JPH05170752A - ３，７−ビス（ジ置換アミノ）フェノチアジン誘導体およびその製造法 - Google Patents

３，７−ビス（ジ置換アミノ）フェノチアジン誘導体およびその製造法

Info

Publication number
JPH05170752A
JPH05170752A JP4099260A JP9926092A JPH05170752A JP H05170752 A JPH05170752 A JP H05170752A JP 4099260 A JP4099260 A JP 4099260A JP 9926092 A JP9926092 A JP 9926092A JP H05170752 A JPH05170752 A JP H05170752A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
formula
amino
general formula
phenazathionium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP4099260A
Other languages
English (en)
Inventor
Hironaga Masuya
浩大 桝屋
Hiroshi Shimazu
浩 島津
Toshio Miyawaki
敏雄 宮脇
Ee Motsutsuenbotsukaa Maabin
マービン・エー・モッツエンボッカー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries Ltd filed Critical Takeda Chemical Industries Ltd
Priority to JP4099260A priority Critical patent/JPH05170752A/ja
Publication of JPH05170752A publication Critical patent/JPH05170752A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Pyrrole Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Nitrogen- Or Sulfur-Containing Heterocyclic Ring Compounds With Rings Of Six Or More Members (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 抗体蛋白等を容易に修飾しうる光感受性染料
誘導体を提供する。 【構成】一般式： 【化１】 ［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はそれぞれＣ1-6アル
キル基であって、その少なくとも１つはアミノ基、チオ
ール基またはカルボキシル基と反応する基を置換基とし
て有し、Ｘはフェナザチオニウムと対イオンを形成しう
る基を示す］で表されるフェノチアジン誘導体。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規フェノチアジン誘
導体およびその製造法に関する。本発明化合物は、光感
受性染料の１つであるメチレンブルーの抗体蛋白等への
結合能を有した誘導体であり、癌の光力学治療（ｐｈｏ
ｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ）や化学発光を利
用する免疫試験法への応用が期待される化合物である。
【０００２】
【従来の技術】光感受性染料類の酸化的特性反応を利用
した実用例としては、例えば、メチレンブルーによる用
水の消毒滅菌がよく知られている。これまでに、ローズ
ベンガル、フルオレセイン、エオシン、エリスロシン等
のキサンチン類、メチレンブルーに代表されるフェノチ
アジン類およびポルフィリン類等の光感受性染料の光励
起活性について広範な研究がなされており、最近では癌
の臨床薬や診断薬の分野への応用が増加する傾向にあ
る。これらの光感受性染料のうち、メチレンブルーは異
常に強力な光酸化作用を有し、また生体組織を容易に透
過する長波長光（６７０ｎｍ）を吸収する点で優れてい
る。メチレンブルーの光による励起活性は、フート（メ
カニズム・オブ・フォトセンシタイズド・オキシディシ
ョン）［Ｆｏｏｔｅ（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆ Ｐｈ
ｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ、１
９６８年１１月２９日、１６２巻、９６３〜９７０
頁）］によって報告されたように、主として２つの反応
からなっていると考えられる。すなわち、タイプＩの光
励起反応にあっては、励起された染料が直接基質と反応
し、タイプIIの場合には、まず励起された三重項染料
が、分子状酸素と反応して一重項酸素を生成し、ついで
基質を酸化すると考えられており、そのいずれのルート
を経るかは、色素、溶存酸素および基質の濃度で決まる
とされている。
【０００３】最近、これらの光感受性染料のうちでもと
りわけポルフィリン類の癌治療への利用が報告された
［アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、６１巻、１９８９年１２月
１５日、１３６７〜１３７５頁］。それによると、ポル
フィリン類は癌組織またはその付近に注入され、体の外
部から光エネルギーの供給を受けることにより励起さ
れ、一重項酸素を生成し癌細胞を死に至らしめるとされ
ている。このような染料類の重要な特徴の１つに、生体
組織を透過できる長波長光（＞６５０ｎｍ）を吸収でき
る点が挙げられる。このような癌治療の試みとして、最
近、抗原抗体反応の特異性を利用した改良方法が報告さ
れた。すなわち、癌に対する抗体に光感受性のポルフィ
リン染料を結合することにより、抗原である癌細胞自体
を特異的に攻撃する方法である（ＪＯ ２０５９−５８
５−Ａ；欧州特許第２５２６８３号）。しかしながら、
これらの光感受性染料の大部分は抗体蛋白に結合させる
ことは容易ではない。かくして、蛋白とのカップリング
が容易でかつ長波長光（＞６５０ｎｍ）を吸収できる高
反応性光感受性染料が容易に入手できるならば、この分
野における意義深い改善をもたらすことが期待できる。
【０００４】光感受性染料のもう１つの重要な利用法
に、診断薬の分野が挙げられる。例えば、本明細書にお
ける光感受性染料は、抗体、ハプテンまたは核酸（ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ）プローブのラベル化に用いられる。得られ
たラベル化された抗体、ハプテンまたは核酸プローブ
は、臨床化学分析の過程において被分析物の原量（ｏｒ
ｉｇｉｎａｌ）を示すシグナルの発生に用いられる。そ
のシグナルはラベル化した光感受性染料に由来するもの
であり、比色、蛍光あるいは化学発光がその代表的なも
のである。しかしながら、この方法は蛋白とハプテンま
たは核酸と共有結合が可能な光感受性染料の高反応性誘
導体が、これまで入手困難であったためほとんど利用さ
れていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】理想的な光感受性染料
の誘導体は、通常の反応条件下で蛋白、ハプテンまたは
核酸と容易に反応できる活性な官能基を有していること
である。これらの活性な官能基の１つは、蛋白または核
酸のアミノ基と反応できるスクシンイミドエステル基で
あり、もう１つは蛋白のチオール基と反応できるマレイ
ミド基である。メチレンブルー色素にこのような官能基
を直接導入することは困難であり、この事実はメチレン
ブルーが５０年以上にわたって多くの研究対象になった
にもかかわらず、蛋白または核酸の修飾可能な誘導体が
未だ見いだされていないことからも自明である。蛋白ま
たはハプテン（例えば、甲状腺ホルモン）に染料のよう
な低分子の芳香族化合物が結合した際に、染料触媒標識
体（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の
沈降と固相表面への非特異的結合がしばしば問題とな
る。この２つの問題は水溶液中での染料の疎水性によっ
て惹起されるものであり、結果として染料触媒標識体の
溶解度の低下と固相表面への蛋白、ハプテンまたは核酸
の非特異的吸着を生じる。かくして、染料触媒標識体の
このような不安定性の改良、あるいは非特異的吸着を防
止する何らかの方法を見いだすことができれば、従来の
技術を大幅に改善することが可能となる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の問
題点に鑑み、メチレンブルーの反応性誘導体を種々合成
し、検討した結果、メチレンブルー骨格へのカルボキシ
ル基等の親水性基の導入が、染料触媒標識体の不安定性
の改良に効果的であることを見いだし、本発明を完成す
るに至った。
【０００７】すなわち本発明は、 （１）一般式：
【０００８】
【化１５】
【０００９】［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はそれぞ
れＣ1-6アルキル基であって、その少なくとも１つはア
ミノ基、チオール基またはカルボキシル基と反応する基
を置換基として有し、Ｘ-はフェナザチオニウムの対イ
オンを示す］で表されるフェノチアジン誘導体；
【００１０】（２）一般式：
【００１１】
【化１６】
【００１２】［式中、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3'およびＲ4'の少
なくとも１つは式：-(ＣＨ2)m-ＣＯ-Ｙで示される基
を、他はＣ1-6アルキル基を示し、Ｙは脱離基を示し、
ｍは１〜６の整数を示し、Ｘ-はフェナザチオニウムの
対イオンを示す］で表されるフェノチアジン誘導体；
【００１３】（３）一般式：
【００１４】
【化１７】
【００１５】［式中、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3'およびＲ4'の少
なくとも１つは式：-(ＣＨ2)m-ＣＯ-Ｙで示される基
を、他はＣ1-6アルキル基を示し、Ｙは脱離基を示し、
ｍは１〜６の整数を示す］で表されるインダミンチオス
ルホン酸誘導体；
【００１６】（４）一般式：
【００１７】
【化１８】
【００１８】［式中、Ｒ1”はＣ1-6アルキル基を示し、
Ｙは脱離基を示し、ｍは１〜６の整数を示す］で表され
る２−アミノ−５−ジ置換アミノフェニルチオスルホン
酸誘導体； （５）一般式
【００１９】
【化１９】
【００２０】［式中、Ｒ1'、Ｒ2'およびＲ3'の少なくと
も１つは式：-(ＣＨ2)m-ＣＯ-Ｙで示される基を、他は
Ｃ1-6アルキル基を示し、Ｙは脱離基を示し、ｍは１〜
６の整数を示す］で表されるインダミンチオスルホン酸
誘導体； （６）一般式：
【００２１】
【化２０】
【００２２】［式中、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3'およびＲ4'の少
なくとも１つは式：-(ＣＨ2)m-ＣＯ-Ｙで示される基
を、他はＣ1-6アルキル基を示し、Ｙは脱離基を示し、
ｍは１〜６の整数を示し、Ｘ-はフェナザチオニウムの
対イオンを示す］で表されるフェノチアジン誘導体のＹ
を脱離させ、ついでアミノ基、チオール基またはカルボ
キシル基と反応する基を導入することを特徴とする一般
式：
【００２３】
【化２１】
【００２４】［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はそれぞ
れＣ1-6アルキル基であって、その少なくとも１つはア
ミノ基、チオール基またはカルボキシル基と反応する基
を置換基として有し、Ｘ-はフェナザチオニウムの対イ
オンを示す］で表されるフェノチアジン誘導体の製造
法； （７）一般式：
【００２５】
【化２２】
【００２６】［式中、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3'およびＲ4'の少
なくとも１つは式：-(ＣＨ2)m-ＣＯ-Ｙで示される基
を、他はＣ1-6アルキル基を示し、Ｙは脱離基を示し、
ｍは１〜６の整数を示す］で表されるインダミンチオス
ルホン酸誘導体を、水あるいは有機溶媒またはそれらの
混合溶媒中、無機酸化剤で酸化的に閉環して一般式：
【００２７】
【化２３】
【００２８】［式中、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3'およびＲ4'の少
なくとも１つは式：-(ＣＨ2)m-ＣＯ-Ｙで示される基
を、他はＣ1-6アルキル基を示し、Ｙは脱離基を示し、
ｍは１〜６の整数を示し、Ｘ-はフェナザチオニウムの
対イオンを示す］で表されるフェノチアジン誘導体を
得、そのＹを脱離させ、ついでアミノ基、チオール基ま
たはカルボキシル基と反応する基を導入することを特徴
とする一般式：
【００２９】
【化２４】
【００３０】［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はそれぞ
れＣ1-6アルキル基であって、その少なくとも１つはア
ミノ基、チオール基またはカルボキシル基と反応する基
を置換基として有し、Ｘ-はフェナザチオニウムの対イ
オンを示す］で表されるフェノチアジン誘導体の製造
法； （８） 一般式：
【００３１】
【化２５】
【００３２】［式中、Ｂはスクシンイミドオキシカルボ
ニル基またはマレイミド基を示し、ｍは１〜６の整数を
示す］で表されるスクシンイミドエステル誘導体に、酸
性アミノ酸のトリエチルアミン塩を反応させることを特
徴とする一般式：
【００３３】
【化２６】
【００３４】［式中、Ｂはスクシンイミドオキシカルボ
ニル基またはマレイミド基を示し、ｍは１〜６の整数を
示し、ｎは１または２を示す］で表される化合物の製造
法； （９） 一般式：
【００３５】
【化２７】
【００３６】［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は同一ま
たは異なってそれぞれＣ1-6アルキル基であって、その
少なくとも１つはアミノ基、チオール基またはカルボキ
シル基と反応する基を置換基として有し、Ｘ-はフェナ
ザチオニウムの対イオンを示す］で表されるフェノチア
ジン誘導体を抗原または抗体にカップリングさせて得ら
れる標識体を測定することを特徴とする試料中の分析対
象の測定方法； （１０） 抗原または抗体にそのアミノ基、チオール基
またはカルボキシ基によりカップリングした一般式：
【００３７】
【化２８】
【００３８】［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は同一ま
たは異なってそれぞれＣ1-6アルキル基であって、その
少なくとも１つはアミノ基、チオール基またはカルボキ
シル基と反応する基を置換基として有し、Ｘ-はフェナ
ザチオニウムの対イオンを示す］で表されるフェノチア
ジン誘導体よりなることを特徴とする該抗原または抗体
の標識体；を提供するものである。
【００３９】前記一般式(Ｉ)の化合物のＲ1〜Ｒ4におけ
る、アミノ基、チオール基またはカルボキシル基と反応
する基としては、免疫試験等の対象となる蛋白、ハプテ
ン、ペプチド、核酸、アミノ酸等と反応しうるいずれの
基でもよく、特に限定するものではないが、代表的な例
として、（１）アミノ基と反応する基としては、カルボ
キシル基、ハロゲノカルボニル基（例、クロロカルボニ
ル基）、アジドカルボニル基、シアノカルボニル基、ア
ルコキシカルボニルオキシカルボニル基（例、エトキシ
カルボニルオキシカルボニル基、イソブトキシカルボニ
ルオキシカルボニル基）、置換フェノキシカルボニル基
（例、ｐ−ニトロフェノキシカルボニル基、２,４−ジ
ニトロフェノキシカルボニル基、ペンタクロロフェノキ
シカルボニル基、２,４,５−トリクロロフェノキシカル
ボニル基、ペンタフルオロフェノキシカルボニル基）、
１−イミダゾリルカルボニル基、１−ベンゾトリアゾリ
ルオキシカルボニル基、５−ノルボルネン−２,３−ジ
カルボキシイミドオキシカルボニル基、スクシンイミド
オキシカルボニル基、マレイミドオキシカルボニル基、
アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基が；（２）チオ
ール基と反応する基としては例えば、マレイミド基が；
（３）カルボキシル基と反応する基としては例えば、ア
ミノアルキルカルバモイル基（例、アミノエチルカルバ
モイル基、アミノデシルカルバモイル基）等が挙げられ
る。
【００４０】本発明においては、その目的から、かかる
反応性の基は一般式(Ｉ)のＲ1〜Ｒ4基の少なくとも１つ
に含まれていることが必要である。また、一般式(Ｉ)の
化合物はその目的から親水性であることが好ましく、Ｒ
1〜Ｒ4基の組み合わせにより、かかる反応性の基の数は
適宜選択できる。Ｒ1〜Ｒ4で示されるＣ1-6アルキル基
としては、同一または異なって、それぞれ直鎖状または
分枝鎖状のＣ1-6アルキル基、例えば、メチル、エチ
ル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec−ブチル、
ｔert−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチ
ル、ヘキシル、イソヘキシル等が挙げられ、メチレンブ
ルーとの構造上の類似性および親水性の観点から特にメ
チルおよびエチルが好ましい。Ｒ1’〜Ｒ4’および本明
細書における他の基におけるＣ1-6アルキル基も同様な
基を示す。
【００４１】前記一般式(I)および(II)においてＸで示
されるフェナザチオニウムと対イオンを形成しうる基と
しては、ハロゲン（例、塩素、臭素、ヨウ素、フッ
素）、ヒドロキシル、過塩素酸、硫酸、硝酸、トリフル
オロ酸、ホウフッ化水素酸等が挙げられる。前記一般式
(II)、(III)、(IV)および(V)において式：-(ＣＨ2)m-
ＣＯ-Ｙ中Ｙで示される脱離基としては、ペプチド合
成、β−ラクタム抗生物質等の分野で通常用いられる脱
離基でよく、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキ
シ、sec−ブトキシ、tert−ブトキシなど炭素数１〜４
の低級アルコキシ基およびベンジルオキシ、ｐ−ニトロ
ベンジルオキシ、ｐ−メチルチオベンジルオキシ、ジフ
ェニルメチルオキシ、４−ピリジルメトキシ等のアラル
キルオキシ基あるいは１−フェノキシエトキシ基等が挙
げられる。
【００４２】一般式（I）で表される化合物は、例え
ば、一般式（II）で表されるフェノチアジン誘導体のＹ
を脱離させ、ついでアミノ基、チオール基またはカルボ
キシル基と反応する基を導入することにより得られる。
具体的には例えば、以下に示すチャート１の工程に従っ
て製造できる。
【００４３】チャート１ ［チャート１中、ｍは１〜６の整数、ｎは１または２、
Ｘ-はフェナザチオニウムの対イオンを示す。］
【００４４】
【化２９】
【００４５】［式中、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3'およびＲ4'の少
なくとも１つは式：-(ＣＨ2)m-ＣＯ-Ｙで示される基
を、他はＣ1-6アルキル基を示し、Ｙは脱離基を示
す。］
【００４６】
【化３０】
【００４７】［式中、Ｒ5'、Ｒ6'、Ｒ7'およびＲ8'の少
なくとも１つは式：-(ＣＨ2)m-ＣＯＯＨで示される基
を、他はＣ1-6アルキル基を示す。］
【００４８】
【化３１】
【００４９】［式中、Ｒ9'、Ｒ10'、Ｒ11'およびＲ12'
の少なくとも１つは式：-(ＣＨ2)m-ＣＯＡで示される基
を、他はＣ1-6アルキル基を示し、-ＣＯＡはアミノ基と
反応する基を示す。］
【００５０】
【化３２】
【００５１】［式中、Ｒ13'、Ｒ14'、Ｒ15'およびＲ16'
の少なくとも１つは式： -(CH2)m-CONH-CH(COOH)-(CH2)n-COOH で示される基を、他はＣ1-6アルキル基または-(ＣＨ2)m
−ＣＯＡ（-ＣＯＡは前記と同意義）を示す］
【００５２】すなわち、 （１）一般式（Ｉ）で表されるフェノチアジン誘導体の
うち、Ｒ1〜Ｒ4にアミノ基と反応する基を有する化合物
は、一般式（II）で表される化合物を加水分解、接触還
元または酸分解反応（ａｃｉｄｏｌｙｓｉｓ）に付して
得られるカルボン酸誘導体を、ハロゲン化、アジド化、
混合酸無水物化あるいは活性エステル化反応に付す公知
方法によって製造することができる。なお、チャート
中、−ＣＯＡで表されるアミノ基と反応する基として
は、Ｒ1〜Ｒ4で表されるアミノ基と反応する基として前
記したもの（ただし、アスパラギン酸残基およびグルタ
ミン酸残基は除く）が挙げられる。
【００５３】一般式（II）で表される化合物のエステル
加水分解は通常、鉱酸または苛性アルカリの１規定溶液
中、反応温度２０〜３０℃、所要時間２０分〜４８時間
で行うことができる。しかしながら、このような条件下
ではフェノチアジン骨格の分解も同時に進行するため一
般的に低収率であり、この傾向はアルカリ性条件下で特
に顕著である。化合物（II）における脱離基が、ベンジ
ルオキシ、ｐ−ニトロベンジルオキシ、４−ピリジルメ
トキシ、ジフェニルメチルオキシ等のアラルキルオキシ
基である場合には、接触還元でこれらを除去することが
できる。反応は通常、不活性溶媒中、常温常圧下に水素
気流中、パラジウム触媒で処理することにより行う。こ
の際、エステルの脱離と共に、フェノチアジン骨格も還
元され、ロイコ型のフェノチアジン誘導体が生成する
が、このものは元のフェノチアジンに急速に空気酸化さ
れる。
【００５４】一方、tert-ブトキシのようなアルコキシ
基や、ｐ−メチルチオベンジルオキシ、ジフェニルメチ
ルオキシ等のアラルキルオキシ基あるいは１−フェノキ
シエトキシ基は、ギ酸またはトリフルオロ酢酸中で処理
することにより容易に脱離することができる。反応は通
常、０〜２５℃の反応温度において３０〜６０分で終了
する。有機酸は単独または不活性溶媒との混合物として
使用できる。化合物（II）で示される脱離基のうち、そ
の除去の容易さと脱離後の精製を考慮すると、tert−ブ
トキシ基が最も好ましい。すなわち、脱離基がtert-ブ
トキシ基である場合には、反応終了後に濃縮乾固するだ
けで次工程に使用することができる。なお、さらなる精
製を必要とする場合には、シリカゲルカラムクロマトグ
ラフィー（展開溶媒ＭｅＣＮ／Ｈ2Ｏ／１Ｎ ＨＣｌ＝４
０：５：１）が可能である。かくして得られたカルボン
酸誘導体は、ついでアミノ基を有する化合物とカップリ
ングさせるため、酸クロリド、酸アジド、混合酸無水物
または活性エステル等の反応性誘導体に導かれる。
【００５５】以下にさらに具体的に説明する。酸クロリド法 ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ベンゼン
等の不活性溶媒中、カルボン酸誘導体に塩化チオニル、
塩化オギザリル、トリクロロメチルクロロホルマート
（ジホスゲン）、ビス−トリクロロメチルカルボナート
（トリホスゲン）等の塩化物を０〜２５℃で作用させ、
相当する酸クロリドとした後、トリエチルアミン、ジイ
ソプロピルエチルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミ
ノピリジン等の有機３級アミンの存在下にアミノ化合物
とのカップリング反応に供される。
【００５６】酸アジド法 カルボン酸誘導体から導かれるヒドラジド誘導体に、ク
ルチウス［Ｃｕｒｔｉｕｓ、Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．、３
５、３２２６（１９０２）］の方法に従って酸性溶液
中、亜硝酸ナトリウムを作用させ中和後生成した酸アジ
ド体を溶媒抽出してカップリング反応に供するか、ある
いは中和した反応液をイン・シトゥにカップリング反応
に供することもできる。このアジド化反応は、また亜硝
酸ナトリウムの代わりに亜硝酸アルキルを用いて非水溶
媒中で行うことができる［ジェイ・ルディンガー（Ｊ．
Ｒｕｄｉｎｇｅｒ）ら、Ｃｏｌｌｅｃｔ．Ｃｚｅｃｈ．
Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２６、２３３３（１９６
１）］。さらに本誘導体は、ジフェニルリン酸アジド
（ＤＰＰＡ）［ティー・シオイリ（Ｔ．Ｓｈｉｏｉｒ
ｉ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、９４、６２０
３（１９７２）］を用いても合成することができる。
【００５７】混合酸無水物法 カルボン酸誘導体と混合酸無水物を形成する酸成分とし
ては、炭酸モノアルキルエステルが好ましく、不活性溶
媒中、有機３級アミンの存在下、塩化エトキシカルボニ
ル［ティー・ウィーランド（Ｔ．Ｗｉｅｌａｎｄ）ら、
Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．、５７２、１９０（１９５１）；ア
ール・エイ・ボイソナス（Ｒ．Ａ．Ｂｏｉｓｓｏｎｎａ
ｓ）、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．、３４、８７４
（１９５１）］あるいは塩化イソブチロキシカルボニル
［ジェイ・アール・ボーグハン（Ｊ．Ｒ．Ｖａｕｇｈａ
ｎ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、７４、６７６
（１９５２）］を−１５〜−５℃で反応させることによ
り得ることができ、アミノ化合物とは直接反応すること
ができる。
【００５８】活性エステル法 ペプチド合成に利用される活性エステルの一つに電子吸
引性の置換基を有するフェニルエステルが知られている
が、本カルボン酸誘導体にも応用することができる。す
なわち、ｐ−ニトロフェノール、２,４−ジニトロフェ
ノール、ペンタクロロフェノール、２,４,５ートリクロ
ロフェノール、ペンタフルオロフェノールとのエステル
が好都合である。
【００５９】一方、この外の重要な活性エステルにＯ−
アシルヒドロキシルアミン系エステルが知られている。
例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール［ビー・ケ
ーニヒ（Ｗ．Ｋｏｅｎｉｇ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．、
１０３、７８８（１９７０）］、Ｎ−ヒドロキシコハク
酸イミド［ジー・ダブリュー・アンダーソン（Ｇ．Ｗ．
Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．、８５、３０３９（１９６３）；同、８６、１８３
９（１９６４）］、Ｎ−ヒドロキシマレイミド（前記Ｎ
−ヒドロキシコハク酸イミドに準じて製造できる）ある
いはＮ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカ
ルボキシイミド［エム・フジノ（Ｍ．Ｆｕｊｉｎｏ）
ら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２２、１８５
７（１９７４）］等のエステル誘導体である。また、Ｎ
−ヒドロキシフタルイミド［ジー・エイチ・エル・ネフ
ケウス（Ｇ．Ｈ．Ｌ．Ｎｅｆｋｅｕｓ）ら、Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８３ 、１２６３（１９６１）］
とのエステルも同様に用いることができる。
【００６０】これらの活性エステル誘導体は、両者の混
合物にＮ,Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣ
Ｃ）または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ：水溶性カルボジ
イミド）等の縮合剤を作用させることによって得ること
ができる。以上の外、１,１'−カルボニルジイミダゾー
ル（ＣＤＩ）との反応から１−アシルイミダゾール［エ
ス・シュタブ（Ｓ．Ｓｔａａｂ）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｅｄｉｔ．、１、３５１（１９
６２）］が、またジエチルリン酸シアニド（ＤＥＰＣ）
との反応から、アシルシアニド［ティー・シオイリ
（Ｔ．Ｓｈｉｏｉｒｉ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ．、１９７３、１５９５］等の反応性誘導体を
得ることができ、いずれの反応性誘導体もアミノ誘導体
と直接反応に用いることができる。
【００６１】かくして得られた一般式（Ｉ）で示される
フェノチアジン誘導体のうち、Ｒ1〜Ｒ4にアミノ基と反
応する基を有する化合物は、前記カップリング方法を適
宜選択することにより、蛋白、ハプテン、核酸またはア
ミノ酸等のアミノ化合物とペプチド結合を形成すること
ができる。縮合方法は特に限定されるものではなく、ア
ミノ化合物の性質に応じ適宜選択できる。とりわけ、含
水溶液中でも行えるカップリング方法としては、アジド
法、混合酸無水物法、活性エステル法が好ましいが、反
応性誘導体の安定性、高反応性および反応終了後の精製
の容易さを考慮すると、Ｏ−アシルヒドロキシルアミン
系のエステル、とりわけＮーヒドロキシコハク酸イミド
とのエステルが最も好ましい。
【００６２】該スクシンイミドエステルの製造は、例え
ば、アセトニトリル、ジメチルアセトアミドまたはジメ
チルホルムアミドのような無水の非プロトン性溶媒中、
２〜３当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下、
同当量のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）ま
たは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
−カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）を反応（２０〜４０
℃、１〜４８時間）させることによりモノエステル体
が、またジカルボン酸の場合にはモノエステル体を主生
成物とするジエステル体との混合物が得られる。ジエス
テル体を目的とする場合には、３〜６当量の反応試薬を
用いることが好ましい。
【００６３】これらのエステル化反応にあって、特に、
スクシンイミドエステル化は、Ｎ,Ｎ'−ジスクシンイミ
ドカルボナート（ＤＳＣ）［エイチ・オグラ（Ｈ．Ｏｇ
ｕｒａ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、１
９７９、４７４５］またはＮ,Ｎ'−ジスクシンイミドオ
キザレート（ＤＳＯ）［エイチ・オグラ（Ｈ．Ｏｇｕｒ
ａ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、２４、
４４５１（１９８３）］のようなＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドの活性エステルを使用することが好ましい。通
常、例えば、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジ
オキサン、アセトンのような不活性溶媒中、活性エステ
ルの２倍量の、例えば、ピリジン、トリエチルアミンの
ような有機塩基の存在下、モノエステル化の場合には
１.５〜３当量の、ジエステル化にあっては３〜６当量
の前記活性エステルを用いることが好ましい。
【００６４】反応は通常、２０〜３０℃で１〜３時間で
終了する。出発原料がジカルボン酸誘導体である場合、
モノエステル体のみを生成させることは困難である場合
が多いが、これらの分離は、例えばセファデックス（Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ）(登録商標)ＬＨ−２０（展開溶媒：ア
セトニトリル）によるカラムクロマトグラフィーで可能
である。得られたスクシンイミドエステルにアスパラギ
ン酸またはグルタミン酸のトリエチルアミン塩を反応
（ＭｅＣＮ／Ｈ2Ｏ＝３：１、２５℃、１０分）させる
ことにより、一般式 (VII)またはチャート中の一般式
（VII')で示される化合物を製造することができる。
【００６５】（２）一般式（Ｉ）で表されるフェノチア
ジン誘導体のうち、Ｒ1〜Ｒ4にチオール基と反応する基
すなわちマレイミド基等を有する化合物、例えば、Ｒ4
がマレイミドアルキル基である化合物（一般式（VI)、
(VII)でＢがマレイミド基である化合物等）は、一般式
（V）の化合物、すなわち一般式（III）においてＲ4'が
マレイミドアルキル基である化合物から得られる一般式
（II）においてＲ4'がマレイミドアルキル基である化合
物を、アミノ基と反応する基を有する化合物の場合と同
様に処理することによって製造することができる。ま
た、 （３）一般式（Ｉ）で示される化合物のうち、Ｒ1〜Ｒ4
にカルボキシル基と反応する基を有するフェノチアジン
誘導体は、前記（１）で示したフェノチアジンカルボン
酸の反応性誘導体に、式 Ｈ2Ｎ-(ＣＨ2)p-ＮＨ2 ［式
中、ｐは２〜１０の整数を意味する］で表されるジアミ
ノ化合物を反応させることにより、得られるモノアシル
アミノアルキルアミンは、さらにその他のカルボキシル
基またはその反応性誘導体との反応に供せられる。
【００６６】一般式(I)で表される化合物を製造するた
めの出発原料となる一般式(II)で表される化合物は、チ
ャート２に示す工程に従い、自体公知であるメチレンブ
ルーの合成法［アー・ベルンスゼン（Ａ．Ｂｅｒｎｔｈ
ｓｅｎ）、Ａｎｎａｌｅｎｄｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ、２５
１、１、（１８８８）；アイ・トミオカ（Ｉ．Ｔｏｍｉ
ｏｋａ）、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．Ｔｏｋｙｏ Ｊａｐ
ａｎ、２０，Ｉ−２（１９１７）］に準拠しても製造す
ることができる。
【００６７】
【化３３】
【００６８】［式中、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3'およびＲ4'の少
なくとも１つは式：-(ＣＨ2)m-ＣＯ-Ｙで示される基
を、他はＣ1-6アルキル基を示し、Ｙは脱離基を示し、
Ｘ-はフェナザチオニウムの対イオンを示す。］ しかしながら、本発明化合物の合成中間体はメチレンブ
ルーに比べはるかに脂溶性であり、反応溶媒がすべて水
であるメチレンブルー合成法の単純な応用では満足すべ
き結果は得られない。かくして、反応溶媒としては水ま
たは有機溶媒とりわけアセトニトリル、アセトンが好ま
しく、必要に応じてそれらの混合された状態で用いられ
る。また、各酸化工程における酸化剤としては、従来よ
り使用されている重クロム酸塩、塩化第二鉄、二酸化マ
ンガン等の無機酸化剤を使用しうるが、本発明の特徴で
ある含水有機溶媒中での酸化反応に使用する酸化剤とし
ては重クロム酸塩または二酸化マンガンが好ましい。
【００６９】各工程についてさらに具体的に説明する。
モノアルキルアニリン（ここで、アルキルはメチルまた
はエチルを意味する）から常法に従いＮ−アルキル化お
よびニトロソ化、ついで還元することにより得られる
Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ｐ−フェニレンジアミンに水また
はアセトン、アセトニトリル等の含水有機溶媒中、１.
２〜３.５当量のチオ硫酸ナトリウム、１.０〜３.０当
量の硫酸アルミニウムおよび８.０〜１２.０当量の酸
（例えば、塩酸、硫酸または酸性硫酸カリ）の存在下、
０.３〜４.０当量、好ましくは０.３〜２.０当量の重ク
ロム酸塩を反応温度０〜４０℃、好ましくは５〜２５℃
で反応させると、一般式(IV)で表される化合物が得られ
る。また、この化合物は重クロム酸塩の代わりに３.０
〜１０.０当量の二酸化マンガンを用いても製造するこ
とができる。
【００７０】一般式(IV)で示される化合物を、水、含水
アセトンまたは含水アセトニトリル溶液中、当量の式(V
III)で表される化合物および１.０〜３.０当量の酸（例
えば、塩酸、硫酸または硫酸水素カリ）の存在下、０.
６〜３.０当量、好ましくは０.６〜１.５当量の重クロ
ム酸塩を０〜４０℃、好ましくは５〜２５℃で反応させ
ると、一般式(III)で表されるインダミンチオスルホン
酸誘導体が得られる。また、本反応の酸化剤は３.０〜
１０.０当量の二酸化マンガンによって代用される。
【００７１】一般式（II）で示される化合物は、一般式
（III）で表されるインダミンチオスルホン酸誘導体
を、水あるいは有機溶媒またはそれらの混合溶媒中、無
機酸化剤で酸化的に閉環することにより得られる。さら
に詳しくは、一般式(III)で示される化合物を、水、ア
セトン、アセトニトリルまたはそれらの含水溶媒中、
５.０〜２０.０当量、好ましくは１０.０〜１５.０当量
の二酸化マンガンと、さらに好ましくは触媒量の硫酸銅
存在下、２０〜１００℃で処理すると一般式(II)で表さ
れる新規メチレンブルー誘導体が得られる。また、チャ
ート２に示される工程中、中間体 (IV)および(III)を
単離することなく、各工程毎のスラリーに、必要な反応
試剤を追加することにより、化合物(IV)から一貫して(I
I)を製造することもできる。
【００７２】本発明の化合物は抗体、抗体フラグメン
ト、アビジン（塩基性糖蛋白）等の種々の蛋白とカップ
リングすることができる。癌の治療に光感受性染料誘導
体を用いる場合には、癌細胞によって容易にとりこまれ
る、例えばトランスフェリン蛋白［ｔｒａｎｓｆｅｒｒ
ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｉｒｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ
ｐｒｏｔｅｉｎ）］のような癌細胞の生長に要する蛋白
または生体分子を選択する必要がある。
【００７３】蛋白とのカップリングに要する時間は１分
〜２４時間、好ましくは４〜１２時間である。カップリ
ング時の温度は１〜８０℃が好ましい。高温下でのカッ
プリングは、反応は促進されるが蛋白の熱変性もおこる
ため通常１〜２４℃が適当である。カップリング時のｐ
Ｈは４〜１０であるが、好ましくは６〜８である。カッ
プリング時は通常水溶液で行われるが、強い求核性がな
く、かつ活性な反応性誘導体と反応しない、例えばアル
コール、アセトン、ジメチルホルムアミドのような溶媒
は使用することができる。同様にｐＨコントロール用の
緩衝塩も反応性誘導体と反応しないものであればどのよ
うなものでも使用することができる。例えば、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノエタン等は緩衝剤としては
不適当であり、リン酸塩類等が適当である。
【００７４】本質的にすべての蛋白質には１級アミノ基
が存在し、本発明化合物と反応することができる。アミ
ノ基と反応する基を有する本発明化合物を蛋白質、ハプ
テン等のアミノ基を有する化合物と反応させるに際し、
前記アミノ基と反応する基がカルボキシル基の場合に
は、縮合剤の存在下で行うのが好都合である。このよう
な縮合剤としては、例えば、ＤＣＣ、ＷＳＣ等が挙げら
れる。マレイミド誘導体とのカップリング時における蛋
白溶液中には、還元状態の蛋白システイン以外のメルカ
プト基を有する不純物があってはならない。免疫試験お
よび癌の光力学的治療（ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔ
ｈｅｒａｐｙ）への利用は抗体蛋白は特に推奨される。
カップリング時の蛋白に対する反応性光感受性染料誘導
体のモル比は、１より大きく、特に１０〜３００が好ま
しい。蛋白に反応性染料誘導体をカップリングさせた
後、生成した染料触媒標識体は、例えばゲル濾過クロマ
トグラフィーによって、未反応色素から分離することが
できる。調製された染料触媒標識体は水溶液中長時間保
存が可能である。しかしながら、高いｐＨ（１０以上）
領域では染料が不安定であるため貯蔵することはできな
い。
【００７５】例えば、医薬またはそれらの誘導体、ホル
モンまたは核酸のような低分子のハプテンに対する反応
性染料誘導体のカップリングは前記と同様の条件下でお
こなうことができ、生成した標識体の精製も、生成物と
未反応原料が区別できる、例えばクロマトグラフィー等
の手段によって行うことができる。染料触媒標識体の免
疫試験への利用は、染料が励起される適当な波長光を照
射し、励起された染料からの生成物と、例えばルミノー
ルのような感知試薬との組合わせによる酸化的化学発光
を検出することによっておこなうことができる。染料触
媒標識体を癌の光力学治療に用いるときは、光源の光ス
ペクトラムと色素の吸収スペクトラムがよく一致し、か
つ入手容易な半導体レーザー光（６７０ｎｍ）が特に好
ましい。
【００７６】
【実施例】以下に、参考例および実施例を挙げて本発明
をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定され
るものではない。 参考例１ Ｎ−(３−エトキシカルボニルプロピル)−Ｎ−メチル−
ｐ−フェニレンジアミン ４−(Ｎ−メチルアニリノ)酪酸エチル（J.C.S.Perkin
I、１９７２、１８０３）２２gに氷冷下濃塩酸６０mlを
加えて溶解し、激しくかきまぜながら、亜硝酸ナトリウ
ム８gの水１０ml溶液を０〜４℃で滴下した。同温度で
３０分間かきまぜたのち３０gの亜鉛末を１０℃以下で
加え、１５℃でさらに３０分間かきまぜた。亜鉛を濾去
し、濾液は炭酸水素ナトリウムでアルカリ性としたのち
エーテルで抽出した。エーテル層を無水硫酸ナトリウム
で乾燥し、濃縮、残留部をシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィーに付し、酢酸エチル／ヘキサン＝１:１で展開
すると、９gのＮ−エトキシカルボニルプロピル−Ｎ−
メチル−p−フェニレンジアミンが得られた。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ: １.２１(３Ｈ,t,Ｊ＝７Ｈz)、１.
８４(２Ｈ,quintet,Ｊ＝７Ｈz)、２.３０(２Ｈ,t,Ｊ＝
７Ｈz)、２.８０(３Ｈ,s)、３.１〜３.５(２Ｈ,br.)、
３.２０(２Ｈ,t,Ｊ＝７Ｈz)、４.１０(２Ｈ,q,Ｊ＝７Ｈ
z)、６.６３(４Ｈ,s)。 ＩＲ(neat)ν: ３４５０、３３５０、１７３０、１５２
０、１３７０、１２６５、１１７５、８１５cm-1。
【００７７】参考例２ ５−（Ｎ−メチルアニリノ）吉草酸エチル Ｎ−メチルアニリン１６g、５−ブロモ吉草酸エチル３
０.２gの混合物を１１０℃で２２時間かきまぜたのち、
炭酸水素ナトリウム水でアルカリ性とし、酢酸エチルで
抽出、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濃縮後、残留
部を減圧下に蒸留し、５−(Ｎ−メチルアニリノ)吉草酸
エチルの２８.６gを得た。bp: １２４〜１２８℃／０．
４mmＨg ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ: １.２５(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈz)、
１.６６(４Ｈ,m)、２.３３(２Ｈ,t,Ｊ＝８Ｈz)、２.９
１(３Ｈ,s)、３.３２(２Ｈ,t,Ｊ＝７Ｈz)、４.１２(２
Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz)、６.６７(３Ｈ,m)、７.２２(２Ｈ,
m)。
【００７８】参考例３ ６−（Ｎ−メチルアニリノ）ヘキサン酸エチル Ｎ−メチルアニリン２５g、６−ブロモヘキサン酸エチ
ル５０gの混合物を１２０℃で２４時間かきまぜた。冷
後、炭酸水素ナトリウム水を加えアルカリ性としたのち
酢酸エチルで抽出、食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウム
で乾燥した。減圧下に濃縮後、蒸留し、６−（Ｎ−メチ
ルアニリノ）ヘキサン酸エチル４０.５gを得た。 bp: １４１〜１４３℃／０．９mmＨg ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ: １.２５(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈz)、
１.３７(２Ｈ,m)、１.６５(４Ｈ,m)、２.３０(２Ｈ,t,
Ｊ＝７.４Ｈz)、２.９２(３Ｈ,s)、３.３０(２Ｈ,t,Ｊ
＝７.４Ｈz)、４.１３(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz)、６.６７
(３Ｈ,m)、７.２２(２Ｈ,m)。
【００７９】参考例４ ４−クロロ酪酸tert−ブチル tert−ブタノール１８.５gとジメチルアニリン１８.２g
の混合物に、氷冷撹拌下、４−クロロ塩化ブチリルの１
４.１gを滴下したのち、油浴中(１００℃)で２時間かき
まぜた。反応液にエーテル２００ml、水１００mlおよび
１Ｎ塩酸５０mlを加えて振りまぜ、有機層をさらに１Ｎ
−塩酸、炭酸水素ナトリウム溶液、食塩水の順に洗浄
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去後、
減圧蒸留に付し１３.２gの４−クロロ酪酸tert−ブチル
を得た。 bp: ９４〜９５℃／２２mmＨg ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ: １.４５(９Ｈ,s)、２.０５(２Ｈ,
quintet,Ｊ＝７Ｈz)、２.４１(２Ｈ,t,Ｊ＝７Ｈz)、３.
５９(２Ｈ,t,Ｊ＝７Ｈz)。
【００８０】参考例５ ４−(Ｎ−メチルアニリノ)酪酸tert−ブチル 参考例４で得た４−クロロ酪酸tert−ブチルエステル１
０.７２gとＮ−メチルアニリン７.７２gの混合物を１０
０℃の油浴中２１時間かきまぜた。反応液に飽和炭酸水
素ナトリウム溶液の５０mlを加え３００mlのエーテルで
抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濃縮後減圧
蒸留に付し、４.４０gの４−(Ｎ−メチルアニリノ)酪酸
tert−ブチルを得た。 bp: １４０〜１４７℃／１.５mmＨg ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ: １.４５(９Ｈ,s)、１.８６(２Ｈ,
quintet,Ｊ＝７Ｈz)、２.２６(２Ｈ,t,Ｊ＝７Ｈz)、２.
９２(３Ｈ,s)、３.３５(２Ｈ,t,Ｊ＝７Ｈz)、６.６〜
６.８(３Ｈ,m)、７.１〜７.３(２Ｈ,m)。
【００８１】参考例６ Ｎ−(３−tert−ブトキシカルボニルプロピル)−Ｎ−メ
チル−p−フェニレンジアミン 参考例５で得た４−(Ｎ−メチルアニリノ)酪酸tert−ブ
チル８.００gを８０％酢酸３０mlに溶解し、氷冷撹拌
下、１０℃以下で亜硝酸ナトリウム２.４４gの水３ml溶
液を滴下した。同温度で３０分間かきまぜた後、酢酸３
０mlを加え１０℃以下で亜鉛末１９gを加えた。３０分
間かきまぜた後、反応液を濾過、濾液を減圧下に濃縮
し、炭酸水素ナトリウム水およびエーテルと振り混ぜ、
エーテル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下
に濃縮後、残留部をシリカゲルカラムクロマトグラフィ
ーに付し、ヘキサン／酢酸エチル＝２:１で展開する
と、Ｎ−tert−ブトキシカルボニルプロピル−Ｎ−メチ
ル−p−フェニレンジアミンの３.２１gが褐色油状物と
して得られた。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ: １.４４(９Ｈ,s)、１.８１(２Ｈ,
quintet,Ｊ＝７Ｈz)、２.５５(２Ｈ,t,Ｊ＝７Ｈz)、２.
５０〜３.５０(２Ｈ,br.)、２.８０(３Ｈ,s)、３.１９
(２Ｈ,t,Ｊ＝７Ｈz)、６.６５(４Ｈ,s)。
【００８２】参考例７ ３−[Ｎ−(４−エトキシカルボニルブチル)−Ｎ−メチ
ルアミノ]−７−ジメチルアミノフェナザチオニウム
クロライド 参考例２で得た５−(Ｎ−メチルアニリノ)吉草酸エチル
０.２５gに氷冷下、１Ｎ−塩酸１mlおよび水１４mlを加
えて溶解した後、２−アミノ−５−ジメチルアミノフェ
ニルチオスルホン酸［Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．、２５１、１
（１８８８）］０.２５gを加え、ついで重クロム酸ナト
リウム２水和物０.２gの水２ml溶液を５〜１０℃で滴下
し、同温度で３０分間かきまぜた。反応液に酢酸０.０
３mlを加え、室温でさらに１時間かきまぜた後、析出沈
澱物を濾取、水洗した。つぎに、沈澱物をアセトニトリ
ル２０mlに懸濁し、二酸化マンガン０.２５gおよび触媒
量の硫酸銅を加え、３０分間加熱還流した。反応液を濾
過、濾液を減圧下に濃縮乾固した。残渣をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーに付し、アセトニトリルついで
ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ／１Ｎ ＨＣl＝４０:５:１の混合溶媒
で展開し、３−[Ｎ−(４−エトキシカルボニルブチル)
−Ｎ−メチルアミノ]−７−ジメチルアミノフェナザチ
オニウム クロライドの０.２９gを得た。 ＮＭＲ(Ｄ2Ｏ)δ: １.２８(３Ｈ,t)、１.６７(４Ｈ,
m)、２.４８(２Ｈ,m)、３.１７(９Ｈ,br.s)、３.５５
(２Ｈ,m)、４.２０(２Ｈ,q)、６.８０〜７.５０(６Ｈ,
m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν: ３４２０(br.)、１７２５、１６００、
１４９０、１４４０、１３９０、１３４０、１２４５、
１１８０、１１４０、８８５cm-1。
【００８３】参考例８ ３−[Ｎ−(４−エトキシカルボニルブチル)−Ｎ−メチ
ルアミノ]−７−ジメチルアミノフェナザチオニウム
クロライド 参考例２で得た５−(Ｎ−メチルアニリノ)吉草酸エチル
０.２gを５０％アセトニトリル−水１０mlに溶解し、酢
酸０.１ml、２−アミノ−５−ジメチルアミノフェニル
チオスルホン酸０.２gおよび二酸化マンガン０.５gを加
え室温で２時間かきまぜた。さらに８０℃で５時間かき
まぜたのち、反応液を濾過、アセトニトリルで洗浄し、
濾液を減圧下に濃縮乾固した。残渣をシリカゲルカラム
クロマトグラフィーに付し、ＣＨ3ＣＮついでＣＨ3ＣＮ
／Ｈ2Ｏ／１Ｎ ＨＣl＝４０:５:１で展開すると、０.１
１gの３−[Ｎ−(４−エトキシカルボニルブチル)−Ｎ−
メチルアミノ]−７−ジメチルアミノフェナザチオニウ
ム クロライドが得られた。
【００８４】参考例９ ３−[Ｎ−(４−カルボキシブチル)−Ｎ−メチルアミノ]
−７−ジメチルアミノフェナザチオニウム クロライド ３−[Ｎ−(４−エトキシカルボニルブチル)−Ｎ−メチ
ルアミノ]−７−ジメチルアミノフェナザチオニウム
クロライドの０.７gを１Ｎ塩酸１０mlに溶解し、室温で
４８時間反応させた。反応液をシリカゲルカラムクロマ
トグラフィーに付し、水、ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ＝１０:１
ついでＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ／１Ｎ ＨＣl＝４０:５:１の順
に展開し、目的画分を濃縮後、凍結乾燥すると、３−
[Ｎ−(４−カルボキシブチル)−Ｎ−メチルアミノ]−７
−ジメチルアミノフェナザチオニウムクロライドの０.
７gが得られた。 ＮＭＲ(Ｄ2Ｏ)δ: １.６７(４Ｈ,br.s)、２.４９(２Ｈ,
br.s)、３.０８(９Ｈ,br.s)、３.４５(２Ｈ,br.s)、６.
６０〜７.４０(６Ｈ,m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν: ３６５０〜２８００、１７２０、１６
００、１４８５、１３９０、１３３５、８８５cm-1。
【００８５】実施例１ ３−[Ｎ−メチル−Ｎ−(４−スクシンイミドオキシカル
ボニルブチル)アミノ]−７−ジメチルアミノフェナザチ
オニウム クロライド 参考例９で得た３−[Ｎ−(４−カルボキシブチル)−Ｎ
−メチルアミノ]−７−ジメチルアミノフェナザチオニ
ウム クロライドの０.３４gをジメチルホルムアミド１
００mlに溶解し、約３０mlまで減圧下に濃縮したのち、
Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド０．２５５gおよび１−
エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイ
ミド塩酸塩０.４２５gを加え、室温で３日間反応させ
た。減圧下に溶媒を留去したのち、残渣をジクロルメタ
ンに溶解し、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで
乾燥した。減圧下に濃縮後、残渣にジクロルメタン６ml
を加えて溶解し、ついで酢酸エチル１００mlを加えた。
析出した沈澱物を濾取乾燥し、３−[Ｎ−メチル−Ｎ−
(４−スクシンイミドオキシカルボニルブチル)アミノ]
−７−ジメチルアミノフェナザチオニウム クロライド
の０.２gを得た。 ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ: １.７４(４Ｈ,br.s)、２.７
７(２Ｈ,br.s)、２.８２(４Ｈ,s)、３.３３(３Ｈ,s)、
３.３８(６Ｈ,s)、３.７７(２Ｈ,br.s)、７.４５〜７.
６０(４Ｈ,m)、７.８０〜７.９８(２Ｈ,m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν: ３４２５(br.)、１８１０、１７８０、
１７３５、１６００、１３９５、１３５５(shoulder)、
１３４０、８５５cm-1。
【００８６】参考例１０ ３−[Ｎ−(５−エトキシカルボニルペンチル)−Ｎ−メ
チルアミノ]−７−ジメチルアミノフェナザチオニウム
クロライド 参考例３で得た６−(Ｎ−メチルアニリノ)ヘキサン酸エ
チル１gに氷冷下、１Ｎ塩酸４mlおよび水５０mlを加え
て溶解したのち、２−アミノ−５−ジメチルアミノフェ
ニルチオスルホン酸１gを加え、ついで重クロム酸ナト
リウム２水和物０.８gの水６ml溶液を５〜１０℃で滴下
し、同温度で３０分、さらに室温で１時間かきまぜた。
析出物を濾取、水洗後、アセトニトリル８０mlに懸濁
し、二酸化マンガン１gおよび触媒量の硫酸銅を加え、
１時間加熱還流した。反応液を濾過し、残渣をメタノー
ルで洗浄、ついで濾液を減圧下に濃縮乾固した。残渣を
シリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、ＣＨ3Ｃ
ＮついでＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ／１Ｎ ＨＣl＝４０:５:１で
展開し、目的画分を凍結乾燥すると３−[Ｎ−(５−エト
キシカルボニルペンチル)−Ｎ−メチルアミノ]−７−ジ
メチルアミノフェナザチオニウムクロライドの０.８７
５gが得られた。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ: １.２６(３Ｈ,t,Ｊ＝７Ｈz)、１.
４９(２Ｈ,m)、１.７４(４Ｈ,m)、２.３５(２Ｈ,t,Ｊ＝
７.２Ｈz)、３.４６(６Ｈ,s)、３.７１(２Ｈ,br.t)、
４.１３(２Ｈ,q,Ｊ＝７Ｈz)、７.２８(２Ｈ,m)、７.６
０〜８.００(４Ｈ,m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν: ３４２５(br.)、１７２５、１６００、
１４９０、１３９０、１３３５、１２４５、１１７５、
１１４０、８８５cm-1。
【００８７】実施例２ ３−[Ｎ−メチル−Ｎ−(５−スクシンイミドオキシカル
ボニルペンチル)アミノ]−７−ジメチルアミノフェナザ
チオニウム クロライド 参考例１０で得られた３−[Ｎ−(５−エトキシカルボニ
ルペンチル)−Ｎ−メチルアミノ]−７−ジメチルアミノ
フェナザチオニウム クロライドの０.７８５gを１Ｎ−
塩酸１０mlに溶解し、室温で１６時間反応させた。反応
液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、水、
ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ／１Ｎ ＨＣl＝４０:５:１の順に展開
し、目的画分を濃縮乾固した。残渣をジメチルホルムア
ミドの２００mlに溶解、不溶物を濾去したのち約５０ml
まで濃縮した。この溶液にＮ−ヒドロキシコハク酸イミ
ド０.５４gおよびＷＳＣ ０.９gを加え、室温で４８時
間反応させた。反応液を減圧下に濃縮後、残渣をジクロ
ルメタンに溶解し、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥した。減圧下に濃縮したのち、残渣を１５ml
のジクロルメタンに溶解し、２５０mlの酢酸エチルを加
え、析出した沈澱を濾取乾燥すると、３−[Ｎ−メチル
−Ｎ−(５−スクシンイミドオキシカルボニルペンチル)
アミノ]−７−ジメチルアミノフェナザチオニウム ク
ロライドの０.７１８gが得られた。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ: １.５６(２Ｈ,m)、１.８３(４Ｈ,
m)、２.６６(２Ｈ,t,Ｊ＝６.８Ｈz)、２.９１(４Ｈ,
s)、３.４０(３Ｈ,s)、３.４６(６Ｈ,s)、３.７３(２
Ｈ,m)、７.２０〜８.００(６Ｈ,m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν: ３４２５、１８１０、１７８０、１７
３５、１６００、１３９０、１３３５、１２１０、１１
４０、１０７０、８８５cm-1。
【００８８】参考例１１ ３−[Ｎ−(３−tert−ブトキシカルボニルプロピル)−
Ｎ−メチルアミノ]−７−ジメチルアミノフェナザチオ
ニウム クロライド 参考例５で得た４−(Ｎ−メチルアニリノ)酪酸tert−ブ
チルの０.５０gに、氷冷下、硫酸水素カリウム０.４１g
の水２５ml溶液を加えて溶解し、２−アミノ−５−ジメ
チルアミノフェニルチオスルホン酸０.５０gを加えた。
この懸濁溶液に重クロム酸ナトリウム２水和物０.４０g
の水５ml溶液を５〜１０℃で滴下し、ついで酢酸０.０
６mlを加え同温度で３０分間かきまぜたのち、さらに室
温で１.５時間反応させた。反応液を濾過、水洗し、つ
いで残渣をアセトンに懸濁、二酸化マンガン４.０gおよ
び硫酸銅０.０３gを加え、１時間加熱還流した。反応液
を濾過、ついで濃縮乾固して得られる粗生成物をシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーに付し、アセトニトリ
ル、９０％アセトニトリル−水ついでアセトニトリル／
水／１Ｎ ＨＣl＝３０:５:３で展開すると、０.３３gの
３−[Ｎ−(３−tert−ブトキシカルボニルプロピル)−
Ｎ−メチルアミノ]−７−ジメチルアミノフェナザチオ
ニウム クロライドが得られた。 mp: ９４〜９８℃(dec.) ＮＭＲ(Ｄ2Ｏ)δ: １.５２(９Ｈ,s)、１.８７(２Ｈ,
m)、２.４３(２Ｈ,t,Ｊ＝７Ｈz)、３.１３(３Ｈ,s)、
３.１７(６Ｈ,s)、３.４７(２Ｈ,m)、６.８１(２Ｈ,br.
s)、７.０〜７.１(２Ｈ,m)、７.２５〜７.４(２Ｈ,m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν: ３３８０、１７２０、１６００、１３
９０、１３３５、１１４０、８８５、６１５cm-1。 λmax：６５１nm( ＭeＯＨ中) 元素分析：Ｃ23Ｈ30Ｎ3Ｏ2ＳＣl・２Ｈ2Ｏとして 計算値：Ｃ,５７.０７; Ｈ,７.０８; Ｎ８.６８ 実測値：Ｃ,５７.０８; Ｈ,６.７０; Ｎ８.７０
【００８９】参考例１２ ３−[Ｎ−(３−カルボキシプロピル)−Ｎ−メチルアミ
ノ]−７−ジメチルアミノフェナザチオニウム クロラ
イド 参考例１１で得た３−[Ｎ−(３−tert−ブトキシカルボ
ニルプロピル)−Ｎ−メチルアミノ]−７−ジメチルアミ
ノフェナザチオニウム クロライドの０.０５gをトリフ
ルオロ酢酸３mlに溶解し、室温で１時間反応させた。減
圧下にトリフルオロ酢酸を留去後、残渣をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーに付し、アセトニトリルついで
アセトニトリル／水／１Ｎ塩酸＝３０:５:３で展開し、
０.０１４gの３−[Ｎ−(３−カルボキシプロピル)−Ｎ
−メチルアミノ]−７−ジメチルアミノフェナザチオニ
ウム クロライドを得た。 ＮＭＲ(Ｄ2Ｏ)δ: １.７９(２Ｈ,m)、２.５１(２Ｈ,
m)、３.００(９Ｈ,br.s)、３.３１(２Ｈ,m)、６.５５〜
７.１０(６Ｈ,m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν: ３４２０、１６０５、１３９５、１３
４０、１１４０、８８５、８５０、８００cm-1。
【００９０】実施例３ ３−[Ｎ−メチル−Ｎ−(３−スクシンイミドオキシカル
ボニルプロピル)アミノ]−７−ジメチルアミノフェナザ
チオニウム クロライド 参考例１１で得た３−[Ｎ−(３−tert−ブトキシカルボ
ニルプロピル)−Ｎ−メチルアミノ]−７−ジメチルアミ
ノフェナザチオニウム クロライドの０.１７gにトリフ
ルオロ酢酸１５mlを加え室温で１５分間反応させた。ト
リフルオロ酢酸を減圧下に留去し、残渣をアセトニトリ
ルの１０mlに溶解した。これにピリジン０.１９mlおよ
びＤＳＯ ０.３２gを加え室温で１.５時間かきまぜた。
反応液を濃縮乾固後残渣を５０mlのジクロルメタンに溶
解し、１Ｎ塩酸を５ml含有する飽和食塩水と振り混ぜた
のち、さらに飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム
で乾燥した。減圧下に濃縮したのち、残渣をジクロルメ
タンに溶解し、過剰量の酢酸エチルを加えて得られる沈
澱物を濾取乾燥すると、０.１２gの３−[Ｎ−メチル−
Ｎ−(３−スクシンイミドオキシカルボニルプロピル)ア
ミノ]−７−ジメチルアミノフェナザチオニウム クロ
ライドが得られた。 mp: １２５〜１３０℃(dec.) ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ: ２.１１(２Ｈ,m)、２.８１(２Ｈ,
t,Ｊ＝６Ｈz)、２.９１(４Ｈ,s)、３.３７(９Ｈ,br.
s)、３.７９(２Ｈ,m)、７.２３(２Ｈ,d,Ｊ＝９Ｈz)、
７.７５(２Ｈ,d,Ｊ＝９Ｈz)、７.７６(２Ｈ,m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν: ３４２０、１８１０、１７９０、１７
３５、１６００、１３９０、１３４０、１１４０、８８
５cm-1。
【００９１】参考例１３ ２−アミノ−５−[Ｎ−(３−エトキシカルボニルプロピ
ル)−Ｎ−メチルアミノ]フェニルチオスルホン酸 参考例１で得たＮ−(３−エトキシカルボニルプロピル)
−Ｎ−メチル−p−フェニレンジアミン８.９７gに氷冷
下、１Ｎ硫酸７６mlを加えて溶解し、硫酸アルミニウム
カリウム１２水和物１７.１gの水８０ml溶液、チオ硫酸
ナトリウム５水和物９.８８gの水１９ml溶液を１０℃以
下で加え、ついで重クロム酸カリウム３.６５gの水５７
ml溶液を１０℃で滴下した。冷浴を除去し、室温で１時
間かきまぜたのち、炭酸水素ナトリウムを加えpＨ５に
調整した。反応液を濾過、濾液を減圧下に濃縮乾固し、
残渣をＯＤＳ(シリカゲルのシラノールにオクタデシル
基を化学結合させたもの)カラムクロマトグラフィーに
付し、５０％ＭeＯＨ−Ｈ2Ｏで展開し、目的の画分を凍
結乾燥すると、４gの２−アミノ−５−[Ｎ−(３−エト
キシカルボニルプロピル)−Ｎ−メチルアミノ]フェニル
チオスルホン酸が得られた。 ＮＭＲ(ＣＨ3ＯＤ)δ: １.２２(３Ｈ,t,Ｊ＝７Ｈz)、
１.８０(２Ｈ,quintet,Ｊ＝７Ｈz)、２.３５(２Ｈ,t,Ｊ
＝７Ｈz)、２.９６(３Ｈ,s)、３.３０(２Ｈ,t,Ｊ＝７Ｈ
z)、４.１０(２Ｈ,q,Ｊ＝７Ｈz)、６.９６(２Ｈ,br.
s)、７.２３(１Ｈ,br.s)。 ＩＲ(ＫＢr)ν: １７３０、１６２５、１５０５、１２
２０、１０３０、８３５cm-1。
【００９２】参考例１４ [Ｎ−(３−tert−ブトキシカルボニルプロピル)−Ｎ−
メチルアミノ]−[Ｎ'−(３−エトキシカルボニルプロピ
ル)−Ｎ'−メチルアミノ]インダミンチオスルホン酸 参考例５で得た４−(Ｎ−メチルアニリノ)酪酸tert−ブ
チルの０.９９７gに氷冷下、硫酸水素カリウム０.８１
７gの水１０ml溶液を加えて溶解し、参考例１３で得た
２−アミノ−５−[Ｎ−(３−エトキシカルボニルプロピ
ル)−Ｎ−メチルアミノ]フェニルチオスルホン酸の１.
３９４gを加えた。ついで重クロム酸カリウムの１.１８
gを少量ずつ加え、５〜１０℃で１時間かきまぜた。析
出物を濾取、水洗したのちメタノールに溶解し、不溶物
を濾去、濾液は減圧下に濃縮した。濃縮物をＯＤＳカラ
ムクロマトグラフィーに付し５０％ＣＨ3ＣＮ−Ｈ2Ｏで
展開すると、０.６gの[Ｎ−(３−tert−ブトキシカルボ
ニルプロピル)−Ｎ−メチルアミノ]−[Ｎ'−(３−エト
キシカルボニルプロピル)−Ｎ'−メチルアミノ]インダ
ミンチオスルホン酸が得られた。 ＩＲ(ＫＢr)ν: ３４５０、３３５０、１７３０、１６
１０、１５１５、１３６５、１２４０、１１７０、１０
１５、８２０、６１５cm-1。
【００９３】参考例１５ ３−[Ｎ−(３−tert−ブトキシカルボニルプロピル)−
Ｎ−メチルアミノ]−７−[Ｎ−(３−エトキシカルボニ
ルプロピル)−Ｎ−メチルアミノ]フェナザチオニウム
クロライド 参考例１４で得た[Ｎ−(３−tert−ブトキシカルボニル
プロピル)−Ｎ−メチルアミノ]−[Ｎ'−(３−エトキシ
カルボニルプロピル)−Ｎ'−メチルアミノ]インダミン
チオスルホン酸の０.６０gをアセトン２５mlに溶解し、
二酸化マンガン３gを加え室温で２０時間かきまぜた。
二酸化マンガンを濾去し、メタノールで洗浄した。濾液
を減圧下に濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィーに付し、アセトニトリル／水＝２０:１、つい
でアセトニトリル／水／１Ｎ塩酸＝１２０:２０:３で展
開し、目的画分を集め濃縮すると、３−[Ｎ−(３−tert
−ブトキシカルボニルプロピル)−Ｎ−メチルアミノ]−
７−[Ｎ−(３−エトキシカルボニルプロピル)−Ｎ−メ
チルアミノ]フェナザチオニウム クロライドの０.２６
gが得られた。 ＮＭＲ(Ｄ2Ｏ)δ: １.３０(３Ｈ,t,Ｊ＝７Ｈz)、１.５
０(９Ｈ,s)、１.８３〜１.９０(２Ｈ,br.)、２.３８〜
２.５５(２Ｈ,m)、３.１５(６Ｈ,br.s)、３.４７(２Ｈ,
br.s)、４.２０(２Ｈ,q,Ｊ＝７Ｈz)、６.８５(２Ｈ,br.
s)、７.１１(２Ｈ,m)、７.６５(２Ｈ,m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν: １７２５、１６００、１４００、１３
６５、１３４０、１１８５、１１５０、８９０cm-1。
【００９４】実施例４ ３−[Ｎ−メチル−Ｎ−(３−スクシンイミドオキシカル
ボニルプロピル)アミノ]−７−[Ｎ−(３−エトキシカル
ボニルプロピル)−Ｎ−メチルアミノ]フェナザチオニウ
ム クロライド 参考例１５で得た３−[Ｎ−(３−tert−ブトキシカルボ
ニルプロピル)−Ｎ−メチルアミノ]−７−[Ｎ−(３−エ
トキシカルボニルプロピル)−Ｎ−メチルアミノ]フェナ
ザチオニウム クロライド０.２４gにトリフルオロ酢酸
１８mlを加え、室温で１時間かきまぜた。反応液を減圧
下に濃縮乾固し、残渣にアセトニトリル１５ml、ピリジ
ン０.３３mlおよびＤＳＣ ０.５２gを加え、室温で２時
間かきまぜた。反応液を減圧下に濃縮し、残渣をジクロ
ロメタン１５０mlに溶解、１Ｎ塩酸６mlを含有する飽和
食塩水で洗浄後、さらに飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸
ナトリウムで乾燥した。濃縮乾固して得られる残渣をジ
クロロメタン−酢酸エチルから再沈澱すると、０.１８g
の３−[Ｎ−メチル−Ｎ−(３−スクシンイミドオキシカ
ルボニルプロピル)アミノ]−７−[Ｎ−(３−エトキシカ
ルボニルプロピル)−Ｎ−メチルアミノ]フェナザチオニ
ウム クロライドが得られた。 mp: ７０〜８５℃(dec．) ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ: １.２７(３Ｈ,t,Ｊ＝７Ｈz)、２.
０４(２Ｈ,m)、２.１８(２Ｈ,m)、２.５３(２Ｈ,t,Ｊ＝
６．５Ｈz)、２.８９(２Ｈ,m)、２.９７(４Ｈ,s)、３.
４０(３Ｈ,s)、３.４２(３Ｈ,s)、３.８３(４Ｈ,m)、
４.１６(２Ｈ,q,Ｊ＝７Ｈz)、７.３６(２Ｈ,t,Ｊ＝１０
Ｈz)、７.５９(２Ｈ,d,Ｊ＝１５Ｈz)、７.８５(２Ｈ,d
d,Ｊ＝２,１０Ｈz)。 ＩＲ(ＫＢr)ν: ３４２０、１８１０、１７８０、１７
３５、１５９５、１３９０、１３３５、１１９０、１１
４０、８８５cm-1。
【００９５】参考例１６ ２−アミノ−５−[Ｎ−(３−tert−ブトキシカルボニル
プロピル)−Ｎ−メチルアミノ]フェニルチオスルホン酸 参考例６で得たＮ−(３−tert−ブトキシカルボニルプ
ロピル)−Ｎ−メチル−p−フェニレンジアミン３.３０g
を氷冷下、５０mlの１Ｎ硫酸に溶解し、かきまぜながら
硫酸アルミニウム１４〜１８水和物８.３３gの水１５ml
溶液、チオ硫酸ナトリウム５水和物９.３１gの水１５ml
溶液、ついで重クロム酸カリウム２水和物１.２７gの水
１７ml溶液を、反応温度５〜１０℃で順次加えた。同温
度で３０分間かきまぜたのち、室温でさらに１時間撹拌
した。反応液に炭酸水素ナトリウムを加え、pＨ４とし
たのち減圧下に濃縮乾固した。濃縮物に５００mlのメタ
ノールを加え不溶物を濾去、濾液は減圧下に濃縮した。
残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、酢
酸エチル／メタノール＝１５:１、ついで(５:１)で展開
し、１.５４gの２−アミノ−５−[Ｎ−(３−tert−ブト
キシカルボニルプロピル)−Ｎ−メチルアミノ]フェニル
チオスルホン酸を暗緑色粘稠物として得た。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ: １.４２(９Ｈ,s)、１.７３(２Ｈ,
m)、２.１９(２Ｈ,br.s)、２.７６(３Ｈ,br.s)、３.１
５(２Ｈ,br.m)、４.５０(３Ｈ,br.s)、６.５０〜７.４
０(３Ｈ,m)。
【００９６】参考例１７ ビス[Ｎ−(３−tert−ブトキシカルボニルプロピル)−
Ｎ−メチルアミノ]インダミンチオスルホン酸 参考例５で得た４−(Ｎ−メチルアニリノ)酪酸tert−ブ
チル１.１６gを硫酸水素カリウム０.９５gの水９０ml溶
液に溶解し、氷冷下に参考例１６で得た２−アミノ−５
−[Ｎ−(３−tert−ブトキシカルボニルプロピル)−Ｎ
−メチルアミノ]フェニルチオスルホン酸１.６２gを加
え、ついで重クロム酸カリウム２水和物１.３８gの水１
０ml溶液を５〜１０℃で滴下した。酢酸０.１４mlを加
え、室温で１時間かきまぜたのち、析出物を濾取水洗し
た。濾過残渣を２００mlのメタノールで抽出し、ついで
濃縮乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ
ィーに付し、クロロホルム／メタノール＝２０:１で展
開すると、ビス[Ｎ−(３−tert−ブトキシカルボニルプ
ロピル)−Ｎ−メチルアミノ]インダミンチオスルホン酸
の０.４８gが得られた。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ: １.４５(１８Ｈ,s)、１.８８(４
Ｈ,br.)、２.８６(４Ｈ,br.s)、２.９０〜３.２０(４
Ｈ,m)、３.２０〜３.７０(６Ｈ,br.)、６.５０〜７.７
０(７Ｈ,m)。
【００９７】参考例１８ ３,７−ビス[Ｎ−(３−tert−ブトキシカルボニルプロ
ピル)−Ｎ−メチルアミノ]フェナザチオニウム クロラ
イド 参考例１７で得たビス[Ｎ−(３−tert−ブトキシカルボ
ニルプロピル)−Ｎ−メチルアミノ]−インダミンチオス
ルホン酸の０.４７gをアセトン４０mlに溶解し、二酸化
マンガン２.０gおよび硫酸銅０.０３gを加え、３０分間
加熱還流した。反応液を濾過し、濾液は減圧下に濃縮乾
固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに
付し、アセトニトリル、９０％アセトニトリル−水、つ
いでアセトニトリル／水／１Ｎ ＨＣl＝１２０:２０:３
の順に展開し、目的画分を濃縮乾固した。残渣をジクロ
ロメタン−酢酸エチルから再沈澱し、３,７−ビス[Ｎ−
(３−tert−ブトキシカルボニルプロピル)−Ｎ−メチル
アミノ]フェナザチオニウムクロライドの０.１１gを得
た。 mp: １４２〜１４５℃ ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ: １.４７(１８Ｈ,s)、２.００(４
Ｈ,quintet,Ｊ＝７Ｈz)、２.４３(４Ｈ,t,Ｊ＝７Ｈz)、
３.４３(６Ｈ,s)、３.７９(４Ｈ,t,Ｊ＝７Ｈz)、７.３
９(２Ｈ,d,Ｊ＝１０Ｈz)、７.６２(２Ｈ,br.s)、７.９
１(２Ｈ,d,Ｊ＝１０Ｈz)。 ＩＲ(ＫＢr)ν: ３４３０、２９７０、２９２０、１７
２０、１５９５、１３９５、１３３５、１２４０、１１
４０、９８０cm-1。 元素分析：Ｃ30Ｈ42Ｎ3Ｏ4ＳＣl・３Ｈ2Ｏとして 計算値：Ｃ,５７.１７; Ｈ,７.６８; Ｎ,６.６７ 実測値：Ｃ,５７.２９; Ｈ,７.４５; Ｎ,６.６７。
【００９８】参考例１９ ３,７−ビス[Ｎ−(３−カルボキシプロピル)−Ｎ−メチ
ルアミノ]フェナザチオニウム クロライド 参考例１８で得た３,７−ビス[Ｎ−(３−tert−ブトキ
シカルボニルプロピル)−Ｎ−メチルアミノ]フェナザチ
オニウム クロライドの０.１１gを１０mlのトリフルオ
ロ酢酸に溶解し、３０分間室温で反応させたのち、減圧
下に濃縮乾固すると３,７−ビス[Ｎ−(３−カルボキシ
プロピル)−Ｎ−メチルアミノ]フェナザチオニウム ク
ロライドがトリフルオロ酢酸塩として定量的に得られ
た。 ＮＭＲ(Ｄ2Ｏ)δ: １.８６(４Ｈ,br.s)、２.４５(４Ｈ,
br.s)、２.８０〜３.７０(１０Ｈ,br.m)、６.７０〜７.
４０(６Ｈ,br.m)。
【００９９】実施例５ ３,７−ビス[Ｎ−メチル−Ｎ−(３−スクシンイミドオ
キシカルボニルプロピル)アミノ]フェナザチオニウム
クロライドおよび３−[Ｎ−メチル−Ｎ−(３−スクシン
イミドオキシカルボニルプロピル)アミノ］−７−［Ｎ
−（３−カルボキシプロピル）−Ｎ−メチルアミノ］フ
ェナザチオニウム クロライド 参考例１９で得た３,７−ビス[Ｎ−(３−カルボキシプ
ロピル)−Ｎ−メチルアミノ]フェナザチオニウム クロ
ライド トリフルオロ酢酸塩の０.１１gをアセトニトリ
ル２０mlに溶解し、ピリジン０.１４mlおよびＤＳＣ
０.２１gを加え、室温で３時間かきまぜた。反応液を減
圧下に濃縮後、残渣にジクロロメタンを加えて溶解し、
飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濃
縮乾固して得られる深青色粉末をセファデックス(登録
商標) ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーに付し、ア
セトニトリルで展開すると、先に溶出するビススクシン
イミドエステル誘導体の３,７−ビス[Ｎ−メチル−Ｎ−
(３−スクシンイミドオキシカルボニルプロピル)アミ
ノ]フェナザチオニウム クロライドが０.１g、ついで
溶出するモノスクシンイミドエステル誘導体の３−[Ｎ
−メチル−Ｎ−(３−スクシンイミドオキシカルボニル
プロピル)アミノ］−７−［Ｎ−（３−カルボキシプロ
ピル）−Ｎ−メチルアミノ］フェナザチオニウムクロラ
イドが０.０３g、それぞれの溶出画分を濃縮乾固するこ
とによって得られた。
【０１００】[ビススクシンイミドエステル] mp: １１５〜１２０℃(dec．) NMR(ＤＭＳＯ−d6)δ: １.８８(２Ｈ,m)、２.０２(２
Ｈ,m)、２.３８(２Ｈ,t,Ｊ＝７Ｈz)、２.８７(４Ｈ,
s)、３.１３(２Ｈ,t,Ｊ＝７Ｈz)、ca３.３０(３Ｈ,s)、
３.３６(３Ｈ,s)、３.７６(４Ｈ,m)、７.５５(４Ｈ,br.
s)、７.９５(２Ｈ,d,Ｊ＝１０Ｈz)。 ＩＲ(ＫＢr)ν: ３４１０、２９３０、１８１０、１７
７５、１７３５、１５９５、１３９０、１３３５、１１
９０、１１４０、８８０cm-1。 [モノスクシンイミドエステル] mp: １２９〜１３３℃(dec．) ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ: ２.０１(４Ｈ,m)、２.８４
(４Ｈ,s)、２.８８(４Ｈ,t,Ｊ＝７Ｈz)、ca３.３(６Ｈ,
s)、３.８０(４Ｈ,m)、７.５６(４Ｈ,br.s)、７.９６
(２Ｈ,d,Ｊ＝１０Ｈz)。 ＩＲ(ＫＢr)ν: ３４００、２９３０、１８１０、１７
７５、１７３０、１５９５、１３９０、１３３５、１１
９０、１１４０、１０６５、８８０cm-1。
【０１０１】実施例６ ３−［Ｎ−メチル−Ｎ−（３−スクシンイミドオキシカ
ルボニルプロピル）−アミノ］−７−［Ｎ−［３−
（１，３−ジカルボキシプロピルカルバモイル）−プロ
ピル］−Ｎ−メチルアミノ］フェナザチオニウム クロ
ライド 実施例５で得た３,７−ビス[Ｎ−メチル−Ｎ−(３−ス
クシンイミドオキシカルボニルプロピル)アミノ]フェナ
ザチオニウム クロライド２０ｍｇを２ｍｌのアセトニ
トリルに溶解し、グルタミン酸８ｍｇ、トリエチルアミ
ン１５μｌ、５０％アセトニトリル−水２ｍｌの溶液を
加え、室温で１０分間かきまぜた。反応液に１Ｎ−塩酸
０.１ｍｌを加えたのち、セファデックス（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ）(登録商標) ＬＨ−２０カラムクロマトグラフ
ィーに付し、アセトニトリルで展開した。目的画分を濃
縮乾固し、３−［Ｎ−メチル−Ｎ−（３−スクシンイミ
ドオキシカルボニルプロピル）アミノ］−７−［Ｎ−
［３−（１，３−ジカルボキシプロピルカルバモイル）
プロピル］−Ｎ−メチルアミノ］フェナザチオニウムク
ロライドの１０.８ｍｇを青色粉末として得た。 ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ:１.７５〜２.０５（６Ｈ、
ｍ）、２.２０〜２.３５（４Ｈ、ｍ）、２.８４（４
Ｈ、ｓ）、２.８５〜２.９５（２Ｈ、ｍ）、３.６０〜
３.８５（６Ｈ、ｍ）、４.１５〜４.３（１Ｈ、ｍ）、
７.５０〜７.６０（３Ｈ、ｍ）、７.９〜８.１（３Ｈ、
ｍ）。 ＩＲ(ＫＢr)ν:３４２０、２９７０、２９４０、２６７
０、２４９０、１８１０、１７３５、１６６０、１５９
５、１３９０、１３４０、１１４５、１０３５、８８０
ｃｍ-1。
【０１０２】参考例２０ Ｎ−(５−エトキシカルボニルペンチル)−Ｎ−メチル−
p−フェニレンジアミン 参考例３で得たＮ−(５−エトキシカルボニルペンチル)
−Ｎ−メチルアニリン１０.０gを８０％酢酸４１.３ml
に溶解し、かきまぜながら１０℃以下で亜硝酸ナトリウ
ム３.０５gを含む水３.８ml溶液を加えた。ついで、反
応液に酢酸３７.５mlを加え、１０℃以下に保ちながら
亜鉛末２３.８gを約４０分を要して加えた。反応液を氷
水２００mlに注入、濾過し、亜鉛末を酢酸エチルで洗浄
した。濾液に酢酸エチルを加えて抽出し、抽出液を炭酸
水素ナトリウム水溶液で中和した後、飽和食塩水で洗浄
し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下に濃縮
後、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付
し、ヘキサン／酢酸エチル＝２:１で展開すると目的化
合物の２.７６gが赤紫色粘稠油状物として得られた。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.２５(３Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈ
z)、１.３３(２Ｈ,quintet,Ｊ＝７.５Ｈz)、１.５４(２
Ｈ,quintet,Ｊ＝７.５Ｈz)、１.６５(２Ｈ,quintet,Ｊ
＝７.５Ｈz)、２.２９(２Ｈ,t,Ｊ＝７.５Ｈz)、２.８０
(３Ｈ,s)、２.９０〜３.５０(２Ｈ,br.)、３.１６(２
Ｈ,t,Ｊ＝７.５Ｈz)、４.１２(２Ｈ,q,Ｊ＝７.０Ｈz)、
６.６５(５Ｈ,s)。 ＩＲ(neat)ν:３４３０,３３５０,２９３０,１７３０,
１５１５,１２６０,１１７５,８１０cm-1。
【０１０３】参考例２１ ３,７−ビス[Ｎ−(５−エトキシカルボニルペンチル)−
Ｎ−メチルアミノ]フェナザチオニウム クロライド Ｎ−(５−エトキシカルボニルペンチル)−Ｎ−メチル−
p−フェニレンジアミン １.３２gを０.７５gの硫酸を含
む水６５mlに溶解し、氷冷下にかきまぜながら、チオ硫
酸ナトリウム５水和物の２.１８gを含む水５ml溶液およ
び二酸化マンガン０.８６gを加えた。２０分後にチオ硫
酸ナトリウム５水和物４.３６gおよび二酸化マンガン
１.９２gを追加した。１時間かきまぜた後、反応液を１
Ｎ硫酸でpＨ４に調整し、Ｎ−(５−エトキシカルボニル
ペンチル)−Ｎ−メチルアニリン１.７０gの１Ｎ硫酸１
０ml溶液を同温度で加えた。さらに、二酸化マンガン
２.０８gおよび２５％硫酸６mlを追加し、１.５時間攪
拌した。ついで、反応液を１Ｎ水酸化ナトリウムでpＨ
５に調整し、二酸化マンガン０.７７gおよび硫酸銅０.
２９gを加え、９０℃で４０分間かきまぜた。反応液を
濾過、残渣を水洗、ついで３００mlのアセトンで抽出し
た。アセトン抽出液を濃縮したのち、残留物をクロロホ
ルムで抽出し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。濃縮後
の残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付
し、アセトニトリル、ついで９０％アセトニトリル−
水、アセトニトリル／水／１Ｎ塩酸＝１２０:２０:３の
順に展開して３０mgの目的化合物を得た。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.２６(６Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈ
z)、１.５０(４Ｈ,m)、１.７２(４Ｈ,m)、２.３５(４
Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈz)、３.４１(６Ｈ,s)、３.７１(４Ｈ,
m)、４.１３(４Ｈ,q,Ｊ＝７.０Ｈz)、７.２３(２Ｈ,br.
d,Ｊ＝９.０Ｈz)、７.８０(２Ｈ,br.s)、７.９１(２Ｈ,
br.d,Ｊ＝９.０Ｈz)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:１７２０,１６００,１３９５,１３４０,
１１４０,８８５cm-1
【０１０４】参考例２２ ３,７−ビス[Ｎ−(５−カルボキシペンチル)−Ｎ−メチ
ルアミノ]フェナザチオニウム クロライド ３,７−ビス[Ｎ−(５−エトキシカルボニルペンチル)−
Ｎ−メチルアミノ]フェナザチオニウム クロライド
０.３２gを９０％アセトニトリルの２０mlに溶解し、こ
れに１Ｎ塩酸４０mlを加え室温で２０時間かきまぜた。
反応液を減圧下に濃縮後、残留物をシリカゲルカラムク
ロマトグラフィーに付し、９０％アセトニトリル−水、
ついでアセトニトリル／水／１Ｎ塩酸＝３０:５:１の順
に展開し目的化合物の０.３２gを濃青色粉末として得
た。 ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):１.２５〜１.５０(４Ｈ,
m)、１.５０〜１.７５(８Ｈ,m)、２.２４(４Ｈ,t,Ｊ＝
７.０Ｈz)、３.５０(６Ｈ,s)、３.６５〜３.８０(４Ｈ,
m)、７.３５〜７.５０(２Ｈ,m)、７.５４(２Ｈ,br.s)、
７.９３(２Ｈ,br.d,Ｊ＝９.０Ｈz)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:１６３５,１６００,１４８５,１３９０,
１３４０,１２４０,１１４５,８８５cm-1。
【０１０５】実施例７ ３,７−ビス[Ｎ−メチル−Ｎ−(５−スクシンイミドオ
キシカルボニルペンチル)アミノ]フェナザチオニウム
クロライドおよび３−[Ｎ−メチル−Ｎ−(５−スクシン
イミドオキシカルボニルペンチル)アミノ]−７−[Ｎ−
(５−カルボキシペンチル)−Ｎ−メチルアミノ]フェナ
ザチオニウム クロライド 方法Ａ ３,７−ビス[Ｎ−(５−カルボキシペンチル)−Ｎ−メチ
ルアミノ]フェナザチオニウム クロライド ０.１５gを
トリフルオロ酢酸１０mlに溶解し、ついで濃縮乾固し
た。得られたトリフルオロ酢酸塩を３０mlのアセトニト
リルに溶解し、ＤＳＣ ０.９２gおよびピリジン０.８５
mlを加え、室温で１５時間かきまぜた。反応液を減圧下
に濃縮したのち、ジクロロメタンを加えて溶解し、飽和
食塩水で２回洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。
濃縮後、残留物をセファデックス(Ｓephadex)(登録商
標)ＬＨ−２０カラムクロマトグラフィーに付し、アセ
トニトリルで展開すると、ビススクシンイミドエステル
誘導体の３８mgが第一画分として、さらにモノスクシン
イミドエステル誘導体の３６mgが第二画分として得られ
た。
【０１０６】方法Ｂ ３,７−ビス[Ｎ−(５−カルボキシペンチル)−Ｎ−メチ
ルアミノ]フェナザチオニウム クロライド ０.３２gを
ジメチルホルムアミド５mlに溶解し、Ｎ−ヒドロキシコ
ハク酸イミド０.４２gおよびＷＳＣ ０.７０gを加え室
温で３時間かきまぜた。反応液を減圧下に濃縮乾固した
後、ジクロロメタンで抽出した。ジクロロメタン層を飽
和食塩水で２回洗浄し無水硫酸ナトリウムで乾燥した。
濃縮後、残留物をセファデックス(Ｓephadex)ＬＨ−２
０カラムクロマトグラフィーに付し、アセトニトリルで
展開、目的の画分を濃縮した。濃縮物を少量のジクロロ
メタンに溶解し、酢酸エチルを加えると、８３mgのビス
スクシンイミドエステル誘導体が濃青紫色粉末として得
られた。
【０１０７】［ビススクシンイミド エステル］ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):１.４０〜１.５５(４Ｈ,
m)、１.６５〜１.７５(８Ｈ,m)、２.７１(４Ｈ,t,Ｊ＝
７.０Ｈz)、２.８２(８Ｈ,s)、３.３１(６Ｈ,s)、３.７
５(４Ｈ,br.t,Ｊ＝７.０Ｈz)、７.５１(２Ｈ,br.s)、
７.５４(２Ｈ,br.d,Ｊ＝９.５Ｈz)、７.９３(２Ｈ,d,Ｊ
＝９.５Ｈz)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:１８１０,１７８０,１７３５,１５９５,
１３９０,１３３５,１２００,１１３５,１０６５,８８
０cm-1。 ［モノスクシンイミド エステル］ ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):１.３５〜１.６５(４Ｈ,
m)、１.６５〜１.８０(８Ｈ,m)、２.２４(２Ｈ,t,Ｊ＝
７.０Ｈz)、２.７１(２Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈz)、２.８２
(４Ｈ,s)、３.３５(６Ｈ,s)、３.７４(４Ｈ,br.t,Ｊ＝
７.０Ｈz)、７.５０(２Ｈ,s)、７.５２(２Ｈ,br.d,Ｊ＝
９.５Ｈz)、７.９２(２Ｈ,d,Ｊ＝９.５Ｈz)、 ＩＲ(ＫＢr)ν:１８１０,１７８０,１７３５,１５９５,
１３９０,１３３５,１２００,１１３５,１０６５,８８
０cm-1。
【０１０８】実施例８ ３−[Ｎ−メチル−Ｎ−(５−スクシンイミドオキシカル
ボニルペンチル)アミノ]−７−[Ｎ−[５−(１,３−ジカ
ルボキシプロピルカルバモイル)ペンチル]−Ｎ−メチル
アミノ]フェナザチオニウム クロライド ３,７−ビス[Ｎ−メチル−Ｎ−(５−スクシンイミドオ
キシカルボニルペンチル)アミノ]フェナザチオニウム
クロライド ７２mgのアセトニトリル６ml溶液に、グル
タミン酸２７mg、水３ml、トリエチルアミン５１μlか
ら調製した溶液を加えた。５分後に、１Ｎ塩酸０.３５m
lを加えてセファデックス(Ｓephadex)(登録商標)ＬＨ−
２０カラムクロマトグラフィーに付し、アセトニトリル
で展開すると、１６mgの目的化合物が得られた。 ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):１.３５〜１.６０(４Ｈ,
m)、１.６０〜１.８０(８Ｈ,m)、１.８０〜２.００(２
Ｈ,m)、２.１５(２Ｈ,t,Ｊ＝６.０Ｈz)、２.２７(２Ｈ,
t,Ｊ＝７.０Ｈz)、２.７１(２Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈz)、２.
８２(４Ｈ,s)、３.３５(６Ｈ,s)、３.７２(４Ｈ,br.
s)、４.２０(１Ｈ,m)、７.４０〜７.５５(４Ｈ,m)、７.
９２(１Ｈ,d,Ｊ＝９.５Ｈz)、８.０４(１Ｈ,d,Ｊ＝９.
５Ｈz)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:１８１０,１７８０,１７３５,１６５０,
１５９５,１３９０,１３３５,１２３５,１２００,１１
３５,１０６５,８８０cm-1。
【０１０９】参考例２３ Ｎ−(３−マレイミドプロピル)−Ｎ−メチルアニリン Ｎ−(３−アミノプロピル)−Ｎ−メチルアニリン［エス
・エル・シャピロ(Ｓ.Ｌ.Ｓhapiro)ら，Ｊ.Ａm.Ｃhem.
Ｓoc.,８１，３０８１（１９５８）］８.３gをジクロロ
メタン５０mlに溶解し、氷冷下に６gの無水マレイン酸
を少量ずつ加えたのち、室温で１時間かきまぜた。溶媒
を留去した後、無水酢酸２０mlを加え２日間室温で放置
した。反応液を６０℃で２時間、さらに１００℃で２時
間かきまぜたのち、減圧下に濃縮し、残留部を酢酸エチ
ルで抽出した。有機層を炭酸水素ナトリウム水溶液で中
和した後、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾
燥した。濃縮後の残留物をシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィーに付し、ヘキサン／酢酸エチル＝４:１で展開
した。得られた目的化合物を同溶媒から再結晶して、
４.１gの黄色針状晶を得た。 mp：８７〜８８℃ ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.８９(２Ｈ,quintet,Ｊ＝
７.３Ｈz)、２.９１(３Ｈ,s)、３.３３(２Ｈ,t,Ｊ＝７.
３Ｈz)、３.５７(２Ｈ,t,Ｊ＝７.３Ｈz)、６.６８(３
Ｈ,m)、６.６９(２Ｈ,s)、７.２１(２Ｈ,m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:１７００,１６００,１５１０,１４１０,
１３７０,１２２０,８３０,７５０,６９０cm-1。 元素分析：Ｃ14Ｈ16Ｎ2Ｏ2として 計算値：Ｃ,６８.８３;Ｈ,６.６０;Ｎ,１１.４７ 実測値：Ｃ,６８.９５;Ｈ,６.７７:Ｎ,１１.４９。
【０１１０】参考例２４ ３−[Ｎ−(３−マレイミドプロピル)−Ｎ−メチルアミ
ノ]−７−[Ｎ−(３−エトキシカルボニルプロピル)−Ｎ
−メチルアミノ]フェナザチオニウム クロライド Ｎ−(３−マレイミドプロピル)−Ｎ−メチルアニリン
０.２５gをアセトン１０mlに溶解し、１Ｎ塩酸１mlおよ
び水９mlを加えた。ついで２−アミノ−５−[Ｎ−(３−
エトキシカルボニルプロピル)−Ｎ−メチルアミノ]フェ
ニルチオスルホン酸 ０.３５gを加え、氷冷下にかきま
ぜながら重クロム酸ナトリウム・２水和物０.２gの水２
ml溶液を滴下した。同温度で３０分間かきまぜたのち、
酢酸０.０３mlを加え、さらに室温で３０分間攪拌し
た。つぎに、触媒量の硫酸銅及び０.２５gの二酸化マン
ガンを加え、室温で３０分、さらに７０℃で１時間かき
まぜた。冷後、反応液を濾過し、残渣をエタノールで洗
浄、濾液は減圧下に濃縮した。残留部をエタノールで再
抽出し不溶物を濾去した。濾液は濃縮後、シリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーに付し、アセトニトリル、つい
でアセトニトリル／水／１Ｎ塩酸＝４０:５:１で展開
し、０.３１gの目的化合物を得た。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.２８(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈ
z)、１.７８(４Ｈ,m)、２.５５(２Ｈ,m)、３.３９(３
Ｈ,s)、３.４６(３Ｈ,s)、３.６０〜３.９５(６Ｈ,m)、
４.１７(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz)、６.８０(２Ｈ,s)、７.
１５〜８.００(６Ｈ,m)、 ＩＲ(ＫＢr)ν:１７２０,１７００,１５９０,１３９０,
１３３０,１２２５,１１８０,１１４０,８８０cm-1。
【０１１１】実施例９ ３−[Ｎ−(３−マレイミドプロピル)−Ｎ−メチルアミ
ノ]−７−[Ｎ−(３−カルボキシプロピル)−Ｎ−メチル
アミノ]フェナザチオニウム クロライド ３−[Ｎ−(３−マレイミドプロピル)−Ｎ−メチルアミ
ノ]−７−[Ｎ−(３−エトキシカルボニルプロピル)−Ｎ
−メチルアミノ]フェナザチオニウム クロライド ０.
３gをアセトニトリル２mlおよび１Ｎ塩酸６mlの混合物
に溶解し、開放下に２日間放置した。析出した金属光沢
を有する沈澱物を濾取し、エーテルで洗浄、乾燥すると
０.２５gの目的化合物が得られた。 ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):１.９０(４Ｈ,m)、２.３
９(２Ｈ,t,Ｊ＝６.８Ｈz)、３.２３(３Ｈ,s)、３.３５
(３Ｈ,s)、３.５４(２Ｈ,m)、７.０１(２Ｈ,s)、７.４
０〜７.６５(４Ｈ,m)、７.８５〜８.００(２Ｈ,m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:１７３５,１７００,１５９５,１３９０,
１３３０cm-1。
【０１１２】実施例１０ ３−[Ｎ−(３−マレイミドプロピル)−Ｎ−メチルアミ
ノ]−７−[Ｎ−[３−(１,３−ジカルボキシプロピルカ
ルバモイル)プロピル]−Ｎ−メチルアミノ]フェナザチ
オニウム クロライド ３−[Ｎ−(３−マレイミドプロピル)−Ｎ−メチルアミ
ノ]−７−[Ｎ−(３−カルボキシプロピル)−Ｎ−メチル
アミノ]フェナザチオニウム クロライド ５１mgを４Å
のモレキュラーシーブで乾燥したジメチルホルムアミド
の５mlに溶解し、２５mgのＮ−ヒドロキシコハク酸イミ
ドおよび５０mgのＷＳＣを加え、室温で２３時間反応さ
せた。この溶液を、Ｌ−グルタミン酸１７.７mg、ジメ
チルホルムアミド５ml、水０.５mlおよびトリエチルア
ミン３４μlから調製した溶液に、氷冷下で加え１時間
かきまぜた。減圧下に濃縮したのち、残留部を５mlの水
に溶解し、１Ｎ塩酸０.２４mlを加えた。この溶液をシ
リカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、アセトニト
リル／水＝９:１、ついでアセトニトリル／水／１Ｎ塩
酸＝３０:１５:１で溶出した。目的の画分を濃縮したの
ち、残留部をセファデックス(Ｓephadex)(登録商標)Ｌ
Ｈ−２０カラムクロマトグラフィーに付し、アセトニト
リル／水＝１０:１で展開、目的の画分を凍結乾燥する
と２６mgの目的化合物が得られた。 ＮＭＲ(Ｄ2Ｏ)δ(ppm):１.６０〜２.３０(６Ｈ,m)、２.
４５(４Ｈ,m)、３.１４(６Ｈ,s)、３.３５〜３.６５(６
Ｈ,m)、４.３５(１Ｈ,t)、６.８０〜７.５０(６Ｈ,m)、
６.９２(２Ｈ,s)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:１７３０,１７００,１６４０,１５９５,
１３９０,１３３０cm-1。
【０１１３】参考例２５ Ｎ−(３−シアノプロピル)−Ｎ−メチルアニリン Ｎ−メチルアニリン２５gに４−クロロブチロニトリル
２５mlを加え１１０℃で２４時間かきまぜた。冷後、炭
酸水素ナトリウム水溶液で中和し、酢酸エチルで抽出し
た。有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで
乾燥した。濃縮後、残留部を減圧蒸留に付し、目的化合
物の２１.５gを淡黄色油状物として得た。 bp:１１８〜１２１℃／０.５mmＨg ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.９６(２Ｈ,quintet,Ｊ＝
７.０Ｈz)、２.４０(２Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈz)、２.９６
(３Ｈ,s)、３.４７(２Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈz)、６.７４(３
Ｈ,m)、７.２５(２Ｈ,m)。 ＩＲ(neat)ν:２９５０,２８７５,２８２５,２２５０,
１６００,１５０５,１３７０,１１９０,７５０,６９０c
m-1。
【０１１４】参考例２６ Ｎ−(４−アミノブチル)−Ｎ−メチルアニリン 乾燥エーテルの５０mlに窒素気流下、２gの水素化リチ
ウムアルミニウムを加え、かきまぜながらＮ−(３−シ
アノプロピル)−Ｎ−メチルアニリン ９gの乾燥エーテ
ル１０ml溶液を滴下した。１時間かきまぜたのち、さら
に２時間加熱還流した。酢酸エチルで過剰の還元剤を分
解したのち、有機層を水洗、無水硫酸ナトリウムで乾燥
した。これを濃縮すると、目的化合物の９.８gが無色の
油状物として得られた。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.５４(４Ｈ,m)、２.７３
(２Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈz)、2.９３(３Ｈ,s)、３.３３(２
Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈz)、６.７０(３Ｈ,m)、７.２２(２Ｈ,
m)。
【０１１５】参考例２７ Ｎ−(４−マレイミドブチル)−Ｎ−メチルアニリン Ｎ−(４−アミノブチル)−Ｎ−メチルアニリン７.２gを
ジクロロメタン７０mlに溶解し、無水マレイン酸４gを
加え室温で２時間かきまぜた。溶媒を留去したのち無水
酢酸１０mlを加え、１００℃で５時間かきまぜた。濃縮
後、残留部に炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて中和
し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄
し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下に濃縮した。
残留部をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し、
ヘキサン／酢酸エチル＝２:１で展開すると、目的化合
物の２.０gが黄色針状晶として得られた。 mp:６６〜６７℃ ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.６０(４Ｈ,m)、２.９１
(３Ｈ,s)、３.３３(２Ｈ,t,Ｊ＝６.８Ｈz)、３.５４(２
Ｈ,t,Ｊ＝６.８Ｈz)、６.６８(２Ｈ,s)、６.６８(３Ｈ,
m)、７.２２(２Ｈ,m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:１６９５,１６００,１５０５,１４１０,
１３６５,７５０,６９０cm-1。 元素分析：Ｃ15Ｈ18Ｎ2Ｏ2として 計算値：Ｃ,６９.７４;Ｈ,７.０２;Ｎ,１０.８４ 実測値：Ｃ,６９.９８;Ｈ,７.２０;Ｎ,１０.９２。
【０１１６】参考例２８ Ｎ−(４−エトキシカルボニルブチル)−Ｎ−メチル−p
−フェニレンジアミン 参考例２で得たＮ−(４−エトキシカルボニルブチル)−
Ｎ−メチルアニリン２.３５gを１Ｎ塩酸３０mlに溶解
し、亜硝酸ナトリウム０.７６gを含む水５ml溶液を０゜
〜４℃で滴下した。同温度で３０分間かきまぜた後、３
Ｎ塩酸１５ml、ついで亜鉛末２gを２０〜２７℃で加
え、同温度でさらに１時間攪拌した。反応液に炭酸水素
ナトリウムを加えて中和し、酢酸エチルで抽出した。有
機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥
後濃縮した。濃縮物をシリカゲルフラッシュクロマトグ
ラフィーに付し、ヘキサン／酢酸エチル＝１:１で展開
すると、目的化合物の１.７gが褐色油状物として得られ
た。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.２５(３Ｈ,t,Ｊ＝７.２Ｈ
z)、１.６１(４Ｈ,m)、２.３１(２Ｈ,t,Ｊ＝７.１Ｈ
z)、２.８１(３Ｈ,s)、３.１８(２Ｈ,t,Ｊ＝６.５Ｈ
z)、４.１２(２Ｈ,q,Ｊ＝７.２Ｈz)、６.６５(４Ｈ,
s)。
【０１１７】参考例２９ ２−アミノ−５−[Ｎ−(４−エトキシカルボニルブチ
ル)−Ｎ−メチルアミノ］フェニルチオスルホン酸 Ｎ−(４−エトキシカルボニルブチル)−Ｎ−メチル−p
−フェニレンジアミン１.７gを１Ｎ塩酸１３.６mlに溶
解し、硫酸アルミニウム・１４〜１８水和物２gを含む
水１０ml溶液を加え氷冷した。これに、チオ硫酸ナトリ
ウム・５水和物２gを含む水８ml溶液を加えたのち、重
クロム酸ナトリウム・２水和物０.７９８gを含む水５ml
溶液を滴下した。氷冷下で３０分かきまぜたのち酢酸
０.６mlを加え、さらに室温で２時間かきまぜた。反応
液を濃縮乾固したのち、炭酸水素ナトリウム水溶液でア
ルカリ性とし、不溶物を濾去した。濾液は酢酸でpＨ４
に調整後、約５０mlまで濃縮し冷却した。析出した結晶
性沈澱物を濾取、冷水で洗浄後乾燥すると目的化合物の
２.１gが得られた。 ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6＋Ｄ2Ｏ)δ:１.６４(３Ｈ,t,Ｊ＝
７.０Ｈz)、１.５１(４Ｈ,m)、２.３０(２Ｈ,m)、３.０
１(３Ｈ,s)、３.３９(２Ｈ,m)、４.０４(２Ｈ,q,Ｊ＝
７.０Ｈz)、６.８０〜７.４０(３Ｈ,m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:１７２０,１６２０,１２５０,１１８０,
１１１０,６３０cm-1。
【０１１８】参考例３０ ３−[Ｎ−(４−マレイミドブチル)−Ｎ−メチルアミノ]
−７−[Ｎ−(４−エトキシカルボニルブチル)−Ｎ−メ
チルアミノ]フェナザチオニウム クロライド 参考例２７で得たＮ−(４−マレイミドブチル)−Ｎ−メ
チルアニリン０.２６ｇをアセトン１０ｍｌに溶解し、
１Ｎ塩酸１mlおよび水９mlを加えて氷冷した。これに２
−アミノ−５−[Ｎ−(４−エトキシカオルボニルブチ
ル)−Ｎ−メチルアミノ]フェニルチオスルホン酸０.４
g、ついで重クロム酸ナトリウム・２水和物０.２gを含
む水１ml溶液を加え３０分かきまぜた。酢酸０.０３ml
を追加しさらに室温で１時間かきまぜた。ついで、反応
液に触媒量の硫酸銅および二酸化マンガン０.２５gを加
え、室温で３０分さらに７０℃で１時間かきまぜた。冷
後、反応液を濾過し、残渣をメタノールおよび水で洗浄
した。濾液を濃縮乾固したのち、飽和食塩水およびクロ
ロホルムと振り混ぜ、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾
燥した。濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー
に付し、アセトニトリル、ついでアセトニトリル／水／
１Ｎ塩酸＝４０:５:１の順に展開し、目的の画分を濃縮
した。濃縮物にアセトニトリルを加え、不溶物を濾去し
たのち濾液を濃縮乾固すると、目的化合物の０.２８９g
が得られた。 ＮＭＲ(ＣＤＣl3)δ(ppm):１.２６(３Ｈ,t,Ｊ＝７.０Ｈ
z)、１.７７(８Ｈ,m)、２.４１(２Ｈ,t,Ｊ＝５.７Ｈ
z)、３.４０(３Ｈ,s)、３.６１(２Ｈ,t,Ｊ＝６.０Ｈ
z)、３.７７(４Ｈ,m)、４.１３(２Ｈ,q,Ｊ＝７.０Ｈ
z)、６.７８(２Ｈ,s)、７.６５〜７.９６(６Ｈ,m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:１７２０,１７００,１５９５,１３９０,
１３３０,１１４０,８８０cm-1。
【０１１９】実施例１１ ３−[Ｎ−(４−マレイミドブチル−Ｎ−メチルアミノ]
−７−[Ｎ−(４−カルボキシブチル)−Ｎ−メチルアミ
ノ]フェナザチオニウム クロライド ３−[Ｎ−(４−マレイミドブチル)−Ｎ−メチルアミノ]
−７−[Ｎ−(４−エトキシカルボニルブチル)−Ｎ−メ
チルアミノ]フェナザチオニウム クロライド０.２８７
gにアセトニトリル２mlおよび１Ｎ塩酸６mlを加えて溶
解し、開放下に４４時間放置した。金属光沢を有する析
出物を濾取し、エーテルで洗浄、乾燥すると、０.２４
６gの目的化合物が得られた。 ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6)δ(ppm):１.６１(８Ｈ,m)、２.３
０(２Ｈ,t,Ｊ＝６.０Ｈz)、３.７６(４Ｈ,m)、７.０３
(２Ｈ,s)、７.５２(４Ｈ,br．s)、７.８５〜８.００(２
Ｈ,m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:１７４０,１７００,１３９０,１３３０c
m-1。
【０１２０】実施例１２ ３−[Ｎ−(４−マレイミドブチル)−Ｎ−メチルアミノ]
−７−ジメチルアミノフェナザチオニウム クロライド 参考例２７で得たＮ−(４−マレイミドブチル)−Ｎ−メ
チルアニリン０.２６gをアセトン１０mlに溶解し、１Ｎ
塩酸１mlおよび水１０mlを加えて氷冷した。２−アミノ
−５−ジメチルアミノフェニルチオスルホン酸０.２５g
を加えたのち、重クロム酸ナトリウム・２水和物０.２g
を含む水２ml溶液を滴下した。同温度で３０分かきまぜ
たのち、酢酸、０.０３mlを加えさらに１時間室温でか
きまぜた。減圧下にアセトンを留去し、析出した金属光
沢を有する不溶物を濾取し水洗した。これを、５０％ア
セトン−水の３０mlに懸濁、触媒量の硫酸銅および二酸
化マンガン０２５gを加え、室温で１時間、さらに７０
℃で１時間かきまぜた。冷後、反応液を濾過し残渣をア
セトン、水、エタノールの順に洗浄した。濾液を濃縮乾
固したのち、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに付
し、アセトニトリル、ついでアセトニトリル／水／１Ｎ
塩酸＝４０:５:１の順に展開し、目的の画分を濃縮し
た。残留部にクロロホルム５０mlおよびエタノール４ml
を加え、不溶物を濾去後、濾液を濃縮乾固すると０.４
２gの目的化合物が得られた。 ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−d6＋Ｄ2Ｏ)δ(ppm):１.６０(４Ｈ,
m)、３.３１(３Ｈ,s)、３.３６(６Ｈ,s）、３.４７(２
Ｈ,m)、３.７２(２Ｈ,m)、７.００(２Ｈ,s)、７.４０〜
７.６０(４Ｈ,m)、７.８５〜７.９６(２Ｈ,m)。 ＩＲ(ＫＢr)ν:１７００,１５９０,１３９０,１３５０,
１３３０cm-1。
【０１２１】実施例１３ ＢＳＡおよび変性ＢＳＡへのスクシンイミドメチレンブ
ルー誘導体の結合 牛血清アルブミン（ＢＳＡ)［マイルズ・インコーポレ
イティド(Ｍiles Ｉnc.)、Ｋankakee,Ｉll．ＵＳＡ］の
５０mgを、０.５％ラウリル硫酸ナトリウムおよび０.２
５％β−メルカプトエタノールを含むpＨ７の２５mＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液２５mlに溶解した。この溶液を９
０℃で１０分間加熱した。反応溶液を冷却したのち、セ
ファデックス(Ｓephadex)(登録商標)Ｇ−５０のカラム
ゲル濾過に付し、２５mＭリン酸緩衝液で展開すること
により、変性蛋白を還元剤から分離した。
【０１２２】以下に用いられるすべての緩衝液は、特に
断わらない限りpＨ７の０.１Ｍリン酸緩衝液である。ス
クシンイミドメチレンブルー誘導体１,２,３,４,５,６,
７および８の各２mgを１mlの緩衝液に溶解した。各溶液
の０.５mlに１mgのＢＳＡを含む緩衝液０.５mlを加え、
６℃で一夜インキュベートした。各溶液の０.２５mlに
０.５mgの変性ＢＳＡを含む緩衝液０.７５mlを加え、６
℃で一夜インキュベートした。一夜インキュベーション
したスクシンイミドメチレンブルー誘導体１の溶液に２
mgのリジンを加えた。それぞれの溶液をセファデックス
(Ｓephadex)(登録商標)Ｇ−５０カラムによるゲル濾過
に付し、未反応のメチレンブルー誘導体を除去した。そ
れぞれの標識体溶液中における蛋白の濃度は、染料−結
合試験［バイオラッド・ラボラトリーズ(Ｂiorad Ｌab
oratories),Ｒichmond,Ｃａ．ＵＳＡ］で決定した。ま
た、結合したメチレンブルー誘導体の数量は６６２nmに
おける吸光度から求めた。表１にＢＳＡおよび変性ＢＳ
Ａにとり込まれたメチレンブルー誘導体の数量(ＭＢ／
ＢＳＡ)と、それらの相対的な化学発光活性を示す。該
メチレンブルー誘導体の化学構造を以下に示す。尚、
( ）内にその製造例を説明した実施例番号を示した。
【０１２３】
【化３４】
【０１２４】
【化３５】
【０１２５】
【表１】
【０１２６】実施例１４ ＩgＧへのスクシンイミドメチレンブルー誘導体の結合 スクシンイミドメチレンブルー誘導体２,４,６および８
のそれぞれ２mgを１mlの緩衝液に溶解した。それぞれを
モル比において１５,５０および２００倍となるよう
に、０.５mgのＩgＧ(抗アルファフェトプロテイン抗体
Ａ４−４、和光純薬製、大阪、日本)を含む緩衝液０.５
mlと混合し、６℃で一夜インキュベートした。それぞれ
の溶液をセファデックス(Ｓephadex)(登録商標) Ｇ−５
０のゲル濾過に付し、未反応のメチレンブルー誘導体を
除去した。ＩgＧおよびメチレンブルー誘導体(ＭＢ)の
濃度は前述の方法で決定した。これらの抗体結合活性
は、アルファフェトプロテインのＥＬＩＳＡ法における
ＩgＧ−メチレンブルー誘導体標識体とＩgＧ−ＨＲＰ標
識体間の競合反応によって決定した。表２にこれらの結
果を示す。
【０１２７】
【表２】
【０１２８】実施例１５ ＩgＧ−メチレンブルー誘導体標識体を用いるＥＬＩＳ
Ａ 直径３.２μmのラテックス１０％溶液［シグマ・ケミカ
ル社(Ｓigma Ｃhemical Ｃo.),Ｓt．Ｌouis,Ｍo．ＵＳ
Ａ］０.５mlを５mlの水で２回洗浄して担体を調製し
た。得られたラテックスをpＨ９.５の０.１Ｍ炭酸緩衝
液５mlで洗浄し、ついで固緩衝液５mlに再懸濁した。こ
れを５６℃で２０分間インキュベートしたのち、１mgの
抗アルファフェトプロテイン抗体(Ａ２−９５、和光純
薬製)を加え、さらに５６℃で４０分間ついで室温で２
時間インキュベートした。これを０.２％Ｔween−２０
を含む５mlの０.１Ｍリン酸緩衝液(pＨ６)、ついで２５
％ブロックエース(雪印乳業製、札幌、日本)を含むリン
酸緩衝生理食塩水(５０mＭリン酸ナトリウム、０.８％
塩化ナトリウム、pＨ７)５mlで洗浄し、２５％ブロック
エース、０.５％牛血清アルブミン、０.０２％マーチオ
レートを含むリン酸緩衝生理食塩水中に貯えた。
【０１２９】ＥＬＩＳＡ法においては、スクシンイミド
メチレンブルー誘導体４をＩgＧの５０倍モル比でイン
キュベートして得られるＩgＧ−メチレンブルー誘導体
標識体５μlと１０％ブロックエースを含有するリン酸
緩衝生理食塩水２５０μlとを、前記で調製した２％ラ
テックス溶液５０μlと混合し、種々の濃度のアルファ
フェトプロテインを加え、３７℃で３０分間インキュベ
ートした。それぞれを０.１％Ｔween−２０を含有する
リン酸緩衝生理食塩水で４回洗浄し、ついでリン酸緩衝
生理食塩水で洗浄した。それぞれに、１mＭルミノール
含有０.１Ｍ水酸化ナトリウム０.４mlを加え、ついでそ
の懸濁液をオプティカリー・ポンプト・ケミルミネッセ
ンス［Ｏptically Ｐumped Ｃhemiluminescence(ＯＰ
Ｃ)］法(特願平２−２４９８７９)で測定するためのプ
ラスチックチューブに移しかえた。その結果を図１に示
す。図１においては、縦軸はＣＰＭ（photons counted
per minute）を、横軸はアルファフェトプロテインの量
を示す。この結果は、化学発光量がアルファフェトプロ
テイン量に対して直線的に増加することを示している。
【０１３０】実施例１６ Ｆab'−ＢＳＡ−メチレンブルー誘導体標識体を用いる
ＥＬＩＳＡ 本実施例においては、担体蛋白として牛血清アルブミン
を用いることにより、抗体フラグメントＦab'−メチレ
ンブルー誘導体標識体を作製した。抗アルファフェトプ
ロテイン抗体から調製されたＦ(ab')2１mgを、２０mＭ
ジチオスレイトールを含有するpＨ６.８の０.１Ｍリン
酸緩衝液１mlにインキュベートすることにより還元し
た。過剰のジチオスレイトールを同緩衝液中ゲル濾過に
より除去した。得られた蛋白は直ちに、Ｎ,Ｎ'−ビス
(３−マレイドプロピル)−２−ヒドロキシ−１,３−プ
ロパンジアミンの２mgと３７℃で３０分間反応させた。
過剰の試薬はゲル濾過で除去した。前記の方法に従っ
て、牛血清アルブミンの１mgを変性し、スクシンイミド
メチレンブルー誘導体４と反応させ、ついでジチオスレ
イトールで還元した。蛋白をゲル濾過から回収し、前記
で調製したＦab'と混合し６℃で一夜インキュベートし
た。調製されたＦab'−ＢＳＡ−メチレンブルー誘導体
標識体は、実施例１５に記載したと同様の方法により、
アルファフェトプロテインのアッセイに用いた。その結
果を図２に示す。図２においては、縦軸はＣＰＭを、横
軸はアルファフェトプロテインの量を示す。結果から明
らかなように、化学発光量はアルファフェトプロテイン
量に対して直線的に増加する。
【０１３１】
【発明の効果】本発明が提供する光感受性染料誘導体に
より、従来困難であった光感受性染料による抗体蛋白等
の修飾が容易になり、該修飾の際に従来問題となってい
た染料触媒標識体の沈降と固相表面への非特異的結合を
防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 前記実施例１５のアルファフェトプロテイン
・アッセイの結果を示す。
【図２】 前記実施例１６のアルファフェトプロテイン
・アッセイの結果を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/533 8310−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 31/54 ＡＤＵ 7252−4Ｃ (Ｃ０７Ｄ 417/12 207:00 7019−4Ｃ 279:00） 8314−4Ｃ

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 一般式： 【化１】 ［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は同一または異なって
    それぞれＣ1-6アルキル基であって、その少なくとも１
    つはアミノ基、チオール基またはカルボキシル基と反応
    する基を置換基として有し、Ｘ-はフェナザチオニウム
    の対イオンを示す］で表されるフェノチアジン誘導体。
  2. 【請求項２】 一般式： 【化２】 ［式中、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3'およびＲ4'の少なくとも１つ
    は式：-(ＣＨ2)m-ＣＯ-Ｙで示される基を、他はＣ1-6ア
    ルキル基を示し、Ｙは脱離基を示し、ｍは１〜６の整数
    を示し、Ｘ-はフェナザチオニウムの対イオンを示す］
    で表されるフェノチアジン誘導体。
  3. 【請求項３】 一般式： 【化３】 ［式中、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3'およびＲ4'の少なくとも１つ
    は式：-(ＣＨ2)m-ＣＯ-Ｙで示される基を、他はＣ1-6ア
    ルキル基を示し、Ｙは脱離基を示し、ｍは１〜６の整数
    を示す］で表されるインダミンチオスルホン酸誘導体。
  4. 【請求項４】 一般式： 【化４】 ［式中、Ｒ1”はＣ1-6アルキル基を示し、Ｙは脱離基を
    示し、ｍは１〜６の整数を示す］で表される２−アミノ
    −５−ジ置換アミノフェニルチオスルホン酸誘導体。
  5. 【請求項５】 一般式： 【化５】 ［式中、Ｒ1'、Ｒ2'およびＲ3'の少なくとも１つは式：
    -(ＣＨ2)m-ＣＯ-Ｙで示される基を、他はＣ1-6アルキル
    基を示し、Ｙは脱離基を示し、ｍは１〜６の整数を示
    す］で表されるインダミンチオスルホン酸誘導体。
  6. 【請求項６】 一般式： 【化６】 ［式中、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3'およびＲ4'の少なくとも１つ
    は式：-(ＣＨ2)m-ＣＯ-Ｙで示される基を、他はＣ1-6ア
    ルキル基を示し、Ｙは脱離基を示し、ｍは１〜６の整数
    を示し、Ｘ-はフェナザチオニウムの対イオンを示す］
    で表されるフェノチアジン誘導体のＹを脱離させ、つい
    でアミノ基、チオール基またはカルボキシル基と反応す
    る基を導入することを特徴とする一般式： 【化７】 ［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はそれぞれＣ1-6アル
    キル基であって、その少なくとも１つはアミノ基、チオ
    ール基またはカルボキシル基と反応する基を置換基とし
    て有し、Ｘ-はフェナザチオニウムの対イオンを示す］
    で表されるフェノチアジン誘導体の製造法。
  7. 【請求項７】 一般式： 【化８】 ［式中、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3'およびＲ4'の少なくとも１つ
    は式：-(ＣＨ2)m-ＣＯ-Ｙで示される基を、他はＣ1-6ア
    ルキル基を示し、Ｙは脱離基を示し、ｍは１〜６の整数
    を示す］で表されるインダミンチオスルホン酸誘導体
    を、水あるいは有機溶媒またはそれらの混合溶媒中、無
    機酸化剤で酸化的に閉環して一般式： 【化９】 ［式中、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3'およびＲ4'の少なくとも１つ
    は式：-(ＣＨ2)m-ＣＯ-Ｙで示される基を、他はＣ1-6ア
    ルキル基を示し、Ｙは脱離基を示し、ｍは１〜６の整数
    を示し、Ｘ-はフェナザチオニウムの対イオンを示す］
    で表されるフェノチアジン誘導体を得、そのＹを脱離さ
    せ、ついでアミノ基、チオール基またはカルボキシル基
    と反応する基を導入することを特徴とする一般式： 【化１０】 ［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はそれぞれＣ1-6アル
    キル基であって、その少なくとも１つはアミノ基、チオ
    ール基またはカルボキシル基と反応する基を置換基とし
    て有し、Ｘ-はフェナザチオニウムの対イオンを示す］
    で表されるフェノチアジン誘導体の製造法。
  8. 【請求項８】 一般式： 【化１１】 ［式中、Ｂはスクシンイミドオキシカルボニル基または
    マレイミド基を示し、ｍは１〜６の整数を示す］で表さ
    れるスクシンイミドエステル誘導体に、酸性アミノ酸の
    トリエチルアミン塩を反応させることを特徴とする一般
    式： 【化１２】 ［式中、Ｂはスクシンイミドオキシカルボニル基または
    マレイミド基を示し、ｍは１〜６の整数を示し、ｎは１
    または２を示す］で表される化合物の製造法。
  9. 【請求項９】 一般式： 【化１３】 ［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は同一または異なって
    それぞれＣ1-6アルキル基であって、その少なくとも１
    つはアミノ基、チオール基またはカルボキシル基と反応
    する基を置換基として有し、Ｘ-はフェナザチオニウム
    の対イオンを示す］で表されるフェノチアジン誘導体を
    抗原または抗体にカップリングさせて得られる標識体を
    測定することを特徴とする試料中の分析対象の測定方
    法。
  10. 【請求項１０】 抗原または抗体にそのアミノ基、チオ
    ール基またはカルボキシ基によりカップリングした一般
    式： 【化１４】 ［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は同一または異なって
    それぞれＣ1-6アルキル基であって、その少なくとも１
    つはアミノ基、チオール基またはカルボキシル基と反応
    する基を置換基として有し、Ｘ-はフェナザチオニウム
    の対イオンを示す］で表されるフェノチアジン誘導体よ
    りなることを特徴とする該抗原または抗体の標識体。
JP4099260A 1991-04-26 1992-04-20 ３，７−ビス（ジ置換アミノ）フェノチアジン誘導体およびその製造法 Withdrawn JPH05170752A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP4099260A JPH05170752A (ja) 1991-04-26 1992-04-20 ３，７−ビス（ジ置換アミノ）フェノチアジン誘導体およびその製造法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP3-96930 1991-04-26
JP9693091 1991-04-26
JP4099260A JPH05170752A (ja) 1991-04-26 1992-04-20 ３，７−ビス（ジ置換アミノ）フェノチアジン誘導体およびその製造法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH05170752A true JPH05170752A (ja) 1993-07-09

Family

ID=26438080

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP4099260A Withdrawn JPH05170752A (ja) 1991-04-26 1992-04-20 ３，７−ビス（ジ置換アミノ）フェノチアジン誘導体およびその製造法

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JPH05170752A (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004508448A (ja) * 2000-09-06 2004-03-18 エボテック・オーアーイー・アーゲー オキサジン誘導体
JP2005500271A (ja) * 2001-05-30 2005-01-06 フォトファーマイカ リミテッド 生物学的に活性なメチレンブルー誘導体
JP2008513535A (ja) * 2004-09-23 2008-05-01 ヴィスタ ラボラトリーズ リミテッド メチルチオニニウム塩化物（ｍｔｃ）などのジアミノフェノチアジニウム化合物を化学合成および精製する方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004508448A (ja) * 2000-09-06 2004-03-18 エボテック・オーアーイー・アーゲー オキサジン誘導体
JP2005500271A (ja) * 2001-05-30 2005-01-06 フォトファーマイカ リミテッド 生物学的に活性なメチレンブルー誘導体
JP2009280588A (ja) * 2001-05-30 2009-12-03 Photopharmica Ltd 生物学的に活性なメチレンブルー誘導体
JP2008513535A (ja) * 2004-09-23 2008-05-01 ヴィスタ ラボラトリーズ リミテッド メチルチオニニウム塩化物（ｍｔｃ）などのジアミノフェノチアジニウム化合物を化学合成および精製する方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5344928A (en) Phenothiazine derivatives, their production and use
EP0321353B1 (fr) Cryptates de terres rares, procédés d'obtention, intermédiaires de synthèse et application à titre de marqueurs fluorescents
EP0273115B1 (en) Chemiluminescent acridinium and phenanthridinium salts
JP4195200B2 (ja) ポルフィリン化合物、それらの結合体および前記結合体の使用に基づく検定方法
US5284951A (en) Hydrolytically stable chemiluminescent labels and their conjugates, and assays therefrom
FI93278B (fi) Diagnostinen analyysielementti ja fluoresoiva konjugaatti
FI90542C (fi) Kemiluminoivia akridiinijohdannaisia, niiden valmistus ja niiden käyttö luminesenssi-immunoanalyyseissä
JP3264757B2 (ja) 蛍光化合物
EP0322926B1 (en) Assays utilizing improved chemiluminescent esters, thioesters and amides
FR2500165A1 (fr) Procede et reactifs d'immunodetermination par polarisation de fluorescence utilisant des carboxyfluoresceines
JP4068137B2 (ja) ビオチニル化した化学発光性標識、結合体、測定法及び測定法キット
CN112250700B (zh) 氟硼二吡咯类蛋白质错误折叠探针Halo-BODIPY及其制备方法与应用
US4225485A (en) Chemiluminescent naphthalene-1,2-dicarboxylic acid hydrazide-labeled polypeptides and proteins
JP2023175753A (ja) 化学発光アンドロステンジオンコンジュゲート
US5338847A (en) Hydrolytically stable chemiluminescent labels and their conjugates, and assays therefrom by adduct formation
KR19990014715A (ko) 에스에이치기 표지용 시약, 그의 제조방법 및 이를 이용한 표지법
Adamczyk et al. Evaluation of chemiluminescent estradiol conjugates by using a surface plasmon resonance detector
JP3544549B2 (ja) ピリジン誘導体
Adamczyk et al. Synthesis of immunocomponents for the measurement of lead (Pb) by fluorescence polarization immunoassay
US4331808A (en) Chemiluminescent naphthalene-1,2-dicarboxylic acid hydrazide-labeled haptens
JP2526359B2 (ja) ノルトリプチリン測定方法および測定用試薬抗体
Soini et al. Influence of linker unit on performance of palladium (II) coproporphyrin labelling reagent and its bioconjugates
JP3248628B2 (ja) 化学発光性化合物およびこれを用いるアッセイ法
JP3551984B2 (ja) アクリジン誘導体
RU1833690C (ru) Способ определения антигенов или антител

Legal Events

Date Code Title Description
A300 Withdrawal of application because of no request for examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300

Effective date: 19990706