JPH0499483A - 動物細胞の潅流培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、浮遊性の動物細胞を長期間高密度で培養する
方法に関する。

［従来の技術］ 動物細胞は、リンパ球系の細胞のように、浮遊状態で増
殖する細胞と、培養容器表面やコラーゲンマトリックス
などに付着して増殖する細胞とに、生育上の性質から分
類できる。浮遊性の細胞としては、ハイブリドーマなど
物質生産上有用な細胞が多いため大量培養の方法が多数
考案されている。

−船釣には細胞培養は、培養液１ｄ当りの密度をどの程
度まであげることができるかが最大の課題である。通常
の培養条件では動物細胞の場合は、培養液１Ｉ２１！当
り１０５〜１０６個程度である。このために培養液を定
期的に交換し、また、ガス置換を行うことにより、１０
６〜１０″の細胞密度を達成することが可能となること
が知られている。

このために連続的に培養液を交換するための方法として
、培養液を常時循環潅流し、この循環回路において培養
液を交換し、また培地中に生産された有用物質をあわせ
て回収する方法が開発されている。当初この技術は、微
生物の高密度培養に使用されたのが始まりである０例え
ば特開昭６１−８８７２号公報（特公昭６３−６３１９
３号公報）には、乳酸菌の高密度培養方法が開示されて
いる。この方法によれば乳酸菌の培養槽より、培養液を
抜き出し、ホローファイバー濾過膜により低分子物質と
菌体とを分離し、菌体は新鮮培地とともに培養槽に戻し
、またホローファイバー濾過膜を定期的に逆洗浄するこ
とを特徴としている。この方法を浮遊性の動物細胞に応
用した例として、特開昭６１−２５７１８１号公報には
、抗体生産ハイブリドーマを培養し、ホローファイバー
濾過膜を使用し、培地交換を行い、又ホローファイバー
に濾過膜を無血清培地により定期的に逆洗する方法が開
示されている。この方法によれば２２日間ハイブリドー
マを培養し、培養液１１１１当り１．３Ｘ１０’個の細
胞密度に到達したと述べている。このように浮遊性細胞
培養においては培養液の潅流とホローファイバー膜によ
る培地の交換、ホローファイバー膜の逆洗浄は、高密度
培養におけるポイントとも言える。　しかしこのような
ホローファイバー膜を使用する方法は、装置の膜面積を
上げる上では、有効ではあるが、細胞を含む培養液が、
ホローファイバーの細管内を流れるため、細胞に強い剪
断力が加わり細胞破砕の原因となることが指摘されてい
る。また濾過面に細胞が付着し、めづまりをおこし、長
期培養が困難となる事例がしばしば発生している。この
ため逆洗浄による効果を発揮させるために膜の孔サイズ
は、分子量１０，０００以下カツトの能力を有するよう
な小孔の濾過膜を使用することが一般的とされていた。

しかし、このようなサイズの孔を有する膜を使用した場
合は培養液中に分泌生産される蛋白質や抗体など、高分
子物質の分離・回収は効率よくできないなどの問題点が
指摘されていた。

ちなみに抗体の代表的なサブクラスであるＩｇＧは、Ｍ
Ｗ１４６，０００　ｔ−ＰＡは６９．０００など有用物
質には分子量の高いものが多い。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明者らは浮遊性動物細胞の、長期連続培養方法と物
質生産について検討を行って来たところ、ホローファイ
バーによる濾過の欠点を改良した新しい培地交換と濾過
膜の最適な組合わせを見出し、本発明を完成するにいた
った。

従って本発明は、濾過膜を使用し浮遊性細胞を長期間連
続培養する場合の最適な培養方法を従供することを課題
とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明においては浮遊性動物細胞を長期連続培養するに
当り、細胞の浮遊する培養液の１部をぬきとり、培養液
と細胞を濾過膜を介して分離し、細胞を新鮮培地ととも
に培養槽に戻して連続的に培地交換を行う培養方法であ
って、 ■　細胞の分離に０．２μｍ〜０．８μｍの孔を有する
平板濾過膜を使用し、 ■　該平板濾過膜を無血清基礎培地で間歇的に、培養液
の循環方向と同方向より洗浄する操作を行うことにより
目的とする細胞を高密度でかつ長期間培養することが可
能であることが判明した。

本発明の方法により培養を行うためには、第１図に示す
機能を有する培養装置を例示することができる。

ＢＲで示される培養槽においてスターラ−（Ｓｌｌ）に
より、浮遊性の動物細胞は、ゆるやかに撹拌培養される
。細胞浮遊液は、Ｌｌで示されるラインを通り、定常的
にＰｌで示されるポンプを通り濾過システム（ＦＭ）に
導入される。そして、この中に設置されている平板ＩＩ
ｔ１８膜によって培養濾液と細胞を含んだ培養濃縮液と
に濾過分離される。

細胞を含んだ培養濃縮液は、ラインＬ２を通り撹拌培養
槽（ＢＲ）に戻される。また撹拌培養槽（ＢＲ）から抜
き出された培養液は、液面計（ＬＳ）により検知され、
減少量だけポンプ（Ｂ２）を通り供給培地（ＳＭ）から
供給され撹拌培養槽（ＢＲ）内において常に定常を維持
される。撹拌培養１（ＢＲ）中のｐＨ，Ｏ□濃度は、溶
存酸素計（ＤＯ）ｐＨコントローラーにより検知され、
常に定常値に制御される。

細胞と培養液の分離に使用する濾過システムとしては平
面の濾過膜を備えてるものであればどのようなものでも
使用できる。濾過面の孔のサイズとしては浮遊性動物細
胞を通過させず高分子の蛋白質を通過させるような膜を
備えたものが好ましい、この点から孔サイズとしては、
０．２μｍ〜０．８μｍが特に好ましい。

潅流時はポンプ（Ｂ３）により吸引し濾過後培養液はラ
イン（ＬＳ）を通り回収培地槽（ＲＭ）に回収され、必
要に応じ精製回収工程へまわされる。

濾過膜表面は循環方向と同方向より定期的（間歇的）に
洗浄を行う、従来のホローファイバーを使用した濾過装
置においては、膜表面を洗浄することは困難であり、ま
た中空繊維内のつまりを除くために循環方向と逆方向の
洗浄が必要であったが、本発明の平膜による濾過方法で
は、１日１回循環方向と同方向に培養液と同成分の基礎
培地で洗浄することにより長期間の連続培養を維持でき
ることがわかった。

洗浄に当ってはポンプ（ＰＩ）、（Ｂ３）を停止し、バ
ルブ（Ｂ２）、（Ｂ３）を洗浄ラインに切り変え、ポン
プ（Ｂ４）を駆動し、洗浄液槽（ＣＭ）より洗浄液を潅
流流量の５０〜１００倍量の流速で１０〜６０秒間送っ
て洗浄し、次いで循環流路にパルプ（Ｂ２）、（Ｂ３）
を切り替え、ポンプ（Ｐｉ）、（Ｂ３）を駆動させて潅
流を再開すればよい。このような方法を採ることで、浮
遊性の動物細胞の長期間高密度培養と培養液の回収が可
能となる。

本発明における平板濾過膜は、ミクロ濾過膜（１０−’
１１−３０〜５０μ園濾過能力を有する）をフィルター
形状に、単層、もしくは多層とし、シート状に成形され
たものでミリポアフィルタ−（ミリポア社）、ウルトラ
フィルター、アイオプレート（アミコン社）などが例示
できる。またこれらのフィルターをセットした濾過シス
テムとしてミニタン（ミリポア社）、セルプロセンサー
（アミコン社）、アイオプレートシステム（アミコン社
）などをあげることができる、これを使用することによ
ってホローファイバーを使用したときのように洗浄液を
逆洗する必要がなく洗浄を容易に行うことができ、また
細胞の破砕、膜面の目づまり等を防止することができる
。

また、本発明は、ＦＭ３Ａ、リンパ球、ナマルバ細胞、
ハイブリドーマ等の動物細胞の培養に使用され、これら
の生産する生理活性物質等を効率よく採取することがで
きる。

以下に本発明の方法を実施例を挙げてさらに具体的に説
明する。

実施例 第１図に示した培養装置を用い浮遊性細胞ＦＭ３Ａを培
養した例を示す。

ＦＭ３Ａは小山らにより樹立されたマウス由来の細胞株
で我国では癌研究振興財団リサーチ　リソースバンクに
ＪＣＲＢＯ７０１として登録されており、容易に入手可
能である。

撹拌培養槽（ＢＲ）（容量１１のものを使用）に５％仔
牛血清を含むＤＭＥＭ　（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　ｍｏｄｉ
ｆｉｅｄＥａｇｉｅ　５ｅｄｉｕｓ）５００−を入れ、
これにＦＭ３Ａを初期細胞密度ｌＸｌ０’／ｄとなるよ
うに加え、培養を開始した。５％ＣＯ２を含む空気を液
面に通気しなから４０ｒｐ−で培養槽をゆるやかに撹拌
しながら培養を行った。

培養液は７００〜８００　ｄ／ｈｒの速度で循環させ、
また培養液の濾過システムによる透過回収は６０ｄ／ｈ
ｒの量であった。培養液の減少量をレベルセンサー（Ｌ
Ｓ）により検知し、ライン（Ｂ４）より自動的に５％Ｃ
３含有ＤＭＥＭを供給した。

培養開始２４時間ごとにラインをバルブ（Ｂ２）。

（Ｂ３）により洗浄ラインに切りかえポンプ（Ｐｌ）、
（Ｂ３）を停止し、ポンプ（Ｂ４）を駆動して無血清Ｄ
？ｌＥＭを４５０ｄ使用し、１０００ｄ／５ｉｎ（循環
流速の５０〜１００倍）の速度で潅流と同方向で濾過シ
ステムを洗浄した。

本実施例において使用した濾過システムは、ミリボア社
製ミニタン（０，６５μｍの孔サイズ）を使用した。こ
のような方法を採用して培養を行ったところ、第２図（
−０−○−）に示すように細胞密度は最高３Ｘ１０’を
超え、３２日以上の長期間培養が可能であった。比較例
として、本装置を使用し膜面の洗浄を行なわず新鮮培地
の供給のみを行った場合の培養結果を示した（−ローロ
ー）。

この場合は短期間（１０日間）、１０’／ｄの細胞密度
に到達したが細胞は以後ゆるやかに死滅し、１５日間し
か維持できなかった。

また、Ｔフラスコにより行った回分培養の結果を（−△
−△−）で示した。培地は５％Ｃ８を含むＤＭＢＭを使
用し５％ＣＯ８雰囲気下のインキュベータ中で培養を行
った。細胞密度は２Ｘ１０’／ｄにしか達せず、しかも
培養は８日間しか維持できなかった。

このように、本発明方法により長期間高密度に浮遊細胞
を培養できることを確認した。また培養液は、はぼ毎日
１５００ａｆ回収することができた。

〔発明の効果〕

本発明の実施により浮遊性動物細胞の高密度、潅流培養
が可能となった。本方法によれば培地交換と回収が連続
的にでき、また従来問題となっていた濾過孔のめづまり
や、細胞の破砕もなく良好な状態で細胞培養を行うこと
ができた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の方法の工程を概略図で示す。 第２図は、本発明の方法による浮遊性細胞ＦＭ３Ａを長
期間培養した結果を示す。また参考として従来法による
培養結果２例を示す。 図中、−〇−〇〜は本発明方法による培養結果を、−口
〜ローは従来法（循環培養法）による培養結果を、−△
−△−は従来法（回分培養法）による培養結果をそれぞ
れ示す。 細胞密度［ｃｅｌｌｓ／ｍｌ］

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）浮遊性動物細胞の浮遊する培養液の１部をぬきと
   り、培養液と動物細胞とを濾過膜によって分離し、動物
   細胞を新鮮培地とともに培養槽に戻して連続的に培地交
   換を行う長期連続培養方法において、 ［１］細胞の分離に０．２μｍ〜０．８μｍの孔を有す
   る平板濾過膜を使用し、 ［２］該平板濾過膜を培地で間歇的に、培養液の循環方
   向と同方向より洗浄する ことを特徴とする、浮遊性動物細胞の長期連続潅流培養
   方法。
2. （２）浮遊性動物細胞がＦＭ３Ａ細胞である請求項（１
   ）記載の浮遊性動物細胞の長期連続潅流培養方法。