JPH05140195A - ペプチドおよびその塩 - Google Patents
ペプチドおよびその塩Info
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 利尿ホルモンに結合性を有し、次式、
Arg-Glu-Pro-Pro-Asn-Pro
またはPro-Asn-Pro-Pro-Glu-Arg
で特定されるアミノ酸配列の少なくとも４個のアミノ酸
の連続配列を含有するペプチドの群から選択されること
を特徴とするペプチドおよび医薬用、診断薬用または生
物体由来物質調製用として許容されるその塩。 【効果】 利尿ホルモンに対し特異的な反応性および高
い結合能を有する。
の連続配列を含有するペプチドの群から選択されること
を特徴とするペプチドおよび医薬用、診断薬用または生
物体由来物質調製用として許容されるその塩。 【効果】 利尿ホルモンに対し特異的な反応性および高
い結合能を有する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、利尿ホルモンに結合特
異性を有する点で医化学上有用なペプチドおよび医薬
用、診断薬用または生物体由来物質調製用として許容さ
れるその塩に関する。さらに詳しくは、ヒト・Ａ型利尿
ホルモン(以下、ヒトＡＮＰと略す)をコードするＤＮＡ
鎖(または該ＤＮＡ鎖から転写されるＲＮＡ鎖)の対合Ｄ
ＮＡ鎖(または該対合ＤＮＡ鎖から転写されるＲＮＡ鎖)
配列により規定されるペプチド配列の部分配列から成る
ペプチドであり、かつ利尿ホルモンに結合親和性を有す
るペプチドおよび医薬用、診断薬用または生物体由来物
質調製用として許容されるその塩に関する。さらに、本
発明のペプチド類およびその塩は臨床検査薬または生理
学、生化学の研究に有用である利尿ホルモン検出試薬、
さらには、利尿ホルモンの生理活性を修飾させる目的で
使用される医薬または生理生化学の研究に用いる阻害剤
として利用されるものである。
異性を有する点で医化学上有用なペプチドおよび医薬
用、診断薬用または生物体由来物質調製用として許容さ
れるその塩に関する。さらに詳しくは、ヒト・Ａ型利尿
ホルモン(以下、ヒトＡＮＰと略す)をコードするＤＮＡ
鎖(または該ＤＮＡ鎖から転写されるＲＮＡ鎖)の対合Ｄ
ＮＡ鎖(または該対合ＤＮＡ鎖から転写されるＲＮＡ鎖)
配列により規定されるペプチド配列の部分配列から成る
ペプチドであり、かつ利尿ホルモンに結合親和性を有す
るペプチドおよび医薬用、診断薬用または生物体由来物
質調製用として許容されるその塩に関する。さらに、本
発明のペプチド類およびその塩は臨床検査薬または生理
学、生化学の研究に有用である利尿ホルモン検出試薬、
さらには、利尿ホルモンの生理活性を修飾させる目的で
使用される医薬または生理生化学の研究に用いる阻害剤
として利用されるものである。
【０００２】
【従来の技術】ＡＮＰすなわち心房性ナトリウム利尿ペ
プチド(AtrialNatriuretic Peptide)は、主に心房から
分泌され強力なナトリウム利尿作用、血管拡張および血
圧降下作用を呈するペプチド性ホルモンであり、分子量
の違いによりα型、β型、γ型の３つのタイプに分類さ
れる。α型は、２８個のアミノ酸から構成される１本鎖
のポリペプチド鎖で、分子内に１個のジスルフィド結合
［Cys(7)-Cys(23)］を有している(バイオケミストリー
アンド バイオフィジクス リサーチ コミュニケー
ション（Biochem. Biophys. Res. Commun., 118, 131-1
39, 1984)）。β型は、α型の逆並行２量体であり、γ
型は、Ｃ末端領域［99-126］にα型の配列を含む１２６
個のアミノ酸で構成される高分子タンパク質で生合成上
の前駆体であることが示唆されている(ネイチャー（Nat
ure), 313, 397-400, 1985）。
プチド(AtrialNatriuretic Peptide)は、主に心房から
分泌され強力なナトリウム利尿作用、血管拡張および血
圧降下作用を呈するペプチド性ホルモンであり、分子量
の違いによりα型、β型、γ型の３つのタイプに分類さ
れる。α型は、２８個のアミノ酸から構成される１本鎖
のポリペプチド鎖で、分子内に１個のジスルフィド結合
［Cys(7)-Cys(23)］を有している(バイオケミストリー
アンド バイオフィジクス リサーチ コミュニケー
ション（Biochem. Biophys. Res. Commun., 118, 131-1
39, 1984)）。β型は、α型の逆並行２量体であり、γ
型は、Ｃ末端領域［99-126］にα型の配列を含む１２６
個のアミノ酸で構成される高分子タンパク質で生合成上
の前駆体であることが示唆されている(ネイチャー（Nat
ure), 313, 397-400, 1985）。
【０００３】本態性高血圧症および２次性高血圧症患者
や、遺伝性および２次性高血圧モデル動物では、一般に
血中ＡＮＰ濃度は上昇する(ハイパーテンション（Hyper
tension） 11, I212-I216, 1988 : サーキュレーション
リサーチ（Circ. Res.）, 62, 926-930, 1988)。これ
は高血圧に起因する心房への負荷増大の結果、代償的に
ＡＮＰ分泌が亢進するためと考えられている。また、Ａ
ＮＰの血中濃度は心房圧によく相関して上昇することか
ら、例えば欝血性心不全の指標ともなる(ジャーナル
オブ クリニカル インベスティゲーション（J. Clin.
Invest.）, 81, 1962-1970, 1988 : J. Clin. Inves
t., 83, 298-305, 1989 : J. Clin. Invest., 83, 46-5
1, 1989)。すなわち、該ホルモンを測定することの臨床
上の本質的意義は、本疾患をはじめとする心臓病の予知
診断または高血圧症の診断、経過観察にある。
や、遺伝性および２次性高血圧モデル動物では、一般に
血中ＡＮＰ濃度は上昇する(ハイパーテンション（Hyper
tension） 11, I212-I216, 1988 : サーキュレーション
リサーチ（Circ. Res.）, 62, 926-930, 1988)。これ
は高血圧に起因する心房への負荷増大の結果、代償的に
ＡＮＰ分泌が亢進するためと考えられている。また、Ａ
ＮＰの血中濃度は心房圧によく相関して上昇することか
ら、例えば欝血性心不全の指標ともなる(ジャーナル
オブ クリニカル インベスティゲーション（J. Clin.
Invest.）, 81, 1962-1970, 1988 : J. Clin. Inves
t., 83, 298-305, 1989 : J. Clin. Invest., 83, 46-5
1, 1989)。すなわち、該ホルモンを測定することの臨床
上の本質的意義は、本疾患をはじめとする心臓病の予知
診断または高血圧症の診断、経過観察にある。
【０００４】ＡＮＰの現行測定法は、抗体を検出試薬と
して用いる方法(サイエンス（Science）, 228, 323-32
5, 1985 : ネイチャー（Nature）, 314, 264-266, 1985
: Biochem. Biophys. Res. Commun., 124, 815-821, 1
984 : バイオケミストリーアンド バイオフィジクス
リサーチ コミュニケーション（Biochem. Biophys. Re
s. Commun.）, 124, 663-668, 1984 : Biochem. Biophy
s. Res. Commun., 125, 315-323, 1984)であり、さらに
近年の細胞生物学の技術進歩により単クローン抗体が容
易に作成されるようになり(ライフサイエンス（Life Sc
i.）, 38, 1991-1997 : モレキュラー イムノロジー
（Mol.Immunol.）, 24, 127-132, 1987: エンドクリノ
ロジー（Endocrinology）, 121, 843-852, 1987 : ハイ
ブリドーマ（Hybridoma）, 6, 433-440, 1987 : 特開平
2-16997号公報)、該抗体を検出試薬として用いる酵素免
疫測定法が報告されている(特開昭64-61500号公報 : 特
開平1-61500号公報 : 特開平1-221399号公報)。さらに
基礎医学領域では、高血圧症モデルにおけるＡＮＰの生
理的意義の解明のために用いる研究用試薬として単クロ
ーン抗体が使用される(バイオケミストリー アンド
バイオフィジクス リサーチ コミュニケーション（Bi
ochem. Biophys. Res. Commun.）, 151, 1277-1284, 19
88 : ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲ
ーション（J. Clin. Invest.）, 84, 145-154, 1989)。
して用いる方法(サイエンス（Science）, 228, 323-32
5, 1985 : ネイチャー（Nature）, 314, 264-266, 1985
: Biochem. Biophys. Res. Commun., 124, 815-821, 1
984 : バイオケミストリーアンド バイオフィジクス
リサーチ コミュニケーション（Biochem. Biophys. Re
s. Commun.）, 124, 663-668, 1984 : Biochem. Biophy
s. Res. Commun., 125, 315-323, 1984)であり、さらに
近年の細胞生物学の技術進歩により単クローン抗体が容
易に作成されるようになり(ライフサイエンス（Life Sc
i.）, 38, 1991-1997 : モレキュラー イムノロジー
（Mol.Immunol.）, 24, 127-132, 1987: エンドクリノ
ロジー（Endocrinology）, 121, 843-852, 1987 : ハイ
ブリドーマ（Hybridoma）, 6, 433-440, 1987 : 特開平
2-16997号公報)、該抗体を検出試薬として用いる酵素免
疫測定法が報告されている(特開昭64-61500号公報 : 特
開平1-61500号公報 : 特開平1-221399号公報)。さらに
基礎医学領域では、高血圧症モデルにおけるＡＮＰの生
理的意義の解明のために用いる研究用試薬として単クロ
ーン抗体が使用される(バイオケミストリー アンド
バイオフィジクス リサーチ コミュニケーション（Bi
ochem. Biophys. Res. Commun.）, 151, 1277-1284, 19
88 : ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲ
ーション（J. Clin. Invest.）, 84, 145-154, 1989)。
【０００５】一方、多臓器に対する多彩なＡＮＰの生理
活性を受容体結合反応に関しＡＮＰと競合することによ
り修飾または抑制させる薬剤の報告は、ラット・ＡＮＰ
のＮ端、Ｃ端及び環状構造の一部を欠如させた合成リガ
ンドＣ-ＡＮＦ(サイエンス（Science）, 238, 675-678,
1987)やヒト・ＡＮＰ［７-28］の逆並行２量体の１組
のジスルフィド結合をＬ-α-aminosuberic acidで置換
したアナログ（Analog） III(フェブス レター（FEBS
Lett.）, 248, 28-34, 1989)がある。しかしながら、Ａ
ＮＰに結合することによりＡＮＰの生理活性を増強させ
るような賦活剤の報告はない。
活性を受容体結合反応に関しＡＮＰと競合することによ
り修飾または抑制させる薬剤の報告は、ラット・ＡＮＰ
のＮ端、Ｃ端及び環状構造の一部を欠如させた合成リガ
ンドＣ-ＡＮＦ(サイエンス（Science）, 238, 675-678,
1987)やヒト・ＡＮＰ［７-28］の逆並行２量体の１組
のジスルフィド結合をＬ-α-aminosuberic acidで置換
したアナログ（Analog） III(フェブス レター（FEBS
Lett.）, 248, 28-34, 1989)がある。しかしながら、Ａ
ＮＰに結合することによりＡＮＰの生理活性を増強させ
るような賦活剤の報告はない。
【０００６】また、ペプチド(i)をコードするＤＮＡ鎖
またはｍＲＮＡ鎖に対する対合ＤＮＡ鎖または相補ＲＮ
Ａを構成する遺伝コドンにより規定されるアミノ酸を該
遺伝コドンの順位に従って配置することにより得られる
ペプチド(ii)が元のペプチド(i)に対し親和性があるこ
とは、アンジオテンシン(Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
85, 2518-2522)、黄体形成ホルモン放出ホルモン(Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 9714-9718)、副腎皮質
刺激ホルモン(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,1372-1
375)等を例に報告されている。さらに、ＤＮＡの非解読
鎖配列または相補ＲＮＡ鎖配列により規定されるペプチ
ド(ii)の設計方法に関しては、ブラロック(特表昭62-50
2513号公報)により報告されている。
またはｍＲＮＡ鎖に対する対合ＤＮＡ鎖または相補ＲＮ
Ａを構成する遺伝コドンにより規定されるアミノ酸を該
遺伝コドンの順位に従って配置することにより得られる
ペプチド(ii)が元のペプチド(i)に対し親和性があるこ
とは、アンジオテンシン(Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
85, 2518-2522)、黄体形成ホルモン放出ホルモン(Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 9714-9718)、副腎皮質
刺激ホルモン(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,1372-1
375)等を例に報告されている。さらに、ＤＮＡの非解読
鎖配列または相補ＲＮＡ鎖配列により規定されるペプチ
ド(ii)の設計方法に関しては、ブラロック(特表昭62-50
2513号公報)により報告されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】現行法でのＡＮＰの測
定においては、前述の如く抗ＡＮＰ抗体を用いるのが一
般的である。近年、細胞生物学または生化学に関する諸
技術が進歩したとはいえ、選択される抗体分子およびそ
の性能は、基本的に抗体を産する生物体もしくは細胞の
偶然性に支配され使用性能上の制限を受ける。つまり、
極めて小さい結合定数を有する抗体が産生されることが
望まれるにも拘らず、期待値を達成する抗体を得られな
いために、試料中の被験物質つまりＡＮＰを抽出・濃縮
する操作が必要となる。
定においては、前述の如く抗ＡＮＰ抗体を用いるのが一
般的である。近年、細胞生物学または生化学に関する諸
技術が進歩したとはいえ、選択される抗体分子およびそ
の性能は、基本的に抗体を産する生物体もしくは細胞の
偶然性に支配され使用性能上の制限を受ける。つまり、
極めて小さい結合定数を有する抗体が産生されることが
望まれるにも拘らず、期待値を達成する抗体を得られな
いために、試料中の被験物質つまりＡＮＰを抽出・濃縮
する操作が必要となる。
【０００８】また、抗体分子はその化学的性状がよく研
究されてはいるものの所詮は生物体に由来する生合成蛋
白であり、この性状は温度・時間の影響を極めて甚大に
被るものであり、この性質はしばしば検出試薬の保存安
定性を劣悪にさせる要因ともなる。さらに、抗体分子を
産する生物個体または継代細胞が代わることに伴って、
抗体分子種も代わり、検出試薬の均質化を図る上で大き
な障害となる。また、これらのことは臨床診断薬を構成
している検出試薬に関する課題に留まらず、生理・生化
学の研究上の課題ともなりうる。
究されてはいるものの所詮は生物体に由来する生合成蛋
白であり、この性状は温度・時間の影響を極めて甚大に
被るものであり、この性質はしばしば検出試薬の保存安
定性を劣悪にさせる要因ともなる。さらに、抗体分子を
産する生物個体または継代細胞が代わることに伴って、
抗体分子種も代わり、検出試薬の均質化を図る上で大き
な障害となる。また、これらのことは臨床診断薬を構成
している検出試薬に関する課題に留まらず、生理・生化
学の研究上の課題ともなりうる。
【０００９】一方、ＡＮＰに結合することによりＡＮＰ
の受容体への結合反応およびグアニル酸シクラーゼによ
るｃＧＭＰ産生の刺激を増強させる賦活剤の１つとして
ペプチド性の薬剤が考えられる。ＡＮＰに対し高親和性
を有するペプチド(ii)の設計方法に関しては前記の方法
(特表昭62-502513号公報)は概括的な手法であり、実際
上の最適ペプチド配列を特定するものではない。なぜな
らば、このようなペプチド(ii)の最適設計方法は設計対
象である元のペプチド(i)毎に異なるからである。すな
わち該設計方法はペプチド(i)に対し、より高い親和性
を有するペプチド(ii)を設計する上での一概念に過ぎ
ず、本目的を達成するには、さらに多段階の研究を要す
る。実際、前記方法で設計されたペプチドが、元のペプ
チドに対して充分な結合親和性を有しないとの報告もあ
る（de Gasparo,M.,Whitebread,S.,Einsle,K.&Heusser,
C.(1989)バイオケミカル ジャーナル（Biochem.J.）26
1,310-311）。
の受容体への結合反応およびグアニル酸シクラーゼによ
るｃＧＭＰ産生の刺激を増強させる賦活剤の１つとして
ペプチド性の薬剤が考えられる。ＡＮＰに対し高親和性
を有するペプチド(ii)の設計方法に関しては前記の方法
(特表昭62-502513号公報)は概括的な手法であり、実際
上の最適ペプチド配列を特定するものではない。なぜな
らば、このようなペプチド(ii)の最適設計方法は設計対
象である元のペプチド(i)毎に異なるからである。すな
わち該設計方法はペプチド(i)に対し、より高い親和性
を有するペプチド(ii)を設計する上での一概念に過ぎ
ず、本目的を達成するには、さらに多段階の研究を要す
る。実際、前記方法で設計されたペプチドが、元のペプ
チドに対して充分な結合親和性を有しないとの報告もあ
る（de Gasparo,M.,Whitebread,S.,Einsle,K.&Heusser,
C.(1989)バイオケミカル ジャーナル（Biochem.J.）26
1,310-311）。
【００１０】
【課題を解決するための手段】前述の課題を解決するた
め、本発明者らはＡＮＰに結合性を有する抗体に代わる
特異的検出試薬または薬剤の検索を、ホルモン受容体ま
たは生理活性ペプチド受容体のリガンド結合部位とホル
モン遺伝子または生理活性ペプチド遺伝子の対合鎖にコ
ードされる遺伝情報によって進化論的に規定されるとい
う仮説に基づき、鋭意研究を行った結果、ＡＮＰに結合
性を有するペプチド配列を得、さらにその利用法の発明
を完成させるに至った。
め、本発明者らはＡＮＰに結合性を有する抗体に代わる
特異的検出試薬または薬剤の検索を、ホルモン受容体ま
たは生理活性ペプチド受容体のリガンド結合部位とホル
モン遺伝子または生理活性ペプチド遺伝子の対合鎖にコ
ードされる遺伝情報によって進化論的に規定されるとい
う仮説に基づき、鋭意研究を行った結果、ＡＮＰに結合
性を有するペプチド配列を得、さらにその利用法の発明
を完成させるに至った。
【００１１】発明者らは、ブラロックの方法(特表昭62-
502513号公報)に準じ、ＡＮＰに対して相補的である複
数のペプチド配列を設計し、そしてその後に該ペプチド
配列とＡＮＰ受容体との相同性を検索した。その後、受
容体配列中に存在する相同性の高い部分配列を含むペプ
チド群を合成し、ＡＮＰに対する反応性をスクリーニン
グした結果、本発明の反応性の高いペプチド群を得た。
502513号公報)に準じ、ＡＮＰに対して相補的である複
数のペプチド配列を設計し、そしてその後に該ペプチド
配列とＡＮＰ受容体との相同性を検索した。その後、受
容体配列中に存在する相同性の高い部分配列を含むペプ
チド群を合成し、ＡＮＰに対する反応性をスクリーニン
グした結果、本発明の反応性の高いペプチド群を得た。
【００１２】すなわち本発明は、利尿ホルモンに結合性
を有し、次式、 Arg-Glu-Pro-Pro-Asn-Pro またはPro-Asn-Pro-Pro-Glu-Arg で特定されるアミノ酸配列の少なくとも４個のアミノ酸
の連続配列を含有するペプチドの群から選択されること
を特徴とするペプチドおよび医薬用、診断薬用または生
物体由来物質調製用として許容されるその塩に関する。
を有し、次式、 Arg-Glu-Pro-Pro-Asn-Pro またはPro-Asn-Pro-Pro-Glu-Arg で特定されるアミノ酸配列の少なくとも４個のアミノ酸
の連続配列を含有するペプチドの群から選択されること
を特徴とするペプチドおよび医薬用、診断薬用または生
物体由来物質調製用として許容されるその塩に関する。
【００１３】具体的にはArg-Glu-Pro-Pro、Glu-Pro-Pro
-Asn、Pro-Pro-Asn-Pro、Pro-Asn-Pro-Pro、Asn-Pro-Pr
o-Glu、Pro-Pro-Glu-Argで示されるテトラペプチド、Ar
g-Glu-Pro-Pro-Asn、Glu-Pro-Pro-Asn-Pro、Pro-Asn-Pr
o-Pro-Glu、Asn-Pro-Pro-Glu-Argで示されるペンタペプ
チド、Arg-Glu-Pro-Pro-Asn-Pro、Pro-Asn-Pro-Pro-Glu
-Argで示されるヘキサペプチドが挙げられる。なお、本
明細書において、上記アミノ酸の略号及び配列は、当技
術分野において慣用されているものであり、全てＬ−ア
ミノ酸を表わすものである。
-Asn、Pro-Pro-Asn-Pro、Pro-Asn-Pro-Pro、Asn-Pro-Pr
o-Glu、Pro-Pro-Glu-Argで示されるテトラペプチド、Ar
g-Glu-Pro-Pro-Asn、Glu-Pro-Pro-Asn-Pro、Pro-Asn-Pr
o-Pro-Glu、Asn-Pro-Pro-Glu-Argで示されるペンタペプ
チド、Arg-Glu-Pro-Pro-Asn-Pro、Pro-Asn-Pro-Pro-Glu
-Argで示されるヘキサペプチドが挙げられる。なお、本
明細書において、上記アミノ酸の略号及び配列は、当技
術分野において慣用されているものであり、全てＬ−ア
ミノ酸を表わすものである。
【００１４】本発明のペプチドは、上記のように、得ら
れる配列の少なくとも４個のアミノ酸を含有するペプチ
ドである。なぜならば、４個のアミノ酸配列が利尿ホル
モンに対し特異的である数学的な確立は１６万分の１で
あり、生物学的な特異性を論ずるには十分な値であるか
らである。また、それらの類似体および派生体も本発明
の範囲内である。つまり、任意のアミノ酸順位でほぼ同
等の疎水性を有するアミノ酸と置換したもの、ＡＮＰの
イソペプチドまたはその受容体のアミノ酸配列を参考に
適当なアミノ酸と置換したペプチド、ペプチドのＮ末端
若しくはＣ末端のいずれか一方、または両方において随
意に遮断もしくは保護されているペプチド、例えば任意
の部位でアセチル化やアミド化等の化学修飾を受けたペ
プチド、該ペプチドより高分子量の蛋白質類や機能性高
分子化合物に結合させたペプチド等も本発明に含まれ
る。ＡＮＰのイソペプチドとしては、ＢＮＰ、ＣＮＰが
ある。また、それらの受容体としては、Ｂ型受容体のＡ
タイプ及びＢタイプ、Ｃ型受容体がある。
れる配列の少なくとも４個のアミノ酸を含有するペプチ
ドである。なぜならば、４個のアミノ酸配列が利尿ホル
モンに対し特異的である数学的な確立は１６万分の１で
あり、生物学的な特異性を論ずるには十分な値であるか
らである。また、それらの類似体および派生体も本発明
の範囲内である。つまり、任意のアミノ酸順位でほぼ同
等の疎水性を有するアミノ酸と置換したもの、ＡＮＰの
イソペプチドまたはその受容体のアミノ酸配列を参考に
適当なアミノ酸と置換したペプチド、ペプチドのＮ末端
若しくはＣ末端のいずれか一方、または両方において随
意に遮断もしくは保護されているペプチド、例えば任意
の部位でアセチル化やアミド化等の化学修飾を受けたペ
プチド、該ペプチドより高分子量の蛋白質類や機能性高
分子化合物に結合させたペプチド等も本発明に含まれ
る。ＡＮＰのイソペプチドとしては、ＢＮＰ、ＣＮＰが
ある。また、それらの受容体としては、Ｂ型受容体のＡ
タイプ及びＢタイプ、Ｃ型受容体がある。
【００１５】さらに、本発明のペプチドの医薬用、診断
薬用または生物体由来物質調製用として許容されるイオ
ンから構成されるその塩も本発明に含まれる。このよう
な塩としては、酸付加塩、塩基性塩などが挙げられ、具
体的には、塩酸、硫酸、燐酸、ピロ燐酸等の無機酸の
塩、酢酸、乳酸、パルミチン酸、ステアリン酸、プロピ
オン酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、アスコルビン
酸、シュウ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸の塩などの酸付
加塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、
カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属
塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩などの塩が挙
げられる。本発明のペプチドは、公知の方法、例えば、
固相法および液相法による化学合成、該ペプチドを暗号
化できるＤＮＡ鎖を含むＤＮＡベクターを作成し、それ
により培養原核細胞または真核細胞を形質転換後、該形
質転換体によりペプチドを生産させる生体合成法等によ
り製造することができる。
薬用または生物体由来物質調製用として許容されるイオ
ンから構成されるその塩も本発明に含まれる。このよう
な塩としては、酸付加塩、塩基性塩などが挙げられ、具
体的には、塩酸、硫酸、燐酸、ピロ燐酸等の無機酸の
塩、酢酸、乳酸、パルミチン酸、ステアリン酸、プロピ
オン酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、アスコルビン
酸、シュウ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン
酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸の塩などの酸付
加塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、
カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属
塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩などの塩が挙
げられる。本発明のペプチドは、公知の方法、例えば、
固相法および液相法による化学合成、該ペプチドを暗号
化できるＤＮＡ鎖を含むＤＮＡベクターを作成し、それ
により培養原核細胞または真核細胞を形質転換後、該形
質転換体によりペプチドを生産させる生体合成法等によ
り製造することができる。
【００１６】本発明のペプチドを結合せしめる高分子蛋
白質としては、該ペプチドに対する抗体を得る場合は、
免疫原として用いる貝ヘモシアニン、牛血清アルブミ
ン、牛サイログロブリン、鳥ガンマグロブリン等があ
り、免疫化学分析に用いる場合に、検出用酵素として用
いる西洋ワサビ過酸化酵素、アルカリフォスファター
ゼ、ブドウ糖酸化酵素、ブドウ糖６燐酸脱水素酵素、ガ
ラクトース分解酵素等があげられるが、ペプチドの用途
によって相違し、特に制限を加えるものではない。本発
明のペプチドを結合せしめる機能性高分子化合物として
は、該ペプチドに対する抗体を得る場合は、免疫原とし
て用いるポリビニルピロリドン等があり、免疫化学分析
に用いる場合に、検出用物質として用いる、125Ｉ等の
ラジオアイソトープ、ＦＩＴＣ等の蛍光物質、磁性化デ
キストラン、ラテックス粒子等があるが特に制限を加え
るものではない。
白質としては、該ペプチドに対する抗体を得る場合は、
免疫原として用いる貝ヘモシアニン、牛血清アルブミ
ン、牛サイログロブリン、鳥ガンマグロブリン等があ
り、免疫化学分析に用いる場合に、検出用酵素として用
いる西洋ワサビ過酸化酵素、アルカリフォスファター
ゼ、ブドウ糖酸化酵素、ブドウ糖６燐酸脱水素酵素、ガ
ラクトース分解酵素等があげられるが、ペプチドの用途
によって相違し、特に制限を加えるものではない。本発
明のペプチドを結合せしめる機能性高分子化合物として
は、該ペプチドに対する抗体を得る場合は、免疫原とし
て用いるポリビニルピロリドン等があり、免疫化学分析
に用いる場合に、検出用物質として用いる、125Ｉ等の
ラジオアイソトープ、ＦＩＴＣ等の蛍光物質、磁性化デ
キストラン、ラテックス粒子等があるが特に制限を加え
るものではない。
【００１７】本発明のペプチドまたはその塩を薬剤とし
て利用する場合、好適な医薬用途は、高血圧症および循
環器系疾患に対する治療薬である。また、臨床検査薬と
して利用する好適な診断分野は高血圧症および循環器系
疾患であるが、これらの分野での使用は非限定的例であ
る。本発明のペプチドまたはその塩を医薬として用いる
場合はその有効量を、診断薬として用いる場合はその所
定量を、治療上または診断上許容される担体と共に含有
または担体に結合させて用いられる。診断薬用途では、
該ペプチドまたはその塩の所定量を上記検出用酵素、検
出用物質または固定化用担体に結合させて用いることが
できる。固定化用担体としては、ラテックス粒子、アガ
ロース樹脂、アクリルアミド樹脂、ポリスチレン樹脂、
ポリエチレン樹脂等があるが特に制限を加えるものでは
ない。さらに上記検出用酵素、検出用物質および固定化
用担体に該発明ペプチドを結合させる場合、これらの物
質とペプチドとの間にスペーサ構造物を共有結合等によ
り介在させてもよい。
て利用する場合、好適な医薬用途は、高血圧症および循
環器系疾患に対する治療薬である。また、臨床検査薬と
して利用する好適な診断分野は高血圧症および循環器系
疾患であるが、これらの分野での使用は非限定的例であ
る。本発明のペプチドまたはその塩を医薬として用いる
場合はその有効量を、診断薬として用いる場合はその所
定量を、治療上または診断上許容される担体と共に含有
または担体に結合させて用いられる。診断薬用途では、
該ペプチドまたはその塩の所定量を上記検出用酵素、検
出用物質または固定化用担体に結合させて用いることが
できる。固定化用担体としては、ラテックス粒子、アガ
ロース樹脂、アクリルアミド樹脂、ポリスチレン樹脂、
ポリエチレン樹脂等があるが特に制限を加えるものでは
ない。さらに上記検出用酵素、検出用物質および固定化
用担体に該発明ペプチドを結合させる場合、これらの物
質とペプチドとの間にスペーサ構造物を共有結合等によ
り介在させてもよい。
【００１８】医薬用途では、本発明のペプチドまたはそ
の塩の有効量に等しいかまたはそれ以下の所定量から製
剤化され、製剤学的に許容される担体を含有する粉剤、
エリキシル剤、溶液剤、丸剤、カプセル剤、小丸剤、錠
剤、スプレー剤または嗅剤の形状をとることができる。
本目的に使用が許容される担体としては、澱粉、砂糖、
蛋白、タルク、慣用的に用いられる合成ゴムもしくは天
然ゴム、または水がある。さらにこれら医薬の投与方法
としては、特に制限はないが、皮下、皮内、筋肉内、静
脈内、場合によっては脳脊髄腔への注射または経口、経
皮、座剤、スプレー剤や点眼剤等による経粘膜経路等が
ある。
の塩の有効量に等しいかまたはそれ以下の所定量から製
剤化され、製剤学的に許容される担体を含有する粉剤、
エリキシル剤、溶液剤、丸剤、カプセル剤、小丸剤、錠
剤、スプレー剤または嗅剤の形状をとることができる。
本目的に使用が許容される担体としては、澱粉、砂糖、
蛋白、タルク、慣用的に用いられる合成ゴムもしくは天
然ゴム、または水がある。さらにこれら医薬の投与方法
としては、特に制限はないが、皮下、皮内、筋肉内、静
脈内、場合によっては脳脊髄腔への注射または経口、経
皮、座剤、スプレー剤や点眼剤等による経粘膜経路等が
ある。
【００１９】
【実施例】本発明を実施例により、さらに具体的に詳述
するが、これにより本発明を限定するものではない。な
お、以下に本実施例中で使用する略号の意味を示す。 tBu;t-ブチルエステル, OtBu;t-ブチルエーテル, Boc;t
ブチルオキシカルボニル, Mtr;4-メトキシ-2,3,6-トリ
メチルベンゼンスルホニル, Trt;トリチル,Opfp;ペンタ
フルオロフェニルエステル, ODhbt;ジヒドロキシベンゾ
トリアジンエステル, HMD;ヘキサメチレンジアミン, Fm
oc;9-フルオレニルメチルオキシカルボニル, HOBT;1-ヒ
ドロキシ-ベンゾトリアゾール。
するが、これにより本発明を限定するものではない。な
お、以下に本実施例中で使用する略号の意味を示す。 tBu;t-ブチルエステル, OtBu;t-ブチルエーテル, Boc;t
ブチルオキシカルボニル, Mtr;4-メトキシ-2,3,6-トリ
メチルベンゼンスルホニル, Trt;トリチル,Opfp;ペンタ
フルオロフェニルエステル, ODhbt;ジヒドロキシベンゾ
トリアジンエステル, HMD;ヘキサメチレンジアミン, Fm
oc;9-フルオレニルメチルオキシカルボニル, HOBT;1-ヒ
ドロキシ-ベンゾトリアゾール。
【００２０】〔固相合成装置による合成例〕 例１： Arg-Glu-Pro-Pro-Asn-Proで示されるペプチド
の合成 固相として、Fmoc-Pro-Pep Syn KA樹脂カラム（ミリシ゛ェン
(MilliGen)社製）を用い、９０５０型ペプチド合成装置
（MilliGen社製）でFmoc-ポリアミド法により上記ペプ
チドの合成を行った。２．２ｇの該固相樹脂（０．０９
meq／ｇ）カラムを流速５ｍｌ／分のジメチルホルムア
ミドで１分間平衡化後、Fmoc基を流速５ｍｌ／分の２０
％ピペリジン／ジメチルホルムアミド（容積／容積）で
１０分間除去処理し、その後さらに流速５ｍｌ／分のジ
メチルホルムアミドで１５分間該樹脂を洗浄した。引き
続き、固相表面上に結合しているアミノ酸の４倍量(mol
数)の Fmoc-AsnのOpfpを５％（重量／容積） HOBT／ジ
メチルホルムアミド ２．６４ｍｌに溶解し該樹脂カラ
ムに３０分間循環させアミノ酸の伸長反応を行った。反
応後、該樹脂カラムをジメチルホルムアミドで洗浄し次
の段階に供した。上記記載の１段階の反応には約１時間
を要した。さらに上記の段階を次に記載する固相表面上
に結合しているアミノ酸の４倍量(mol数)の保護アミノ
酸の Opfp； Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ， Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ， Ｆｍｏｃ−
Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ） をこの順で用いて反復反応させた後、流速５ｍｌ／分の
２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドで１０分間、
同流速のジメチルホルムアミドで１５分間、さらに同流
速のジクロロメタンで１５分間順次洗浄することにより
Ｆｍｏｃ基を除去したペプチド樹脂； Arg(Mtr)-Glu(OtBu)-Pro-Pro-Asn-Pro-Pep Syn KA-樹脂
を得た。上記反応により得られたペプチド樹脂をカラム
から取り出し、m-クレゾール０．６ｍｌ、チオアニソー
ル３．６ｍｌ、トリフルオロ酢酸２０．０ｍｌを加え室
温で１時間撹拌し、樹脂からペプチドを溶離させた。溶
離液は濾液として回収し、該瀘液にエタンジチオール
１．８ｍｌ、トリメチルブロモシラン４．０ｍｌを加え
０℃で１時間撹拌後窒素ガスを吹き付けた。引き続き、
該混合液を撹拌しつつエーテルの１００ｍｌを添加して
ペプチドを析出させ３，０００×ｇで５分間遠沈回収し
た。その後さらに上記操作により回収した沈澱をエーテ
ルにより４回遠沈洗浄した後、減圧乾固して表記される
ペプチドを得た。
の合成 固相として、Fmoc-Pro-Pep Syn KA樹脂カラム（ミリシ゛ェン
(MilliGen)社製）を用い、９０５０型ペプチド合成装置
（MilliGen社製）でFmoc-ポリアミド法により上記ペプ
チドの合成を行った。２．２ｇの該固相樹脂（０．０９
meq／ｇ）カラムを流速５ｍｌ／分のジメチルホルムア
ミドで１分間平衡化後、Fmoc基を流速５ｍｌ／分の２０
％ピペリジン／ジメチルホルムアミド（容積／容積）で
１０分間除去処理し、その後さらに流速５ｍｌ／分のジ
メチルホルムアミドで１５分間該樹脂を洗浄した。引き
続き、固相表面上に結合しているアミノ酸の４倍量(mol
数)の Fmoc-AsnのOpfpを５％（重量／容積） HOBT／ジ
メチルホルムアミド ２．６４ｍｌに溶解し該樹脂カラ
ムに３０分間循環させアミノ酸の伸長反応を行った。反
応後、該樹脂カラムをジメチルホルムアミドで洗浄し次
の段階に供した。上記記載の１段階の反応には約１時間
を要した。さらに上記の段階を次に記載する固相表面上
に結合しているアミノ酸の４倍量(mol数)の保護アミノ
酸の Opfp； Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ， Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ， Ｆｍｏｃ−
Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ），Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｍｔｒ） をこの順で用いて反復反応させた後、流速５ｍｌ／分の
２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドで１０分間、
同流速のジメチルホルムアミドで１５分間、さらに同流
速のジクロロメタンで１５分間順次洗浄することにより
Ｆｍｏｃ基を除去したペプチド樹脂； Arg(Mtr)-Glu(OtBu)-Pro-Pro-Asn-Pro-Pep Syn KA-樹脂
を得た。上記反応により得られたペプチド樹脂をカラム
から取り出し、m-クレゾール０．６ｍｌ、チオアニソー
ル３．６ｍｌ、トリフルオロ酢酸２０．０ｍｌを加え室
温で１時間撹拌し、樹脂からペプチドを溶離させた。溶
離液は濾液として回収し、該瀘液にエタンジチオール
１．８ｍｌ、トリメチルブロモシラン４．０ｍｌを加え
０℃で１時間撹拌後窒素ガスを吹き付けた。引き続き、
該混合液を撹拌しつつエーテルの１００ｍｌを添加して
ペプチドを析出させ３，０００×ｇで５分間遠沈回収し
た。その後さらに上記操作により回収した沈澱をエーテ
ルにより４回遠沈洗浄した後、減圧乾固して表記される
ペプチドを得た。
【００２１】このようにして得られたペプチドは、ＹＭ
Ｃ−ＯＤＳ−５（直径4.6mm×150mm，山村化学製)上で
溶離剤として０．１％トリフルオロ酢酸水溶液-アセト
ニトリル(５％-２３％グラジエント、１５分間、０．５
ｍｌ／分)を用いるＨＰＬＣにおいて、２９分間の保持
時間を示した。１０μｇ／５μｌのペプチド水溶液をイ
ンジェクトして得た保持時間２９分のピーク画分をチュ
ーブに入れ減圧乾燥させた後、PICO TAGワークステーシ
ョン(ウォーターズ社製)の反応槽に１％フェノール／６
Ｎ塩酸（容積／容積）を減圧気化（500mTorr）させ、１
５０℃で１時間処理してペプチドを酸分解した。引き続
き、湿潤状態のペプチドを減圧乾燥させ、エタノール、
水、トリエチルアミンの２：２：１（容積：容積：容
積）混合液１０μｌに溶解後再度減圧乾燥させた。その
後さらにエタノール、トリエチルアミン、水、フェニル
イソチオシアネートの７：１：１：１（容積：容積：容
積：容積）混合液を２０μｌ添加し、室温で２５分間反
応させた後、５０μｌのＰＴＣ−アミノ酸溶離液Ａ（和
光純薬工業社製）／ＰＴＣ−アミノ酸溶離液Ｂ（和光純
薬工業社製）（ＰＴＣ−アミノ酸溶離液Ｂ容積比０％−
７０％グラジェント、１５分間、１ｍｌ／分）を展開溶
液に用いるＨＰＬＣでアミノ酸を分離し、同様に処理し
たアミノ酸標準液のピーク高から該合成ペプチドのアミ
ノ酸組成を求めた結果、Arg 0.80(1), Glu 0.98(1),Pro
3.40(3),Asn 0.96(1)であった。
Ｃ−ＯＤＳ−５（直径4.6mm×150mm，山村化学製)上で
溶離剤として０．１％トリフルオロ酢酸水溶液-アセト
ニトリル(５％-２３％グラジエント、１５分間、０．５
ｍｌ／分)を用いるＨＰＬＣにおいて、２９分間の保持
時間を示した。１０μｇ／５μｌのペプチド水溶液をイ
ンジェクトして得た保持時間２９分のピーク画分をチュ
ーブに入れ減圧乾燥させた後、PICO TAGワークステーシ
ョン(ウォーターズ社製)の反応槽に１％フェノール／６
Ｎ塩酸（容積／容積）を減圧気化（500mTorr）させ、１
５０℃で１時間処理してペプチドを酸分解した。引き続
き、湿潤状態のペプチドを減圧乾燥させ、エタノール、
水、トリエチルアミンの２：２：１（容積：容積：容
積）混合液１０μｌに溶解後再度減圧乾燥させた。その
後さらにエタノール、トリエチルアミン、水、フェニル
イソチオシアネートの７：１：１：１（容積：容積：容
積：容積）混合液を２０μｌ添加し、室温で２５分間反
応させた後、５０μｌのＰＴＣ−アミノ酸溶離液Ａ（和
光純薬工業社製）／ＰＴＣ−アミノ酸溶離液Ｂ（和光純
薬工業社製）（ＰＴＣ−アミノ酸溶離液Ｂ容積比０％−
７０％グラジェント、１５分間、１ｍｌ／分）を展開溶
液に用いるＨＰＬＣでアミノ酸を分離し、同様に処理し
たアミノ酸標準液のピーク高から該合成ペプチドのアミ
ノ酸組成を求めた結果、Arg 0.80(1), Glu 0.98(1),Pro
3.40(3),Asn 0.96(1)であった。
【００２２】例２：〔ペプチドの結合性の評価のための
ピンテクノロジ法による合成〕 本発明のペプチドの結合性を評価するために、ペプチド
のＮ末端をアセチル基で保護し、Ｃ末端を他のアミノ酸
誘導体を介し固相に結合させたピンテクノロジ法による
ペプチドの合成を行った。ケンブリッジ・リサーチ・バ
イオケミカル社（ＣＲＢ社）のＰＴ−０２−３０００マ
ニュアルに従い、ＮＥＣ社製のＡＰＣ Ｈ５０２０型コ
ンピュータ上でＣＲＢ社製ソフトウエアを起動させ、ペ
プチドの合成に必要なアミノ酸量、試薬量およびピンの
配置を計算した。ペプチドの合成は上記マニュアルおよ
び文献〔Geysen H M.:Use of peptide synthesis to pr
obe viral antigens for epitopes to a resolution of
asingle amino acid : Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,81,3
998-4002,(1984)〕に準じ、ＣＲＢ社製のミモトープ・
デザインキットに含まれるピン・ブロックとFmoc−Ｌ−
アミノ酸を用いて行った。セリンとスレオニンを除く全
てのアミノ酸はアミノ末端をFmoc基で保護された(-Opf
p)であり、セリンとスレオニンはアミノ末端をFmoc基で
保護された(-ODhbt)である。また、セリン、スレオニ
ン、チロシンの側鎖保護基は(-tBu)、アスパラギン酸、
グルタミン酸の側鎖保護基は(-OtBu)、リジン、ヒスチ
ジンの側鎖保護基は(Boc-)、アルギニンの側鎖保護基は
(Mtr-)、システィンの側鎖保護基は(Trt-)である。ま
た、合成に供するピンは表面にアクリル酸がグラフト重
合させてあるポリエチレンの支持体にヘキサメチレンジ
アミン(HMD)をスペーサとしてFmoc-βアラニン(bAla)が
結合させてある。以下に具体的合成例をしめす。
ピンテクノロジ法による合成〕 本発明のペプチドの結合性を評価するために、ペプチド
のＮ末端をアセチル基で保護し、Ｃ末端を他のアミノ酸
誘導体を介し固相に結合させたピンテクノロジ法による
ペプチドの合成を行った。ケンブリッジ・リサーチ・バ
イオケミカル社（ＣＲＢ社）のＰＴ−０２−３０００マ
ニュアルに従い、ＮＥＣ社製のＡＰＣ Ｈ５０２０型コ
ンピュータ上でＣＲＢ社製ソフトウエアを起動させ、ペ
プチドの合成に必要なアミノ酸量、試薬量およびピンの
配置を計算した。ペプチドの合成は上記マニュアルおよ
び文献〔Geysen H M.:Use of peptide synthesis to pr
obe viral antigens for epitopes to a resolution of
asingle amino acid : Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,81,3
998-4002,(1984)〕に準じ、ＣＲＢ社製のミモトープ・
デザインキットに含まれるピン・ブロックとFmoc−Ｌ−
アミノ酸を用いて行った。セリンとスレオニンを除く全
てのアミノ酸はアミノ末端をFmoc基で保護された(-Opf
p)であり、セリンとスレオニンはアミノ末端をFmoc基で
保護された(-ODhbt)である。また、セリン、スレオニ
ン、チロシンの側鎖保護基は(-tBu)、アスパラギン酸、
グルタミン酸の側鎖保護基は(-OtBu)、リジン、ヒスチ
ジンの側鎖保護基は(Boc-)、アルギニンの側鎖保護基は
(Mtr-)、システィンの側鎖保護基は(Trt-)である。ま
た、合成に供するピンは表面にアクリル酸がグラフト重
合させてあるポリエチレンの支持体にヘキサメチレンジ
アミン(HMD)をスペーサとしてFmoc-βアラニン(bAla)が
結合させてある。以下に具体的合成例をしめす。
【００２３】Arg-Glu-Pro-Pro-Asn-Proで示されるペプ
チドの合成 ポリエチレンロッド末端のピン球(直径４ｍｍ)にアクリ
ル酸をグラフト重合させ、HMDを介しFmoc基でαアミノ
基が保護されたβ-アラニンを結合させてある樹脂のFmo
c基を２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミド（容積
／容積）で３０分間除去処理し、ジメチルホルムアミ
ド、メタノールのそれぞれ過剰量で順に洗浄後風乾し、
さらにジメチルホルムアミド中で樹脂を平衡化後、２
２．５ｍＭ HOBT／ジメチルホルムアミドに溶解した２
０ｍＭ Fmoc-ProのOpfpの１００μｌに３０℃で１晩浸
漬し、その後過剰量のジメチルホルムアミド、メタノー
ルで樹脂を順次洗浄して Fmoc-Pro-bAla-HMD-樹脂を得
た。引き続き該ペプチド樹脂のαアミノ基の保護基(Fmo
c)を上記の処理により除き、さらに上記の段階を次に記
載する２０ｍＭの保護アミノ酸の Opfp； Fmoc-Asn, Fmoc-Pro, Fmoc-Pro, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc
-Arg(Mtr) をこの順で用いて反復反応させ保護されたペプチド樹
脂； Fmoc-Arg(Mtr)-Glu(OtBu)-Pro-Pro-Asn-Pro-bAla-HMD-
樹脂を得た。該ペプチド樹脂のαアミノ基の保護基(Fmo
c)を上記の処理により除き、過剰量のジメチルホルムア
ミド、メタノールで樹脂を順次洗浄後風乾した。その
後、ジメチルホルムアミド、無水酢酸、トリエチルアミ
ンの５:２：１（容積：容積：容積）混合液中に該ペプ
チド樹脂を浸漬してアセチル化反応を３０℃で９０分間
行い、同様に過剰量のジメチルホルムアミド、メタノー
ルで樹脂を順次洗浄後風乾した。引き続き、トリフルオ
ロ酢酸、アニソール、エタンジチオールの９５：２．
５：２．５（容積：容積：容積）混合液中に該ペプチド
樹脂を浸漬し室温で４時間反応させて保護基を除去、風
乾後０．１％（容積／容積）塩酸、５０％（容積／容
積）メタノールの混液中で該ペプチドを十分に超音波洗
浄して、Ac-Arg-Glu-Pro-Pro-Asn-Pro-bAla-HMD-樹脂を
得た。
チドの合成 ポリエチレンロッド末端のピン球(直径４ｍｍ)にアクリ
ル酸をグラフト重合させ、HMDを介しFmoc基でαアミノ
基が保護されたβ-アラニンを結合させてある樹脂のFmo
c基を２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミド（容積
／容積）で３０分間除去処理し、ジメチルホルムアミ
ド、メタノールのそれぞれ過剰量で順に洗浄後風乾し、
さらにジメチルホルムアミド中で樹脂を平衡化後、２
２．５ｍＭ HOBT／ジメチルホルムアミドに溶解した２
０ｍＭ Fmoc-ProのOpfpの１００μｌに３０℃で１晩浸
漬し、その後過剰量のジメチルホルムアミド、メタノー
ルで樹脂を順次洗浄して Fmoc-Pro-bAla-HMD-樹脂を得
た。引き続き該ペプチド樹脂のαアミノ基の保護基(Fmo
c)を上記の処理により除き、さらに上記の段階を次に記
載する２０ｍＭの保護アミノ酸の Opfp； Fmoc-Asn, Fmoc-Pro, Fmoc-Pro, Fmoc-Glu(OtBu), Fmoc
-Arg(Mtr) をこの順で用いて反復反応させ保護されたペプチド樹
脂； Fmoc-Arg(Mtr)-Glu(OtBu)-Pro-Pro-Asn-Pro-bAla-HMD-
樹脂を得た。該ペプチド樹脂のαアミノ基の保護基(Fmo
c)を上記の処理により除き、過剰量のジメチルホルムア
ミド、メタノールで樹脂を順次洗浄後風乾した。その
後、ジメチルホルムアミド、無水酢酸、トリエチルアミ
ンの５:２：１（容積：容積：容積）混合液中に該ペプ
チド樹脂を浸漬してアセチル化反応を３０℃で９０分間
行い、同様に過剰量のジメチルホルムアミド、メタノー
ルで樹脂を順次洗浄後風乾した。引き続き、トリフルオ
ロ酢酸、アニソール、エタンジチオールの９５：２．
５：２．５（容積：容積：容積）混合液中に該ペプチド
樹脂を浸漬し室温で４時間反応させて保護基を除去、風
乾後０．１％（容積／容積）塩酸、５０％（容積／容
積）メタノールの混液中で該ペプチドを十分に超音波洗
浄して、Ac-Arg-Glu-Pro-Pro-Asn-Pro-bAla-HMD-樹脂を
得た。
【００２４】例３；〔ペプチドの利尿ホルモン結合活性
の測定〕 上記例２に示す方法で各種ヘキサペプチドを製造し、以
下に示す方法で利尿ホルモンに対する結合活性を評価し
た。結果を表１に示す。 ａ：〔酵素免疫競合阻害測定法(EIA阻害活性)〕 例２において得られたペプチド樹脂を０．２％脱脂粉乳
溶液で易吸着性部位を被覆後、２００μｌのヒト・Ａ型
利尿ホルモン溶液(１μｇ／ｍｌ)［０．１％脱脂粉乳及
び０．１％トウィーンを含有するダルベッコ燐酸緩衝生
理食塩液に溶解して調製］に浸漬し、室温で緩やかに撹
拌しながら３時間反応を行った後の溶液を試料液(i)と
した。これとは別にＥＬＩＳＡ用マイクロプレートの孔
をヒト・Ａ型利尿ホルモン溶液(０．５μｇ／ｍｌ)の２
００μｌで４℃１晩処理し、さらに翌日０．２％脱脂粉
乳溶液でプレート上の未反応部位を保護してヒト・Ａ型
利尿ホルモン吸着プレート(ii)を調製した。ヒト・Ａ型
利尿ホルモン吸着プレート(ii)を洗浄用緩衝液［０．１
％トウィーンを含有するダルベッコ燐酸緩衝生理食塩
液］で洗浄後、試料液(i)の５０μｌを添加、その後直
ちに１０，０００分の１に希釈した抗ヒト・Ａ型利尿ホ
ルモンウサギ抗体溶液［希釈用緩衝液として、０．１％
脱脂粉乳及び０．１％トウィーンを含有するダルベッコ
燐酸緩衝生理食塩液を使用］の２００μｌを加え室温で
２時間競合反応を行った。該競合反応後プレートを洗浄
用緩衝液で十分に洗浄して、２，０００分の１に希釈し
たアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ，Ａ，
Ｍヤギ抗体溶液の２００μｌを加えプレート上に捕捉さ
れている抗ヒト・Ａ型利尿ホルモンウサギ抗体と室温で
２時間結合反応させた。その後同様にプレートを洗浄
し、基質溶液(１ｍｇ p-ニトロフェニル燐酸／ｍｌ １
Ｍジエタノールアミン緩衝液)の２００μｌを添加、プ
レート上に捕捉残存している標識酵素により遊離される
p-ニトロフェノール量を４０５ｎｍの吸光度を測定する
ことにより求め、別に作成した検量線から試料液(i)中
のヒト・Ａ型利尿ホルモン量を算出した。該ペプチドの
結合阻害活性（試料液(i)中のヒト・Ａ型利尿ホルモン
の抗原活性のペプチド樹脂ピンへの結合反応を行う前に
比べての低下した割合）を表１に示す。
の測定〕 上記例２に示す方法で各種ヘキサペプチドを製造し、以
下に示す方法で利尿ホルモンに対する結合活性を評価し
た。結果を表１に示す。 ａ：〔酵素免疫競合阻害測定法(EIA阻害活性)〕 例２において得られたペプチド樹脂を０．２％脱脂粉乳
溶液で易吸着性部位を被覆後、２００μｌのヒト・Ａ型
利尿ホルモン溶液(１μｇ／ｍｌ)［０．１％脱脂粉乳及
び０．１％トウィーンを含有するダルベッコ燐酸緩衝生
理食塩液に溶解して調製］に浸漬し、室温で緩やかに撹
拌しながら３時間反応を行った後の溶液を試料液(i)と
した。これとは別にＥＬＩＳＡ用マイクロプレートの孔
をヒト・Ａ型利尿ホルモン溶液(０．５μｇ／ｍｌ)の２
００μｌで４℃１晩処理し、さらに翌日０．２％脱脂粉
乳溶液でプレート上の未反応部位を保護してヒト・Ａ型
利尿ホルモン吸着プレート(ii)を調製した。ヒト・Ａ型
利尿ホルモン吸着プレート(ii)を洗浄用緩衝液［０．１
％トウィーンを含有するダルベッコ燐酸緩衝生理食塩
液］で洗浄後、試料液(i)の５０μｌを添加、その後直
ちに１０，０００分の１に希釈した抗ヒト・Ａ型利尿ホ
ルモンウサギ抗体溶液［希釈用緩衝液として、０．１％
脱脂粉乳及び０．１％トウィーンを含有するダルベッコ
燐酸緩衝生理食塩液を使用］の２００μｌを加え室温で
２時間競合反応を行った。該競合反応後プレートを洗浄
用緩衝液で十分に洗浄して、２，０００分の１に希釈し
たアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ，Ａ，
Ｍヤギ抗体溶液の２００μｌを加えプレート上に捕捉さ
れている抗ヒト・Ａ型利尿ホルモンウサギ抗体と室温で
２時間結合反応させた。その後同様にプレートを洗浄
し、基質溶液(１ｍｇ p-ニトロフェニル燐酸／ｍｌ １
Ｍジエタノールアミン緩衝液)の２００μｌを添加、プ
レート上に捕捉残存している標識酵素により遊離される
p-ニトロフェノール量を４０５ｎｍの吸光度を測定する
ことにより求め、別に作成した検量線から試料液(i)中
のヒト・Ａ型利尿ホルモン量を算出した。該ペプチドの
結合阻害活性（試料液(i)中のヒト・Ａ型利尿ホルモン
の抗原活性のペプチド樹脂ピンへの結合反応を行う前に
比べての低下した割合）を表１に示す。
【００２５】ｂ：〔放射性リガンドの結合活性〕 例３の方法において得られたペプチド樹脂を０．２％脱
脂粉乳溶液で易吸着性部位を被覆後、１００ｍｌの125
Ｉ-ヒト・Ａ型利尿ホルモン溶液(比活性〜７４ＴＢｑ／
ｍｍｏｌ)溶液（０．１３１ｎｇ／ｍｌ）［０．１％脱
脂粉乳及び０．１％トウィーンを含有するダルベッコ燐
酸緩衝生理食塩液に溶解して調製］に懸濁し室温で２時
間反応させた。結合反応後、ペプチド樹脂を洗浄用緩衝
液［０．１％トウィーンを含有するダルベッコ燐酸緩衝
生理食塩液］で十分に洗浄し、ペプチド樹脂に結合した
放射活性をγカウンタで測定した。その結果、ペプチド
樹脂に結合したヒト・Ａ型利尿ホルモンの量を算出し
た。結果を表１に示す。
脂粉乳溶液で易吸着性部位を被覆後、１００ｍｌの125
Ｉ-ヒト・Ａ型利尿ホルモン溶液(比活性〜７４ＴＢｑ／
ｍｍｏｌ)溶液（０．１３１ｎｇ／ｍｌ）［０．１％脱
脂粉乳及び０．１％トウィーンを含有するダルベッコ燐
酸緩衝生理食塩液に溶解して調製］に懸濁し室温で２時
間反応させた。結合反応後、ペプチド樹脂を洗浄用緩衝
液［０．１％トウィーンを含有するダルベッコ燐酸緩衝
生理食塩液］で十分に洗浄し、ペプチド樹脂に結合した
放射活性をγカウンタで測定した。その結果、ペプチド
樹脂に結合したヒト・Ａ型利尿ホルモンの量を算出し
た。結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】例４；その他、前記例２に示す方法によ
り、下記に示すペプチドを合成し、例３に示す方法で評
価したところ、いずれのペプチドも充分な結合活性を示
した。 Arg-Glu-Pro-Pro、Arg-Glu-Pro-Pro-Asn、Pro-Asn-Pro-
Pro-Glu-Arg
り、下記に示すペプチドを合成し、例３に示す方法で評
価したところ、いずれのペプチドも充分な結合活性を示
した。 Arg-Glu-Pro-Pro、Arg-Glu-Pro-Pro-Asn、Pro-Asn-Pro-
Pro-Glu-Arg
【００２８】
【発明の効果】本発明のペプチドは、利尿ホルモンに対
し特異的な反応性および高い結合能を有する。したがっ
て、利尿ホルモンおよび利尿ホルモン構造を含有する前
駆物質または利尿ホルモンの一部の測定に用いる検出試
薬、さらには、これらの生理機能を賦活または修飾する
治療薬をはじめとする薬剤等として非常に有用である。
し特異的な反応性および高い結合能を有する。したがっ
て、利尿ホルモンおよび利尿ホルモン構造を含有する前
駆物質または利尿ホルモンの一部の測定に用いる検出試
薬、さらには、これらの生理機能を賦活または修飾する
治療薬をはじめとする薬剤等として非常に有用である。
【００２９】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Arg Glu Pro Pro 1
【００３０】配列番号：２ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Pro Pro Asn 1
【００３１】配列番号：３ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Pro Pro Asn Pro 1
【００３２】配列番号：４ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Pro Asn Pro Pro 1
【００３３】配列番号：５ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asn Pro Pro Glu 1
【００３４】配列番号：６ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Pro Pro Glu Arg 1
【００３５】配列番号：７ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Arg Glu Pro Pro Asn 1 5
【００３６】配列番号：８ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Pro Pro Asn Pro 1 5
【００３７】配列番号：９ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Pro Asn Pro Pro Glu 1 5
【００３８】配列番号：１０ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asn Pro Pro Glu Arg 1 5
【００３９】配列番号：１１ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Arg Glu Pro Pro Asn Pro 1 5
【００４０】配列番号：１２ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｒｇ １ ５
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｂ 8310−2Ｊ Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 小田川 泰久 茨城県つくば市和台48番地 日立化成工業 株式会社筑波開発研究所内 (72)発明者 馬場 憲三 茨城県つくば市和台48番地 日立化成工業 株式会社筑波開発研究所内
Claims (2)
- 【請求項１】 利尿ホルモンに結合性を有し、次式、 Arg-Glu-Pro-Pro-Asn-Pro またはPro-Asn-Pro-Pro-Glu-Arg で特定されるアミノ酸配列の少なくとも４個のアミノ酸
の連続配列を含有するペプチドの群から選択されること
を特徴とするペプチドおよび医薬用、診断薬用または生
物体由来物質調製用として許容されるその塩。 - 【請求項２】 ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端のいず
れか一方、または両方が、随意に遮断もしくは保護され
ている請求項１記載のペプチドおよび医薬用、診断薬用
または生物体由来物質調製用として許容されるその塩。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3295713A JPH05140195A (ja) | 1991-11-12 | 1991-11-12 | ペプチドおよびその塩 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3295713A JPH05140195A (ja) | 1991-11-12 | 1991-11-12 | ペプチドおよびその塩 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05140195A true JPH05140195A (ja) | 1993-06-08 |
Family
ID=17824197
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3295713A Pending JPH05140195A (ja) | 1991-11-12 | 1991-11-12 | ペプチドおよびその塩 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05140195A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002069055A (ja) * | 2000-05-15 | 2002-03-08 | Bayer Corp | トリプシン基質及び診断具ならびにその使用方法 |
-
1991
- 1991-11-12 JP JP3295713A patent/JPH05140195A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002069055A (ja) * | 2000-05-15 | 2002-03-08 | Bayer Corp | トリプシン基質及び診断具ならびにその使用方法 |
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