JPH05184373A

JPH05184373A - 抗菌ペプチドおよびそれに基づく植物耐病性

Info

Publication number: JPH05184373A
Application number: JP3134340A
Authority: JP
Inventors: Jonathan P Duvick; ピー．デュビックジョナサン; Tracy A Rood; エー．ルードトレイシー; Aragula G Rao; ジー．ラオアラグラ
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1990-06-05
Filing date: 1991-06-05
Publication date: 1993-07-27
Also published as: AU7735791A; AU642257B2; DE69132357T2; ATE195345T1; DE69132357D1; ES2150415T3; US5905187A; EP0465009A1; CA2042448A1; EP0465009B1

Abstract

(57)【要約】【目的】植物に有害な菌類および他の微生物を殺す方法
および物質を提供する。【構成】ＣＭＩＩＩ感受性の植物病原体による病気に対
する抵抗性は、抗菌量で発現しＣＭＩＩＩを生産する遺
伝子を植物細胞に挿入して生じる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、植物に有害な菌類およ
び他の微生物を殺す物質と方法、さらに植物に病気に対
する抵抗性を付与する物質と方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】多くの菌類および細菌が、一般的な農作
物の重大な有害生物となる。病気を制御する１つの方法
は、抗菌性の有機または半有機化合物を作物に適用する
ことであった。この方法は、多くの、当該技術上に知ら
れた問題を有する。有害微生物の制御のより新しい方法
は生物学的な制御生物の使用であり、その生物は典型的
には問題となる微生物の天然の拮抗者または阻害者であ
った。しかし、広い地域に生物学的な制御生物を適用す
ることは困難であり、そしてそのような生きている生物
を処理地域に長い時間留まらせるのはさらに困難であ
る。さらに最近、組換えＤＮＡの技術により、抗菌化合
物を発現するクローン化された遺伝子を植物細胞に挿入
する機会が与えられた。この技術は、特に強い淘汰圧に
直面した場合、よく知られた、自然に見いだされる、抗
菌物に対して起こり得る微生物の抵抗性についての心配
をさらに引き起こした。このことは、幾つかの地域で起
こり得る。従って、単一の構造遺伝子の翻訳によって直
接に植物細胞により作られることが可能な、天然に見い
だされる抗菌化合物を同定することが、継続して必要と
なっている。

【０００３】米国特許出願第７２５，３６８号にもとづ
く欧州特許出願第２０４，５９０号には、ヘテロの外来
構造遺伝子の発現を制御するために植物細胞を遺伝子的
に改変する方法が記述されている。その方法において、
植物細胞はｐＲｉのＴ‐ＤＮＡプロモーターおよびヘテ
ロ外来構造遺伝子を含むように形質転換されており、プ
ロモーターおよび構造遺伝子は、お互いに、構造遺伝子
がプロモーターの制御のもと植物細胞において発現し得
るような位置および方向にある。

【０００４】同様に、米国特許出願第６８５，８２４号
に基づく欧州特許出願第１８６，４２５号は、（ａ）Ｔ
‐ＤＮＡボーダー配列が両側に隣接した転写ユニットで
あって、プロモーターと、それに結合するアミノ末端領
域をコードする配列群と、ターミネーターシグナル配列
とを包含し、その配列は植物細胞で天然に発現する１つ
以上の遺伝子に由来する。および（ｂ）プロモーターお
よびそれに結合性した、アミノ末端領域をコードする配
列と、ターミネーター配列との間に位置する抗菌の抵抗
性遺伝子をコードする配列、さらに（ｃ）アグロバクテ
リウムにおいて機能的である複製単位を含むＤＮＡ断
片、を包含する組換えＤＮＡ発現ベクターについて記載
している。

【０００５】米国特許第１６８，１０９号に基づくＰＣ
Ｔ出願第８８０７０８７号は、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓポリ
ヘドリンプロモーターと、抗菌活性を持ち得るヘテロペ
プチドまたはタンパクをコードするヌクレオチド配列と
を包含する組換えウィルス発現システムを開示してい
る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、植物に有害
な菌類および他の微生物を殺す物質と方法、さらに植物
に病気に対する抵抗性を付与する方法を提供することを
目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】小さな、塩基性のトウモ
ロコシの種子ペプチドＣＭＩＩＩは、一般の植物病原体
に対して強い抗菌活性を有することがこれまでに確認さ
れている。ＣＭＩＩＩは特に、植物病原性菌Sclerotini
a、および、トウモロコシ種子病原体Fusariumgraminear
umに対して活性がある。

【０００８】従って、本発明は、生物の環境に抗菌量の
ＣＭＩＩＩを導入する工程を包含する、選択された微生
物を含む植物病原体を殺す方法を提供する。ＣＭＩＩＩ
は、スプレー、粉剤または抗菌技術として一般的な他の
処方によって微生物に感染した植物に効果的に適用され
得る。他には、ＣＭＩＩＩは病気を受け易い植物内に取
り込まれ、その結果植物に感染する過程において、病原
体は抗菌量のＣＭＩＩＩに曝される。これを行う１つの
方法は、病気を受け易い植物への全体投与に適する非植
物毒性の担体にＣＭＩＩＩを取り込ませることである。
この方法は、かみ砕く害虫を攻撃するために考案され、
殺虫剤および殺幼虫剤の製剤の当業者の範囲内にある殺
虫性物質について、一般的に使われる。しかし、ＣＭＩ
ＩＩをコードする遺伝子は、単離され、クローン化さ
れ、適当な発現カセットに挿入され、さらに病気を受け
易い植物種の細胞に移入され得るので、この方法の特に
好適な実施態様は、転写イニシエーターおよび植物にお
いて活性なプロモーター配列と共に、正しい読み取り枠
においてＣＭＩＩＩをコードするＤＮＡ配列を植物のゲ
ノムに挿入することを含む。調節配列の制御のもとで
の、ＤＮＡ配列の転写と翻訳の結果、病原体によって正
常に感染した植物の組織中で、ＣＭＩＩＩの抗菌量を与
えるレベルでの、ＣＭＩＩＩタンパク配列が発現され
る。

【０００９】植物は、好ましくは、１種以上のFusarium
graminearum、Fusarium moniliforme、Aspergillus fl
avus、Alternaria longipes、Sclerotinia sclerotioru
m、およびSclerotinia trifoliorumによる感染と、損傷
に感受性のある植物である。これらはトウモロコシ(Zea
mays)およびモロコシ(Sorghum bicolor)を含む。しか
し、これは限定して解釈されるべきではない。なぜなら
ば、これらの種は確実に形質転換し再生するに最も困難
な商業作物の１つであり、そしてこれらの微生物は他の
作物にも感染する。従って本発明の方法は従来の技術に
より多くの植物種に、もしそれらが上述の植物有害生物
に感受性であることが知られるならば、容易に適用でき
る。それらには、限定はしないが、以下に述べる属由来
の種が含まれる。その属とは、Fragaria、Lotus、Medic
ago、Onobrychis、Trifolium、Trigonella、Vigna、Cit
rus、Linum、Geranium、Manicot、Daucus、Arabidopsi
s、Brassica、Raphanus、Sinapis、Atoropa、Capsicu
m、Datura、Hyoscyamus、Lycopersionn、Nicotiana、So
lanum、Petunia、Digitalis、Majorana、Cichorium、He
lianthus、Lactuca、Bromus、Asparagus、Antirrhinu
m、Hemerocallis、Nemesia、Pelargonium、Panicum、Pe
nnisetum、Ranunculus、Senecio、Salpiglossis、Cucum
is、Browallia、Glycine、Lolium、Triticum、およびDa
turaである。

【００１０】本発明の方法に従って形質転換される好適
な植物は、トウモロコシ、ライ麦、大麦、小麦、モロコ
シ、カラス麦、キビ、米、トリティケール(tritical
e)、ヒマワリ、アルファルファ、菜種および大豆を含む
穀類である。

【００１１】発現した時に抗菌活性を与えるＤＮＡ配列
はここで述べたようにＣＭＩＩＩをコードする構造遺伝
子である。一般的に、本発明の目的は植物が感受性の微
生物に抵抗性を与えることであるので、幾つかの場合に
おいてＣＭＩＩＩは植物に本来あるものではない。即
ち、ＣＭＩＩＩ遺伝子は、形質転換される植物とは他の
種由来となる。しかし、抗菌量よりも低い量でＣＭＩＩ
Ｉを生産する種においては、ＣＭＩＩＩが過剰生産され
るために、強力な構成的プロモーターの制御下にあるＣ
ＭＩＩＩの遺伝子を挿入することが好適であり得、この
結果抗菌レベルが達成され、効果的な病気に対する抵抗
性が与えられる。他方、植物がＣＭＩＩＩを生産する
が、病気によって通常影響される組織中でＣＭＩＩＩが
生産されず或はそこに分配されないところでは、組織特
異的プロモーターが、ＣＭＩＩＩの局在化した発現また
は過剰生産を提供するために使用され得る。組織特異的
プロモーターは、感染した組織またはＣＭＩＩＩの生産
が有効な組織にＣＭＩＩＩの生産を局在化することが望
ましいあらゆる場合に使用され得る。

【００１２】本発明の実施においてＣＭＩＩＩをコード
するＤＮＡ配列は従来の手法によって得ることができ、
その後遺伝子は適当な制限酵素の使用によって取り出さ
れ、選ばれた植物発現カセットに継ぎ入れられ得る。他
方、精製されたＣＭＩＩＩは既知の方法を用いてその全
体を配列決定することができ、その後適当なアミノ酸配
列をコードする合成ＤＮＡ配列が調製され得、この合成
配列は適当な植物発現カセットに挿入され得る。

【００１３】同様に多くの植物発現カセットおよびベク
ターが、当該分野においてよく知られている。”発現カ
セット”という用語は、イニシエーション、プロモータ
ーおよび終止配列を含み、これらが正しい読み取り枠に
おいて構造遺伝子に隣接する時植物細胞において機能す
る制御配列の完全なセットを意味する。発現カセットは
しばしばそして好適に、開裂およびあらゆる所望の構造
遺伝子の挿入に適した、制限部位の組み合せを含む。ク
ローン化された遺伝子は、構造配列の正しい読み取り枠
の中に開始コドンを有することが重要である。さらに、
植物発現カセットは、好ましくは、一端に、高頻度で遺
伝子の転写を起こす強力な構成的プロモーター配列を含
み、さらに他端に、メッセンジャーＲＮＡの正しいプロ
セシングと輸送のためのポリ‐Ａ認識配列を含む。本発
明のｃＤＮＡが挿入され得るこのような好適な（空の）
発現カセットの例は、ＰｉｏｎｅｅｒＨｉ‐Ｂｒｅｄ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．、Ｊｏｈｎｓｔ
ｏｎ、ＩＡのＢｅａｃｈらによって開発されたｐＰＨ４
１４プラスミドである。より好適な植物発現カセット
は、カナマイシン抵抗性または除草剤耐性遺伝子のよう
な１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むように設
計される。

【００１４】ここで”ベクター”という用語は、複製可
能で、宿主細胞において外来遺伝子を発現し得るＤＮＡ
配列を意味する。典型的に、ベクターは、適当な酵素の
使用によって予め決められた様式で切断され得る、１つ
以上のエンドヌクレアーゼ認識部位を有する。このよう
なベクターは、好ましくは抗生物質または除草剤抵抗性
を与える構造遺伝子配列をさらに含むように構築され、
これは形質転換された細胞を同定し分離するマーカーと
して働く。好適な標識／選択試薬は、カナマイシン、ク
ロロスルフロン、ホスホノトリシン、ハイグロマイシン
およびメトトレキセートを含む。ベクター中の外来遺伝
子物質が機能的に発現する、ベクターによって”形質転
換”された細胞は、”形質転換体”と呼ばれる。

【００１５】特に好適なベクターは、プラスミドであ
り、これは細胞の染色体の一部ではない環状二本鎖ＤＮ
Ａ分子を意味する。

【００１６】上述のように、目的の遺伝子をコードする
ｃＤＮＡおよびゲノムが本発明において使用され得る。
目的のベクターもまた、一部にはｃＤＮＡクローンから
そして一部にはゲノムクローンから構築され得る。目的
の遺伝子が単離された後、宿主細胞において遺伝子の有
効な発現を提供する、必要な調節配列を含む遺伝子が構
築される。本発明に従い、遺伝子の構築は、（ａ）目的
のタンパクまたは形質をコードする最初の遺伝子配列、
および（ｂ）目的の構造遺伝子の一方に機能し得るよう
結合した１つ以上の調節配列を含む。典型的には、調節
配列は、プロモーターおよびターミネーターを含むグル
ープから選択される。調節配列は自己のまたはヘテロの
起源由来で有り得る。

【００１７】遺伝子配列において使用され得るプロモー
ターは、ｎｏｓ、ｏｃｓおよびＣａＭＶプロモーターを
含む。

【００１８】使用され得る効果的な植物プロモーターは
過剰生産性の植物プロモーターである。本発明において
使用され得る過剰生産性の植物プロモーターは、大豆由
来のリブロース‐１，５‐バイホスフェートカルボキシ
ラーゼの小サブユニット（ｓｓ）のプロモーター（Ｂｅ
ｒｒｙ‐Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄ
Ａｐｐ．Ｇｅｎ．、１：４８３‐４９８（１９８
２））、およびクロロフィルａ‐ｂ結合タンパクのプロ
モーターを含む。これら２つのプロモーターは真核性の
植物細胞において、光誘導性として知られている。例え
ば、ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＰｌ
ａｎｔｓ、ＡｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＰｅｒｓｐ
ｅｃｔｉｖｅ、Ａ．Ｃａｓｈｍｏｒｅ、Ｐｅｌｈａｍ、
ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８３、ｐｐ．２９‐３８、Ｇ．
Ｃｏｒｕｚｚｉら．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５
８：１３９９（１９８３）、およびＰ．Ｄｕｎｓｍｕｉ
ｒら．、Ｊ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＡｐｐ．Ｇ
ｅｎ．、２：２８５（１９８３））に記載されている。

【００１９】所望の制御配列に機能し得るように結合し
たＣＭＩＩＩの構造遺伝子を含有する発現カセットは、
適当なクローニングベクターに連結され得る。一般的
に、宿主細胞と共存できる種由来の複製および制御配列
を含む、プラスミドまたはウィルス（バクテリオファー
ジ）ベクターが使用される。クローニングベクターは典
型的には、複製起点および形質転換された宿主細胞中で
の表現型選択マーカーを与え得る特定の遺伝子を有す
る。典型的には、抗生物質または選ばれた除草剤に対す
る抵抗性を与える遺伝子が使用される。遺伝子物質が標
的細胞に移入された後に、うまく形質転換された細胞お
よび／または細胞のコロニーがこれらの標識に基づく選
択により単離され得る。

【００２０】典型的には、中間体宿主細胞が、本発明の
実施においてクローニングベクターのコピー数を増加さ
せるために使用される。コピー数が増加すると、目的の
遺伝子を含むベクターは、所望の植物細胞に導入される
ために有意な量だけ単離され得る。本発明の実施におい
て使用され得る宿主細胞は、E.coli、Ｓ．typhimuriu
m、およびSerratia marcescensを含む原核生物を包含す
る。イーストまたは糸状菌のような真核性宿主もまた本
発明に使用され得る。これらの宿主もまた微生物である
ので、細菌においてＣＭＩＩＩの発現を引き起こさない
植物プロモーターがベクターとして使用されることを確
かめる必要がある。

【００２１】単離されたクローニングベクターは、好適
な技術を用いて植物細胞に移入される。この技術にはエ
レクトロポレーション（プロトプラストにおける）、レ
トロウィルス、衝撃法、および微量注入法が含まれ、細
胞または組織培養における単子葉または双子葉植物由来
の細胞に移入され、植物発現カセットのＤＮＡ配列の少
なくとも１コピーを外来ＤＮＡとして含む形質転換され
た植物細胞が提供される。好ましくは、単子葉植物種は
トウモロコシ、モロコシ、小麦および米から選択され、
双子葉植物種は大豆、アルファルファ、タバコおよびト
マトから選択される。既知の技術を用いて、プロトプラ
ストが再生され得、細胞または組織の培養物が、ＣＭＩ
ＩＩの遺伝子を有し発現する完全稔性植物を形成するよ
うに再生され得る。従って、本発明のより好適な実施態
様は、形質転換されたトウモロコシ植物であり、その細
胞は、外来ＤＮＡとして本発明の発現カセットのＤＮＡ
配列の少なくとも１コピーを含む。

【００２２】最後に、本発明は、Fusarium graminearu
m、Fusarium moniliforme、Aspergillus flavus、Alter
naria longipes、Sclerotinia sclerotiorum、およびSc
lerotinia trifoliorumから選択される微生物によって
引き起こされる病気に対する抵抗性を、病気に感受性の
分類群の植物に付与する方法を提供するもので、以下の
ａ）、ｂ）およびｃ）の工程を包含する：ａ）分類群から選ばれた少なくとも１つの植物由来の細
胞または組織を培養する工程；ｂ）細胞においてＣＭＩＩＩ構造遺伝子の発現を引き起
こす植物調節配列に機能し得るように結合した、ＣＭＩ
ＩＩの構造遺伝子を含有する発現カセットの少なくとも
１コピーを、細胞または組織培養物の形態の細胞に導入
する工程；およびｃ）細胞または組織培養物から、病気に抵抗性のある完
全な植物を再生する工程。

【００２３】ひとたび完全な植物が得られると、それら
は発現カセットとして与えられる配列の少なくとも１コ
ピーが再生産の子孫の細胞中に存在するような方法で、
性的またはクローン的に再生産され得る。

【００２４】また、ひとたび単一の形質転換された植物
が、前述の組換えＤＮＡ法により得られると、交配およ
び戻し交雑をによってＣＭＩＩＩ構造遺伝子および結合
した調節配列を転移するために、従来の植物育成法が使
用され得る。このような仲介の方法は、以下のａ）、
ｂ）およびｃ）の工程をさらに包含する：ａ）病気に抵抗性のある植物を病気に感受性の分類群由
来の植物と性的にかけ合わせる工程；ｂ）かけ合わせの子孫から生殖性物質を回収する工程；
およびｃ）生殖性物質から病気に抵抗性のある植物を育成する
工程。

【００２５】所望のまたは必要な場合、病気に感受性の
分類群の農業形質は、ａ）およびｂ）の工程をさらに反
復して含む拡大された方法によって、実質的に保存され
得る：ａ）病気に抵抗性のある子孫を病気に感受性の分類群由
来の病気に感受性の植物と戻し交雑すること；およびｂ）病気に感受性の分類群の特徴が、抗菌活性を付与す
る遺伝子を有する子孫中に所望の割合で存在するまで、
戻し交雑の子孫の中から抗菌活性（または結合したマー
カー遺伝子）の発現を選択すること。

【００２６】ここで、”分類群”という用語は、属また
はそれ以下の植物学上の分類の単位を意味する。従って
それは、属、種、栽培品種、品種、変種、および一貫し
た命名法が欠如した他の少数の分類上のグループを含
む。

【００２７】ここで提供された植物ベクターはAgrobact
erium tumefaciensに取り込まれ、その後それが、主と
して双子葉植物種由来の感受性の細胞にベクターを転移
するために用いられ得ることも、当業者に認められるこ
とである。従って、本発明は、そのプラスミドが本発明
の植物発現カセットを含むように改変されたAgrobacter
ium tumefaciensで、細胞を感染することによって発現
カセットが細胞に導入されるAgrobacterium tumefacien
s感受性の双子葉植物に、抗菌活性および病気に対する
抵抗性を付与する方法を提供する。

【００２８】

【実施例】次の記述は本発明の組成物とそれらを製造し
使用する方法を例示している。しかし、当業者によって
同等であると知られている他の方法も使用され得るの
は、理解されるところである。

【００２９】（実施例１）［ＣＭＩＩＩの精製］ＣＭＩＩＩを、一般のトウモロコ
シ品種Ｂ３７および専売トウモロコシ品種ＭＨ１８の２
つの起源から次のようにして得た：ひいたトウモロコシ
の種子を室温で０．１ＮＨ₂ＳＯ₄で抽出した。得られた
抽出液を中性化し、遠心分離して不溶物を取り除いた。
抽出液をｐＨ５．２に調整し、Ｏ．３Ｍの酢酸アンモニ
ウム中で平衡化したカルボキシメチルセルロースカチオ
ン交換カラムでクロマトグラフィーにかけ、０．４から
１．０Ｍの酢酸アンモニウムの勾配で溶離した（図
１）。ＣＭＩＩＩは、同様の大きさと性質の他のペプチ
ドも含む、一連のＡ２８０のピーク中において、およそ
０．８Ｍで溶離した。

【００３０】ＣＭＩＩＩは、酢酸アンモニウムの同様の
勾配で、Ｍｏｎｏ‐Ｓカチオン交換ＦＰＬＣカラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ社製）のクロマトグラフィーでも精製
し得た。図２においてピークＭＳ‐１６はＣＭＩＩＩに
相当する。

【００３１】ＣＭＩＩＩは、逆相ＨＰＬＣカラム
（Ｃ₁₈、０．１％ＴＦＡで平衡化；アセトニトリル１０
〜４０％勾配／０．１％ＴＦＡ）から単一の主要ＵＶ吸
収ピークとして溶離し、このことは不純物のタンパクま
たはペプチドが実質的にないことを示している。

【００３２】（実施例２）［ＣＭＩＩＩの特性付け］ＣＭＩＩＩは、ＳＤＳ‐尿素
およびＳＤＳ‐ＴＲＩＳ‐トリシンの両者のポリアクリ
ルアミドゲル系において単一のクーマシーブルー染色バ
ンドとして移動し、相対的な移動性から４０００ダルト
ンの分子量であることが示された。アミノ酸分析によ
り、アルギニン（１０残基／モル）、グルタミン酸／グ
ルタミン（７残基／モル）およびシステイン（４残基／
モル）の高い比率が示された。

【００３３】トリプトファンは、アミノ酸分析によって
検出されないが、Ｎ‐ブロモスクシンイミドで定量的に
酸化することによって検出された（およそ１残基／モ
ル）。円偏向二色性スペクトルは高いα‐らせん形の含
有を示している。

【００３４】最初にＣＭＩＩＩの２４個のＮ末端を、Ｔ
ＲＩＳ‐トリシンＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルからイモビロン
（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）Ｐポリビニリジンフルオライド
膜にブロット化されたペプチドの配列決定により同定し
た。さらに、ＣＭＩＩＩの５つのエンド‐Ｇｌｕｃ‐Ｃ
断片を逆相ＨＰＬＣで精製し、配列決定し、そして試験
的にペプチド配列を全３４残基まで拡大して確認し、お
よそ３９００ダルトンの全分子量を得た。ＣＭＩＩＩは
試験的な配列Ａｒｇ‐Ｓｅｒ‐Ｇｌｙ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｙ
‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓ‐Ａｒｇ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｎ‐Ｃｙｓ‐
Ｌｅｕ‐Ａｒｇ‐Ａｒｇ‐Ｈｉｓ‐Ｇｌｕ‐Ｇｌｙ‐Ｇ
ｌｎ‐Ｐｒｏ‐Ｔｒｙ‐Ｇｌｕ‐Ｔｈｒ‐Ｇｌｎ‐Ｇｌ
ｕ‐Ｃｙｓ‐Ｍｅｔ‐Ａｒｇ‐Ａｒｇ‐Ｃｙｓ‐Ａｒｇ
‐Ａｒｇ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｙを有する。

【００３５】この分析から、ＣＭＩＩＩは構造的に単子
葉植物チオニン類（ｔｉｏｎｉｎｓ）のいずれとも異な
ることが分かる。チオニン類はＣＭＩＩＩとは異なって
リシンに富んでおり、アルギニンが少ない。ＣＭＩＩＩ
は、驚くべきほど、哺乳類の抗菌ペプチドであるウサギ
由来のデフェンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎ）ＮＰ１に類似
しているが、ＣＭＩＩＩはグルタミン酸に非常に富んで
おり、６個ではなく４個のシステインを有する。アルギ
ニンおよびグルタミン酸／グルタミンに富んでいるが、
システインが欠如しているカボチャの種子（Ｎａｉｓｂ
ｉｔｔら．、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１９８８、
８８：７７０）から得られる塩基性のペプチドに若干類
似している。

【００３６】ＣＭＩＩＩはＣＤ，ＵＶ吸収および蛍光ス
ペクトルによってさらに特徴づけられ、これは図４、図
５および図６に示すとおりである。

【００３７】（実施例３）［ＣＭＩＩＩ遺伝子の同定および細菌への挿入］ＣＭＩ
ＩＩのアミノ酸配列は、下位のオリゴヌクレオチドプロ
ーブの合成による構築に従い易い、いくつかの伸張を含
む；１つの例は、残基２０〜２６位（Ｔｒｙ‐Ｇｌｕ‐
Ｔｈｒ‐Ｇｌｎ‐Ｇｌｕ‐Ｃｙｓ‐Ｍｅｔ‐Ａｒｇ）
で、ヌクレオチド配列ＴＧＧＧＡＲＡＣＮＣＡＲＧ
ＡＲＴＧＹＡＴＧＭＧによってコードされる。ここ
でＹ＝ＴまたはＣ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｍ＝ＡまたはＣ、
およびＮ＝ＡまたはＧまたはＴまたはＣである。他に重
なっている範囲は、残基１５〜２１位（Ｈｉｓ‐Ｇｌｕ
‐Ｇｌｙ‐Ｇｌｎ‐Ｐｒｏ‐Ｔｒｙ‐Ｇｌｕ‐Ｔｈｒ）
で、これは以下によってコードされ得る：ＣＡＹＧＡ
ＲＧＧＮＣＡＲＣＣＮＴＧＧＧＡＲＡＣ。これら
のオリゴヌクレオチドは³²Ｐで末端がラベルされてお
り、トウモロコシのゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングするのに使用される。両方のプローブ
にハイブリダイズするクローンはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＫＳ＋のような適当な一本鎖ファージベクターにサブ
クローン化され、クローン化したＤＮＡにおける制限酵
素部位の地図が作成され、ＣＭＩＩＩ遺伝子に相当する
領域は、オリゴヌクレオチドをプローブとして用いた制
限酵素断片のサザンハイブリダイゼーションにより同定
される。ＣＭＩＩＩ遺伝子領域はサブクローン化され、
配列決定されることにより、同一性が確かめられタンパ
ク合成のオープンリーディングフレームが決定される。
最後に、制限酵素部位を位置指向性突然変異誘発によっ
てオープンリーディングフレームの一方に作り、遺伝子
が植物発現カセットに導入され得るようにする。

【００３８】一方で、もちろん、完全な合成遺伝子が、
ここで得られたＣＭＩＩＩタンパクに対する配列から構
築され得る。

【００３９】（実施例４）［植物中のＣＭＩＩＩ遺伝子の発現］Ｂｅａｃｈらによ
って開発された調節配列を使用する、ＣＭＩＩＩ遺伝子
を含む植物発現カセットが構築される。ｐＰＨ４１４と
命名された、好ましいプラスミドの制限酵素切断地図を
図１に図示する。このプラスミドは、−４２１位から−
９０位まで縦に二重化された領域を有するヌクレオチド
−４２１位から＋２位まで広がったカリフラワーモザイ
クウィルスの強化された３５Ｓプロモーター、タバコモ
ザイクウィルスの５’リーダー配列に広がるｐＪＩＩ１
０１由来の７９ｂｐＨｉｎｄＩＩＩＳａｌ１断片、ト
ウモロコシＡｄＨ１‐Ｓ由来の第一イントロンに広がる
５７９ｂｐ断片、およびｐＴｉＴ３７中のノパリンシン
ターゼ由来のポリアデニレーション部位に広がる２８１
ｂｐ断片を含む。

【００４０】発現カセットとして使用され得るもう１つ
の構築物は、図２に示されるｐＰＨＩ４１２プラスミド
である。これはＡｄＨのイントロンセグメントを欠いて
いるという点においてｐＰＨＩ４１２と異なる。しか
し、これは、ｐＰＨＩ４１４のように、Ｏ’セグメント
とＮＯＳセグメントの間に多くの制限酵素部位を持つよ
うに構築され、これらの部位はＣＭＩＩＩ構造遺伝子を
位置に置いて継ぐために好適に使用され得る。

【００４１】このベクターは、抗生物質抵抗性に対する
選択可能なマーカーを含む類似のプラスミドと共にエレ
クトロポレーションによってブラックメキシカンスウ
ィートコーンのプロトプラストに同時形質転換され得
る。その後、これらのプロトプラストは従来の技術によ
って、細胞壁を再生し、カルスに発育するように誘導さ
れ得る。その後、同様に、このカルスは形質転換された
コロニーを選択するための抗生物質の選択を受け得、そ
してこれらのコロニーは、既知の方法を用いて適当なＣ
ＭＩＩＩに対する抗血清の使用によりＣＮＩＩＩの発現
をテストされ得る。防護の効果は、カルス（またはカル
ス由来の懸濁培養物）を標的の微生物で感染させ、およ
び生き残った割合を測定することにより測定され得る。

【００４２】ＣＭＩＩＩ遺伝子は、ブラックメキシカ
ンスウィートに使ったのと同様の方法で、胚形成トウ
モロコシカルスに移入され得る。胚形成カルスは完全な
稔性植物に再生され得る。ＣＭＩＩＩの内在性の生産に
よって付与された抗菌活性および病気に対する抵抗性
は、単純に受け継がれ、これは優性素質であり、もし望
むならば単純な交配または戻し交雑によって他の植物変
種に導入され得る。

【００４３】ここで使用したように、”抗菌量”という
用語は、標的の生物に対して測定した時の、ＣＭＩＩＩ
の少なくともＬＤ₅₀値を意味する。

【００４４】（実施例５）［ＣＭＩＩＩに対する微生物の感受性］植物病原性菌類
に対する胞子発芽アッセイおよび菌糸成長アッセイにお
いて、ＣＭＩＩＩは、１１２μｇ／ｍＬの濃度で、Fusa
rium graminearum、Sclerotinia sclerotiorum、および
Sclerotinia trifoliorumに対して抑制活性を有するこ
とが分かった。Fusarium moniliformeおよびAspergillu
s flavusを含む他の菌類は、この濃度で、僅かに抑制さ
れた。ＣＭＩＩＩ活性は、植物細胞抽出物の存在下で、
実質的に減少した。

【００４５】およそ１５０個の分生子またはおよそ５か
ら２０個の菌糸の断片を、マイクロタイタープレートウ
ェル中の９０マイクロリッターの培養倍地でインキュベ
ートした。培養培地は、０．２５％のイースト抽出物、
０．１％のカゼイン加水分解物、１％のグルコース、
０．０２５％の硝酸カルシウム、０．００５％のリン酸
カリウム、および０．００６２５％の硫酸マグネシウム
を有する肉汁培地であった。テスト濃度のペプチドを、
水またはバッファー中の１０マイクロリッター加え、プ
レートを２８℃で１から３日インキュベートした。イン
キュベーション期間の終わりに、ウェルを検査し、菌糸
の成長を以下のようにコントロールのウェルに対して点
数化した：０＝抑制なし１＝僅かに抑制２＝中程度抑制３＝ほとんど完全に抑制４＝完全に抑制このような研究の１つの結果を図３に示す。

【００４６】他の研究において、Alternaria longipes
が、ＣＭＩＩＩの作用に対して最も敏感な菌であること
が分かり、１．９マイクロモルで、注目すべき抑制を示
した。Aspergillus flavusは最も抵抗性があり、１２２
マイクロモルで僅かな抑制を示した。トウモロコシ種子
の病原菌であるFusarium graminearumおよびFusariummo
niliformeは３．８マイクロモルまで低濃度で注目すべ
く抑制されたが、しかしF.moniliformeは１２２マイク
ロモルでさえも完全には抑制されなかった。Sclerotini
a分離株は、高濃度では強力に抑制されたが、しかし低
濃度（S.sclerotiorumに対しては３０．４マイクロモル
より低く、S.trifoliorumに対しては１５．２マイクロ
モルより低い濃度）では抑制が観察されなかった。

【００４７】さらに他の研究において、A.longipesは３
μＭでＣＭＩＩＩに影響されなかった。

【００４８】要約すると、抑制様式は病原体の種類によ
って異なるが、ＣＭＩＩＩは広範囲の植物病原体に対し
て抑制活性を有する。

【００４９】

【発明の効果】本発明によれば、ＣＭＩＩＩは広範囲の
植物病原体に対して抑制活性を有する。好適な実施態様
においては、ＣＭＩＩＩに感受性の植物病原体によって
引き起こされた病気に対する抵抗性が、その発現がＣＭ
ＩＩＩの抗菌量の生産を引き起こす遺伝子を、植物の細
胞に挿入することによって生み出される。ただし、抑制
活性は病原体の種類によって異なる。

【００５０】

【配列表】

【００５１】

【配列番号：１】配列の長さ：３４トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Arg Ser Gly Arg Gly Glu Cys Arg Arg Gln Cys Leu Arg Arg His Glu 1 5 10 15 Gly Gln Pro Try Glu Thr Gln Glu Cys Met Arg Arg Cys Arg Arg Arg 20 25 30 Gly Gly

【００５２】

【配列番号：２】配列の長さ：８トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００５３】

【配列番号：３】配列の長さ：８トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１および２に記載したように粗植物抽出
物のセルロースクロマトグラフィーの結果を示すグラフ
図である。

【図２】実施例１および２に記載したように粗植物抽出
物のＦＰＬＣ精製の結果を例示するグラフ図である。

【図３】単一の微生物抑制実験からのデータを示すグラ
フ図であり、実施例５に記載したように抑制率は、ペプ
チドを含まないコントロールのウェルに対する点数とし
て示している。

【図４】ＣＭＩＩＩのＣＤを示している。

【図５】ＣＭＩＩＩの吸収を示している。

【図６】ＣＭＩＩＩの蛍光スペクトルを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 5/10 15/29 ＺＮＡ // Ｃ０７Ｋ 7/10 8318−4Ｈ 15/10 8619−4ＨＣ０７Ｋ 99:00 (72)発明者ジョナサンピー．デュビックアメリカ合衆国ポークカウンティ，アイオワ 50310，デモイン， 38ティーエイチストリート 1707 (72)発明者トレイシーエー．ルードアメリカ合衆国ポークカウンティ，アイオワ 50310，デモイン，アリソンアベニュー 4333 (72)発明者アラグラジー．ラオアメリカ合衆国ポークカウンティ，アイオワ 50322 アーバンデール， 70 ティーエイチプレイス 4628

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＣＭＩＩＩに感受性の植物病原性の微生物
を殺し、抑制する方法であって、病原性の微生物の環境
に抗菌量のＣＭＩＩＩを導入する工程を包含する、方
法。
【請求項２】Fusarium graminearum、Fusarium monilif
orme、Aspergillusflavus、Alternaria longipes、Scle
rotinia sclerotiorumおよびSclerotiniatrifoliorumで
なる群から選択される植物病原体を殺し抑制する方法で
あって、病原性の微生物の環境に抗菌量のＣＭＩＩＩを
導入する工程を包含する、方法。
【請求項３】前記病原体の環境が生きている植物の組織
である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記ＣＭＩＩＩが前記植物にもともと存在
しない、請求項３に記載の方法。
【請求項５】Fusarium graminearum、Fusarium monilif
orme、Aspergillusflavus、Alternaria longipes、Scle
rotinia sclerotiorum、およびSclerotiniatrifoliorum
でなる群から選択される病原体による感染に対して植物
を保護する請求項２に記載の方法であって、病原体によ
って正常に感染する植物の組織に、ＣＭＩＩＩをコード
する配列を、植物において活性な転写イニシエーターお
よびプロモーター配列に関して正しい読み取り枠で、該
植物のゲノムに挿入し、該植物の組織においてＣＭＩＩ
Ｉの抗菌量を与えるレベルで、ＣＭＩＩＩ配列の発現を
引き起こす工程を包含する、方法。
【請求項６】前記ＣＭＩＩＩが前記植物にもともと存在
しない、請求項５に記載の方法。
【請求項７】前記植物が小麦、米、モロコシから選択さ
れる単子葉植物種から選択される、請求項５に記載の方
法。
【請求項８】さらに以下のａ）、ｂ）およびｃ）の工程
を包含する、請求項５に記載の方法：ａ）前記植物由来の細胞または組織を培養する工程、ｂ）該細胞または組織の培養物の細胞に、ＣＭＩＩＩを
コードする配列を有する発現カセットの少なくとも１種
のコピーを導入する工程、およびｃ）該細胞、または組織培養物由来の保護された全植物
体を、再生させる工程。
【請求項９】前記発現カセットによって与えられた配列
の少なくとも１種のコピーが、前記再生産による子孫の
細胞に存在するような方法で、性的にまたはクローン的
に全植物体を再生産する工程をさらに包含する、請求項
８に記載の方法。
【請求項１０】前記発現カセットがエレクトロポレーシ
ョンによって前記細胞に導入される、請求項８に記載の
方法。
【請求項１１】前記発現カセットがミクロ粒子衝撃法に
よって細胞に導入される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】前記発現カセットが微量注入法によって
細胞に導入される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】Agrobacterium tumefaciensに感受性の
ある双子葉植物に、微生物に対する抵抗性を与える、請
求項８に記載の方法であって、該双子葉植物に、Agroba
cterium tumefaciensで該細胞を感染させることによっ
て、前記発現カセットが該細胞に導入され、該Agrobact
erium tumefaciensのプラスミドが該発現カセットを含
むように改変されている、方法。
【請求項１４】Fusarium graminearum、Fusarium monil
iforme、Aspergillus flavus、Alternaria longipes、S
clerotinia sclerotiorum、およびSclerotinia trifoli
orumでなる群から選択される植物病原体によって引き起
こされる病気に対する抵抗性を、それらの病気に感受性
のある分類群の植物に付与する方法であって、以下の
ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の工程を包含する方法：ａ）性的に交配できる植物由来であり、請求項８に記載
の方法によって調製され、繁殖力があり、病気に対して
抵抗性のある植物を選択する工程；ｂ）病気に対して抵抗性のある該植物を、病気に感受性
の分類群由来の植物と性的にかけ合わせる工程；ｃ）該交配による子孫から生殖性物質を回収する工程；
およびｄ）該生殖性物質から、保護された植物を生育させる工
程。
【請求項１５】実質的にホモ接合の植物から成る分類群
において、病気に対する抵抗性と抗菌活性を付与する請
求項１４に記載の方法であって、以下のａ）およびｂ）
の工程を繰り返してさらに包含する、方法；ａ）病気に対する抵抗性のある子孫を、その分類群由来
の実質的にホモ接合の、病気に感受性の植物と戻し交雑
する工程；およびｂ）戻し交雑による子孫のうちの病気に感受性の分類群
の他の所望の特徴と共に、病気に対する抵抗性および抗
菌活性の発現についての選択を、該子孫に、病気に対す
る抵抗性および抗菌活性とともに病気に感受性の分類群
の特徴が所望される割合（％）で存在するようになるま
で行う方法。
【請求項１６】実質的にＣＭＩＩＩのみをコードする植
物のゲノム由来のＤＮＡクローン。
【請求項１７】植物細胞におけるＤＮＡクローンの発現
を引き起こす植物の調節配列に作動可能に結合した、請
求項１６に記載のＤＮＡクローンを有する、発現カセッ
ト。
【請求項１８】細菌細胞におけるＤＮＡクローンの発現
を引き起こす細菌の発現調節配列に作動可能に結合し
た、請求項１６に記載のＤＮＡクローンを有する、発現
カセット。
【請求項１９】請求項１８に記載の発現カセットのコピ
ーを少なくとも１つ外来プラスミドとして含む、細菌細
胞。
【請求項２０】請求項１７に記載の発現カセットのＤＮ
Ａ配列のコピーを少なくとも１つ外来ＤＮＡとして含
む、形質転換された植物細胞。
【請求項２１】単子葉植物の細胞であることによりさら
に特徴づけられる、請求項２０に記載の形質転換細胞。
【請求項２２】トウモロコシ、モロコシ、小麦または米
の細胞であることにより、さらに特徴づけられる、請求
項２１に記載の形質転換細胞。
【請求項２３】双子葉植物種の細胞であることによりさ
らに特徴づけられる、請求項２０に記載の形質転換細
胞。
【請求項２４】大豆、アルファルファ、タバコまたはト
マトの細胞であることによりさらに特徴づけられる、請
求項２３に記載の形質転換細胞。
【請求項２５】請求項２２に記載の細胞を含有する、と
うもろこしの細胞または組織培養物。
【請求項２６】細胞が、請求項１６に記載の発現カセッ
トのＤＮＡ配列のコピーを少なくとも１つ外来ＤＮＡと
して含んでいる、形質転換されたとうもろこし植物。
【請求項２７】非植物毒性の担体中に抗菌量のＣＭＩＩ
Ｉを含有する、抗菌組成物。
【請求項２８】担体が病気に感受性の植物に対する全植
物体投与に適する、請求項２７に記載の組成物。