JPH05130875A - 微生物による芳香族複素環式化合物中のメチル基のヒドロキシル化 - Google Patents
微生物による芳香族複素環式化合物中のメチル基のヒドロキシル化Info
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- JPH05130875A JPH05130875A JP3238226A JP23822691A JPH05130875A JP H05130875 A JPH05130875 A JP H05130875A JP 3238226 A JP3238226 A JP 3238226A JP 23822691 A JP23822691 A JP 23822691A JP H05130875 A JPH05130875 A JP H05130875A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 活性キシレン−モノオキシゲナーゼを形成
し、有効な染色体−またはプラスミド化したアルコール
デヒドロゲナーゼを形成しない遺伝子を含み、それによ
って、芳香族の５員または６員複素環式化合物のメチル
基をヒドロキシル化して相当するヒドロキシルジメチル
誘導体に変換することができる微生物を使用する。 【効果】 メチル基が特異的にヒドロキシル化された５
員または６員複素環式化合物が得られる。
し、有効な染色体−またはプラスミド化したアルコール
デヒドロゲナーゼを形成しない遺伝子を含み、それによ
って、芳香族の５員または６員複素環式化合物のメチル
基をヒドロキシル化して相当するヒドロキシルジメチル
誘導体に変換することができる微生物を使用する。 【効果】 メチル基が特異的にヒドロキシル化された５
員または６員複素環式化合物が得られる。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、芳香族の５員または６員複素環
式化合物におけるメチル基をヒドロキシル化するための
微生物学的方法、その方法にとくに好適な新規なハイブ
リッドプラスミド、および新規な生産品種に関する。
式化合物におけるメチル基をヒドロキシル化するための
微生物学的方法、その方法にとくに好適な新規なハイブ
リッドプラスミド、および新規な生産品種に関する。
【０００２】これらのヒドロキシルメチル化した複素環
式化合物は、たとえば医薬および農薬を製造するための
重要な中間生成物である。
式化合物は、たとえば医薬および農薬を製造するための
重要な中間生成物である。
【０００３】遺伝子工学的に変性した微生物によって、
脂肪族側鎖の末端をヒドロキシル化するための微生物学
的方法は、ＥＰ−Ａ ０２７７６７４により既知であ
る。この反応は、シュードモナス・オレオボランスのＯ
ＣＴ−プラスミドからの遺伝子ａｌｋＢＡによりコード
化されたアルカン−ヒドロキシラーゼにより触媒作用を
受ける。
脂肪族側鎖の末端をヒドロキシル化するための微生物学
的方法は、ＥＰ−Ａ ０２７７６７４により既知であ
る。この反応は、シュードモナス・オレオボランスのＯ
ＣＴ−プラスミドからの遺伝子ａｌｋＢＡによりコード
化されたアルカン−ヒドロキシラーゼにより触媒作用を
受ける。
【０００４】これらの微生物は、生じたヒドロキシ基を
それ以上酸に酸化できないように遺伝子的に変性されて
いる。 しかし、この遺伝子の自然発現および調整（ａ
ｌｋＲ）は維持されている。 これらの微生物には、複
素環式化合物におけるメチル基の酸化に対する活性は全
く無く、アルカン類および６〜１２個の炭素原子を有す
るアルキル基を備えたアルキル化合物のヒドロキシル化
だけに触媒作用する。
それ以上酸に酸化できないように遺伝子的に変性されて
いる。 しかし、この遺伝子の自然発現および調整（ａ
ｌｋＲ）は維持されている。 これらの微生物には、複
素環式化合物におけるメチル基の酸化に対する活性は全
く無く、アルカン類および６〜１２個の炭素原子を有す
るアルキル基を備えたアルキル化合物のヒドロキシル化
だけに触媒作用する。
【０００５】さらに、ハラヤマら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．１７１，１９８９，ｐ．５０４８−５０５５か
ら、シュードモナス・プチダ種の微生物は、プラスミド
ｐＷＷＯにより、トルエンのメチル基を３段階で安息香
酸に酸化できることが知られている。
ｏｌ．１７１，１９８９，ｐ．５０４８−５０５５か
ら、シュードモナス・プチダ種の微生物は、プラスミド
ｐＷＷＯにより、トルエンのメチル基を３段階で安息香
酸に酸化できることが知られている。
【０００６】その際、キシレン−モノオキシゲナーゼ
（ｘｙｌＭＡ）の作用によりまずベンジルアルコールが
生じ、それが続く二つの段階でアルコールデヒドロゲナ
ーゼ（ｘｙｌＢ）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ
（ｘｙｌＣ）による触媒作用を受け、酸に転換される。
この品種では、キシレン分解に対してコード化するｘ
ｙｌ−遺伝子およびｘｙｌ−遺伝子の調整を受けもつ遺
伝子も、プラスミドｐＷＷＯ上にある。
（ｘｙｌＭＡ）の作用によりまずベンジルアルコールが
生じ、それが続く二つの段階でアルコールデヒドロゲナ
ーゼ（ｘｙｌＢ）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ
（ｘｙｌＣ）による触媒作用を受け、酸に転換される。
この品種では、キシレン分解に対してコード化するｘ
ｙｌ−遺伝子およびｘｙｌ−遺伝子の調整を受けもつ遺
伝子も、プラスミドｐＷＷＯ上にある。
【０００７】したがって、そこから、メチル基の酸化を
受けもつ遺伝子ｘｙｌＭＡＢＣＮの特性、確認、クロー
ニング、選択および制限地図も知られている。 遺伝子
ｘｙｌＮの機能は、まだ知られていない。 しかし、芳
香族の５員または６員複素環式化合物におけるメチル基
を、ヒドロキシル化できる微生物学的方法は知られてい
ない。 そのような特異的にヒドロキシメチル化した複
素環式化合物を化学的に得るのは、非常に困難である。
受けもつ遺伝子ｘｙｌＭＡＢＣＮの特性、確認、クロー
ニング、選択および制限地図も知られている。 遺伝子
ｘｙｌＮの機能は、まだ知られていない。 しかし、芳
香族の５員または６員複素環式化合物におけるメチル基
を、ヒドロキシル化できる微生物学的方法は知られてい
ない。 そのような特異的にヒドロキシメチル化した複
素環式化合物を化学的に得るのは、非常に困難である。
【０００８】したがって本発明の目的は、芳香族の５員
または６員複素環式化合物におけるメチル基を特異的に
ヒドロキシル化して相当する純粋なヒドロキシメチル化
した誘導体に変換し、その際、生成物はそれ以上異化さ
れないような微生物学的方法を開発することである。
または６員複素環式化合物におけるメチル基を特異的に
ヒドロキシル化して相当する純粋なヒドロキシメチル化
した誘導体に変換し、その際、生成物はそれ以上異化さ
れないような微生物学的方法を開発することである。
【０００９】この目的は、請求項１により達成される。
本発明により、この方法は、 ａ）活性キシレン−モノオキシゲナーゼを形成するシュ
ードモナスＴＯＬ−プラスミドの遺伝子を含み、 ｂ）有効な染色体−またはプラスミド−コード化したア
ルコールデヒドロゲナーゼを形成せず、 それによって、芳香族の５員または６員複素環式化合物
のメチル基をヒドロキシル化して相当するヒドロキシメ
チル誘導体に変換することができる微生物により行な
い、その際、複素環式化合物は、変換のための基質とし
て作用するものであってヒドロキシル化すべきメチル基
の隣接炭素原子に置換基をもたず、ヒドロキシメチル誘
導体はそれ以上異化されない。
本発明により、この方法は、 ａ）活性キシレン−モノオキシゲナーゼを形成するシュ
ードモナスＴＯＬ−プラスミドの遺伝子を含み、 ｂ）有効な染色体−またはプラスミド−コード化したア
ルコールデヒドロゲナーゼを形成せず、 それによって、芳香族の５員または６員複素環式化合物
のメチル基をヒドロキシル化して相当するヒドロキシメ
チル誘導体に変換することができる微生物により行な
い、その際、複素環式化合物は、変換のための基質とし
て作用するものであってヒドロキシル化すべきメチル基
の隣接炭素原子に置換基をもたず、ヒドロキシメチル誘
導体はそれ以上異化されない。
【００１０】好ましくは、これらの微生物は、下記の制
限地図を特徴とし、すでにＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
７１（１９８９）、５０４８−５０５５頁に記載されて
いるシュードモナスＴＯＬ−プラスミドｐＷＷＯからキ
シレン−モノオキシゲナーゼを形成するための遺伝子を
含む。
限地図を特徴とし、すでにＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
７１（１９８９）、５０４８−５０５５頁に記載されて
いるシュードモナスＴＯＬ−プラスミドｐＷＷＯからキ
シレン−モノオキシゲナーゼを形成するための遺伝子を
含む。
【００１１】
【図２】
【００１２】キシレン−モノオキシゲナーゼー遺伝子の
供給源 キシレン−モノオキシゲナーゼ−遺伝子の供給源として
は、たとえばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションでＡＴＣＣ ３３０１５の番号で入手できる、Ｔ
ＯＬ−プラスミドｐＷＷＯを有するシュードモナス・プ
チダを使用することができる。
供給源 キシレン−モノオキシゲナーゼ−遺伝子の供給源として
は、たとえばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ションでＡＴＣＣ ３３０１５の番号で入手できる、Ｔ
ＯＬ−プラスミドｐＷＷＯを有するシュードモナス・プ
チダを使用することができる。
【００１３】キシレン−モノオキシゲナーゼに関してコ
ード化する遺伝子情報は、ａ）ＤＮＡ供給源として使用
するこの微生物からＴＯＬ−プラスミド−ＤＮＡを分離
し、次いで、ｂ）キシレン−モノオキシゲナーゼのため
の遺伝子を分離するためにこのＴＯＬ−プラスミド−Ｄ
ＮＡを消化し、次いで、特異的な遺伝子配列をｃ）発現
ベクターの中に導入し、それによってｄ）ハイブリッド
プラスミドが生じる、ことにより得ることができる。
次いで、このハイブリッドプラスミドは、この方法に好
適な微生物ｅ）（宿主品種）の中に、形質転換により取
り込むことができる。 次いで、この形質転換した宿主
品種が、本発明の発酵方法ｉ）のための生産品種ｇ）
（選択ｈ）後）を形成する。
ード化する遺伝子情報は、ａ）ＤＮＡ供給源として使用
するこの微生物からＴＯＬ−プラスミド−ＤＮＡを分離
し、次いで、ｂ）キシレン−モノオキシゲナーゼのため
の遺伝子を分離するためにこのＴＯＬ−プラスミド−Ｄ
ＮＡを消化し、次いで、特異的な遺伝子配列をｃ）発現
ベクターの中に導入し、それによってｄ）ハイブリッド
プラスミドが生じる、ことにより得ることができる。
次いで、このハイブリッドプラスミドは、この方法に好
適な微生物ｅ）（宿主品種）の中に、形質転換により取
り込むことができる。 次いで、この形質転換した宿主
品種が、本発明の発酵方法ｉ）のための生産品種ｇ）
（選択ｈ）後）を形成する。
【００１４】ａ）ＴＯＬ−プラスミド−ＤＮＡの分離 ＴＯＬ−プラスミド−ＤＮＡは、当業者には通常の方
法、たとえばハンセンおよびオルセンの方法〔Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．１３５，１９７８，ｐ．２２７−２３
８〕またはハンフレーら〔Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ３８３，１９７５，ｐ．４５７−４８
３〕の方法により得られる。 大量のＴＯＬ−プラスミ
ド−ＤＮＡを分離するには、シュードモナス・プチダ
（ＡＴＣＣ３３０１５）を完全に溶解し、続いて密度勾
配遠心分離によりＴＯＬ−プラスミドを分離する、ハン
フレーら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ
３８３，１９７５，ｐ．４５７−４８３）の方法を使
用するのが有利である。
法、たとえばハンセンおよびオルセンの方法〔Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．１３５，１９７８，ｐ．２２７−２３
８〕またはハンフレーら〔Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ３８３，１９７５，ｐ．４５７−４８
３〕の方法により得られる。 大量のＴＯＬ−プラスミ
ド−ＤＮＡを分離するには、シュードモナス・プチダ
（ＡＴＣＣ３３０１５）を完全に溶解し、続いて密度勾
配遠心分離によりＴＯＬ−プラスミドを分離する、ハン
フレーら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ
３８３，１９７５，ｐ．４５７−４８３）の方法を使
用するのが有利である。
【００１５】ｂ）制限酵素による分解およびアガロース
−ゲル−電気泳動によるＤＮＡの分離 ＴＯＬ−プラスミド−ＤＮＡを分離した後、ＴＯＬ−プ
ラスミド−ＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩおよびＨｉｎｄ I
IIにより分解するのが好ましいが、その際、キシレン−
モノオキシゲナーゼに関してコード化を行なうＤＮＡ−
分節を、『分子生物学における現況』，ジョン・ウィリ
ー・アンド・サンズ（ニューヨーク）１９８７，２．６
章，「大型ＤＮＡ−制限分節のアガロースゲルからの分
離および精製」に準じて、アガロース−ゲル−電気泳動
により分離することができる。
−ゲル−電気泳動によるＤＮＡの分離 ＴＯＬ−プラスミド−ＤＮＡを分離した後、ＴＯＬ−プ
ラスミド−ＤＮＡを制限酵素ＳａｌＩおよびＨｉｎｄ I
IIにより分解するのが好ましいが、その際、キシレン−
モノオキシゲナーゼに関してコード化を行なうＤＮＡ−
分節を、『分子生物学における現況』，ジョン・ウィリ
ー・アンド・サンズ（ニューヨーク）１９８７，２．６
章，「大型ＤＮＡ−制限分節のアガロースゲルからの分
離および精製」に準じて、アガロース−ゲル−電気泳動
により分離することができる。
【００１６】このＤＮＡ分節は、すでに前に述べたよう
に、下記の制限地図により特徴付けられ、有効なアルコ
ールデヒドロゲナーゼをコード化する遺伝子をまったく
含まない。
に、下記の制限地図により特徴付けられ、有効なアルコ
ールデヒドロゲナーゼをコード化する遺伝子をまったく
含まない。
【００１７】
【図３】
【００１８】ｃ）発現ベクターにおけるＤＮＡ分節の結
合 そのようにして得た遺伝子分節は、通常の分子生物学的
技術により、あらかじめ同じ程度に切断しておいた発現
ベクター−ＤＮＡと結合し、ハイブリッドプラスミドに
することができる。
合 そのようにして得た遺伝子分節は、通常の分子生物学的
技術により、あらかじめ同じ程度に切断しておいた発現
ベクター−ＤＮＡと結合し、ハイブリッドプラスミドに
することができる。
【００１９】発現ベクターは、通常、好適な、大部分調
整可能なプロモーターを含む。 このプロモーターの後
に、好ましくは転写方向で、制限酵素のための一つ以上
の単一の切断位置がある。 通常、これらの切断位置
で、発現させるべき望ましい遺伝子分節を挿入する。
整可能なプロモーターを含む。 このプロモーターの後
に、好ましくは転写方向で、制限酵素のための一つ以上
の単一の切断位置がある。 通常、これらの切断位置
で、発現させるべき望ましい遺伝子分節を挿入する。
【００２０】発現ベクターとしては、表１に示すすべて
を使用することが好ましい。 本発明の方法には、ｐＭ
Ｅ２８５，ｐＫＴ２４０，ｐＭＭＢ６７ＥＨまたはｐＭ
ＭＢ６７ＥＨ＊のような広い宿主領域を有する発現ベク
ターを使用するのが有利である。
を使用することが好ましい。 本発明の方法には、ｐＭ
Ｅ２８５，ｐＫＴ２４０，ｐＭＭＢ６７ＥＨまたはｐＭ
ＭＢ６７ＥＨ＊のような広い宿主領域を有する発現ベク
ターを使用するのが有利である。
【００２１】好ましくは、これらの発現ベクターを制限
酵素ＳａｌＩおよびＨｉｎｄ IIIで切断し、生じた制限
末端を、続いて、たとえばＴ４−ＤＮＡ−リガーゼを使
用して、分離したＴＯＬ−プラスミド−ＤＮＡと結合さ
せる。 場合によっては、たとえば『分子生物学におけ
る現況』，ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（ニュー
ヨーク）１９８７，３．１６章，「ＤＮＡ−分節のサブ
クローニング」に記載されているような、他の結合方法
を使用することもできる。
酵素ＳａｌＩおよびＨｉｎｄ IIIで切断し、生じた制限
末端を、続いて、たとえばＴ４−ＤＮＡ−リガーゼを使
用して、分離したＴＯＬ−プラスミド−ＤＮＡと結合さ
せる。 場合によっては、たとえば『分子生物学におけ
る現況』，ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（ニュー
ヨーク）１９８７，３．１６章，「ＤＮＡ−分節のサブ
クローニング」に記載されているような、他の結合方法
を使用することもできる。
【００２２】ｄ）ハイブリッドプラスミド そのようにして生じた好適なハイブリッドプラスミドｐ
Ｌ０３，ｐＬ０４およびｐＬ０５も同様に本発明の要素
であり、広い宿主領域を備え、それゆえ、高い基質許容
差および抽出許容差で、宿主品種に導入することができ
る。
Ｌ０３，ｐＬ０４およびｐＬ０５も同様に本発明の要素
であり、広い宿主領域を備え、それゆえ、高い基質許容
差および抽出許容差で、宿主品種に導入することができ
る。
【００２３】これらのハイブリッドプラスミドは、自然
の調整機構により連結を外すことが好ましい。 それに
よって、プロモーターＰtacを備えたハイブリッドプラ
スミドｐＬ０４（発現ベクターｐＭＭＢ６７ＥＨおよび
前に記載した制限地図により特徴づけられるＴＯＬ−プ
ラスミド−遺伝子からなる）は、リプレッサー遺伝子ｌ
ａｃＩｑにより調整される。
の調整機構により連結を外すことが好ましい。 それに
よって、プロモーターＰtacを備えたハイブリッドプラ
スミドｐＬ０４（発現ベクターｐＭＭＢ６７ＥＨおよび
前に記載した制限地図により特徴づけられるＴＯＬ−プ
ラスミド−遺伝子からなる）は、リプレッサー遺伝子ｌ
ａｃＩｑにより調整される。
【００２４】したがって、ＴＯＬ−プラスミド−遺伝子
の発現は、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）
により誘発される。
の発現は、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）
により誘発される。
【００２５】プロモーターＰtacを備えたハイブリッド
プラスミドｐＬ０５（発現ベクターｐＭＭＢ６７ＥＨ＊
および上記の制限地図により特徴づけられるＴＯＬ−プ
ラスミド−遺伝子からなる）におけるＴＯＬ−プラスミ
ド−遺伝子の発現は、リプレッサー遺伝子ｌａｃＩｑが
無いために、永続的（本質的）に誘発される。
プラスミドｐＬ０５（発現ベクターｐＭＭＢ６７ＥＨ＊
および上記の制限地図により特徴づけられるＴＯＬ−プ
ラスミド−遺伝子からなる）におけるＴＯＬ−プラスミ
ド−遺伝子の発現は、リプレッサー遺伝子ｌａｃＩｑが
無いために、永続的（本質的）に誘発される。
【００２６】このために、カナマイシン耐性を導入する
ことにより、リプレッサー遺伝子ｌａｃＩｑをｐＭＭＢ
６７ＥＨ＊中で突然変異させるのが有利である。 同様
に、宿主領域のせまいハイブリッドプラスミドを使用す
ることも可能である。 好ましくは、宿主領域のせまい
ハイブリッドプラスミドとして、プロモーターラムダＰ
Lを有するｐＧＳＨ２８３６を使用し、その際ＴＯＬ−
プラスミド−遺伝子の発現が永続的（本質的）に誘発さ
れる。 ｐＧＳＨ２８３６のための宿主としてたとえば
エシェリチア・コリ（以下、「Ｅ．コリ」）Ｋ１２＊を
使用する場合、プロモーターラムダＰLの発現を達成す
るために、熱により、そこで染色体と一体化したリプレ
ッサー遺伝子ｃＩ８５７を不活性化しなければならな
い。
ことにより、リプレッサー遺伝子ｌａｃＩｑをｐＭＭＢ
６７ＥＨ＊中で突然変異させるのが有利である。 同様
に、宿主領域のせまいハイブリッドプラスミドを使用す
ることも可能である。 好ましくは、宿主領域のせまい
ハイブリッドプラスミドとして、プロモーターラムダＰ
Lを有するｐＧＳＨ２８３６を使用し、その際ＴＯＬ−
プラスミド−遺伝子の発現が永続的（本質的）に誘発さ
れる。 ｐＧＳＨ２８３６のための宿主としてたとえば
エシェリチア・コリ（以下、「Ｅ．コリ」）Ｋ１２＊を
使用する場合、プロモーターラムダＰLの発現を達成す
るために、熱により、そこで染色体と一体化したリプレ
ッサー遺伝子ｃＩ８５７を不活性化しなければならな
い。
【００２７】ハイブリッドプラスミドｐＧＳＨ２８３６
は、ドイチェン・ザムルング・フュア・ミクロオルガニ
ズメン・ウント・ツェルクルトゥーレンＧｍｂＨ，マシ
ェローダーヴェク１ｂ，Ｄ−３３００ブラウンシュヴァ
イクに、番号ＤＳＭ６１５４によりＥ．コリＫ１２＊内
で寄託してある。 ハイブリッドプラスミドｐＬ０４お
よびｐＬ０５は、以下の節に述べるように、Ｅ．コリＫ
１２＊（ｐＬ０４）またはシュードモナス・プチダ（ｐ
Ｌ０５）内で寄託してある。
は、ドイチェン・ザムルング・フュア・ミクロオルガニ
ズメン・ウント・ツェルクルトゥーレンＧｍｂＨ，マシ
ェローダーヴェク１ｂ，Ｄ−３３００ブラウンシュヴァ
イクに、番号ＤＳＭ６１５４によりＥ．コリＫ１２＊内
で寄託してある。 ハイブリッドプラスミドｐＬ０４お
よびｐＬ０５は、以下の節に述べるように、Ｅ．コリＫ
１２＊（ｐＬ０４）またはシュードモナス・プチダ（ｐ
Ｌ０５）内で寄託してある。
【００２８】ｅ）宿主品種 そのようにして生じたハイブリッドプラスミド（ｐＬ０
３，ｐＬ０４，ｐＬ０５）は、宿主領域が広いために、
多数の宿主品種中に導入することができる。
３，ｐＬ０４，ｐＬ０５）は、宿主領域が広いために、
多数の宿主品種中に導入することができる。
【００２９】好ましくは、基質許容差および抽出許容差
の高い宿主品種、たとえばシュードモナス、アシネトバ
クター、リゾビウム、アグロバクテリウムまたはエシェ
リチア種の宿主品種を使用する。
の高い宿主品種、たとえばシュードモナス、アシネトバ
クター、リゾビウム、アグロバクテリウムまたはエシェ
リチア種の宿主品種を使用する。
【００３０】ｆ）形質転換 ハイブリッドプラスミドの上記宿主品種への導入は、通
常の方法、好ましくはレーダーバーグおよびコーエンの
方法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１９，１９７４，
ｐ．１０７２−１０７４〕により行なうことができる。
常の方法、好ましくはレーダーバーグおよびコーエンの
方法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１９，１９７４，
ｐ．１０７２−１０７４〕により行なうことができる。
【００３１】ｇ）生産品種 生産品種としては、表２に示すすべての品種を使用する
のが有利である。 ハイブリッドプラスミドｐＬ０３，
ｐＬ０４およびｐＬ０５により形質転換した微生物（表
２）は新規であり、したがって同様に本発明の構成要素
である。
のが有利である。 ハイブリッドプラスミドｐＬ０３，
ｐＬ０４およびｐＬ０５により形質転換した微生物（表
２）は新規であり、したがって同様に本発明の構成要素
である。
【００３２】好ましくは、１９９０年８月２９日にＤＳ
Ｍ番号６１５３で寄託したハイブリッドプラスミドｐＬ
０４で形質転換した微生物Ｅ．コリＫ１２＊、または１
９９０年８月２９日にＤＳＭ番号６１５２で寄託したハ
イブリッドプラスミドｐＬ０５で形質転換した微生物シ
ュードモナス・プチダＪＤ７、ならびにそれらの子孫お
よび突然変異体を使用する。
Ｍ番号６１５３で寄託したハイブリッドプラスミドｐＬ
０４で形質転換した微生物Ｅ．コリＫ１２＊、または１
９９０年８月２９日にＤＳＭ番号６１５２で寄託したハ
イブリッドプラスミドｐＬ０５で形質転換した微生物シ
ュードモナス・プチダＪＤ７、ならびにそれらの子孫お
よび突然変異体を使用する。
【００３３】寄託は、ドイチェン・ザムルング・フュア
・ミクロオルガニズメン・ウント・ツェルクルトゥーレ
ンＧｍｂＨ，マシェローダーヴェク１ｂ，Ｄ−３３００
ブラウンシュヴァイクで行なった。
・ミクロオルガニズメン・ウント・ツェルクルトゥーレ
ンＧｍｂＨ，マシェローダーヴェク１ｂ，Ｄ−３３００
ブラウンシュヴァイクで行なった。
【００３４】また、天然のＴＯＬ−プラスミドを含み、
活性アルコールデヒドロゲナーゼに関してコード化する
遺伝子を除去、または不活性化した微生物も生産品種と
して使用できる。 その不活性化ないし除去は、古典的
な突然変異、たとえばアクリジンオレンジを使用し、ト
ランスポゾン挿入により、あるいは以下に記載する同族
組換えによる「遺伝子交換」法（Ａ．ツィンマーマン
ら、『分子微生物学』５，１９９１，ｐ．１４８３−１
４９０）により行なうことができる。
活性アルコールデヒドロゲナーゼに関してコード化する
遺伝子を除去、または不活性化した微生物も生産品種と
して使用できる。 その不活性化ないし除去は、古典的
な突然変異、たとえばアクリジンオレンジを使用し、ト
ランスポゾン挿入により、あるいは以下に記載する同族
組換えによる「遺伝子交換」法（Ａ．ツィンマーマン
ら、『分子微生物学』５，１９９１，ｐ．１４８３−１
４９０）により行なうことができる。
【００３５】次いで、これらの生産品種中で、たとえば
トルエン、キシレンまたはサイメンのような化合物で誘
発することにより、ＴＯＬ−プラスミド−遺伝子の発現
を行なう。
トルエン、キシレンまたはサイメンのような化合物で誘
発することにより、ＴＯＬ−プラスミド−遺伝子の発現
を行なう。
【００３６】アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の除去
は、好ましくは、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を
あらかじめ除去してある、前に調製した助ハイブリッド
プラスミドを、同族組換えにより、天然ＴＯＬ−プラス
ミド中に取り入れる（同族組換えにより「遺伝子交
換」）ことにより行なう。
は、好ましくは、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を
あらかじめ除去してある、前に調製した助ハイブリッド
プラスミドを、同族組換えにより、天然ＴＯＬ−プラス
ミド中に取り入れる（同族組換えにより「遺伝子交
換」）ことにより行なう。
【００３７】この取り入れにより、天然のＴＯＬ−プラ
スミド中のアルコールデヒドロゲナーゼが効果的に除去
される。
スミド中のアルコールデヒドロゲナーゼが効果的に除去
される。
【００３８】 ｈ）形質転換した微生物（生産品種）の選択 形質転換した微生物は、通常、最小培地−グルコース−
寒天上で、適当な抑制濃度の抗生物質で選択することが
できる。 使用した抗生物質の耐性特徴を表１に示す。
寒天上で、適当な抑制濃度の抗生物質で選択することが
できる。 使用した抗生物質の耐性特徴を表１に示す。
【００３９】ｉ）発酵方法 本発明に従い、上記の方法により得られた本発明の方法
のための生産品種およびそれらの子孫および突然変異体
を、芳香族の５員または６員複素環式化合物におけるメ
チル基をヒドロキシル化するために使用する。
のための生産品種およびそれらの子孫および突然変異体
を、芳香族の５員または６員複素環式化合物におけるメ
チル基をヒドロキシル化するために使用する。
【００４０】変換のための基質として、酸素、窒素、イ
オウの中から選択した一種以上のヘテロ原子を含む、メ
チル化した芳香族の５員または６員複素環式化合物を使
用することができる。 好適な５員複素環式化合物とし
ては、たとえば、ヒドロキシル化すべきメチル基の隣の
炭素原子に置換基をもたない、メチル化したチオフェ
ン、フラン、ピロール、チアゾール、ピラゾールおよび
イミダゾールの誘導体がある。 好ましくは、５員複素
環式化合物として、３，５−ジメチルピラゾール、４−
メチルチアゾールおよび２，５−ジメチルチオフェンを
使用する。
オウの中から選択した一種以上のヘテロ原子を含む、メ
チル化した芳香族の５員または６員複素環式化合物を使
用することができる。 好適な５員複素環式化合物とし
ては、たとえば、ヒドロキシル化すべきメチル基の隣の
炭素原子に置換基をもたない、メチル化したチオフェ
ン、フラン、ピロール、チアゾール、ピラゾールおよび
イミダゾールの誘導体がある。 好ましくは、５員複素
環式化合物として、３，５−ジメチルピラゾール、４−
メチルチアゾールおよび２，５−ジメチルチオフェンを
使用する。
【００４１】好適な６員複素環式化合物としては、たと
えばヒドロキシル化すべきメチル基の隣の炭素原子に置
換基をもたない、メチル化したピリジン、ピリミジン、
ピラジンおよびピリダジンの誘導体がある。 好ましく
は、６員複素環式化合物として、２−クロロ−５−メチ
ルピリジン、２，５−ジメチルピラジンおよび２，６−
ジメチルピリミジンを使用する。
えばヒドロキシル化すべきメチル基の隣の炭素原子に置
換基をもたない、メチル化したピリジン、ピリミジン、
ピラジンおよびピリダジンの誘導体がある。 好ましく
は、６員複素環式化合物として、２−クロロ−５−メチ
ルピリジン、２，５−ジメチルピラジンおよび２，６−
ジメチルピリミジンを使用する。
【００４２】基質を加える前に、細胞を、６５０nmにお
ける光学密度（ＯＤ650）が培養基中で１〜２００、好
ましくは光学密度が５〜１００になるように調整する。
ける光学密度（ＯＤ650）が培養基中で１〜２００、好
ましくは光学密度が５〜１００になるように調整する。
【００４３】変換は、培養基中の基質濃度が液体基質に
対して２０％(w/v) ないし(v/v) を超えないように、基
質を１回で、または連続的に加えて行なうことができ
る。
対して２０％(w/v) ないし(v/v) を超えないように、基
質を１回で、または連続的に加えて行なうことができ
る。
【００４４】培養基中の基質濃度が５％(w/v) ないし(v
/v) を超えないように基質を加えることが好ましい。
/v) を超えないように基質を加えることが好ましい。
【００４５】変換は、通常、静止した細胞で、４〜１
１、好ましくは６〜１０のｐＨ領域で行なう。
１、好ましくは６〜１０のｐＨ領域で行なう。
【００４６】変換は、通常、１５〜５０℃、好ましくは
２５〜４５℃の温度で行なう。
２５〜４５℃の温度で行なう。
【００４７】変換後、相当するヒドロキシメチル誘導体
を既知の技術および方法で分離する。
を既知の技術および方法で分離する。
【００４８】〔実施例１〕遺伝子ｘｙＩＭＡのクローニング １．１プラスミド調製 〔ハンフリーら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ３８３（１９７５），ｐ．４５７−４８３〕 十分に成長した細菌培養シュードモナス・プチダｐＷＷ
Ｏ（ＡＴＣＣ ３３０１５）の１ｌの細胞を遠心分離し
た。 細胞を１０mlの、０．０５Ｍ−トリス緩衝液中２
５％スクロース、ｐＨ８．０に再分散させた後、１．５
mlのリゾチーム溶液（０．２５−Ｍトリス緩衝液中に２
０mg／ml、ｐＨ８．０）を加えた。 続いて氷上で５分
間培養し、１０mlの０．２５Ｍ−Ｎａ2ＥＤＴＡ（ｐＨ
８）を加え、氷上でさらに５分間培養した。次いで、１
５mlのＢｒｉｊＲポリオキシエチレンラウリルエーテル
／ＤＣＬ溶液（１％ＢｒｉｊＲ５８、０．０１Ｍトリス
緩衝液、０．００１Ｍ−Ｎａ2ＥＤＴＡ中０．４％のナ
トリウムデオキシコレート、ｐＨ８．０）を加えた。
一様に十分混合し、完全に細胞溶解するまで氷上で３０
分間培養した。
ｃｔａ３８３（１９７５），ｐ．４５７−４８３〕 十分に成長した細菌培養シュードモナス・プチダｐＷＷ
Ｏ（ＡＴＣＣ ３３０１５）の１ｌの細胞を遠心分離し
た。 細胞を１０mlの、０．０５Ｍ−トリス緩衝液中２
５％スクロース、ｐＨ８．０に再分散させた後、１．５
mlのリゾチーム溶液（０．２５−Ｍトリス緩衝液中に２
０mg／ml、ｐＨ８．０）を加えた。 続いて氷上で５分
間培養し、１０mlの０．２５Ｍ−Ｎａ2ＥＤＴＡ（ｐＨ
８）を加え、氷上でさらに５分間培養した。次いで、１
５mlのＢｒｉｊＲポリオキシエチレンラウリルエーテル
／ＤＣＬ溶液（１％ＢｒｉｊＲ５８、０．０１Ｍトリス
緩衝液、０．００１Ｍ−Ｎａ2ＥＤＴＡ中０．４％のナ
トリウムデオキシコレート、ｐＨ８．０）を加えた。
一様に十分混合し、完全に細胞溶解するまで氷上で３０
分間培養した。
【００４９】４℃で、１６０００rpmで４５分間遠心分
離し、上澄み液をオートクレーブ処理したメスシリンダ
ーに入れた。 ３％(w/v)ＮａＣｌおよび１０％ＰＥＧ
（ポリエチレングリコール）を加えた。 パラフィルム
で密閉したシリンダーを注意深く回転させて溶液を得
た。 ４℃で２時間培養した。 ５０００rpm で２分間
遠心分離した。 次いで上澄み液を取り、沈殿物を５ml
のＴＥＳ−緩衝液（０．０５Ｍ−トリス、０．００５Ｍ
−Ｎａ2ＥＤＴＡ、０．０５Ｍ−ＮａＣｌ、ｐＨ８．
０）に溶解し、オートクレーブ処理し、８．０ｇの塩化
カルシウムを備えた１５mlコーレックス試験管中に移し
た。 ０．６mlの臭化エチジウム溶液（１０mg／ml）を
加えた後、氷上で３０分間培養した。
離し、上澄み液をオートクレーブ処理したメスシリンダ
ーに入れた。 ３％(w/v)ＮａＣｌおよび１０％ＰＥＧ
（ポリエチレングリコール）を加えた。 パラフィルム
で密閉したシリンダーを注意深く回転させて溶液を得
た。 ４℃で２時間培養した。 ５０００rpm で２分間
遠心分離した。 次いで上澄み液を取り、沈殿物を５ml
のＴＥＳ−緩衝液（０．０５Ｍ−トリス、０．００５Ｍ
−Ｎａ2ＥＤＴＡ、０．０５Ｍ−ＮａＣｌ、ｐＨ８．
０）に溶解し、オートクレーブ処理し、８．０ｇの塩化
カルシウムを備えた１５mlコーレックス試験管中に移し
た。 ０．６mlの臭化エチジウム溶液（１０mg／ml）を
加えた後、氷上で３０分間培養した。
【００５０】４℃、１２０００rpm で３０分間遠心分離
した。 次いで、注意深くデカンテーションして沈殿し
たＰＥＧを溶液から分離した。
した。 次いで、注意深くデカンテーションして沈殿し
たＰＥＧを溶液から分離した。
【００５１】この溶液を密閉試験管中で、５０ＴＩ−ロ
ーターで、１８℃で、４００００rpm で３０時間超遠心
分離した。 ＵＶ−トランスイルミネーターの前で、カ
ニューレにより、ＣｓＣｌ2勾配からプラスミドバンド
を分離した。
ーターで、１８℃で、４００００rpm で３０時間超遠心
分離した。 ＵＶ−トランスイルミネーターの前で、カ
ニューレにより、ＣｓＣｌ2勾配からプラスミドバンド
を分離した。
【００５２】ｎ−ブタノールとともに振とうして、プラ
スミド試料から臭化エチジウムを分離した。 プラスミ
ド−ＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、沈殿物をス
ピード・バック（Ｒ）濃縮器で乾燥させた。 このプラ
スミド試料を０．０１Ｍトリス緩衝液、０．００１Ｍ−
Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中に再分散させた。
スミド試料から臭化エチジウムを分離した。 プラスミ
ド−ＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、沈殿物をス
ピード・バック（Ｒ）濃縮器で乾燥させた。 このプラ
スミド試料を０．０１Ｍトリス緩衝液、０．００１Ｍ−
Ｎａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中に再分散させた。
【００５３】１．２アガロースゲルからＤＮＡ−分節ｘ
ｙｌＭＡの分離 ＳａｉＩおよびＨｉｎｄ III（プラスミド−ＤＮＡ１μ
ｇあたり各４単位）で切断したプラスミド−ＤＮＡを、
調整アガロースゲル電気泳動にかけた（ＴＢＥ緩衝液
（０．０９Ｍのトリス−ホウ酸塩、２．５ｍＭのＮａ2
ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３、臭化エチジウム（１００μｇ／
１００ml））中０．６％(w/v) アガロース）。
ｙｌＭＡの分離 ＳａｉＩおよびＨｉｎｄ III（プラスミド−ＤＮＡ１μ
ｇあたり各４単位）で切断したプラスミド−ＤＮＡを、
調整アガロースゲル電気泳動にかけた（ＴＢＥ緩衝液
（０．０９Ｍのトリス−ホウ酸塩、２．５ｍＭのＮａ2
ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３、臭化エチジウム（１００μｇ／
１００ml））中０．６％(w/v) アガロース）。
【００５４】小さな細片に切断したＤＥＡＥ−セルロー
ス薄膜をＨ2Ｏにひたし、望ましいＤＮＡ分節帯のすぐ
前にあるアガロースゲル中の隙間に差し込んだ。 ＤＮ
Ａを電界中で薄膜上に移行させた。 必要に応じて、よ
り高いＤＮＡ帯は別の薄膜で引き止めた。 移行させた
ＤＮＡは、５００μｌの溶離緩衝液（２０ｍＭのトリ
ス、ｐＨ７．５、１ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡ、１．５Ｍの
ＮａＣｌ）で、６５℃で１時間かけて薄膜から洗い流し
た。
ス薄膜をＨ2Ｏにひたし、望ましいＤＮＡ分節帯のすぐ
前にあるアガロースゲル中の隙間に差し込んだ。 ＤＮ
Ａを電界中で薄膜上に移行させた。 必要に応じて、よ
り高いＤＮＡ帯は別の薄膜で引き止めた。 移行させた
ＤＮＡは、５００μｌの溶離緩衝液（２０ｍＭのトリ
ス、ｐＨ７．５、１ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡ、１．５Ｍの
ＮａＣｌ）で、６５℃で１時間かけて薄膜から洗い流し
た。
【００５５】薄膜を外し、洗浄した。 臭化エチジウム
を、水で飽和したｎ−ブタノールによりＤＮＡ−溶液か
ら抽出し、ＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させた。
を、水で飽和したｎ−ブタノールによりＤＮＡ−溶液か
ら抽出し、ＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させた。
【００５６】沈殿物をスピード・バック（Ｒ）濃縮器で
乾燥させた。 この分節試料を０．０１Ｍのトリス緩衝
液、０．００１ＭのＮａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に再分
散させた。
乾燥させた。 この分節試料を０．０１Ｍのトリス緩衝
液、０．００１ＭのＮａ2ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に再分
散させた。
【００５７】１．３ＤＮＡ−分節ｘｙｌＭＡと発現ベクターの結合 （『分子生物学における現況』ジョン・ウィリー・アン
ド・サンズ（ニューヨーク）１９８７，３．１６章，
「ＤＮＡ−分節のサブクローニング」） ａ）ハイブリッドプラスミドｐＬ０４の調製 発現ベクター−ＤＮＡの準備 結合の前に、ｐＭＭＢ６７ＥＨ−ベクター−ＤＮＡ（２
μｇ）を、適当な結合緩衝液（２０ｍＭのトリス緩衝
液、１０ｍＭのＤＴＴ（ジチオエリトリトール）、１０
ｍＭのＭｇＣｌ2、０．６ｍＭのＡＴＰ、ｐＨ７．２）
中で、各１０単位のＳａｌＩおよびＨｉｎｄ IIIにより
切断した。 続いて、この切断したＤＮＡを４．８単位
のアルカリ性ホスファターゼにより脱ホスホリル化し
た。 ＤＮＡを再度イソプロパノールで沈殿させ、洗浄
した。
ド・サンズ（ニューヨーク）１９８７，３．１６章，
「ＤＮＡ−分節のサブクローニング」） ａ）ハイブリッドプラスミドｐＬ０４の調製 発現ベクター−ＤＮＡの準備 結合の前に、ｐＭＭＢ６７ＥＨ−ベクター−ＤＮＡ（２
μｇ）を、適当な結合緩衝液（２０ｍＭのトリス緩衝
液、１０ｍＭのＤＴＴ（ジチオエリトリトール）、１０
ｍＭのＭｇＣｌ2、０．６ｍＭのＡＴＰ、ｐＨ７．２）
中で、各１０単位のＳａｌＩおよびＨｉｎｄ IIIにより
切断した。 続いて、この切断したＤＮＡを４．８単位
のアルカリ性ホスファターゼにより脱ホスホリル化し
た。 ＤＮＡを再度イソプロパノールで沈殿させ、洗浄
した。
【００５８】ｘｙｌＭＡ−ＤＮＡと発現ベクター−ＤＮＡの結合 結合するために、それぞれのＤＮＡ−プローブ（挿入−
ＤＮＡの過剰量に対してさまざまな量的比率で）を一緒
にし、イソプロパノールで沈殿させ、乾燥した沈殿物を
４０〜１００μｌの結合緩衝液中に入れた（２０ｍＭの
トリス緩衝液、１０ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＭｇＣｌ
2、０．６ｍＭのＡＴＰ、ｐＨ７．２）。ＤＮＡ１μｇ
あたり０．２単位のＴ４−ＤＮＡ−リガーゼを加えた
後、１２〜１６℃で一晩培養して結合させた。
ＤＮＡの過剰量に対してさまざまな量的比率で）を一緒
にし、イソプロパノールで沈殿させ、乾燥した沈殿物を
４０〜１００μｌの結合緩衝液中に入れた（２０ｍＭの
トリス緩衝液、１０ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＭｇＣｌ
2、０．６ｍＭのＡＴＰ、ｐＨ７．２）。ＤＮＡ１μｇ
あたり０．２単位のＴ４−ＤＮＡ−リガーゼを加えた
後、１２〜１６℃で一晩培養して結合させた。
【００５９】続いて、結合混合物を形質転換に直接使用
した。
した。
【００６０】 ｂ）ハイブリッドプラスミドｐＬ０５の調製 実施例１．３ａ）と同様にして発現ベクターｐＭＭＢ６
７ＥＨ＊を調製し、実施例１．３ａ）に準じてｘｙｌＭ
Ａ遺伝子をこのベクター中に結合した。
７ＥＨ＊を調製し、実施例１．３ａ）に準じてｘｙｌＭ
Ａ遺伝子をこのベクター中に結合した。
【００６１】１．４ハイブリッドプラスミド−ＤＮＡ
（ｐＬ０４）による競合細胞の形質転換 ａ）ハイブリッドプラスミド−ＤＮＡ（ｐＬ０４）の濃
縮 助品種としてＥ．コリＳ１７−１の２５ml培養の細胞を
ＯＤ546＝２．０で収穫し、レーダーバーグとコーエン
の方法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｏｌ．１１９（１９７４），
１０７２−１０７４〕により、競合するようにした。
（ｐＬ０４）による競合細胞の形質転換 ａ）ハイブリッドプラスミド−ＤＮＡ（ｐＬ０４）の濃
縮 助品種としてＥ．コリＳ１７−１の２５ml培養の細胞を
ＯＤ546＝２．０で収穫し、レーダーバーグとコーエン
の方法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｏｌ．１１９（１９７４），
１０７２−１０７４〕により、競合するようにした。
【００６２】これらの細胞を１０mlＭｇＣｌ2中で洗浄
した後、細胞を氷上で、１０mlの０．１Ｍ−ＣａＣｌ2
中で３０分間培養した。 これらの細胞を遠心分離し、
１mlの０．１Ｍ−ＣａＣｌ2中に再分散させた。 形質
転換するために、各０．２mlの細胞分離液を、０．５μ
ｇの結合したハイブリッドプラスミド−ＤＮＡと混合し
た。 氷上で３０分間以上培養し、４２℃で２分間熱衝
撃を与えた。
した後、細胞を氷上で、１０mlの０．１Ｍ−ＣａＣｌ2
中で３０分間培養した。 これらの細胞を遠心分離し、
１mlの０．１Ｍ−ＣａＣｌ2中に再分散させた。 形質
転換するために、各０．２mlの細胞分離液を、０．５μ
ｇの結合したハイブリッドプラスミド−ＤＮＡと混合し
た。 氷上で３０分間以上培養し、４２℃で２分間熱衝
撃を与えた。
【００６３】続いて、それぞれの細胞分散液に、あらか
じめ加熱したＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｙｅａｓｔ Ｂｒｏｔ
ｈ（Ｏｘｏｉｄ，Ｗｅｓｅｌ，ＢＲＤ）を加えて５mlに
増量し、発現させるために、受容細胞（Ｅ．コリＳ１７
−１）の最適成長温度で、振とうせずに１時間、振とう
しながらさらに１時間培養した。 形質転換した培養菌
のアリコートを適当な選択培地（栄養寒天、１mlあたり
１００μｇのアンピシリン）上に載せた。
じめ加熱したＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｙｅａｓｔ Ｂｒｏｔ
ｈ（Ｏｘｏｉｄ，Ｗｅｓｅｌ，ＢＲＤ）を加えて５mlに
増量し、発現させるために、受容細胞（Ｅ．コリＳ１７
−１）の最適成長温度で、振とうせずに１時間、振とう
しながらさらに１時間培養した。 形質転換した培養菌
のアリコートを適当な選択培地（栄養寒天、１mlあたり
１００μｇのアンピシリン）上に載せた。
【００６４】ｂ）生産品種中へのｐＬ０４の形質転換 実施例１．１および１．２に準じて、ｐＬ０４を備えた
Ｅ．コリＳ１７−１品種からハイブリッドプラスミドｐ
Ｌ０４を分離した。 続いて、実施例１．４ａ）の方法
により、Ｅ．コリＫ１２＊をハイブリッドプラスミドｐ
Ｌ０４で形質転換した。 選択は、それに応じて選択培
養基（栄養寒天、１mlあたり１００μｇのアンピシリ
ン）。
Ｅ．コリＳ１７−１品種からハイブリッドプラスミドｐ
Ｌ０４を分離した。 続いて、実施例１．４ａ）の方法
により、Ｅ．コリＫ１２＊をハイブリッドプラスミドｐ
Ｌ０４で形質転換した。 選択は、それに応じて選択培
養基（栄養寒天、１mlあたり１００μｇのアンピシリ
ン）。
【００６５】１．５ハイブリッドプラスミドｐＬ０５に
よる競合細胞の形質転換 実施例１．４に準じて、シュードモナス・プチダＪＤ７
中のハイブリッドプラスミドｐＬ０５を形質転換した。
選択は、選択培養基（栄養寒天、１mlあたり５０μｇ
のカナマイシン）を用いて行なった。
よる競合細胞の形質転換 実施例１．４に準じて、シュードモナス・プチダＪＤ７
中のハイブリッドプラスミドｐＬ０５を形質転換した。
選択は、選択培養基（栄養寒天、１mlあたり５０μｇ
のカナマイシン）を用いて行なった。
【００６６】〔実施例２〜８〕 実施例１．３に準じて、ハイブリッドプラスミドｐＬ０
３を調製した。 実施例１．４および１．５に準じて、
ハイブリッドプラスミドｐＧＳＨ２８３６，ｐＬ０３，
ｐＬ０４およびｐＬ０５を宿主品種Ｅ．コリＫ１２＊、
シュードモナス・エルギノサＰＡＯ２５、シュードモナ
ス・プチダＪＤ７およびシュードモナス・プチダ中に形
質転換した。 これらの生産品種の変換率を表２に示
す。
３を調製した。 実施例１．４および１．５に準じて、
ハイブリッドプラスミドｐＧＳＨ２８３６，ｐＬ０３，
ｐＬ０４およびｐＬ０５を宿主品種Ｅ．コリＫ１２＊、
シュードモナス・エルギノサＰＡＯ２５、シュードモナ
ス・プチダＪＤ７およびシュードモナス・プチダ中に形
質転換した。 これらの生産品種の変換率を表２に示
す。
【００６７】〔実施例９〕ｘｙｌＢ−突然変異体の形成 ９．１プラスミドｐＬ０１０の形成 遺伝子ｘｙｌＭＡＢＣＮをプラスミドｐＧＳＨ２８１６
〔ハラヤマら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１，１９
８９〕からＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩ制限酵素を使用し
て分離し、続いて同じように切断したベクターｐＢＲ３
２２（ホリバーら，Ｇｅｎｅ２，１９７７，９５頁参
照）に結合させた。
〔ハラヤマら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１，１９
８９〕からＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩ制限酵素を使用し
て分離し、続いて同じように切断したベクターｐＢＲ３
２２（ホリバーら，Ｇｅｎｅ２，１９７７，９５頁参
照）に結合させた。
【００６８】９．１．１制限酵素による分解およびアガ
ロース−ゲル電気泳動によるＤＮＡの分離 ＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩ（１μｇＤＮＡあたりそれぞ
り５単位）で切断したｐＧＳＨ２８１６−ＤＮＡを調整
アガロース−ゲル電気泳動により分離し（０．０９Ｍの
トリス−ホウ酸塩、２．５ｍＭのＮａ−ＥＤＴＡ中０．
７％アガロース、ｐＨ８．３）、必要とする大きさのＤ
ＮＡ分節を分離した（実施例１．２に準じて）。
ロース−ゲル電気泳動によるＤＮＡの分離 ＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩ（１μｇＤＮＡあたりそれぞ
り５単位）で切断したｐＧＳＨ２８１６−ＤＮＡを調整
アガロース−ゲル電気泳動により分離し（０．０９Ｍの
トリス−ホウ酸塩、２．５ｍＭのＮａ−ＥＤＴＡ中０．
７％アガロース、ｐＨ８．３）、必要とする大きさのＤ
ＮＡ分節を分離した（実施例１．２に準じて）。
【００６９】９．１．２ ＤＮＡ分節と、ｐＢＲ３２２
中のｘｙＩＭＡＢＣＮとの結合 （『分子生物学における現況』ジョン・ウィリー・アン
ド・サンズ（ニューヨーク）１９８７，３．１６章，
「ＤＮＡ−分節のサブクローニング」） ａ．ベクター−ＤＮＡの準備 結合させる前に、ｐＢＲ３２２−ＤＮＡ（２μｇ）をそ
れぞれ１０単位のＥｃｏＲＩおよびＳｃａＩにより、制
限緩衝液（５０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＭｇＣ
ｌ2）中で、調整アガロース−ゲル電気泳動により分離
した。 実施例９．１．１に準じて、必要な３８５０bp
帯を分離した。
中のｘｙＩＭＡＢＣＮとの結合 （『分子生物学における現況』ジョン・ウィリー・アン
ド・サンズ（ニューヨーク）１９８７，３．１６章，
「ＤＮＡ−分節のサブクローニング」） ａ．ベクター−ＤＮＡの準備 結合させる前に、ｐＢＲ３２２−ＤＮＡ（２μｇ）をそ
れぞれ１０単位のＥｃｏＲＩおよびＳｃａＩにより、制
限緩衝液（５０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＭｇＣ
ｌ2）中で、調整アガロース−ゲル電気泳動により分離
した。 実施例９．１．１に準じて、必要な３８５０bp
帯を分離した。
【００７０】ｂ．結合 結合するために、それぞれのＤＮＡプローブ（挿入−Ｄ
ＮＡの過剰量に対してさまざまな量的比率で）を一緒に
し、結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、１０ＭのＤＴＴ、
１０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．６ｍＭＡＴＰ、ｐＨ７．
２）を加え、１単位のＴ４−ＤＮＡ−リガーゼを加えた
後、１２〜１６℃で一晩培養した。続いて、結合混合物
を形質転換に直接使用した。
ＮＡの過剰量に対してさまざまな量的比率で）を一緒に
し、結合緩衝液（２０ｍＭのトリス、１０ＭのＤＴＴ、
１０ｍＭのＭｇＣｌ2、０．６ｍＭＡＴＰ、ｐＨ７．
２）を加え、１単位のＴ４−ＤＮＡ−リガーゼを加えた
後、１２〜１６℃で一晩培養した。続いて、結合混合物
を形質転換に直接使用した。
【００７１】ｃ．Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ６００の形質転換
（実施例１．４に準じる） 選択はテトラサイクリン（２５μｇ／μｌ）を含む栄養
寒天上で行なった。制限調整の後、大量のｐＬ０１０−
ＤＮＡをＣｓＣｌ勾配で精製した。
（実施例１．４に準じる） 選択はテトラサイクリン（２５μｇ／μｌ）を含む栄養
寒天上で行なった。制限調整の後、大量のｐＬ０１０−
ＤＮＡをＣｓＣｌ勾配で精製した。
【００７２】９．２プラスミドｐＬ０１１の形成 ９．２．１制限酵素によるｐＬ０１０−ＤＮＡの分解 ５μｇのｐＬ０１０−ＤＮＡを２２単位のＨｉｎｄ III
で、制限緩衝液（１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＭｇＣ
ｌ2、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．
５）中で切断し、調整アガロースゲル電気泳動をかけ
た。 実施例９．１．１に記載するようにして、３．８
kbないし２．９kbの大きさの２個の分節を分離し、４５
ないし３０μｌの水に入れた。 これらの分節はベクタ
ーｐＢＲ３２２、およびｘｙｌＢの他にｘｙｌ遺伝子の
領域を含む。
で、制限緩衝液（１０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＭｇＣ
ｌ2、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．
５）中で切断し、調整アガロースゲル電気泳動をかけ
た。 実施例９．１．１に記載するようにして、３．８
kbないし２．９kbの大きさの２個の分節を分離し、４５
ないし３０μｌの水に入れた。 これらの分節はベクタ
ーｐＢＲ３２２、およびｘｙｌＢの他にｘｙｌ遺伝子の
領域を含む。
【００７３】９．２．２ 結合 実施例９．２．１で分離した両分節を、実施例９．１．
２ｂに記載するように、結合に使用した。 ４５μｌの
分節３．８kb、３０μｌの分節２．８kb、１０μｌの結
合緩衝液、１０μｌの１０ｍＭ−ＡＴＰおよび１μｌの
Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼを混合し、１２〜１６℃で一晩
培養した。 続いて、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、
１０μｌの水に入れた。
２ｂに記載するように、結合に使用した。 ４５μｌの
分節３．８kb、３０μｌの分節２．８kb、１０μｌの結
合緩衝液、１０μｌの１０ｍＭ−ＡＴＰおよび１μｌの
Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼを混合し、１２〜１６℃で一晩
培養した。 続いて、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、
１０μｌの水に入れた。
【００７４】９．２．３ Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１の形質転換 実施例９．２．２により得られたＤＮＡをＥ．コリＨＢ
１０１の形質転換に直接使用した（実施例９．１．２ｃ
に準じて）。 形質転換した細胞は、テトラサイクリン
（２５μｇ／μｌ）を含む栄養寒天上で選択した。
１０１の形質転換に直接使用した（実施例９．１．２ｃ
に準じて）。 形質転換した細胞は、テトラサイクリン
（２５μｇ／μｌ）を含む栄養寒天上で選択した。
【００７５】９．３ｐＬ０１１の、Ｅ．コリＨＢ１０１
含有ｐＲＫ２０１３中への移入 Ｅ．コリ ＨＢ１０１含有ｐＲＫ２０１３は、ｐＬ０１１
のための宿主として選択した。 ｐＲＫ２０１３上にコ
ード化した機能により、たとえばｐＷＷＯを有するシュ
ードモナス・プチダＪＤ７のような他のグラム陰性菌中
への移入が可能である。
含有ｐＲＫ２０１３中への移入 Ｅ．コリ ＨＢ１０１含有ｐＲＫ２０１３は、ｐＬ０１１
のための宿主として選択した。 ｐＲＫ２０１３上にコ
ード化した機能により、たとえばｐＷＷＯを有するシュ
ードモナス・プチダＪＤ７のような他のグラム陰性菌中
への移入が可能である。
【００７６】分離したｐＬ０１１−ＤＮＡを、実施例
９．１．２ａに記載するようにして、Ｅ．コリＨＢ１０
１含有ｐＲＫ２０１３中に形質転換した。 選択は、テ
トラサイクリン（２５μｇ／μｌ）およびカナマイシン
（２５μｇ／μｌ）を含む栄養寒天上で行なった。
９．１．２ａに記載するようにして、Ｅ．コリＨＢ１０
１含有ｐＲＫ２０１３中に形質転換した。 選択は、テ
トラサイクリン（２５μｇ／μｌ）およびカナマイシン
（２５μｇ／μｌ）を含む栄養寒天上で行なった。
【００７７】９．４ Ｅ．コリＨＢ１０１含有ｐＲＫ２
０１３ｐＬ０１１とシュードモナス・プチダＪＤ７含有
ｐＷＷＯの接合 両接合相手を一晩培養したものから２mlを遠心分離し、
０．９％ＮａＣｌ（塩水）で何度も洗浄し、１００μｌ
の塩水に入れ、栄養寒天皿上で混合した。これらの皿を
３０℃で６時間培養し、接合させた。 生じた細菌の集
合体を１mlの塩水に再分散させ、適度に希釈し、テトラ
サイクリン（５０μｇ／μｌ）を含む栄養寒天上に塗布
した。 得られたトランス接合物の下で、同族組換えに
よるｐＬ０１１がＴＯＬ−プラスミドに取り入れられた
筈である。
０１３ｐＬ０１１とシュードモナス・プチダＪＤ７含有
ｐＷＷＯの接合 両接合相手を一晩培養したものから２mlを遠心分離し、
０．９％ＮａＣｌ（塩水）で何度も洗浄し、１００μｌ
の塩水に入れ、栄養寒天皿上で混合した。これらの皿を
３０℃で６時間培養し、接合させた。 生じた細菌の集
合体を１mlの塩水に再分散させ、適度に希釈し、テトラ
サイクリン（５０μｇ／μｌ）を含む栄養寒天上に塗布
した。 得られたトランス接合物の下で、同族組換えに
よるｐＬ０１１がＴＯＬ−プラスミドに取り入れられた
筈である。
【００７８】９．５ｐＬ０１１とｐＷＷＯとの間のマーカー交換 ＴＯＬ−プラスミド上の同族組換えｘｙｌＢを利用し
て、シュードモナス・プチダＪＤ７におけるｐＷＷＯを
分離するために、前に得られたＥ．コリトランス接合物
の約１００世代以上を選択圧をかけずにテトラサイクリ
ンにより培養した。 その際、ベクターｐＢＲ３２２お
よび完全なｘｙｌＢ−遺伝子を除外（分離）するのが望
ましかった。
て、シュードモナス・プチダＪＤ７におけるｐＷＷＯを
分離するために、前に得られたＥ．コリトランス接合物
の約１００世代以上を選択圧をかけずにテトラサイクリ
ンにより培養した。 その際、ベクターｐＢＲ３２２お
よび完全なｘｙｌＢ−遺伝子を除外（分離）するのが望
ましかった。
【００７９】テトラサイクリンに対して敏感なｘｙｌＢ
突然変異体の数を高めるために、集積ベクターｐＢＲ３
２２に対する選択を行なった。
突然変異体の数を高めるために、集積ベクターｐＢＲ３
２２に対する選択を行なった。
【００８０】すなわち、細胞を２５mlの複合培養基Ｎｕ
ｔｒｉｅｎｔ Ｙｅａｓｔ Ｂｒｏｔｈ（Ｏｘｏｉｄ
Ｗｅｓｅｌ，ＢＲＤ）テトラサイクリン（５０μｇ／μ
ｌ）の中に入れ、３０℃で、ＯＤ650が約３．０になる
まで培養した。 その後、５００μｇ／μｌのシクロセ
リンＣおよび１００μｇ／μｌのピペラシリンを加え
た。 ３０℃で数時間培養した後、細胞がほとんど完全
に溶解した。 生き延びた細胞は遠心分離し、塩水で数
回洗浄し、適度に希釈し、栄養寒天上に塗布した。 得
られたコロニーの８５％までがテトラサイクリンに敏感
であった。
ｔｒｉｅｎｔ Ｙｅａｓｔ Ｂｒｏｔｈ（Ｏｘｏｉｄ
Ｗｅｓｅｌ，ＢＲＤ）テトラサイクリン（５０μｇ／μ
ｌ）の中に入れ、３０℃で、ＯＤ650が約３．０になる
まで培養した。 その後、５００μｇ／μｌのシクロセ
リンＣおよび１００μｇ／μｌのピペラシリンを加え
た。 ３０℃で数時間培養した後、細胞がほとんど完全
に溶解した。 生き延びた細胞は遠心分離し、塩水で数
回洗浄し、適度に希釈し、栄養寒天上に塗布した。 得
られたコロニーの８５％までがテトラサイクリンに敏感
であった。
【００８１】９．６ｘｙｌＢ−欠失変異がある場合のコ
ロニーの試験 ９．６．１サザーン−ブロット−ハイブリダイゼーショ
ンによる欠失決変異の立証 得られたクローンのｐＷＷＯ′−ＤＮＡを、カドおよび
リウの方法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４５，１３６
５−１３７３（１９８１）〕により分離した。１mlの一
晩培養したものを遠心分離し、４０ｍＭのトリス酢酸塩
緩衝液、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．９中に再分散させ
た。 これらの細胞を２００μｌの３％ＳＤＳ（ｐＨ１
２．６）を加えて溶解し、６５℃で１時間培養し、続い
てフェノール−クロロホルム（１：１）で抽出した。
ロニーの試験 ９．６．１サザーン−ブロット−ハイブリダイゼーショ
ンによる欠失決変異の立証 得られたクローンのｐＷＷＯ′−ＤＮＡを、カドおよび
リウの方法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４５，１３６
５−１３７３（１９８１）〕により分離した。１mlの一
晩培養したものを遠心分離し、４０ｍＭのトリス酢酸塩
緩衝液、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．９中に再分散させ
た。 これらの細胞を２００μｌの３％ＳＤＳ（ｐＨ１
２．６）を加えて溶解し、６５℃で１時間培養し、続い
てフェノール−クロロホルム（１：１）で抽出した。
【００８２】水性ＤＮＡ溶液を、ジエチレンエーテルで
繰り返し洗浄し、フェノールから分離して１／１０量の
３Ｍ−酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を加えた。
繰り返し洗浄し、フェノールから分離して１／１０量の
３Ｍ−酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）を加えた。
【００８３】その後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、
乾燥後１００μｌの水に入れた。
乾燥後１００μｌの水に入れた。
【００８４】このＤＮＡプローブの約４０μｌを１００
単位のＥｃｏＲＩおよび５単位のＨｐａＩで、消化緩衝
液（５０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１００
ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．５）中で切
断し、アガロース−ゲル電気泳動にかけた。 ニトロセ
ルロース薄膜上に移したＤＮＡは、５００ngの３２Ｐ−
ＡＴＰでマークしたｐＬ０１１プローブに対してハイブ
リダイゼーションされた。 １．４kbｘｙｌＢ−欠失変
異はオートラジオグラフィーにより直接確認できる。
単位のＥｃｏＲＩおよび５単位のＨｐａＩで、消化緩衝
液（５０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１００
ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．５）中で切
断し、アガロース−ゲル電気泳動にかけた。 ニトロセ
ルロース薄膜上に移したＤＮＡは、５００ngの３２Ｐ−
ＡＴＰでマークしたｐＬ０１１プローブに対してハイブ
リダイゼーションされた。 １．４kbｘｙｌＢ−欠失変
異はオートラジオグラフィーにより直接確認できる。
【００８５】〔実施例１０〕ヒドロキシメチル化した複素環式化合物の調製 ｐＬ０４を有するＥ．コリＫ１２＊（ＤＳＭ番号６１５
３）を、３０℃で一晩、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｙｅａｓｔ
Ｂｒｏｔｈ（Ｏｘｏｉｄ，Ｗｅｓｅｌ，ＢＲＤ）中
で、表１に示す抗生物質を加え、実施例１．４の方法に
より、プラスミドを安定化させるために処理した。 そ
の後、１アリコートを新しい培養基に移し、３０℃でさ
らに２時間培養した後、キシレン−モノオキシゲナーゼ
−遺伝子を発現系（表１）に応じて誘発させた。 これ
は、ｔａｃ−プロモーターによる発現を誘発するために
１ｍＭのＩＰＴＧを加えて行なった。 誘発過程はそれ
ぞれ２〜４時間かかった。 この細菌分散液を遠心分離
し、細胞ペレットを、ＯＤ６５０が１０になるように、
抗生物質を加えずに、新しい培養基中に再分散させた。
この分散液に、０．１％（液体基質に対してはv/v 、
固体基質に対してはw/v)の酸化すべき複素環式化合物を
加え、３０℃でさらに培養した。 一定時間の後、この
細菌分散液を生成物形成について試験した。
３）を、３０℃で一晩、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｙｅａｓｔ
Ｂｒｏｔｈ（Ｏｘｏｉｄ，Ｗｅｓｅｌ，ＢＲＤ）中
で、表１に示す抗生物質を加え、実施例１．４の方法に
より、プラスミドを安定化させるために処理した。 そ
の後、１アリコートを新しい培養基に移し、３０℃でさ
らに２時間培養した後、キシレン−モノオキシゲナーゼ
−遺伝子を発現系（表１）に応じて誘発させた。 これ
は、ｔａｃ−プロモーターによる発現を誘発するために
１ｍＭのＩＰＴＧを加えて行なった。 誘発過程はそれ
ぞれ２〜４時間かかった。 この細菌分散液を遠心分離
し、細胞ペレットを、ＯＤ６５０が１０になるように、
抗生物質を加えずに、新しい培養基中に再分散させた。
この分散液に、０．１％（液体基質に対してはv/v 、
固体基質に対してはw/v)の酸化すべき複素環式化合物を
加え、３０℃でさらに培養した。 一定時間の後、この
細菌分散液を生成物形成について試験した。
【００８６】〔実施例１１〕実施例１０に準じて、ｐＬ
０５を有するシュードモナス・プチダＪＤ７を培養し
た。 リプレッサー遺伝子ｌａｃＩｇがないために、Ｉ
ＰＴＧによる誘発は行なわなかった。 この品種は実施
例１０に準じて複素環式化合物の変換に使用した。
０５を有するシュードモナス・プチダＪＤ７を培養し
た。 リプレッサー遺伝子ｌａｃＩｇがないために、Ｉ
ＰＴＧによる誘発は行なわなかった。 この品種は実施
例１０に準じて複素環式化合物の変換に使用した。
【００８７】〔実施例１２〕実施例１０に準じて、ｐＧ
ＳＨ２８３６を有するＥ．コリＫ１２＊（ＤＳＭ番号６
１５４）を変換に使用した。 誘発は、４２℃で２時間
温度作用させることにより、リプレッサー遺伝子ｃＩ８
５７の不活性化により行なった。
ＳＨ２８３６を有するＥ．コリＫ１２＊（ＤＳＭ番号６
１５４）を変換に使用した。 誘発は、４２℃で２時間
温度作用させることにより、リプレッサー遺伝子ｃＩ８
５７の不活性化により行なった。
【００８８】〔実施例１３および１４〕実施例１０に準
じて、実施例２〜８で調製した生産品種を変換に使用し
た。
じて、実施例２〜８で調製した生産品種を変換に使用し
た。
【００８９】〔実施例１５〜２０〕実施例１２の生産品
種による各種複素環式化合物の変換率を表３に示す。
種による各種複素環式化合物の変換率を表３に示す。
【００９０】 表 １ 発現ベクター xyl ＭＡを有す 大きさ (xylＭＡなし） 記載文献 るハイブリッド 特 徴 プラスミド (kb) ｐＬＶ85 J. Bacteriol. ｐＧＳＨ2836 耐アンピシリン性 5.25 169 (1987) プロモーター P4457-4462 ラムダ ＰＬ ｐＭＥ285 Gene 36(1985) ｐＬ02 カナマイシン 12.95 P27-36 に敏感 耐水銀塩性 mob ＋ ｐＫＴ240 Gene 26(1983） ｐＬ03 カナマイシン 15.25 P273-282 に敏感 耐アンピシリン性 mob＋ ｐＭＭＢ Gene 48(1986） ｐＬ04 耐アンピシリン性 11.15 67ＥＨ P119-131 プロモーター Ｐ tac lacIq ＋ ｐＭＭＢ − ｐＬ05 耐アンピシリン性 13.5 67ＥＨ＊ プロモーター Ｐ tac lacIq − 耐カナマイシン性 表 ２ メチル基をヒドロキシル化するための生産品種 含有ハイブリリッ 基質2-クロロ-5 ドプラスミドまた -メチル-ピリミ 実施例 生産品種 は突然変異プラス 寄託番号 ジン（0.1％濃 ミド ＤＳＭ 度）の変換にお （pＷＷＯ′） おける収量 ％ ２ Ｅ．coli Ｋ12＊ ｐＧＳＨ2836 6154 80 ３ Ｅ．coli Ｋ12＊ ｐＬ04 6153 80 ４ Ｅ．coli Ｋ12＊ ｐＬ03 − 80 ５ Ｅ．coli Ｋ12＊ ｐＬ05 − 80 ６ シュードモナス・アエル ｐＬ05 − 10 ギノサ ＰＡ025 ７ シュードモナス・プチダ ｐＬ05 6152 5 ＪＤ７ ８ シュードモナス・プチダ ｐＬ05 − 5 表 ３ 発現ベクターｐＧＳＨ２８３６を含むＥ．コリＫ１２＊ 細菌種による、メチル化した芳香族複素環式化合物の微生物酸化 実施例 基 質 培養基中の 反応時間 最終生成物 収 量 基質濃度 （時間） （％） １５ ２−クロロ− ０．１％ １６ ２−クロロ−５ ８０ ５−メチル （ｖ／ｖ） −ヒドロキシ ピリジン メチルピリジン １６ ２，５−ジメ ０．１％ １６ ２−ヒドロキシ ５０ チルピラジン （ｖ／ｖ） メチル−５− メチルピラジン １７ ２，５−ジメ ０．１％ １６ ２−ヒドロキシ １０ チルピリミ （ｖ／ｖ） メチル−４− ジン メチルピリミジン １８ ３，５− ０．１％ １６ ３−ヒドロキシ １０ ジメチル （ｖ／ｖ） メチル−６−メ ピラゾール チルピラゾール １９ ４−メチル ０．１％ １６ ４−ヒドロキシ １０ チアゾール （ｖ／ｖ） メチルチアゾール ２０ ２，５− ０．１％ １６ ２−ヒドロキシ １０ ジメチル （ｖ／ｖ） メチル−５− チオフェン メチルチオフェン
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｐ 17/00 Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｐ 17/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 シゲアキ ハラヤマ スイス国 カントン・ゲンフ レ・ザヴア ンシエ リユー・デユ・グラン・ベイ（番 地なし）
Claims (14)
- 【請求項１】 芳香族複素環式化合物におけるメチル基
をヒドロキシル化するための微生物学的な方法におい
て、変換を、 ａ）活性キシレン−モノオキシゲナーゼを形成するシュ
ードモナスＴＯＬ−プラスミドの遺伝子を含み、 ｂ）有効な染色体−またはプラスミド−コード化したア
ルコールデヒドロゲナーゼを形成せず、 それによって、芳香族の５員または６員複素環式化合物
のメチル基をヒドロキシル化して相当するヒドロキシメ
チル誘導体に変換することができる微生物により行な
い、その際、複素環式化合物は、変換のための基質とし
て作用するものであってヒドロキシル化すべきメチル基
の隣接炭素原子に置換基を持たず、ヒドロキシメチル誘
導体はそれ以上異化されないことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 変換を、遺伝子が、活性キシレン−モノ
オキシゲナーゼを形成し、下記の制限地図 【図１】 により特徴づけられるシュードモナスＴＯＬ−プラスミ
ドに由来する微生物により行なうことを特徴とする請求
項１の方法。 - 【請求項３】 変換をシュードモナス、アシネトバクタ
ー、リゾビウム、アグロバクテリウムまたはエシェリチ
ア種に属する微生物により行なうことを特徴とする請求
項１または２の方法。 - 【請求項４】 変換を、天然ＴＯＬ−プラスミドを含
み、活性アルコールデヒドロゲナーゼに関してコード化
する遺伝子を除去または不活性化した微生物により行な
うことを特徴とする請求項１の方法。 - 【請求項５】 変換を、ハイブリッドプラスミドｐＧＳ
Ｈ２８３６（ＤＳＭ番号６１５４）で形質転換したエシ
ェリチア・コリＫ１２＊種の微生物またはそれらの子孫
および突然変異体により行なうことを特徴とする請求項
１〜３のいずれかの方法。 - 【請求項６】 変換を、ハイブリッドプラスミドｐＬ０
４（ＤＳＭ番号６１５３）で形質転換したエシェリチア
・コリＫ１２＊種の微生物またはそれらの子孫および突
然変異体により行なうことを特徴とする請求項１〜３の
いずれかの方法。 - 【請求項７】 変換を、ハイブリッドプラスミドｐＬ０
５（ＤＳＭ番号６１５２）で形質転換したシュードモナ
ス・プチダＪＤ７種の微生物またはそれらの子孫および
突然変異体により行なうことを特徴とする請求項１〜３
のいずれかの方法。 - 【請求項８】 変換を、酸素、窒素、イオウの中から選
択された一種以上の異原子を含む、メチル化した５員ま
たは６員複素環式化合物で行なうことを特徴とする請求
項１〜７のいずれかの方法。 - 【請求項９】 変換を、培養基中の基質濃度が２０％(w
/v) または(v/v) を超えないように、基質を一度に、ま
たは連続的に加えて行なうことを特徴とする請求項１〜
８のいずれかの方法。 - 【請求項１０】 変換を、４〜１１のｐＨ、および１５
〜５０℃の温度で行なうことを特徴とする請求項１〜９
のいずれかの方法。 - 【請求項１１】 発現ベクターｐＭＭＢ６７ＥＨおよび
請求項２のシュード モナスＴＯＬ−プラスミドの遺伝子
からなり、２．３５kbの長さを有し、ＳａｌＩ−および
Ｈｉｎｄ III−切断位置を備え、エシェリチア・コリＫ
１２＊中で供託してあるハイブリッドプラスミドｐＬ０
４（ＤＳＭ番号６１５３）。 - 【請求項１２】 発現ベクターｐＭＭＢ６７ＥＨ＊およ
び請求項２のシュー ドモナスＴＯＬ−プラスミドの遺伝
子からなり、２．３５kbの長さを有し、ＳａｌＩ−およ
びＨｉｎｄ III−切断位置を備え、シュードモナス・プ
チダＪＤ７中で供託してあるハイブリッドプラスミドｐ
Ｌ０５（ＤＳＭ番号６１５２）。 - 【請求項１３】 ハイブリッドプラスミドｐＬ０４（Ｄ
ＳＭ番号６１５３）で形質転換したエシェリチア・コリ
Ｋ１２＊種の微生物およびそれらの子孫および突然変異
体。 - 【請求項１４】 ハイブリッドプラスミドｐＬ０５（Ｄ
ＳＭ番号６１５２）で形質転換したシュードモナス・プ
チダＪＤ７種の微生物およびそれらの子孫および突然変
異体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH3066/90-8 | 1990-09-24 | ||
| CH306690 | 1990-09-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05130875A true JPH05130875A (ja) | 1993-05-28 |
Family
ID=4247870
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3238226A Withdrawn JPH05130875A (ja) | 1990-09-24 | 1991-09-18 | 微生物による芳香族複素環式化合物中のメチル基のヒドロキシル化 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
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