分が
ある種の外的方法によつて容易に分析されるよう
に標識づけされる。

放射線免疫検定法（RIA）は、ラジオアイソト
ープを特異結合対の成分の一つの標識として使用
することは基盤となつている。ラジオアイソトー
プ標識成分は、つぎに適当な機器を用い、アイソ
トープにより放射される放射線をカウントするこ
とにより測定される。

特異結合対の一成分を標識づけする他の方法も
開発されている。酵素標識および螢光標識が最近
使用されてきており、それぞれ、酵素免疫検定法
（EIA）および螢光免疫検定法（FIA）と称され
ている。また、適当な試薬および機器を使用し
て、これらの標識は、液状媒体中におけるアナラ
イトの測定に利用され得る。この基本的操作に対
して多くの変形法も利用され得るが、反応、分離
および標識の検出の段階を必要とするものが多
い。

極く最近になつて、電気化学的センサーはこれ
らの操作によつて得られる感度を改善し、かつ、
簡易化するためのに鋭意検討されてきている。基
本的には、それらの特異結合対の一成分に対する
標識として使用される酵素の反応生成物を検出す
るためにイオン選択的電極が採用されている。

また、特開昭55−10546号公報には、電界トラ
ンジスターを利用した免疫センサーにおいて、抗
原または抗体を絶縁膜表面に付着させる方法を改
良したセンサーが記載されている。

本発明は、特異結合対の標識成分の調製や検定
系からの該成分の分離とか、その後の検出等を除
くことを目的とするものであり、それによつて免
疫検定法を多いに簡易化し得る。より詳細には、
本発明は、以下の説明に示される生化学的に感度
高い半導体装置の利用による、液状媒体中のアナ
ライトの測定方法の新規、かつ、有用な改良法に
関する。

（課題を解決するための手段） 本発明は、液状媒体中におけるアナライトの測
定に用いられる装置を提供する。より詳細には、
本発明は、電気的に半導体である物質、好適には
半導電性有機重合体よりなるセンサーおよびその
装置に関するものであつて、アナライトの特異結
合物質への結合がこの半導電性物質の電気的半導
電性を実測し得る程度に変化させる方法でアナラ
イトの特異結合物質が好適に当該物質に固定され
てなるものである。さらに、本発明は、かかる装
置を使用する液状媒体中におけるアナライトの存
在の検出方法を提供する。

本発明は次のように特定される。

(a) 絶縁構造物と、 (b) 媒体にさらされるために該絶縁構造物上に設
けられ、アナライト用の特異結合物質を含むポ
リアセチレン製半導電性有機重合体よりなる活
性部分を有するエレメント手段と、 (c) 該エレメントに接触する２電極を含む少なく
とも２以上の電極とからなることを特徴とする
媒体中のアナライトの測定用の可変抵抗センサ
ー。

(a) ポリアセチレン製半導電性有機重合体のエ
レメントを製造し、 (b) 該エレメントを特異結合物質で処理し、 (c) 該エレメントを媒体に曝らし、 (d) 処理されたエレメントの電気特性の変化を
測定する段階よりなることを特徴とする 媒体中のアナライトのタイプおよび量を同定する
方法。

(A)(a) 絶縁構造物と、 (b) 媒体にさらされるために該絶縁構造物上に
設けられ、アナライト用の特異結合物質を含
むポリアセチレン製半導電性有機重合体より
なる活性部分を有するエレメント手段と、 (c) 該エレメントに接触する２電極を含む少な
くとも２以上の電極とからなる媒体中のアナ
ライトの測定用の第１の可変抵抗センサー
と、 (B)(a) 絶縁構造物と、 (b) 媒体にさらされるために該絶縁構造物上に
設けられ、アナライト用の特異結合物質を含
むポリアセチレン製半導電性有機重合体より
なる活性部分を有するエレメント手段と、 (c) 該エレメントに接触する２電極を含む少な
くとも２以上の電極とからなる媒体中のアナ
ライトの測定用の第２の可変抵抗センサー
と、 (C) 該第１の可変抵抗センサーと該第２の可変抵
抗センサー間の抵抗測定用の抵抗比較手段と からなることを特徴とする媒体中のアナライト
の測定用の装置。

特定のあらゆるアナライトに対する多くの特異
結合物質は基本的には生物学的であるので、この
装置は、生物化学的に感度の高い半導電的装置ま
たはBSSDと称される。これらの特異結合物質
は、一般に有機化学的種類からなり、測定可能な
性質（一つは特殊な電荷である）を呈する。さら
に、特異結合物質に対して、その電荷は特定アナ
ライトへの結合の結果変化するのであり、結合物
質およびその特異なアナライトの例としては抗体
およびその特異な抗原がある。本発明によれば、
特異な抗体（結合物質）と抗原（アナライト）と
の結合は、結合反応物質の一つまたは二つの成分
の電荷変化を検出、測定することにより定量され
る。特異結合系の二成分のどちらか片方を電場に
よつて影響される物質に極めて接近して位置させ
ることによつて、結合反応の結果としての電場の
変化はその物質の性質に変化を与えることにな
る。もしこの物質の性質が測定し得るものであれ
ば、この結合反応も測定可能となる。

（作用） 本発明のセンサー、装置およびその操作は、第
１，２および４図に示されているように各エレメ
ント毎にそれぞれ最適に説明され、また、センサ
ーおよび装置の電気的操作は第３図に示したとお
りに説明される。

センサーの中心部を占めるエレメント１０は、
半導電性有機重合体の細片よりなる。これにはあ
らゆる半導電性有機重合体が用いられる。この比
較的新規な分類の化合物には、ポリアセチレン、
ポリ（ｐ−フエニレン）、ポリピロール、ポリ
（ポリアルキルポリジイン）例えばポリ（ヘプタ
−１，６−ジイン）、ポリ（ｐ−フエニレンスル
フイド）、ポリメタロフタロシアニン類、好まし
くはポリアルミノフタロシアニンフルオリドおよ
びポリフタロシアニンシロランがある。このリス
トした半導電性有機重合体は、限定するためでは
なく、単なる例示にすぎない。

前記有機重合体は、ドープしていない状態かそ
れとも通常採用されるドーパント、例えば五フツ
化砒素、ヨウ素、過塩素酸塩等を含有させて用い
られる。

エレメント１０は、結合試薬にさらされる。こ
のエレメントは、適当な緩衝液中の結合試薬水溶
液中に浸漬するだけで十分である。本明細書でい
う「結合試薬」なる語には、生化学分野で通常理
解されているタイプのカツプリング反応、抗原／
抗体反応というようなものを遂行する物質が全て
包含される。

結合試薬の代表的なものは、IgGに対する抗
体、酵素、例えばβ−ガラクトシダーゼ、コンカ
ナバリンＡ、リムリン、 補助因子タイプの酵素、例えばイソクエン酸塩
デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナー
ゼ、NAD（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド）、 酵素基質、例えばイソクエン酸塩、 酵素阻害剤、例えばβ−ガラクトシダーゼ阻害
剤、 ホルモン、例えばチロキシン、 酵素基質類似体、例えばＯ−ニトロフエニル−
β−Ｄ−ガラクトピラリシド、 抗原、例えばヒトの絨毛膜ゴナドトロピンであ
る。ここでのこれらの例示は、臨界的なものでは
なく、また、制限するためのものではない。

本発明の例示は重合体エレメントと結合試薬と
の簡単な接触処理を開示するだけであるが、ある
種の条件下でエレメント基質の活性化処理がある
種の結合試薬との結合に必要なことは当該分野の
技術者にとつては明白であろう。そして、このよ
うな反応は、一般的に行なわれており、当該分野
の技術者にもよく知られており、本発明の技術的
範囲にも包含される。

エレメント１０を結合試薬で処理する通常の工
程では、新たに合成された重合体は、所望の結合
試薬の溶液を含む適当な緩衝液中に置かれ、約８
〜約24時間室温下に保温され、食塩水で洗浄さ
れ、窒素下に貯蔵される。窒素下貯蔵は必須とい
うものではないが、多くの結合試薬は酸素に敏感
であり、その活性が最善に維持されるにはできる
だけこの物質に露出されるのを減ずるとよいこと
が知られている。

本発明センサーの一実施態様は第１図に示され
ている。第１図において、エレメント１０は半導
電性物質およびこれに結合した結合試薬を含み、
絶縁材料１４上に設けられている。ここで、電極
である電気接点２２および２４がエレメント１０
に施されている。装置が作動し、アナライト溶液
である媒体１２がその上に置かれると、電極であ
る付加的な電気接点２６，２８が媒体１２に適用
される。ここで、付加的な電気接点とは、媒体の
伝導度の測定用にまたは電界トランジスター効果
を利用してエレメント間の抵抗変化を増幅させる
ために用いられる。これは第４図によつて理解さ
れる。即ち、その右手部分で接点２２，２４の位
置がエレメント１０と絶縁用キヤリア１４とに関
連づけられる。その左手側では接点２６を示す同
様の配置が示される。接点２８は同様に適用され
ることになる。この接点が金メツキまたは金のワ
イヤでつくられるならば、良好な接合のために特
に好ましい。

センサーの最高能力で使用する場合には、第２
図に示されるように僅かにより複雑な装置が用い
られる。図面の符号の最後の二つの数字は第１図
での対応した二つの数字に対応している。

かくして、第２図は、半導電性有機重合体およ
び結合試薬からなるエレメント１１０を備える絶
縁材料からなる基材１１４を示す。エレメント１
１０の他の表面には、それぞれ連結されたリード
１２３，１２５を有する一対の金属接点１２２，
１２４が設けられている。凹部１１１の低い部分
は、Ｌ型断面を有する円盤形の絶縁用エレメント
１６２によつて形成される。凹部１１１の反対側
になるように位置する円盤エレメント１６２の上
に、それぞれ接続せしめられたリード１２７およ
び１２９を有する電極１２６，１２８がある。こ
れらの接点１２６，１２８は凹部の壁面のほんの
僅かな部分しか占めず、円盤エレメント１６４に
より絶縁して囲まれており、アナライト１１２を
含む媒体はこのようにしてつくられた凹部１１１
の中に配せられる。

センサーはエレメントの電気的特性変化の測定
用抵抗比較手段、例えば、第３図に示されるホイ
ートストンブリツジ回路と組合わせて本発明の媒
体中のアナライトの測定用の装置を構成する。こ
の回路で正の電位が接点３２，３６の間に与えら
れる。一つのエレメント１０は接点３２，３４の
間につなぎ、同様なエレメントは接点３６，３８
の間につなぐ。接点３４は接合点４８に連結し、
これに抵抗器４２の一端を連結する。この抵抗器
は、所望ならば可変抵抗器がよい。同様に、別の
抵抗器４４、これも可変抵抗器が好ましいが、そ
の一端も接点４６で連結し、これに接点３８が連
結せしめられる。接合４６，４８は微分増幅器５
２に連結し、これはメーター装置５４を通つて大
地につながつている。

本発明の装置の操作において、３２／３４およ
び３６／３８にそれぞれ連結している二つのエレ
メント１０は、通常の方法でバランスされてい
る。アナライトを含む媒体が、ついで凹部１１１
に配置され、そしてこの当該エレメントの抵抗変
化が測定される。抵抗変化は、時間と濃度のフア
クターであることが見い出されており、かくして
標準液での校正が必要となる。さらに測定の感度
を上げることは、付加的な電気接点２６または２
８のどちらかに電圧をかけるか、または電圧が同
じでも同時に両方にかけることによつて可能であ
る。また、所望ならば、付加的な電気接点２６お
よび２８は、通常の方法で媒体の伝導度測定に使
用される。

「アナライト」なる用語は、ここでは抗原、抗
体、ハプテン、酵素、酵素基質、酵素基質類似
体、凝集素、レクチン、酵素補助因子、酵素阻害
剤、ホルモン等である。

実 験 調製Ａ ヤギ抗−ウサギIgG血清のIgGフラクシヨンは、
ガーヴエイ、ジエイ．エス（Garvey，J.S.）ら
の「Methods in Immunology（免疫学方法）」第
193〜198頁（WA.Benjamin社1980年刊）に記述
されている、33％硫酸アンモニウム沈澱および
DEAEセルロースクロマトグラフイの併用によつ
て単離された。さらに、必要により前記文献に開
示される方法であるアフイニテイクロマトグラフ
イ技術による精製を行なつた。

調製AA アセチレンのトランス型重合体を、チーグラー
型触媒を用い、イトーらの「ジヤーナル、オブ、
ポリマー、サイエンス（Journal of Polymer
Science）」第12巻第11頁（1974年）の操作によつ
て調製した。

調製BB ポリ（Ｐ−フエニレン）は、Shackletteらの
Syn.Met.第１巻第307頁（1980年）の方法により
調製した。

調製CC ポリピロールは、カナザワらのSyn.Met.第１
巻第329頁（1980年）の方法により調製した。

調製DD ポリ（ヘプター１，６−ジイン）は、ギブソン
（Gibson）らのジヤーナル、オブ、ケミカルソサ
エテイ（J.Chem.Soc.）（Chem.Comm）426
（1980年）の方法により調製した。

調製EE ポリ（ｐ−フエニレンスルスイド）ヘキサフル
オロアルセネートは、ラボルト（Rabolt）らの
ジヤーナル、オブ、ケミカル、ソサエテイ（J.
Chem.Soc.）（Chem.Comm）347（1980年）の方
法により調製した。

参考例 Ｉ 約４×10mmの新たに合成されたポリアセチレン
の細片を、精製されたヤギ抗ウサギIgG5mg／ml
を含有するPH9.5の0.05Mの炭酸塩−重炭酸塩緩
衝液に置き、室温下に一晩保持した。ポリアセチ
レン抗体細片は、ついで食塩水で洗浄され、窒素
下に貯えられた。

参考例 新たに合成されたポリ（ｐ−フエニレン）の細
片（約４×20mm）を、ヒトの絨毛膜ゴナドトロピ
ンに対し単クローン性抗体を５mg／ml含有するPH
9.5の0.05Mの炭酸塩−重炭酸塩緩衝液中に置き、
室温下に一晩保持した。ポリ（ｐ−フエニレン）
細片は、ついで食塩水で洗浄され、窒素下に貯え
られた。

参考例 新たに合成されたポリピロールの細片（約４×
20mm）を、アビジン５mg／mlを含むPH9.5の
0.05Mの炭酸塩−重炭酸塩緩衝液中に置き、室温
下に一晩保持した。ポリピロール／アビジン細片
は、ついで食塩水で洗浄され、窒素下に貯えられ
た。

参考例 新たに合成されたポリ（ヘプタ−１，６−ジイ
ン）の細片（約４×20mm）を、β−ガラクトシダ
ーゼ５mg／ml含有のPH9.5の0.05Mの炭酸塩−重
炭酸塩緩衝液中に置き、室温下に一晩保持した。
ポリ（ヘプタ−１，６−ジイン）／β−ガラクト
シダーゼ細片は、ついで食塩水で洗浄され、窒素
下に貯えられた。

参考例 Ｖ 新たに合成されたポリ（ｐ−フエニレンスルフ
イド）ヘキサフルオロアルセネート（約４×20
mm）を、リヌリン５mg／ml含有のPH9.5の0.05M
の炭酸塩−重炭酸塩緩衝液中に置き、室温下に一
晩保持した。ポリ（ｐ−フエニレンスルフイド）
ヘキサフルオロアーセネート／リヌリン細片は、
ついで食塩水で洗浄され、窒素下に貯えられた。

参考例 新たに合成されたポリアルミノタロシアニンフ
ルオリドの細片（約４×20mm）を、NAD5mg／ml
含有のPH9.5の0.05Mの炭酸塩−重炭酸塩緩衝液
中に置き、室温下に一晩保持した。ポリアルミノ
タロシアニンフルオリドは、ついで食塩水で洗浄
され、窒素下に貯えられた。

実施例 １ 参考例Ｉによつて調製された一対のエレメント
は、第４図に示される装置の右手側部の一対の装
置に連結し、そして第３繊の回路に連続した。ブ
リツジ回路はバランスされ、そしてウサギIgGの
PBS緩衝液（IgG500μg／ml）10マイクロリツト
ル（μ）を一つのエレメントに入れ、同量の
PBS緩衝液を他のエレメントに入れ、金属性接
点エレメント２２および２４とどちらのサンプル
も接触しないように留意した。回路のエレメント
４４は可変トランスであり、その読みはＴ＝０か
らＴ＝１時間まで以下の如くであつた。

Ｔ＝０ 470 Ｔ＝１分 498 Ｔ＝２分 488 Ｔ＝３分 563 Ｔ＝９分 731 Ｔ＝20分 687 Ｔ＝１時間 587 供給した電圧は5.1ボルトであつた。

実験は供給電圧5.0ボルトで、20μのIgGを用
いて繰り返し、以下の読みが得られた。

Ｔ＝０ 378 Ｔ＝１分 358 Ｔ＝５分 403 Ｔ＝10分 499 Ｔ＝20分 499 Ｔ＝30分 435 実施例 ２ 参考例Ｉにおけるように、ポリアセチレン抗体
の細片はヤギ抗−ウサギIgG調整法を用いて調製
し、そしてテフロンホールダーに設置した。３mm
直径にカツトアウトされた網はポリアセチレンフ
イルム上に拡げ、水性ゼラチンフイルムを乗せる
ために用いた。二つの電導性クランプを物理的に
も電気的にもゼラチンフイルムと連結しないよう
に留意した。特殊アラナイトの測定は、実施例１
で示されたと同じ装置で行なつた。

実施例 ３ 参考例におけるように、ポリアセチレン抗
体、ゼラチンフイルムの細片を調製した。ただ
し、付加的な電気的連結は、ゼラチンフイルム表
面に白金ワイヤ片を設置することによつて形成し
た。この例では、装置は原理的には電界効果トラ
ンジスターと同様である。この付加的な電気的連
結は、ポリアセチレン抗体フイルムを通る電子の
流れに対し、直角に電圧をかけることになる。こ
の装置を用いてウサギIgGをヤギ抗ウサギIgG抗
体に結合させることが、実施例１で示されたのと
同様に確認された。

以上の例の操作は第２図の装置を用いても繰り
返された。その場合、装置の接触点１２６に対し
ては２〜10ボルトが与えられた。

実施例 ４ 以上の如く示された本発明から、同じことが多
数の方法において変えられることも明白であろ
う。このような変更は本発明の思想および範囲か
ら離れたものと見倣されるのではなく、このよう
な変型はすべて以下の請求の範囲の範囲内に含ま
れるものである。

（発明の効果） 本発明は、アナライトの測定に用いられる装置
および測定方法に関するものであり、特異な結合
物質（抗体）とアナライト（抗原）との結合が結
合反応物質の１つまたは２つの成分の電荷変化を
検出、測定することにより簡便に定量できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明センサーの一実施態様を示すエ
レメント部の断面図、第２図は他の実施態様を示
す断面図、第３図は本発明装置の操作用回路図で
あり、また第４図は本発明センサーのキヤリヤ部
分の斜視図である。 １０……エレメント、１２……媒体、１４……
絶縁材料、２２，２４，２６，２８，３２，３
４，３６，３８……接点、４６，４８，５０……
接合点、５２……増幅器、５４……メーター装
置、１１０……エレメント、１１１……凹部、１
２２，１２４……接点、１２３，１２５，１２
７，１２９……リード、１２６，１２８……電
極、１６２，１６４……円盤エレメント。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (a) 絶縁構造物と、 (b) 媒体にさらされるために該絶縁構造物上に設
   けられ、アナライト用の特異結合物質を含むポ
   リアセチレン製半導電性有機重合体よりなる活
   性部分を有するエレメント手段と、 (c) 該エレメントに接触する２電極を含む少なく
   とも２以上の電極とからなることを特徴とする
   媒体中のアナライトの測定用の可変抵抗センサ
   ー。 ２ 電極が四つであり、二つの電極は該エレメン
   トに接続されており、残りの二つの電極は該媒体
   の伝導度の測定用に該媒体に接触する特許請求の
   範囲第１項に記載のセンサー。 ３ 電極が二つであり、該エレメントに接続され
   ている特許請求の範囲第１項に記載のセンサー。 ４ 電極が三つであり、二つの電極は該エレメン
   トに接続されており、残りの一つの電極は電界ト
   ランジスター効果を生じるように該媒体に接触す
   る特許請求の範囲第１項に記載のセンサー。 ５ 特異結合物質が抗体、抗原、酵素、酵素基
   質、酵素基質類似体、凝集素、レクチン、酵素補
   助因子、酵素阻害剤およびホルモンよりなる群か
   ら選ばれたものである特許請求の範囲第１項また
   は第４項に記載のセンサー。 ６ (a) ポリアセチレン製半導電性有機重合体の
   エレメントを製造し、 (b) 該エレメントを特異結合物質で処理し、 (c) 該エレメントを媒体に曝らし、 (d) 処理されたエレメントの電気特性の変化を測
   定する段階よりなることを特徴とする 媒体中のアナライトのタイプおよび量を同定する
   方法。 ７ 二つの電極を該エレメントと接触させ、かつ
   該電極間の電気特性の変化を測定する特許請求の
   範囲第６項に記載の方法。 ８ 三つの電極を用い、二つの電極は該エレメン
   トと接触させ、残りの一つの電極は電界トランジ
   スター効果を生じるように該媒体に接触する特許
   請求の範囲第７項に記載の方法。 ９ 特異結合物質が抗体、抗原、酵素、酵素基
   質、酵素基質類似体、凝集素、レクチン、酵素補
   助因子、酵素阻害剤およびホルモンよりなる群か
   ら選ばれたものである特許請求の範囲第６，７項
   ないし第８項のいずれか一つに記載の方法。 １０ (A)(a) 絶縁構造物と、 (b) 媒体にさらされるために該絶縁構造物上に
   設けられ、アナライト用の特異結合物質を含
   むポリアセチレン製半導電性有機重合体より
   なる活性部分を有するエレメント手段と、 (c) 該エレメントに接触する２電極を含む少な
   くとも２以上の電極とからなる媒体中のアナ
   ライトの測定用の可変抵抗センサーと、 (B) (a) 絶縁構造物と、 (b) 媒体にさらされるために該絶縁構造物上に
   設けられ、アナライト用の特異結合物質を含
   むポリアセチレン製半導電性有機重合体より
   なる活性部分を有するエレメント手段と、 (c) 該エレメントに接触する２電極を含む少な
   くとも２以上の電極とからなる媒体中のアナ
   ライトの測定用の可変抵抗センサーと、 (C) 該第１の可変抵抗センサーと該第２の可変抵
   抗センサー間の抵抗測定用の抵抗比較手段と からなることを特徴とする媒体中のアナライトの
   測定用の装置。 １１ 電極が八つであり、二つの電極は該第１の
   可変抵抗センサーのエレメントに、二つの電極は
   該第２の可変抵抗センサーのエレメントに接続さ
   れ、二つの電極は該第１の可変抵抗センサーの媒
   体の伝導度の測定に媒体にそして残りの二つの電
   極は該第２の可変抵抗センサーの媒体の伝導度の
   測定に媒体に接触する特許請求の範囲第１０項に
   記載の装置。 １２ 電極が四つであり、二つの電極は該第１の
   可変抵抗センサーのエレメントに、残りの二つの
   電極は該第２の可変抵抗センサーのエレメントに
   接続されている特許請求の範囲第１０項に記載の
   装置。 １３ 電極が六つであり、二つの電極は該第１の
   可変抵抗センサーのエレメントに、二つの電極は
   該第２の可変抵抗センサーのエレメントに接続さ
   れており、一つの電極は電界トランジスター効果
   を生じるように該第１の可変抵抗センサーの媒体
   に残りの一つの電極は電界トランジスター効果を
   生じるように該第２の可変抵抗センサーの媒体に
   接触する特許請求の範囲第１０項に記載の装置。 １４ 特異結合物質が抗体、抗原、酵素、酵素基
   質、酵素基質類似体、凝集素、レクチン、酵素補
   助因子、酵素阻害剤およびホルモンよりなる群か
   ら選ばれたものである特許請求の範囲第１０〜１
   ３項のいずれか１項に記載の装置。