JPH0510946A

JPH0510946A - 細胞解析装置

Info

Publication number: JPH0510946A
Application number: JP3161924A
Authority: JP
Inventors: Mutsuhisa Hiraoka; 睦久平岡; Yasushi Zaitsu; 靖史財津; Tokio Oodo; 時喜雄大戸; Hiroshi Hoshikawa; 寛星川
Original assignee: Fuji Electric Co Ltd
Current assignee: Fuji Electric Co Ltd
Priority date: 1991-07-03
Filing date: 1991-07-03
Publication date: 1993-01-19

Abstract

(57)【要約】【目的】照射光を受けて細胞から発する微弱蛍光から強
い蛍光まで広範囲に、光強度の測定感度と測定の再現性
を高める。【構成】測定光学系における蛍光の検出器として、各チ
ャンネルの光強度をフォトンカウンティングした値の合
計から蛍光強度を測定することができるマルチチャンネ
ルの光検出器を用いた。また、マルチチャンネルの光検
出器の測定範囲を超える蛍光量を測定するために、通常
の光電子増倍管を併用する。このような構成により、蛍
光量をマルチチャンネルの光検出器の各窓に分散して
も、測定のＳ／Ｎ比を低下させることなく、極微弱な蛍
光量から、これまで測定不可能であった強い蛍光量まで
フォトンカウンティングすることができ、測定の再現性
を高めることができる。さらに通常の光電子増倍管を併
用したものは、計測回路の負荷が小さく、測定可能な蛍
光量のダイナミックレンジが拡大される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、被測定流体に光ビーム
を照射し、その流体中に含まれる細胞からの蛍光や散乱
光を測定して、細胞の識別、分取を行なう装置に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】バイオテクノロジーの発展に伴い、医
学，生物学などの広い分野で、細胞の自動分析および分
別を行なう装置の要求が高まっている。このような細胞
解析装置の代表的なものとしてフローサイトメータが知
られている。

【０００３】図４は一般的な細胞解析装置（フローサイ
トメータ）の要部の構成と、その作動を説明するための
模式図である。図４において、容器中にあり細胞を含む
サンプル液１は、別の容器中にあるシース液２ととも
に、エアポンプ３によってフローセル４に導かれ、フロ
ーセル４の内部では、シース液２がサンプル液１を円筒
状に包み込む鞘状のシースフローが形成される。このシ
ースフローは細胞をフローセル４の中心軸に沿って一つ
一つ正確に流すための手段として形成されるものであ
る。フローセル４の下部には、レーザ光源５から出射さ
れ、集束レンズ６によって絞り込まれたレーザ光７が照
射される。サンプル液１に含まれる細胞は、多くの場合
蛍光染料や蛍光ラベルモノクロナール抗体などの蛍光物
質で蛍光標識されており、細胞がレーザ光７中を通過す
るとき、散乱光と蛍光が発生する。散乱光は、集光レン
ズ８とビームブロック９からなる集光光学系を経て、例
えばフォトダイオードなどの光検出器１０で検出され
る。一方、蛍光については、赤色蛍光は集光レンズ１
１，ハーフミラー１２，集光レンズ１３，フィルタ１４
からなる集光光学系で集められて、光検出器１５により
検出され、緑色蛍光はこれとは別経路のハーフミラー１
２から集光レンズ１６，フィルタ１７で集められ、光検
出器１８により検出される。通常、蛍光の検出器１５，
１８には、微弱光の検出が可能な電子増倍管が用いられ
る。散乱光を検出する光検出器１０，赤色蛍光を検出す
る光検出器１５および緑色蛍光を検出する光検出器１８
からの信号は、それぞれ信号処理回路１９に送られ、こ
こで散乱光と蛍光の強度を分析することにより細胞の同
定が行なわれる。

【０００４】上記の例では光源にレーザ光源５を使用し
ているが、これより安価な水銀ランプやキセノンランプ
を用いた装置もある。また、蛍光の測定を３色や４色に
細分して測定する装置、散乱光の多角度成分を測定する
装置もある。さらに細胞識別機能に加えて、識別した細
胞を分取、ソーティングする機構を備えた装置もあり、
これをセルソータと呼んでいる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】以上のような細胞解析
装置では、細胞識別の正確さが要求されるが、これに応
えるためには、蛍光と散乱光のそれぞれの検出感度、即
ちＳ／Ｎ比が高いことと同時に、光強度が再現性よく測
定されることが必要である。とくに蛍光の測定に関して
は、蛍光物質の種類と細胞の種類によって蛍光標識の強
度が異なるため、ある特定の蛍光物質と細胞の組み合わ
せの場合、発生する蛍光強度が非常に弱くなることがあ
り、蛍光検出感度のより高い装置が必要とされる。ま
た、このような微弱蛍光を測定するときに、再現性が非
常に悪くなるという不都合が生ずるため、微弱蛍光の測
定の再現性を向上させることが重要な問題である。

【０００６】微弱蛍光を測定するときに再現性が悪くな
るのは、以下の理由による。図５（ａ），（ｂ）は、検
出器、即ち光電子増倍管からの出力信号の波形を示すも
のであり、通常の測定の場合、出力信号は、図５（ａ）
のようなアナログ波形となり、蛍光強度はアナログ波形
の波高値から求めることができる。しかし、蛍光強度が
極端に弱くなると、出力信号は図５（ｂ）に示すよう
に、フォトンに対応する離散的なパルス群となり、その
波高値は蛍光強度に対応すものではなくなる。この場
合、電荷積算型のプリアンプを用いて、離散パルスの電
荷を積分することも考えられるが、離散パルス幅は数ｎ
ｓであり、このパルス幅が短いために、電気回路による
正確な積分は困難である。また、仮に離散パルスの電荷
積分が正確に行なわれたとしても、測定の再現性にはあ
る程度の限界が存在する。

【０００７】図６はヘッドフォン型光電子増倍管の作動
原理を説明するための模式図である。図６において、光
電子増倍管は真空容器２０の中に、光を電子に変換する
光電面２１，集束電極２２，ｎ個のダイノードを有する
電子増倍部２３，電子を集める陽極２４を収めたもので
あり、一個の光子２５が光電面２１に入射すると、量子
効率ηの確率で光電子が一つ放出される。放出された光
電子（一次電子）は第１ダイノード２３ａに入射し、二
次電子を放出する。この二次電子は数個程度の離散量に
なるため、通常Ｐｏｉｓｓｏｎ分布とみなされ、その平
均電子数ｐと同じだけの分散ｐを持っている。同様のこ
とが第２ダイノード２３ｂ以降のダイノードについても
次々と行なわれ、ｎ段の確率的な増倍過程を経て、最終
の電子グループが陽極２４から出力される。図６では光
電子の増倍過程を矢印線で表わしてある。しかし、各ダ
イノードに光電子が衝突する場所の相違による増倍率の
不均一性、および図６に矢印で示すような本来の増倍過
程を経ない電子（熱電子）が発生するために、陽極パル
ス波高値は一定とならず、ばらつきを持つようになる。
図７にこのパルス波高値の分布線図を示す。以上の現象
により、前述のように電荷積算型のプリアンプを用い
て、これらのパルスを正確に積算することができたとし
ても、蛍光測定値には、ばらつきが生ずることになるの
である。そして、このばらつきは、蛍光量が弱い程大き
くなる。

【０００８】微弱光を検出するとき、上述のような蛍光
測定値のばらつきを生じない計測方法の一つとして、フ
ォトンカウンティングという手法がある。フォトンカウ
ンティング法では、光電子増倍管の離散的な出力信号パ
ルスをパルスのままカウントして、パルスカウント値を
光量として評価するので、パルス波高値のばらつきによ
る測定誤差がなくなる。図８は光由来の信号成分とノイ
ズ信号とを測定の上限と下限によって分けたパルス波高
図であるが、図８のように計数する光由来のパルスをデ
ィスクリミネータに通して、波高値の上限と下限を設定
しておけば、図８に示した暗電流パルス（熱電子による
波高の低いパルス）や宇宙線パルス（波高の高いパル
ス）などのノイズ成分を簡単に除去し、前述のアナログ
的な測定よりもＳ／Ｎ比を高くとることができる。この
ようにフォトンカウンティング法は、高Ｓ／Ｎ比で、し
かも定量性が良いという利点はあるが、フローサイトメ
ータに適用する場合には、細胞が蛍光を発する時間が速
い（数μｓ〜数十μｓ）という現象の高速性と、測定の
ダイナミックレンジを広くとらねばならないことから、
以下の問題を生ずる。

【０００９】フォトンカウンティングで測定可能な光量
には上限がある。即ち、光電子増倍管の時間分解能（パ
ルス幅）内に、２個以上の光電子が存在しない程度に、
出力パルスが離散的な範囲でのみ、言い換えれば単位時
間当たりの光量がこの程度に小さいときのみ、測定が可
能である。その限界は光電子増倍管の特性にもよるが、
光電子パルス密度として１０⁷個／秒程度以下である。
一方、フローサイトメータで測定すべき蛍光強度の上限
は、測定する蛍光物質と細胞の種類にもよるが、これよ
り２〜４桁程度強い光量になる。このような強い光量ま
でフォトンカウンティングするときには、光学フィルタ
で減光するのが一般的であるが、フローサイトメータの
場合は、細胞が蛍光を発する時間は、前述のように細胞
がレーザ光を通過する一瞬の時間（数μｓ〜数十μｓ）
であるから、減光することはできない。例えば、光電子
密度にして１０⁶〜１０⁹個／秒の蛍光量の測定を行な
う場合、発光時間を１０μｓとすれば実際の光電子数は
１０〜１０⁴個であり、フォトンカウンティングのため
に１／１００の減光を行なうと、光電子数は０．１〜１
０²個に減ってしまう。光電子１個以下の領域は測定す
ることができず、また光電子数が少なくなると測定の再
現性が悪くなるので、フローサイトメータにおける微弱
蛍光の測定については、フォトンカウンティング法の特
徴である高Ｓ／Ｎ比で定量性が良いという利点が活かさ
れないことが問題である。

【００１０】そこで、フローサイトメータにフォトンカ
ウンティングを適用する単純な方法として、従来の蛍光
測定光学系とは別に、新たな蛍光測定光学系としてフォ
トンカウンティング光学系を追加し、蛍光強度が弱いと
きにフォトンカウンティングを行ない、蛍光強度が強い
ときに従来のパルス波高計測を行なうことも考えられ
る。しかし、この方法でも本質的な解決には至らない。

【００１１】前述と同様、光電子密度１０⁶〜１０⁹個
／秒の蛍光量の測定を考えてみると、この場合１０⁶〜
１０⁷個／秒の蛍光範囲の測定をフォトンカウンティン
グし、１０⁷〜１０⁹個／秒の蛍光範囲の測定を従来法
のパルス波高計測で行なうことになる。このとき発光時
間を１０μｓとすると、実質的な光電子数の範囲はフォ
トンカウンティングで１０〜１０²個、従来法で１０²
〜１０⁴個となる。ここで問題となるのは、従来法の光
電子数の範囲内における１０²個近くの微弱な蛍光領域
であり、この程度の蛍光量では、出力信号パルスは依然
として離散的な状態のままであって、測定の再現性は改
善されない。即ち、フォトンカウンティングを従来法と
併用するのは、検出感度の向上には効果があっても、再
現性に関しては改善されることがないから、細胞の識別
と分類を効果的に行なうことができないのである。

【００１２】本発明は上述の点に鑑みてなされたもので
あり、その目的は、微弱蛍光から強い蛍光まで広範囲
に、高感度で再現性よく測定することが可能な細胞解析
装置を提供することにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めに、本発明の細胞解析装置は、測定光学系における蛍
光の検出器として、各チャンネルの光強度をフォトンカ
ウンティングした値の合計から蛍光強度を測定するマル
チチャンネルの光検出器を備えたものであり、さらに第
二の測定光学系として、マルチチャンネルの光検出器の
測定範囲を超える蛍光量を測定する光電子増倍管を付加
することもできる。

【００１４】

【作用】蛍光検出器にマルチチャンネルの光検出器を用
い、蛍光光束をレンズなどで拡げて入射すると、蛍光量
の総量がマルチチャンネル光検出器の各窓に分散されて
入ることになり、各窓の蛍光量は小さくなる。一般にフ
ローサイトメータで測定する蛍光強度は弱く、それをさ
らに各窓に分散することになるから、窓の数が多ければ
各窓の蛍光量は、容易にフォトンカウンティングが可能
な範囲まで小さくなる。したがって、各窓の信号出力を
それぞれフォトンカウンティングして各窓の蛍光量を算
出した後、各窓の蛍光量（カウント値）を合計すること
により、ある程度強い蛍光に対してもフォトンカウンテ
ィングが可能になる。

【００１５】このとき、光子数として一発光時間当たり
数個程度の極微弱な蛍光を測定する場合は、蛍光光束は
検出器の各窓に分散するように入射するので、各窓のエ
ネルギー量は１光子に満たなくなる。しかし、これによ
り光電子が発生し難くなることはない。それは、光電面
から光電子が放出される現象は、量子論により確率過程
となるため、それぞれの窓の光電子の放出確率は非常に
小さくなるが、その放出確率を合計すると、結果的にシ
ングルチャンネルの光検出器と同じになるからである。

【００１６】このように、蛍光量をマルチチャンネル光
検出器の各窓に分散しても、測定のＳ／Ｎ比を低下させ
ることなく、極微弱な蛍光量から、これまで測定不可能
であった強い蛍光量までフォトンカウンティングするこ
とができ、フォトンカウンティング法の高Ｓ／Ｎ比とい
う利点を活かしたまま、測定の再現性を高めることがで
きる。

【００１７】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づき説明する。図
１は本発明の細胞解析装置の構成を示す模式図である。
図１の図５と共通する部分は同一符号で表わしてあり、
図１の送液系，フローセル，投光系、散乱光検出部は図
５と同じであるから、ここではそれらの説明を省略す
る。図１が図５と異なる主要な点は、図５の光検出器１
５，１８の代わりに、図１ではマルチチャンネルの光検
出器を用いたことにある。マルチチャンネルの光検出器
とは、光の入射部を複数個有し、各々の窓（チャンネ
ル）に入射した光量をそれぞれ測定し出力する光検出器
であって、具体的にはマルチアノード光電子増倍管やイ
メージインテンシファイヤーなどがある。図１におい
て、細胞からの蛍光は、マルチチャンネルの光検出器で
あるマルチアノード光電子増倍管２６で光電変換され
る。

【００１８】ここで、一旦、マルチアノード光電子増倍
管２６について説明を加える。図２はその説明のための
模式図であり、（ａ）は構造を表わす側面図、（ｂ）は
マイクロチャンネルプレートの一部切断斜視図である。
図２（ａ）において、光子２７が光電面２８に入射する
と光電子２９が放出され、電子レンズ３０により光束の
拡がった光電子２９は、マイクロチャンネルプレート３
１に入り電子増幅される。マイクロチャンネルプレート
３１は、図２（ｂ）に示す如く細いガラス管のチャンネ
ル３２を多数束ねたものであり、個々のチャンネル３２
の内壁は二次電子放出材料で被覆されており、チャンネ
ル３２の１本づつがそれぞれ独立した連続二次電子増幅
器になっている。マイクロチャンネルプレート３１の各
チャンネル３２により増倍された電子群は、終端に配置
された多数のアノードからなるマルチアノード３３［図
２（ａ）］のうち、最も近くにあるアノードに出力され
る。このアノードの数は、数本から数百本まで任意に作
製することができる。マルチアノード光電子増倍管２６
は、本発明に用いるマルチチャンネルの光検出器として
は最適なものであり、多数のアノードからなるマルチア
ノード３３に、光電子２９に対応した信号パルス（電子
群）を振り分けることができる。

【００１９】次に再び図１を参照して説明を続ける。マ
ルチアノード光電子増倍管２６の各アノードの出力信号
パルスは、プリアンプ３４，ディスクリミネータ３５，
ゲート回路３６，カウンタ３７からなる点線で囲ったフ
ォトンカウンティングシステム３８によりそれぞれ計測
することができる。ゲート回路３６では、コンパレータ
３９の前方散乱光信号の出力をみて、細胞がレーザ光を
通過している間だけゲートが開放される。４０はプリア
ンプである。各アノードの各フォトンカウンティング値
は、加算器４１により合計し最終的な蛍光強度として、
信号処理回路１９に出力され、信号処理回路１９では、
散乱光強度および蛍光強度から細胞の識別を行なうこと
ができる。

【００２０】また、本発明の装置は、マルチチャンネル
の光検出器として、高価なマルチアノード光電子増倍管
２６の代わりに、複数個の光電子増倍管を束ねたものを
用いてもよい。ただ、この場合は、検出器のチャンネル
数（光電子増倍管の数）を極端に増やすことができない
ので、測定可能な光量は制限されるが、前述と同様な効
果を簡単に実現させることができる。

【００２１】さらに本発明では、マルチチャンネルの光
検出器を用いた第一の測定光学系とフローセルを挟んで
１８０°に対向させて、シングルチャンネルの光検出器
を用いた第二の測定光学系を配置することも有効であ
る。図３はその構成を示す模式図であり、図１，図４と
共通部分に同一符号を用いてある。ただ、図３には送液
系は図示を省略した。図３に示すようにこの装置は、フ
ローセル４を中心としてマルチアノード光電子増倍管２
６と対象な位置に、光電子増倍管４２を設けてあり、信
号の波高値が蛍光量として出力される。信号処理回路１
９へ送られる蛍光量測定値は、第一の測定光学系である
マルチアノード光電子増倍管２６の信号出力が優先され
るが、蛍光量が大きくなり、フォトンカウンティングシ
ステム３８にエラー信号が出ると、信号選択器４３にエ
ラー信号が送られ、信号選択器４３は信号処理回路１９
へ送る蛍光量測定値として、第二の測定光学系である光
電子増倍管４２の信号出力を採用する。

【００２２】本発明の装置のうち、マルチアノード光電
子増倍管２６もしくはこれに代わる複数個の光電子増倍
管を束ねた検出器を用いた装置では、これら検出器のチ
ャンネル数が多ければ多い程、測定可能な蛍光量の上限
は大きくなる。しかし、検出器の各チャンネルは、それ
ぞれ単独にフォトンカウンティングしなければならない
から、チャンネル数が増すとフォトンカウンティングの
ためのパルス計測回路が大がかりになり、回路の制限に
よりダイナミックレンジを広くとることが難しくなる。
これに対して、上記のように第二の測定光学系を併用し
た装置は、従来十分な測定ができなかった微弱な蛍光範
囲に限り、マルチチャンネルの光検出器を使用し、蛍光
量が大きな領域では従来の検出法に切り替え、蛍光量に
よって測定手段を使い分けるものであるから、マルチチ
ャンネルの光検出器のチャンネル数を必要最小限に抑え
ることができる。したがって、図１と図３の二つの装置
を比較すれば、図１の装置はチャンネル数が多く計測回
路は複雑になるが、図３の装置ではそれを簡単に済ます
ことができ、計測回路の負荷が小さく、しかも測定可能
な蛍光量のダイナミックレンジが広くなるという利点を
持っている。

【００２３】

【発明の効果】細胞を含む流体がフローセルを通過する
際、これにレーザ光を照射し、細胞から発する蛍光を測
定する光学系の光検出器に、従来の細胞解析装置（フロ
ーサイトメータ）は光電子増倍管が用いられているが、
微弱な蛍光の測定に対して出力信号波形は離散的なパル
ス群となり、波高値も一定ではないから光強度測定の再
現性が悪く、これはフォトンカウンティング法を用いて
も、Ｓ／Ｎ比は高くなるが測定の再現性は本質的に改善
されない。これに対して本発明は、蛍光測定の光学系の
光検出器として、マルチチャンネルの光検出器を用いて
細胞解析装置を構成し、そのマルチチャンネルの光検出
器の各チャンネル毎の光強度をフォトンカウンティング
して、各チャンネルの各フォトンカウンティング値の合
計値から蛍光強度を測定するようにしたため、フォトン
カウンティング法による高Ｓ／Ｎ比の特徴を活かしたま
ま、再現性よく蛍光の強度測定を行なうことができ、細
胞解析装置の測定に必要な検出感度と再現性という二つ
の重要な問題を同時に解決し、細胞の識別、分類の精度
を大きく向上させた。さらに通常の光電子増倍管を併用
することにより、計測回路の負荷が小さく、測定可能な
蛍光量のダイナミックレンジが拡大されるという利点も
ある。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の細胞解析装置の構成を示す模式図

【図２】（ａ）はマルチアノード光電子増倍管の構造を
表わす模式側面図、（ｂ）は同じくマイクロチャンネル
プレートの一部切断斜視図

【図３】本発明の第二の測定光学系を配置した装置の構
成を示す模式図

【図４】フローサイトメータの要部の構成とその作動を
説明するための模式図

【図５】（ａ），（ｂ）はいずれも光電子増倍管からの
出力信号の波形図

【図６】ヘッドフォン型光電子増倍管の光電子の増倍過
程を示す模式図

【図７】光電子増倍管からの出力パルス波高値の分布線
図

【図８】光由来の信号成分とノイズ信号とを測定の上限
と下限に分けたパルス波高図

【符号の説明】

１サンプル液２シース液３エアポンプ４フローセル５レーザ光源６集束レンズ７レーザ光８集光レンズ９ビームブロック１０光検出器１１集光レンズ１２ハーフミラー１３集光レンズ１４フィルタ１５光検出器１６集光レンズ１７フィルタ１８光検出器１９信号処理回路２０真空容器２１光電面２２集束電極２３電子増倍部２３ａ第１ダイノード２３ｂ第２ダイノード２４陽極２５光子２６マルチアノード光電子増倍管２７光子２８光電面２９光電子３０電子レンズ３１マイクロチャンネルプレート３２チャンネル３３マルチアノード３４プリアンプ３５ディスクリミネータ３６ゲート回路３７カウンタ３８フォトンカウンティングシステム３９コンパレータ４０プリアンプ４１加算器４２光電子増倍管４３信号選択器

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者星川寛神奈川県川崎市川崎区田辺新田１番１号富士電機株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞を含む流体をフローセルに送り込む送
液系と、このフローセルを通過中の前記流体に光ビーム
を照射する投光光学系と、前記光ビームの照射を受けて
前記細胞から発する散乱光と蛍光の少なくとも一つを測
定する測定光学系を備え、前記測定光学系により測定さ
れる蛍光強度から前記細胞の識別を行なう細胞解析装置
であって、前記測定光学系の蛍光検出器として、各チャ
ンネルの光強度をフォトンカウンティングした値の合計
から蛍光強度を測定するマルチチャンネルの光検出器を
用いたことを特徴とする細胞解析装置。
【請求項２】請求項１記載の装置において、マルチチャ
ンネルの光検出器はマルチアノード光電子増倍管である
ことを特徴とする細胞解析装置。
【請求項３】請求項１記載の装置において、マルチチャ
ンネルの光検出器は複数個の光電子増倍管を束ねたもの
であることを特徴とする細胞解析装置。
【請求項４】請求項１ないし３記載の装置において、マ
ルチチャンネルの光検出器のほかに、前記マルチチャン
ネルの光検出器の測定範囲を超える蛍光量を測定する光
電子増倍管を第二の測定光学系として備えたことを特徴
とする細胞解析装置。
【請求項５】請求項１ないし４記載の装置において、第
二の測定光学系はフローセルに対してマルチチャンネル
の光検出器と対称の位置にあることを特徴とする細胞解
析装置。