JPH0515438B2 - - Google Patents

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JPH0515438B2
JPH0515438B2 JP58234928A JP23492883A JPH0515438B2 JP H0515438 B2 JPH0515438 B2 JP H0515438B2 JP 58234928 A JP58234928 A JP 58234928A JP 23492883 A JP23492883 A JP 23492883A JP H0515438 B2 JPH0515438 B2 JP H0515438B2
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JP
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nucleic acid
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alcohol
organic solvents
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Gurooto Suzanne
Oosutoman Jonasan
Uidoro Robaato
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INTEGUREETETSUDO JENETEITSUKUSU Inc
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INTEGUREETETSUDO JENETEITSUKUSU Inc
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

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  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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  • Saccharide Compounds (AREA)
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  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Adhesives Or Adhesive Processes (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、例えばDNAのハイブリツド形成
（混成分子形成）による検定を行うために、核酸
（RNA及びDNA）を支持体に結合させることに
関する。
このような検定はここ数年間試料中の特定の
DNA配列を検出するために使用されてきており、
特許や技術文献（例えば、Falkow等による米国
特許第4358535号明細書、これは参照することに
よりここに引用される）に開示されている。この
ような検定は一般的に試料中のウイルス、原核細
胞または真核細胞に特定のDNA配列を含むこと
が予想される試料（例えば、尿）をDNA結合支
持体（例えば、ニトロセルロース膜）上に点在さ
せ、必要により細胞を溶解し、DNAを変性並び
に中和して、その後ハイブリツド形成による検定
を行う前にそのDNAを支持体に固定することを
包含する。一般に固定は、例えばGillespie等に
よるJ.Mol.Biol.12829（1965）に記載されるごと
く、自然乾燥させてその後真空炉中で２時間乾燥
させることにより実施される。
一般的に、本発明は核酸（DNAまたはRNA）
を核酸結合支持体に結合させる方法に特徴があ
り、この方法は核酸をその支持体上に付着させ、
次いでその核酸と支持体とを支持体と適合しかつ
核酸を支持体に結合させ得る有機溶媒を含有する
結合溶液に、結合を行わしめるのに十分な時間の
間、接触させることを包含する。
好ましい実施態様において、核酸はハイブリツ
ド形成により検定されるべき試料中に含まれてお
り、結合溶液はハイブリツド形成を妨害するよう
な方法でDNAを変化させず、そしてその有機溶
媒は分子中に20個より多くない炭素原子を含みか
つその有機溶媒が実質的に溶媒の全てをなしてお
り、アルコール、エーテル、芳香族化合物または
ケトンであり、最も好ましくはエタノール、メタ
ノール、sec−ブチルアルコール、イソアミルア
ルコール、イソプロピルアルコール、イソブチル
アルコール、エチルエーテルまたはトルエンであ
る。他の好ましい実施態様において、結合溶液は
１種以上のこのような有機溶媒の混合物を含み、
そして核酸と支持体とがその結合溶液と接触する
時間は１秒ないし10分、最適には約５分である。
本発明方法は非常に短時間で、すなわちたいて
いの場合には５分またはそれ以下で、核酸を固定
化することができる。こうして、ドツトの吸い取
り（Dot blots）、サザンの吸い取り（Sout−
hern blots）、コロニー隆起、および変性核酸を
支持体に固定化するのに要する他の技術を完了さ
せるのに必要な全時間が非常に短縮される。その
上に、本発明方法は真空ポンプや真空炉のような
高価な装置を使用する必要がない。
本発明の他の特徴および効果は次の好ましい実
施態様の記述から明らかになるだろう。
多くの異なつた部類の有機化合物である非常に
広範囲の有機溶媒が核酸を核酸結合支持体に結合
させるのに使用される。最も好ましい部類の化合
物はアルコール類であり、これは一般に毒性が少
ないために他の部類の化合物より取り扱いが簡単
である。核酸を結合させるがアルコール類ほど望
ましいものではない他の部類の化合物にはエーテ
ル類（例えば、エチルエーテル）、芳香剤化合物
（例えば、トルエン）およびケトン類（例えば、
アセトン）がある。さらに他の部類の有機溶媒に
はアルカン類、アルケン類、アルキン類、エステ
ル類およびハロゲン化アルカンのようなヘテロ有
機化合物（例えば、クロロホルムや四塩化炭素）
がある。全ての部類の有機溶媒にとつて、このよ
うな使用のために費用等を考えると、炭素原子数
が20個より多くないものであること、最適には10
個より多くないものであるということが必要であ
る。
特定の場合における溶媒の選択はいくつかの要
因に決められるだろう。まず第一に、溶媒を含む
結合溶液はその結合方法の意図した目的を妨害す
るような方法で核酸を変化させるものであつては
ならず、例えば、核酸をハイブリツド形成による
検定のために固定化する場合にその核酸は溶媒で
の処理後にハイブリツド形成が可能でなければな
らない。
第二に、溶媒を含む結合溶液は使用する支持体
と適合するものでなければならず、すなわち、溶
媒はその結合方法の目的を妨害する程度に支持体
を溶解してはならない。いくつかの核酸結合支持
体は他のものより有機溶媒に溶解されやすい。こ
うして実際に、高い耐溶媒性を示すナイロン基材
の支持体はどの有機溶媒も安全に使用することが
できるが、一方ニトロセルロースのような比較的
溶解されやすい支持体に対しては溶媒の選択がよ
り限定されたものとなる。例えば、無水メタノー
ルやアセトンはハイブリツド形成による検定に許
容されない程度にニトロセルロース膜を軟化する
のでニトロセルロース膜に対しては適合せず、一
方ナイロン基材の支持体には適合する。有機溶媒
と支持体とが不適合である場合に、核酸結合溶液
は、例えば水との希釈によりあるいはより緩和な
有機溶媒との組み合わせにより、しばしば改質さ
れる。こうして、例えば90％メタノールは有効な
結合溶液であり、ニトロセルロースに適合する
が、無水メタノールは不適合である。
最後に、結合溶液は使用温度において液体であ
るべきである。多くの場合にこれは室温である
が、いくつかの場合には室温より高いかまたは低
くてもよい。
実施例 本発明方法の例は、血清中のＢ型肝炎ウイルス
DNAを検出する場合において、次の通りである。
血清試料7μlを0.45μMのニトロセルロース膜上に
滴下させて自然乾燥させる。その膜を0.5M
NaOH，1.5MNaClに１分間浸漬して試料中の
DNAを変性し、その後その膜を1.0Mトリス（PH
7.5）、3MNaClに１分間浸漬して中和する。次い
で膜は自然乾燥させ、その膜を無水sec−ブチル
アルコールに５分間浸漬してDNAを膜に結合さ
せる。その後膜を取り出して自然乾燥させる。
DNAが結合した膜をプラスチツクの袋に入れ、
次いでこの袋に次の組成のハイブリツド形成溶液
を加える：6XSSCP（0.90MNaCl，0.090Mクエン
酸ナトリウム、0.12Mリン酸緩衝液PH7.0）、2Xデ
ンハート溶液（Denhardt′s solution：0.04％牛血
清アルブミン、0.04％ポリビニルピロリドン、
0.04％フイコール500）、40％ホルムアミド、10％
デキストラン硫酸、500μg／mlさけ精液DNA、
および1.6mg／ml追加の牛血清アルブミン。その
後、放射能で標識をしたＢ型肝炎ウイルスDNA
プローブ（比放射能＝２〜３×108cpm／μg）を
ハイブリツド形成溶液１mlあたり１×107カウン
トに対応する量で加える。
プラスチツクの袋を密封して37℃で２〜３時間
ハイブリツドの形成を進行させる。次いで膜を取
り出し、3mMトリス塩基で20分間洗浄して特異
的に結合されないプローブを除去する。洗浄した
膜はＸ−線フイルム下に配置して、血清試料中の
Ｂ型肝炎ウイルスDNAを定量するために４〜24
時間の間オートラジオグラグにかける。
他の実施態様は特許請求の範囲内のものであ
る。例えば、核酸結合技術はいずれかの適当な核
酸結合支持体（例えば、ポール・バイオジン ナ
イロン膜、Pall Biodyne nylon membranes）
と関連して使用され、試料および核酸は所望のい
ずれかの起源（例えば、尿や唾液試料中の細菌
DNAまたは真核生物DNA、血液試料中のウイル
スRNA）からのものであり、そして核酸は支持
体上に点在させる前に精製してもよい。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 核酸をナイロンもしくはニトロセルロースか
    らなる核酸結合支持体上に付着させ、次いでその
    核酸と支持体とを支持体に適合しかつ核酸を支持
    体に結合させ得る有機溶媒を含有する結合溶液
    に、結合を行わしめるのに十分な時間の間、接触
    させることを特徴とする核酸を核酸結合支持体に
    結合させる方法。 ２ 核酸は前もつて決定された型の核酸に対する
    ハイブリツド形成により検定されるべき試料中に
    含まれ、その試料を核酸結合支持体上に付着させ
    る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３ 核酸はDNAであり、支持体に結合させる前
    にそのDNAをハイブリツド形成による検定で使
    用するために変性し次いで中和する、特許請求の
    範囲第２項に記載の方法。 ４ 付着させた後の核酸と支持体は核酸結合溶液
    に接触させる前に自然乾燥させる、特許請求の範
    囲第１項に記載の方法。 ５ 核酸結合溶液との接触はハイブリツド形成を
    妨害するような方法で核酸を変化させない、特許
    請求の範囲第２項に記載の方法。 ６ 有機溶媒は分子中に20個より多くない炭素原
    子を含む、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ７ 核酸結合溶液は実質的にその全てが有機溶媒
    からなつている、特許請求の範囲第１項に記載の
    方法。 ８ 有機溶媒はアルコール、エーテル、芳香族化
    合物またはケトンである、特許請求の範囲第６項
    に記載方法。 ９ 核酸結合溶液は１種以上の有機溶媒の混合物
    を含み、その混合物は核酸を核酸結合支持体に結
    合させることができる、特許請求の範囲第１項に
    記載の方法。 １０ 有機溶媒は各々分子中に20個より多くない
    炭素原子を含む、特許請求の範囲第９項に記載の
    方法。 １１ 有機溶媒は各々互いに無関係にアルコー
    ル、エーテル、芳香族化合物またはケトンであ
    る、特許請求の範囲第９項に記載の方法。 １２ 有機溶媒はエタノール、メタノール、sec
    −ブチルアルコール、イソアミルアルコール、イ
    ソプロピルアルコール、イソブチルアルコール、
    エチルエーテルまたはトルエンである、特許請求
    の範囲第８項に記載の方法。 １３ 有機溶媒は各々互いに無関係にエタノー
    ル、メタノール、sec−ブチルアルコール、イソ
    アミルアルコール、イソプロピルアルコール、イ
    ソブチルアルコール、エチルエーテルまたはトル
    エンである、特許請求の範囲第１１項に記載の方
    法。 １４ 有機溶媒はsec−ブチルアルコールである、
    特許請求の範囲第８項に記載の方法。 １５ 有機溶媒のうちの１種はsec−ブチルアル
    コールである、特許請求の範囲第１３項に記載の
    方法。 １６ 接触時間は１秒ないし10分である、特許請
    求の範囲第１項に記載の方法。 １７ 接触時間は約５分である、特許請求の範囲
    第１６項に記載の方法。 １８ 接触させた後に支持体と核酸を自然乾燥さ
    せる、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
JP58234928A 1982-12-13 1983-12-13 支持体への核酸結合方法 Granted JPS59122499A (ja)

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US448979 1982-12-13
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JPS59122499A JPS59122499A (ja) 1984-07-14
JPH0515438B2 true JPH0515438B2 (ja) 1993-03-01

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