JPH0511572B2 - - Google Patents
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- JPH0511572B2 JPH0511572B2 JP2767985A JP2767985A JPH0511572B2 JP H0511572 B2 JPH0511572 B2 JP H0511572B2 JP 2767985 A JP2767985 A JP 2767985A JP 2767985 A JP2767985 A JP 2767985A JP H0511572 B2 JPH0511572 B2 JP H0511572B2
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Landscapes
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は新規組成の試薬による蛍光検出方法に
関する。詳記すれば、ｏ−フタルアルデヒド法に
よつて第一アミンをイソインドール型蛍光化合物
とし、その蛍光を検出して第一アミンを定量する
蛍光検出方法の改良に関する。 〔従来の技術〕 物質特に微量物質の定量分析には、従来吸光分
析などがあり、それらは簡便で優れた方法である
が、感度がやゝ低いのが欠点である。 これに対し蛍光分析は、検知器の感度や光源の
強さ鈴を増すことによつて感度の向上が容易であ
り、吸光分析等で測定できる濃度が一般に10-6M
程度迄であるのに対し、10-9〜10-10M程度の試
料迄測定が可能である。又蛍光分析は励起波長と
蛍光波長と蛍光波長の二つのパラメーターを最適
値に選定することができるので、選択性も格段に
優れている。 蛍光分析はこのように、微少量の物質の検出や
定量に優れるものであるが、更に発光物質自体の
蛍光を検出する方法だけでなく、非蛍光物質を化
学的に修飾、又は分子に蛍光基を導入して蛍光体
とし、その蛍光を検出するなど、種々の物質に容
易に適用できる優れた分析法である。 非蛍光物質を発蛍光体に誘導する試薬として、
第一アミンと反応して発蛍光体を与えるOPAが
ある。OPAはフルオレツサミン同様、第一アミ
ンと反応して発蛍光体を与えるが、発蛍光体の生
成には２−メルカプトエタノール（以下、MEと
略称する。）の存在が必須とされて来た（M.
Roth：Anal.Chem.43巻880頁（1971年）；S.S.
Simons及びD.F.Johnson：Jr.Org.Chem.43巻
2886頁（1978年））。 適用例としてα−アミノ酸、その代謝生成物の
セロトニン，ヒスタミン等の生理活性アミン、ノ
ルエピネフリン，エピネフリン，ドーパミン等の
カテコールアミン、プトレツシン，スペルミジ
ン，スペルミン等のポリアミン、ペプチド、アミ
ノ糖等の第一アミンの、高速液体クロマトグラフ
イー蛍光分析定量例が報告されている。 試薬は水溶性であり、カラム溶離液と混和して
も沈澱の生成は見られず、アミノ酸自動分析など
自動分析計に組み入れることも容易である。感度
もフルオレツサミンより高い〔J.R.Benson及び
P.E.Hare：Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A.72巻619
頁（1975年）〕。 反応に用いる試薬は市販されており、例えば
OPAを0.700ｇ、MEを2.0ml、15％Brij35〔ポリオ
キシエチレンラウリルエーテル；花王アトラス(株)
商品名〕を2.0ml、メタノールを10.0ml含有し、
これらを合せてホウ酸カリウム緩衝液（PH10.4）
で稀釈して１としたものなどであるが、ここに
界面活性剤Brij35は感度を向上させ〔J.R.Benson
及びP.E.Hare：Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.72巻
619頁（1975年）〕、メタノールはOPAの溶解助剤
であり、反応時のPHがアルカリ性であることを要
するので、ホウ酸カリウム緩衝液（PH10.4）が用
いられている。 〔発明が解決しようとする問題点〕 このように試薬の検出感度は、例えばアミノ酸
の定量でnmol〜pmolレベルと高く、且つ定量も
容易という利点をもち乍ら、試薬の安定性に重大
な欠点があり、試薬の劣化は急速に進行し、その
劣化のために試薬自体が測定を妨害し、試薬調製
約２カ月後には、蛍光が全く観察されなくなるの
が実態である。また劣化を生じた試薬を使用する
と、得られた目的物蛍光体が短時間で劣化すると
いう事象もあり、極めて迅速に反応から測定迄を
完了せねばならないという不便隘路が避けられな
い。これにより、例えば高速液体クロマトグラフ
イー蛍光分析等、カラム分離と組み合せるときな
ど、ラベル化後カラム分離するプレカラム法の適
用は、実質全く不可能である。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、上記試薬の経日劣化と、それを
増幅した悪影響につき鋭意研究の結果、第一アミ
ンをOPA法によつてイソインドール型蛍光化合
物とする反応を、TGの存在で行うように試薬を
処方することによつて、従来の試薬由来の問題を
一挙に解決することを見出し、本発明を完成し
た。本発明は、ｏ−フタルアルデヒド法によつて
第一アミンをイソインドール型蛍光化合物とし、
その蛍光を検出して第一アミンを定量する蛍光検
出方法に於いて、蛍光化合物の生成反応を、チオ
グリセロール（α−モノチオグリセロール）の存
在下に行うことを特徴とする、蛍光検出方法の発
明である。 即ち、OPAと混合した形であれ、用事にはじ
めて混合する形であれ、第一アミンにOPAが作
用するとき、TGが共存するように試薬を処方し
て、その余は従来と同様の操作に従えば、本発明
は容易に実用可能である。 本発明方法の試薬は、混合型であれ用時混合型
であれ、長期保存に耐えて安定であり、第一アミ
ンと反応して得られた蛍光化合物も安定であり、
検出される蛍光が安定であることからして、検出
反応を行う時間的制約が全くなくなる。高感度の
検出方法を提供することは従来通りである。 〔作用〕 全試薬を混合して保存したり、用時に混合して
使つたりする場合、その混合後本発明方法の試薬
が安定である機作は、現在なお不明であるが、
OPAとTGとの間には、例えば従前のOPAとME
との場合のような相互反応は見られず、試料との
所望の反応に対して、所望でない副反応も認めら
れない。 本発明方法の場合、下記反応によつてイソイン
ドール型蛍光化合物が得られる。 得られた蛍光化合物は安定であつて、例えば
OPAとMEとを用いた場合、室温乃至それ以下の
温度に於いても、徐々に転移反応を起して無蛍光
のジヒドロイソインドロン化合物に変化する、と
いうのと全く相違し、安定した蛍光が検出され、
且つその安定性は、励起波長の連続照射にも、充
分耐えるものである。 〔発明の効果〕 既に述べた処であるが、本発明方法を行うとき
は、試薬も安定、得られた蛍光体も安定、且つ操
作とか感度とかは通常蛍光検出で得られるものと
変らぬ上に、検出手順に時間的制約はなく、例え
ばこれを高速液体クロマトグラフイー蛍光分析等
カラム分離と組み合せるときも、カラムに入る前
に第一アミンをOPA法でイソインドール型蛍光
化合物に誘導し、その後カラムで分離するプレカ
ラム法も充分可能である。 なおTGは、一般にチオ化合物が有する強烈な
悪臭も有せず、実用的な溶解性も好適である。 〔実施例〕 以下に実施例を示すが、本発明はこれらの実施
例によつて何らの制約を受けるものではならな
い。 実施例 １ ホウ酸30.9ｇと水酸化カリウム21.5ｇを蒸留水
に溶解した溶液に、OPA0.700ｇ、メタノール
10.0ml、TG2.5ml、15％Brij35の2.0mlを加え、蒸
留水で稀釈して全量を１とし、本発明OPA試
液（PH10.4）を調製した。 別にホウ酸30.9ｇと水酸化カリウム21.5ｇを蒸
留水に溶解した溶液に、OPA0.700ｇ、メタノー
ル10.0ml、ME2.0ml、15％Brij35の2.0mlを加え、
蒸留水で稀釈して全量を１とし、比較例OPA
試液（PH10.4）を調製した。 次に夫々10ml共栓試験管に、別々に両OPA試
液を10.0mlずつとり、これに試料の50ppmL−α
−アラニン水溶液20μを各々添加し、反応液の
Ｌ−α−アラニンによる蛍光値を測定した。 測定は分光蛍光光度計（日立、MPE−４型）
を用い、励起波長Ex338nm、蛍光波長Em425nm
で行つた。結果を第１図（本発明）及び第２図
（比較例）に示す。図中横軸はOPA試液調製時を
０分とした時間の経過（単位＝分）を表わし、従
軸は蒸溜水でゼロ調整し、セル（１cm）に
0.5ppmの硫酸キニーネ（Ｎ／10硫酸溶液）をと
り、同溶液の蛍光光度が記録紙のスケールの74％
になるように感度設定した、記録紙上のピークの
高さ（記録紙の読み）を表わす。 又×印は両OPA試液調製時に試料（Ｌ−α−
アラニン含有）を添加、反応させた反応液の各経
過時間（単位＝分）に於ける蛍光値（蛍光測定
値）を示し、・印は同じく両OPA試液調製時にＬ
−α−アラニンを含まない試料を添加した、
OPA試液の各経過時間（単位＝分）に於ける蛍
光値（ブランク値）を示す。従つてＬ−α−アラ
ニンによる蛍光値＝蛍光測定値−ブランク値−ブ
ランク値として計算される。 第１図及び第２図から明かな通り、本発明
OPA試液では特に生成蛍光化合物が安定性に優
れ、検出される蛍光も極めて安定である。反応か
ら検出迄の時間的制約がなく、プレカラム法の適
用も容易であることなどを示唆するものである。 実施例 ２ 実施例１の本発明OPA試液及び比較例OPA試
液を５℃で保存し、経日的に実施例１と同様にし
てＬ−α−アラニンによる蛍光値を測定したとこ
ろ、比較例OPA試液の経時劣化は激しく、２カ
月経過でブランク値は100を越え、試料蛍光値が
全く観測されなかつたのに対し、本発明OPA試
液は安定で、同じく２カ月経過でブランク値の増
大は全く観測されず、蛍光値（31.7）も調製当初
と変らなかつた。 実施例 ３ 実施例１の本発明OPA試液を用い、表１記載
の種々のアミノ酸各10nmol含有水溶液を試料と
し、、試料20μにつき実施例１と同様にその蛍
光値を測定、表１の結果を得た。
関する。詳記すれば、ｏ−フタルアルデヒド法に
よつて第一アミンをイソインドール型蛍光化合物
とし、その蛍光を検出して第一アミンを定量する
蛍光検出方法の改良に関する。 〔従来の技術〕 物質特に微量物質の定量分析には、従来吸光分
析などがあり、それらは簡便で優れた方法である
が、感度がやゝ低いのが欠点である。 これに対し蛍光分析は、検知器の感度や光源の
強さ鈴を増すことによつて感度の向上が容易であ
り、吸光分析等で測定できる濃度が一般に10-6M
程度迄であるのに対し、10-9〜10-10M程度の試
料迄測定が可能である。又蛍光分析は励起波長と
蛍光波長と蛍光波長の二つのパラメーターを最適
値に選定することができるので、選択性も格段に
優れている。 蛍光分析はこのように、微少量の物質の検出や
定量に優れるものであるが、更に発光物質自体の
蛍光を検出する方法だけでなく、非蛍光物質を化
学的に修飾、又は分子に蛍光基を導入して蛍光体
とし、その蛍光を検出するなど、種々の物質に容
易に適用できる優れた分析法である。 非蛍光物質を発蛍光体に誘導する試薬として、
第一アミンと反応して発蛍光体を与えるOPAが
ある。OPAはフルオレツサミン同様、第一アミ
ンと反応して発蛍光体を与えるが、発蛍光体の生
成には２−メルカプトエタノール（以下、MEと
略称する。）の存在が必須とされて来た（M.
Roth：Anal.Chem.43巻880頁（1971年）；S.S.
Simons及びD.F.Johnson：Jr.Org.Chem.43巻
2886頁（1978年））。 適用例としてα−アミノ酸、その代謝生成物の
セロトニン，ヒスタミン等の生理活性アミン、ノ
ルエピネフリン，エピネフリン，ドーパミン等の
カテコールアミン、プトレツシン，スペルミジ
ン，スペルミン等のポリアミン、ペプチド、アミ
ノ糖等の第一アミンの、高速液体クロマトグラフ
イー蛍光分析定量例が報告されている。 試薬は水溶性であり、カラム溶離液と混和して
も沈澱の生成は見られず、アミノ酸自動分析など
自動分析計に組み入れることも容易である。感度
もフルオレツサミンより高い〔J.R.Benson及び
P.E.Hare：Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A.72巻619
頁（1975年）〕。 反応に用いる試薬は市販されており、例えば
OPAを0.700ｇ、MEを2.0ml、15％Brij35〔ポリオ
キシエチレンラウリルエーテル；花王アトラス(株)
商品名〕を2.0ml、メタノールを10.0ml含有し、
これらを合せてホウ酸カリウム緩衝液（PH10.4）
で稀釈して１としたものなどであるが、ここに
界面活性剤Brij35は感度を向上させ〔J.R.Benson
及びP.E.Hare：Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.72巻
619頁（1975年）〕、メタノールはOPAの溶解助剤
であり、反応時のPHがアルカリ性であることを要
するので、ホウ酸カリウム緩衝液（PH10.4）が用
いられている。 〔発明が解決しようとする問題点〕 このように試薬の検出感度は、例えばアミノ酸
の定量でnmol〜pmolレベルと高く、且つ定量も
容易という利点をもち乍ら、試薬の安定性に重大
な欠点があり、試薬の劣化は急速に進行し、その
劣化のために試薬自体が測定を妨害し、試薬調製
約２カ月後には、蛍光が全く観察されなくなるの
が実態である。また劣化を生じた試薬を使用する
と、得られた目的物蛍光体が短時間で劣化すると
いう事象もあり、極めて迅速に反応から測定迄を
完了せねばならないという不便隘路が避けられな
い。これにより、例えば高速液体クロマトグラフ
イー蛍光分析等、カラム分離と組み合せるときな
ど、ラベル化後カラム分離するプレカラム法の適
用は、実質全く不可能である。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明者らは、上記試薬の経日劣化と、それを
増幅した悪影響につき鋭意研究の結果、第一アミ
ンをOPA法によつてイソインドール型蛍光化合
物とする反応を、TGの存在で行うように試薬を
処方することによつて、従来の試薬由来の問題を
一挙に解決することを見出し、本発明を完成し
た。本発明は、ｏ−フタルアルデヒド法によつて
第一アミンをイソインドール型蛍光化合物とし、
その蛍光を検出して第一アミンを定量する蛍光検
出方法に於いて、蛍光化合物の生成反応を、チオ
グリセロール（α−モノチオグリセロール）の存
在下に行うことを特徴とする、蛍光検出方法の発
明である。 即ち、OPAと混合した形であれ、用事にはじ
めて混合する形であれ、第一アミンにOPAが作
用するとき、TGが共存するように試薬を処方し
て、その余は従来と同様の操作に従えば、本発明
は容易に実用可能である。 本発明方法の試薬は、混合型であれ用時混合型
であれ、長期保存に耐えて安定であり、第一アミ
ンと反応して得られた蛍光化合物も安定であり、
検出される蛍光が安定であることからして、検出
反応を行う時間的制約が全くなくなる。高感度の
検出方法を提供することは従来通りである。 〔作用〕 全試薬を混合して保存したり、用時に混合して
使つたりする場合、その混合後本発明方法の試薬
が安定である機作は、現在なお不明であるが、
OPAとTGとの間には、例えば従前のOPAとME
との場合のような相互反応は見られず、試料との
所望の反応に対して、所望でない副反応も認めら
れない。 本発明方法の場合、下記反応によつてイソイン
ドール型蛍光化合物が得られる。 得られた蛍光化合物は安定であつて、例えば
OPAとMEとを用いた場合、室温乃至それ以下の
温度に於いても、徐々に転移反応を起して無蛍光
のジヒドロイソインドロン化合物に変化する、と
いうのと全く相違し、安定した蛍光が検出され、
且つその安定性は、励起波長の連続照射にも、充
分耐えるものである。 〔発明の効果〕 既に述べた処であるが、本発明方法を行うとき
は、試薬も安定、得られた蛍光体も安定、且つ操
作とか感度とかは通常蛍光検出で得られるものと
変らぬ上に、検出手順に時間的制約はなく、例え
ばこれを高速液体クロマトグラフイー蛍光分析等
カラム分離と組み合せるときも、カラムに入る前
に第一アミンをOPA法でイソインドール型蛍光
化合物に誘導し、その後カラムで分離するプレカ
ラム法も充分可能である。 なおTGは、一般にチオ化合物が有する強烈な
悪臭も有せず、実用的な溶解性も好適である。 〔実施例〕 以下に実施例を示すが、本発明はこれらの実施
例によつて何らの制約を受けるものではならな
い。 実施例 １ ホウ酸30.9ｇと水酸化カリウム21.5ｇを蒸留水
に溶解した溶液に、OPA0.700ｇ、メタノール
10.0ml、TG2.5ml、15％Brij35の2.0mlを加え、蒸
留水で稀釈して全量を１とし、本発明OPA試
液（PH10.4）を調製した。 別にホウ酸30.9ｇと水酸化カリウム21.5ｇを蒸
留水に溶解した溶液に、OPA0.700ｇ、メタノー
ル10.0ml、ME2.0ml、15％Brij35の2.0mlを加え、
蒸留水で稀釈して全量を１とし、比較例OPA
試液（PH10.4）を調製した。 次に夫々10ml共栓試験管に、別々に両OPA試
液を10.0mlずつとり、これに試料の50ppmL−α
−アラニン水溶液20μを各々添加し、反応液の
Ｌ−α−アラニンによる蛍光値を測定した。 測定は分光蛍光光度計（日立、MPE−４型）
を用い、励起波長Ex338nm、蛍光波長Em425nm
で行つた。結果を第１図（本発明）及び第２図
（比較例）に示す。図中横軸はOPA試液調製時を
０分とした時間の経過（単位＝分）を表わし、従
軸は蒸溜水でゼロ調整し、セル（１cm）に
0.5ppmの硫酸キニーネ（Ｎ／10硫酸溶液）をと
り、同溶液の蛍光光度が記録紙のスケールの74％
になるように感度設定した、記録紙上のピークの
高さ（記録紙の読み）を表わす。 又×印は両OPA試液調製時に試料（Ｌ−α−
アラニン含有）を添加、反応させた反応液の各経
過時間（単位＝分）に於ける蛍光値（蛍光測定
値）を示し、・印は同じく両OPA試液調製時にＬ
−α−アラニンを含まない試料を添加した、
OPA試液の各経過時間（単位＝分）に於ける蛍
光値（ブランク値）を示す。従つてＬ−α−アラ
ニンによる蛍光値＝蛍光測定値−ブランク値−ブ
ランク値として計算される。 第１図及び第２図から明かな通り、本発明
OPA試液では特に生成蛍光化合物が安定性に優
れ、検出される蛍光も極めて安定である。反応か
ら検出迄の時間的制約がなく、プレカラム法の適
用も容易であることなどを示唆するものである。 実施例 ２ 実施例１の本発明OPA試液及び比較例OPA試
液を５℃で保存し、経日的に実施例１と同様にし
てＬ−α−アラニンによる蛍光値を測定したとこ
ろ、比較例OPA試液の経時劣化は激しく、２カ
月経過でブランク値は100を越え、試料蛍光値が
全く観測されなかつたのに対し、本発明OPA試
液は安定で、同じく２カ月経過でブランク値の増
大は全く観測されず、蛍光値（31.7）も調製当初
と変らなかつた。 実施例 ３ 実施例１の本発明OPA試液を用い、表１記載
の種々のアミノ酸各10nmol含有水溶液を試料と
し、、試料20μにつき実施例１と同様にその蛍
光値を測定、表１の結果を得た。
【表】
第１図は実施例１の本発明OPA試液による蛍
光測定値（×印）及びブランク値（・印）を表わ
し、第２図は実施例１の比較例OPA試液による
蛍光測定値（×印）及びブランク値（・印）を表
わす。何れも横軸は時間の経過（単位＝分）を、
縦軸はピークの高さ（記録紙の読み）を表わす。
光測定値（×印）及びブランク値（・印）を表わ
し、第２図は実施例１の比較例OPA試液による
蛍光測定値（×印）及びブランク値（・印）を表
わす。何れも横軸は時間の経過（単位＝分）を、
縦軸はピークの高さ（記録紙の読み）を表わす。
Claims (1)
- １ ｏ−フタルアルデヒド法によつて第一アミン
をイソインドール型蛍光化合物とし、その蛍光を
検出して第一アミンを定量する蛍光検出方法に於
いて、蛍光化合物の生成反応を、チオグリセロー
ル（α−モノチオグリセロール）の存在下に行う
ことを特徴とする、蛍光検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2767985A JPS61187657A (ja) | 1985-02-15 | 1985-02-15 | 新規試薬による螢光検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2767985A JPS61187657A (ja) | 1985-02-15 | 1985-02-15 | 新規試薬による螢光検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61187657A JPS61187657A (ja) | 1986-08-21 |
| JPH0511572B2 true JPH0511572B2 (ja) | 1993-02-15 |
Family
ID=12227650
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2767985A Granted JPS61187657A (ja) | 1985-02-15 | 1985-02-15 | 新規試薬による螢光検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61187657A (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0721986A3 (en) * | 1995-01-13 | 1996-09-11 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Reagent for creatine kinase |
| JP3056714B2 (ja) * | 1997-10-06 | 2000-06-26 | 松下電子工業株式会社 | 半導体基板の研磨方法 |
| JP4884726B2 (ja) * | 2005-08-30 | 2012-02-29 | 東洋ゴム工業株式会社 | 積層研磨パッドの製造方法 |
| CN102152232B (zh) | 2007-01-15 | 2013-06-26 | 东洋橡胶工业株式会社 | 研磨垫及其制造方法 |
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| US9067297B2 (en) | 2011-11-29 | 2015-06-30 | Nexplanar Corporation | Polishing pad with foundation layer and polishing surface layer |
| CN102866141B (zh) * | 2012-09-28 | 2014-08-13 | 桂林电子科技大学 | 4-甲氧基邻苯二甲醛在海水中铵氮检测中的应用及测定方法 |
| CN104111245A (zh) * | 2014-07-29 | 2014-10-22 | 桂林电子科技大学 | 降低邻苯二甲醛荧光法测铵氮的试剂空白的方法 |
-
1985
- 1985-02-15 JP JP2767985A patent/JPS61187657A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61187657A (ja) | 1986-08-21 |
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