JPH05139992A - ヒトａｄｆを含有する臓器保護剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 臓器移植及び虚血性再潅流障害の際に臓器を
活性酸素による障害から保護する薬剤の提供である。 【構成】 本発明はヒトＡＤＦを含有する臓器保護剤で
ある。 【効果】 本発明の臓器保護剤は臓器移植及び虚血性再
潅流障害の際に各臓器を極めて効果的に保護する作用を
有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト成人Ｔ細胞白血病
由来因子（以下ヒトＡＤＦと称する）活性を有するポリ
ペプチドを有効成分とする臓器保護剤に関する。

【０００２】

【従来技術】ヒトＡＤＦはＡＴＬ−２細胞の上清に存在
するＩＬ−２レセプタ−誘導因子として１９８５年多賀
谷らによって報告され、そのアミノ酸配列及びＤＮＡ配
列も既に決定され、更に大腸菌での生産についても報告
されている（特開平１−８５０９７号公報）。また、ヒ
トＡＤＦはその後の解析により、大腸菌からほ乳動物に
いたるまで広く存在する酸化還元酵素であるチオレドキ
シンと類似のアミノ酸配列を持つことが明らかになっ
た。従って、研究者によっては本物質をチオレドキシン
と呼ぶ場合もあるが、本発明に於いては、従来どおりヒ
トＡＤＦという名称で統一することにする。尚、ヒトＡ
ＤＦは現在、抗炎症剤、放射線防護剤として利用が検討
されている（特開平３−２０４８１８号公報）。

【０００３】さて、生体が虚血状態に陥ると組織の壊死
が進行する。ここに再び血流が再開（再潅流）し組織が
再酸素化を受けると、むしろ重大な障害がもたらされる
（Ｈｅａｒｓｅ，Ｄ．Ｊ．：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃ
ａｒｄｉｏｌ．，９，６０５−６１６（１９７７））。
このような虚血再潅流障害には、フリーラジカルや活性
酸素が関与するらしい事が、近年明らかになってきた。
即ち、生体内に活性酸素が発生すると蛋白質の変性、核
酸の切断、脂質の過酸化が引き起こされる。一方生体内
にはグルタチオンペルオキシダーゼ、スーパーオキシド
ジスムターゼ（ＳＯＤと称される）、カタラーゼなどの
活性酸素消去酵素、修復酵素が存在し生体を保護してい
るが、大量の活性酸素が発生した場合には、消去、修復
が追いつかなり、その結果、組織に障害が引き起こされ
るのである（井上正康（監訳）：活性酸素と疾患，学会
出版，東京（１９８７））。この虚血再潅流障害は、近
年臨床の間でも問題になっており、最も重要なのは心疾
患と臓器移植である。心疾患の手術時には、一旦心臓を
停止させ冠動脈の血流が停止し心臓に虚血状態が引き起
こされる。術後、心拍動を再開したとき冠動脈の血流が
再開し、この再潅流により組織内に大量に活性酸素が発
生し臓器障害が引き起こされるのである。具体的には、
開心術、心筋梗塞に対する ＴＰＣＡ（経皮的冠動脈形
成術）や ＰＴＣＲ（冠内血栓溶解療法）においてであ
る。

【０００４】また臓器移植においても、拒絶反応の克服
と共に、虚血再潅流性臓器障害の克服が移植の成功を左
右する大きな因子であることが近年認識された。即ち、
提供者から臓器を取りだす時、臓器内の血流が停止（虚
血）する。そして、患者の体内に摘出臓器を移植したと
き血流が再開（再潅流）するが、この時に虚血再潅流に
伴う活性酸素が発生し、その結果、臓器障害が引き起こ
されるのである。従って、虚血時間が長ければ長いほど
臓器障害の度合いが大きくなるので、臓器摘出後出来る
だけ迅速に移植を行う必要がある。これ故、提供者が現
れても遠隔地の場合には保存時間の関係から移植を断念
せざるを得ないケースもある。摘出臓器の長期保存可能
な薬剤が開発されれば、移植しか治療手段のない患者を
さらに多く救う事が出来ると考えられる。

【０００５】

【本発明が解決しようとする課題】本発明の課題は臓器
移植などに於いて移植臓器の損傷を軽減し移植成績を大
幅に向上させ得る臓器保護剤、虚血再潅流臓器障害を伴
う心臓、脳、消化器などを活性酸素から保護する臓器保
護剤の提供である。

【０００６】

【課題を解決する為の手段】本発明者は上記課題を解決
する為に鋭意検討を行った結果、ヒトＡＤＦ活性を有す
るポリペプチドが優れた臓器保護作用を有する事を見い
出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明はヒト
ＡＤＦ活性を有するポリペプチドを有効成分として含有
する臓器保護剤である。以下、本発明を詳細に説明す
る。

【０００７】本発明で用いられるヒトＡＤＦ活性を有す
るポリペプチド（以下、ヒトＡＤＦと略する）としては
通常、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列を有する
ものが用いられるが、これに限定される訳ではない。
即ち、ヒトＡＤＦ活性がある限り、Ｎ末端にメチオニン
残基が付加されたポリペプチド、化学修飾、塩基置換法
によりアミノ酸配列に置換が加わったポリペプチド、ア
ミノ酸配列の一部に欠損があるポリペプチド、アミノ酸
残基の挿入があるポリペプチド、あるいは側鎖に糖鎖等
が付加されたポリペプチドであってもよい。しかし、好
ましくは配列表の配列番号１に示されているＮ末端バリ
ンから始まる１０４個のアミノ酸からなるポリペプチド
及びメチオニンがＮ末端に付加された構造を持つポリペ
プチドが好ましい。

【０００８】本発明で使用されるヒトＡＤＦは如何なる
方法で製造しても良いが、通常は以下に示す方法で製造
する。即ち、ヒト由来細胞株（例えばＡＴＬ−２細胞
等）を培養し、その培養液または細胞抽出液から、塩
析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロ
マトフォーカシング、逆相クロマトグラフィー、疎水性
クロマトグラフィーなどの一般に用いられる手法により
精製し、目的とするヒトＡＤＦを得る方法（特開平１−
８５０９７、特開平６２−１９５３２参照）、遺伝子
組換え法により、ヒトＡＤＦのｃＤＮＡまたはゲノム遺
伝子を大腸菌、枯草菌、酵母、高等動物細胞、植物細胞
などの宿主細胞に導入し、宿主細胞内で組換えヒトＡＤ
Ｆを発現させ、その後に記したような手法を用いて精
製する方法（特開平１−８５０９７号参照）、更には
ペプチド化学合成法により、配列表の配列番号１記載の
アミノ酸配列を有するポリペプチドを合成する方法であ
る。

【０００９】本発明のヒトＡＤＦは、H2O2 などの活性
酸素を消去する事が出来、更には活性酸素により変性失
活した蛋白をリフォールディングにより再活性化する事
もできる。従って、活性酸素による組織障害から臓器を
保護する薬剤として用いることが出来る。例えば、腎
臓、肝臓、肺、心臓などの臓器保存液に添加する事によ
り移植後の活性酸素による臓器障害をを未然に防ぐ事が
出来る。また臓器移植時及び心虚血、脳虚血を伴う疾患
の手術時に、点滴、静注などによりに投与する事によっ
て活性酸素による臓器障害を防ぐ事が出来る。更にヒト
ＡＤＦはヒト由来の蛋白質であるので、人体に投与して
も異物として認識されず毒性は非常に低い。尚、ヒトＡ
ＤＦの安全性は動物実験により確認済みである。

【００１０】さて、ヒトＡＤＦの剤型はヒトＡＤＦを蒸
留水又は適当な緩衝液に溶かしたものを用いても良い
し、また凍結乾燥処理したものを用いても良い。また、
マンニトール、サイクロデキストリン等の賦形剤、安定
剤を本発明の臓器保護剤に含有させても良い。ヒトＡＤ
Ｆを本発明の臓器保護剤として用いるとき、ヒトＡＤＦ
の含量は通常、臓器保護剤１００重量部当り０．１−１
００重量部、好ましくは１０−８０重量部である。もち
ろん、上記範囲に限定されるわけではない。ヒトＡＤＦ
を含有する臓器保護剤を患者に投与する場合、患者の症
状、疾患に応じて投与量を決めれば良いが、通常体重１
Ｋｇ当り１μｇから１００ｍｇ、好ましくは１０μｇか
ら１０ｍｇの用量を術前、術中、術後の何れかの時期に
１回から数回投与すれば良い。以下、本発明を実施例
に基づいて説明する。

【００１１】

【実施例】

（実施例１）ヒトリコンビナンントＡＤＦの臓器保護効
果 体重２５０−３００ｇのウイスターラット（雄及び雌の
両方、実験群あたり各５匹）を実験動物として使用し
た。吸入麻酔剤エトレンにより麻酔を導入し、次に硫酸
アトロピン０．０１ｍｇ／ｂｏｄｙを皮下注射した後、
再び麻酔剤ネンブタ−ル２５ｍｇ／ｋｇを腹腔内に投与
した。気管内挿管の後、人工呼吸器を用いて１回の喚起
量２ｍｌで喚起回数８０回／分という条件（吸入酸素濃
度：FiO2=21%）で喚起を継続して行った。左胸を開き、
主肺動脈、主気管支、主肺静脈を組織から剥離し、左上
大静脈よりヘパリン０．１ｍｌを投与した。その後、肺
動脈、気管支、肺静脈にクリップをかけ１時間阻血状態
にした。そして１時間後クリップをはずし再潅流した。
再潅流後０、１、１０及び３０分に下行大動脈から採血
を行いガス分析を行った。尚、体重１ｋｇ当たり１５ｍ
ｇのヒトＡＤＦを再潅流直前に左上大静脈より投与し
た。

【００１２】本発明で用いたヒトＡＤＦは大腸菌を宿主
にして、遺伝子組換え法で作成したもので、配列表の配
列番号１記載のＮ末端がバリンでアミノ酸数１０４個の
ポリペプチドを用いた。結果は表１，２に示した。

【００１３】

【表１】

【００１４】

【表２】

【００１５】表１及び２は肺のガス交換能を示し、ヒト
ＡＤＦ非投与群では再潅流によるガス交換能の低下に伴
い動脈血酸素分圧の急激な低下（表１）及び動脈血二酸
化炭素分圧の上昇をきたし（表２）、再潅流発生後３０
分後でも正常値に回復しなかった。一方、ヒトＡＤＦ投
与群では再潅流発生後３０分後には、動脈血酸素分圧も
動脈血二酸化炭素分圧共に正常値近くまで回復した（表
１及び２）。また、再潅流により生じた組織障害の一つ
である肺浮腫の程度を示す肺湿乾重量比を測定するとヒ
トＡＤＦ投与群が５．３８±０．２２であり、一方非投
与群が７．２９±０．９４であった。統計処理を行った
ところ、ヒトＡＤＦ投与群では有意に浮腫の形成が抑制
されているのが確認できた。尚、測定は再潅流発生後３
０分後に行った。以上の結果から、ヒトＡＤＦは虚血再
潅流により生じた肺を障害から保護する優れた機能を有
することが確認できた。

【００１６】（実施例２）ヒトリコンビナントＡＤＦの
虚血再潅流足浮腫抑制効果 マウス（ｄｄｙ種、雌、３０ｇ、実験群あたり１５匹）
の右後ろ足を事務用ゴムバンド（直径４２ｍｍ）で縛り
虚血状態にした。２０分後にゴムバンドを除き再潅流を
行うと、虚血再潅流性組織障害が発生し、右後ろ足に浮
腫が形成された。この浮腫の程度は１時間後にマイクロ
メーターで足の厚さを測定することにより数値化した。
即ち、非投与群では、平均１ｍｍ前後の足の腫れが観察
された。さて、ヒトＡＤＦの投与は虚血直前に尾静脈か
ら行い、効果判定は次のように行った。非投与群の平均
−標準偏差よりも浮腫の程度が少なかった個体を浮腫抑
制の認められた個体とした。結果は表３に示した。ま
た、ヒトＡＤＦの投与量は、マウス１ｋｇ当りそれぞれ
０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／
ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇとした。尚、ヒトＡＤＦは大腸
菌を宿主にして、遺伝子組換え法で作成したもので、配
列表の配列番号１記載のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドのＮ末端にメチオニンが付加されたものを用いた。

【００１７】

【表３】

【００１８】表３に示すように、ヒトＡＤＦには優れた
浮腫抑制効果が認めらた。また、投与量の増加に伴い、
浮腫抑制効果も増大した。尚、１０ｍｇ／ｋｇ投与して
も急性毒性が認められなかった。これより、ヒトＡＤＦ
は極めて安全な薬剤と考えられる。

【００１９】

【発明の効果】本発明のヒトＡＤＦは虚血再潅流による
臓器障害の防護効果を示すことより、虚血再潅流による
活性酸素の発生を伴う各種臓器移植、心疾患、脳疾患の
際の各種臓器の保護剤として、臨床的に応用が期待でき
る。ヒトＡＤＦはラジカルスカベンジャー作用を有する
ので、虚血再潅流性臓器障害の治療、予防剤としても利
用できる。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１０４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 生物名：ヒト 株名：ATL-2 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 １ ５
１０ １５ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｌａ ２０ ２５
３０ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ
Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｃｙｓ Ｇｌｙ ３５ ４０
４５ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｐｈｅ
Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｔｙｒ ５０ ５５
６０ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｓｐ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｖａｌ ６５ ７０
７５ ８０ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｍｅｔ
Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｌｙｓ ８５
９０ ９５ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ １００ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三井 彰 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 平川 忠 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内 (72)発明者 淀井 淳司 京都市左京区北白川西瀬ノ内町39

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチドを
   有効成分として含有する臓器保護剤。
2. 【請求項２】 ヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチドが
   配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列を有するもので
   ある請求項１記載の臓器保護剤。
3. 【請求項３】 ヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチドが
   配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列のＮ末端にメチ
   オニンが付加されたものである請求項１記載の臓器保護
   剤。
4. 【請求項４】 ヒトＡＤＦ活性を有するポリペプチドが
   大腸菌で生産されたものである請求項１、２叉は３記載
   の臓器保護剤。