JPH05176767A - 微生物によるβ−１，４−マンナナーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 クロストリジウム・テルチウムまたは、ラク
トバシラス属に属する微生物を培地に培養し、培養物か
らβ─１，４─マンナナーゼを採取するβ─１，４─マ
ンナナーゼの製造法。 【効果】 取扱の簡易な、かつ非常に増殖速度の速い嫌
気性のマンナナーゼ生産菌を利用することによって、従
来よりも簡略化した醗酵方法によって効率的にマンナナ
ーゼを得ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微生物によるβ─１，
４─マンナナーゼの製造法に関するものである。ヘミセ
ルロースの一種であるグルコマンナンやガラクトマンナ
ンおよびそれらの誘導体は、食品工業、繊維工業、製紙
工業、金属工業等広く工業的に利用されている。特に最
近、グァーガムやローカストビーンガムなどのガラクト
マンナン系のガムはその低価格化に伴い、一般に広く工
業的に使用される様になり、食品工業での増粘剤、紙力
増強剤、捺染用糊剤以外に、土木分野での安定液掘削工
法の調質剤、シールドトンネル掘削工法の固化剤等に用
いられ、さらには、石油掘削の二次、三次回収において
も使われている。β─１，４─マンナナーゼは、捺染糊
料の糊抜き剤や土木工事での土壌汚染防止剤、石油回収
での増粘剤にもとずく目詰まり防止剤、マンナン系の廃
水処理への応用等に用いられる有用な酵素である。

【０００２】

【従来の技術】β─１，４─マンナナーゼ（以下単にマ
ンナナーゼという）は、β−１，４−マンナン、ガラク
トマンナン、グルコマンナン等のβ─１，４─Ｄ−マン
ノピランシル結合を加水分解する酵素である。マンナナ
ーゼが加水分解するものとしては、具体的には、次のよ
うなものがあげられる。

【０００３】まず、β─１，４─マンナンを含むものと
して、アイボリーナッツ（学名：フィテレファス・マク
ロカルパ）やコロゾがよく知られている。その他β─
１，４─マンナン含有植物としてはヤシ科フオエニクス
・カナリエンシス，ラン科植物のオーキス・マキュラタ
のサレップマンナンなどが知られている。ガラクトマン
ナンは、イナゴマメ（学名：ケラトニア・シリクア）お
よびグア（学名：シアモプシス・テトラゴノロブス）の
種子から得られるローカストビーンガムおよびグァーガ
ムが代表的なものであり、これらは、そのままあるいは
化学的な改質をほどこした後、工業的に広く使用されて
いる。また、ガラクトマンナンは、大豆サヤ、ケンタッ
キー・コーヒーマメ、ムラサキウマゴヤシ、クローバ
ー、コロハ、アカツメクサなどマメ科の植物にも多く含
まれている。そのほかのガラクトマンナン含有植物とし
ては、ゲニスタ・スコパリア、グレデイツシャ・フエロ
クス、レウカエナ、グラウカなどが知られている。

【０００４】グルコマンナン含有物としては、コンニャ
ク（学名：アモルフォファラス・コンニャク）が最も有
名であるが、サトイモ科のアムル根、マツ属のジャック
パイン、ユリ科植物の球根、ラン科植物の球根からつく
られるサレップ粉、ヒヤシンスの一種のブルーベル、イ
チハツの種子、アロエの葉、ヒガンバナの球根、エゾマ
ツやハリモミなどのトウヒ属の植物などが知られてい
る。そのほかのグルコマンナン含有植物としては、アス
パラガス・オフィシナリス、エレムラス・フスカス、エ
レムラス・レゲリー、エレムラス・スペクタビリス、フ
ァセオラス・アウレウスなどが知られている。

【０００５】これらを加水分解するマンナナーゼは、従
来から多くの微生物由来のものが知られている。糸状菌
の生産するマンナナーゼについては、例えば、リゾプス
・ニベウス(Rhizopus niveus)〔日本農芸化学会誌、第4
3巻、第317〜322項（1969）〕、アスペルギルス・ニガ
ー(Aspergillus niger)〔アクタ ケミカ スカンジナ
ビカ(Acta Chem.Scand.)、第22巻、第1924〜1934項（19
68）〕、アスペルギルス・タマリ(Aspergillus tamari
i）〔バイオケミカル ジャーナル（Biochem.J.) 、第
２19巻、第８57〜８63項（1984）〕において報告されて
いる。しかしながら、糸状菌は、培養日数が長くかかる
ことおよび菌株の取扱いが難しいことなどから工業的な
生産には適していない。

【０００６】放線菌では、例えばストレプトマイセス属
〔アグリカルチュラル アンド バイオロジカル ケミ
ストリー(Agric.Biol.Chem.)、第48巻、第2189〜2195項
（1984）〕において報告されている。細菌では、例え
ば、バシラス・サチリス(Bacillus subtilis）〔アグリ
カルチュラル アンド バイオロジカル ケミストリー
(Agric.Biol.Chem.)、第36巻、第99１〜1001項（197
2）；特開57-65182号公報〕やエロモナス・ヒドロフィ
ラ(Aeromonas hydrophila）〔ジャーナル オブ ザ
ファカルティ オブ アグリカルチャー キュウシュウ
ユニバーシティ(J.Fac.Agric.,Kyusyu Univ.）、第27
巻、第89〜98項（1983）〕、シュードモナス属〔生活衛
生、第32巻、第175〜181項（1988）〕で知られている。
しかしながら、これらの微生物は、比較的好気的な条件
下で増殖するため微生物を工業的に培養するには、醗酵
の曝気動力にコストを要するとともに、雑菌によるコン
タミネーションの危険性を有しており、また土木分野な
ど空気の少ない条件下で微生物を使用する分野での利用
には適していない。

【０００７】嫌気性細菌としては、例えば、バクテロイ
デス・オバータス(Bacteroides ovatus）〔ジャーナル
オブ フード バイオケミストリー(J.Food.Biochemi
stry)、第５巻、第２71〜２82項（1981）〕がグァーガ
ムを菌体外酵素によって分解することが報告されてい
る。しかし、この微生物は、厳密な嫌気的条件下で培養
しなければならないので培養方法が煩雑になる。さらに
増殖速度がおそく、酵素活性も十分でないので工業的生
産に利用するのは困難である。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上述のように微生物を
用いたマンナナーゼの製造法には、その微生物により種
々の問題点があった。そこで本発明の目的は、このよう
な問題を解決するために安価にかつ容易に培養できる微
生物を用いて、工業的利用価値の高いマンナナーゼを製
造する方法を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、マンナナ
ーゼのより簡便な工業生産を可能にするために、酸素の
ない環境下において生育する嫌気性細菌に焦点をあて、
特に病原性を持たない、安全で取扱が容易であり、かつ
増殖速度の速い嫌気性のマンナナーゼ生産菌を求めて、
土壌、嫌気活性汚泥、メタン醗酵汚泥等よりスクリーニ
ングを行った。その結果、クロストリジウム・テルチウ
ム(Clostridium tertium)がグァーガムを単一の炭素源
とした培地にて著しく増殖するとともに、収率よくマン
ナナーゼを産生することを見出した。さらに上記要件を
備えた嫌気性細菌を理化学研究所微生物系統保存施設(J
CM）保管の標準菌株の中から探索を行った結果、クロス
トリジウム・テルチウムのほかにラクトバシラス(Lacto
bacillus）属に属する微生物が該当することを知り、本
発明を完成した。

【００１０】即ち、本発明は、クロストリジウム・テル
チウムまたはラクトバシラス属に属する微生物を培地に
培養し、培養物からβ─１，４─マンナナーゼを採取す
ることを特徴とするものである。以下、本発明を具体的
に説明する。本発明に用いられるクロストリジウム・テ
ルチウムとしては、どのような菌株を用いてもよく、例
えば標準菌株のJCM 3813 (=ATCC19405= NCTC541=NCIB74
8)( 理化学研究所微生物系統保存施設保管株）が挙げら
れるが、好ましくはマンナナーゼ生産能において既知の
菌株に比べ高い活性を持つKT−5Aが挙げられる。

【００１１】KT−5Aはつくば市の蓮田土壌から分離さ
れ、その分離方法は、グァーガム(0.5％、w/v)を唯一の
炭素源とし、酵母エキス（0.01％、w/v) を含む無機塩
類培地（pH 7.0）を用いて30℃で嫌気的に集積培養を繰
り返した後、ロールチューブにてコロニーを形成させる
方法により行われた。なお、培地の還元状態形成のため
に、Ｌ−システイン─塩酸塩および硫化ナトリウムを各
0.05％(w/v) を添加し、気相は窒素置換した。

【００１２】この単離された菌株の菌学的性質は、以下
のとおりである。 １ 細胞 桿菌（0.5〜1
×3〜4μm ） ２ 胞子 先端芽胞 ３ グラム染色 陽性 ４ 運動性 有 ５ ゼラチン液化 陰性 ６ ガゼイン分解 陰性 ７ 尿素 陰性 ８ リパーゼ産生 陰性 ９ レシチナーゼ産生 陰性 １０ インドール産生 陰性 １１ 硝酸塩の還元 陽性 １２ オキシダーゼ 陰性 １３ カタラーゼ 陰性 １４ 硫化水素産生 陰性 １５ アセチルメチルカルビノール産生 陰性 １６ 血液の溶血 陰性 １７ 酸素に対する耐性 陽性 １８ キノン系 無 １９ 牛乳 凝固 ２０ エスクリン加水分解 陽性 ２１ 炭水化物の醗酵 〔陽性〕アミグダリン、アラビノース、セロビオース、
フラクトース、ガラクトース、グルコース、グリコーゲ
ン、ラクトース、マルトース、マンニトール、マンノー
ス、メリビオース、ラフィノース、リボース、サリシ
ン、スターチ、サッカロース、トレハロース、キシロー
ス 〔陰性〕アドニット、セルロース、ズルシトール、エリ
スリトール、カルボキシメチルセルロース、イノシトー
ル、イヌリン、ラムノース、ソルビトール、ソルボース この菌株の菌学的性質の検討には、微生物の分類と同定
（長谷川武治編著、東京大学出版会）および細菌学技術
叢書３嫌気性菌の分離と同定法（日本細菌学会教育委員
会編、菜根出版）に記載されている方法、培地組成を用
い、バージェーズ マニュアル オブ デターミネイテ
ィブ バクテリオロジー(Bergey's Manual of Determin
ative Bacteriology）第８版に基づいて検索しその結
果、この菌株は、クロストリジウム・テルチウムと同定
された。

【００１３】そして、このクロストリジウム・テルチウ
ムKT−5Aは通産省工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研菌寄第12685号(FERM P-12685)として寄託されてい
る。本発明に用いられるラクトバシラス属に属する微生
物としては、マンナナーゼ生産能を有するものであれ
ば、いずれでもよく、その具体例としては、例えば、ラ
クトバシラス・ガッセリー(Lactobacillus gasseri) J
CM 1131 (=ATCC33323=NCDO2233= NCIB11718) 等が挙げ
られる。

【００１４】次に、本発明において用いる微生物を培養
するに際して使用される培地としては、β−１、４−Ｄ
−マンノピラノシル結合を有するものを含有し、更に必
要により窒素源、無機塩類、ビタミン等を適量含むもの
であればよい。そしてβ─１、４−Ｄ−マンノピラノシ
ル結合を有するものとしては、従来公知の各種材料で使
用可能であり、例えば、グァーガム、ローカストビーン
ガム、スピノガム、グルコマンナン等が挙げられる。こ
れらは、精製されたものである必要はなく、それらの含
有植物体そのもの、あるいは単につぶして細かくしたも
のでもよい。培地へのこれらの含有量が多くなると、液
体培養の場合、培地の粘度が著しく高くなり、培地作成
操作や微生物の培養が難しくなるため、培地中への添加
濃度は各種材料に応じて適当に決めるのが望ましい。例
えば、グァーガム濃度として、0.１〜１％(w/v）、好ま
しくは、0.３〜0.８％(w/v）である。

【００１５】培地の窒素源としては、例えば、酵母エキ
ス、肉エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティー
プリカー、大豆粕等の有機窒素源や、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、リン
酸二アンモニウム等の無機窒素源が挙げられる。さらに
無機塩類として、例えば、カリウム塩、ナトリウム塩、
リン酸塩、マグネシウム塩、鉄塩や必要に応じて微量の
金属塩を使用することも可能である。

【００１６】これらの培地を用いてクロストリジウム・
テルチウムまたはラクトバシラス属に属する微生物、例
えば、ラクトバシラス・ガッセリーを、培養温度25〜45
℃、好ましくは30〜40℃、培地の初発pHを5.5〜9.0、好
ましくは、７.0〜８.0として嫌気的に培養すればよい。
培養時間は、培養形態等によっても異なるが、６〜20時
間培養することにより、培養物中にマンナナーゼが生産
蓄積される。

【００１７】培養は、液体培養法により、静置培養、振
とう培養、ジャーファーメンター等の嫌気培養法を用い
ることができる。通常嫌気培養法では、微生物が空気に
触れないようにするため培養容器の気相部を窒素置換
し、さらに培地中に還元剤（Ｌ−システイン─塩酸塩お
よび硫化ナトリウム）を添加しなければならないが、本
発明に用いられる微生物は、それほど厳密な嫌気的条件
を必要とせず、気相部を窒素置換するだけでよく、還元
剤を添加しなくても培養は可能であり、マンナナーゼ生
産も行われる。このため通気コントロールが不要にな
り、マンナナーゼ生産が簡略かつ容易になる。以下培地
中に還元剤を添加し、かつ気相部を窒素置換して行う培
養を嫌気培養とし、還元剤を添加せずに気相部を窒素置
換したのみの培養を微嫌気培養と定義する。

【００１８】本発明により生産されるマンナナーゼは、
既知のマンナナーゼと同じような温度安定性、至適pHを
示し、例えば、クロストリジウム・テルチウムKT−5Aの
生産するマンナナーゼは、55℃まで安定であり、またpH
５〜８の範囲で安定で、反応の至適ｐＨは６〜７付近に
ある。また、既知のマンナナーゼと同様にグァーガム、
ローカストビーンガム、グルコマンナン以外にもヒドロ
キシプロピル化したグァーガムなどにも作用する。した
がって本発明により生産されるマンナナーゼは、既知の
ものと同様なものと考えられる。

【００１９】次に、本発明を実施例により具体的に説明
する。但し、これら実施例により本発明が限定されるも
のではない。なお、実施例中のマンナナーゼ活性の測定
は、０.5％のローカストビーンガムを含む0.02Ｍリン酸
緩衝液（pH 7.0) ０.9mlに適当に希釈した培養液０.1ml
を加え、30℃に一定時間反応させた後、生じた還元糖を
ソモギー・ネルソン法にて定量した。還元糖量は、マン
ノースを標準として作成した検量線により求めた。な
お、酵素力価は、培養液１mlが１分間に１μmol の還元
糖を生成する場合を１単位とした。

【００２０】また、培地の調整において、基質として用
いたガラクトマンナンは、基本培地に加熱、溶解後、1
0,000rpm で遠心分離を行い、沈澱物を除去した上清液
を使用した。

【００２１】

【実施例１】基本培地として、第１表に示した無機塩類
培地を用い、０.5％ローカストビーンガムと０.1％酵母
エキスを含む培地１０ｍｌにて、マンナナーゼ生産活性
と菌体量の増加を調べた。培養は、加圧培養試験管（32
ml容量）に種々の調整した培地（初発pH 7.5）10mlを分
注、気相部を窒素置換後、密栓して滅菌し、さらに、Ｌ
−システイン−塩酸塩および硫化ナトリウムをろ過滅菌
しながら0.05％（w/v)となる様添加し、嫌気培養条件に
した。この調整した培地に、30℃で15〜24時間前培養し
た培養菌液０.2mlを植菌し、30℃で14〜40時間静置培養
したものについてマンナナーゼ活性と菌体量の増加を調
べた。その結果を第２表に示した。なお、菌体量の増加
は培養液の660nmにおける吸光度を測定して求めた。第
２表より、KT−5Aは、従来よりマンナナーゼ活性をもつ
嫌気性細菌として知られるバクテロイデス・オバータス
に比べて、強力なマンナナーゼ生産活性を有するととも
に、非常に速い増殖速度をもつ微生物であることがわか
る。

【００２２】

【表１】

【００２３】

【表２】

【００２４】

【実施例２】基本培地としてニュートリエントブロース
（ディフコ社製）を用い、基質として、グアーガム、ロ
ーカストビーンガム、スピノガム、グルコマンナンを各
々０.5％（w/v)加え、さらに有機窒素源として、酵母エ
キスと大豆粕抽出液を各々０.5％加えて調整した培地１
０ｍｌにて、微嫌気培養および嫌気培養法により培養を
行った場合のマンナナーゼ生産について比較した。微嫌
気培養では、培地１０ｍｌに還元剤を添加せずに試験管
気相部を窒素置換したのみの状態で培養開始した場合で
あり、嫌気培養では、還元剤Ｌ−システイン−塩酸塩お
よび硫化ナトリウムを各0.05％（w/v)培地に添加して培
養を行ったものである。30℃で14時間培養後、マンナナ
ーゼ活性を測定した。その結果を第３表に示した。第３
表より、これら嫌気性のマンナナーゼ生産菌は、還元剤
を添加しない微嫌気的な条件下からでも、嫌気条件下と
同等にマンナナーゼ生産できることがわかる。

【００２５】

【表３】

【００２６】

【実施例３】マンナナーゼの基質特異性について検討し
た。クロストリジウム・テルチウムKT−5A及びJCM 3813
とラクトバシラス・ガッセリーJCM 1131を０.5％ローカ
ストビーンガム、0.５％酵母エキス、０.5％大豆粕抽出
液を含むニュートリエントブロースで14時間培養後、培
養液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）して得ら
れた上清液９．８ｍｌについて、各基質に対する分解活
性を調べた。活性測定に用いた基質は、０.5％の各基質
を0.02Ｍリン酸緩衝液（pH 7.0) に加えたものを用い
た。その結果を第４表に示す。

【００２７】

【表４】

【００２８】

【発明の効果】上述したように本発明によれば、取扱い
の簡易な、かつ非常に増殖速度の速い嫌気性のマンナナ
ーゼ生産菌を利用することによって、従来よりも簡略化
した醗酵方法によって効率的にマンナナーゼを得ること
ができるので、本発明は産業上極めて有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 片岡 直明 東京都港区港南１丁目６番27号 株式会社 荏原製作所内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 クロストリジウム・テルチウムまたはラ
   クトバシラス属に属する微生物を培地に培養し、培養物
   からβ─１，４─マンナナーゼを採取することを特徴と
   するβ─１，４−マンナナーゼの製造法。