JPH05184387A - Ｃｄ８＋ ｔリンパ球のサブポピュレーション中に見出される細胞内抗原及びそれに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
Ｃｄ８＋ ｔリンパ球のサブポピュレーション中に見出される細胞内抗原及びそれに対するモノクローナル抗体Info
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- JPH05184387A JPH05184387A JP2415435A JP41543590A JPH05184387A JP H05184387 A JPH05184387 A JP H05184387A JP 2415435 A JP2415435 A JP 2415435A JP 41543590 A JP41543590 A JP 41543590A JP H05184387 A JPH05184387 A JP H05184387A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ＣＤ８+ Ｔリンパ球のサブポピュレーション
中に見出される細胞内抗原及びそれに対するモノクロー
ナル抗体並びにその応用。この抗原蛋白質と免疫的に交
差反応性のポリペプチドをコードする工作された核酸及
びその利用。 【構成】 １５ｋｄの蛋白質抗原は細胞溶解性Ｔリンパ
球及びナチュラルキラー細胞中の細胞質顆粒と結合して
いる。モノクローナル抗体は１５ｋｄの蛋白質及び免疫
的に１５ｋｄの蛋白質と交差反応性のポリペプチドをコ
ードする核酸プローブと免疫的に反応性である。この１
５ｋｄの蛋白質は、例えば、試料中の細胞溶解性リンパ
球を同定するために用いられ得る。この抗原をコードす
るクローン化ｃＤＮＡはこの抗原を産生するために用い
られ得る。
中に見出される細胞内抗原及びそれに対するモノクロー
ナル抗体並びにその応用。この抗原蛋白質と免疫的に交
差反応性のポリペプチドをコードする工作された核酸及
びその利用。 【構成】 １５ｋｄの蛋白質抗原は細胞溶解性Ｔリンパ
球及びナチュラルキラー細胞中の細胞質顆粒と結合して
いる。モノクローナル抗体は１５ｋｄの蛋白質及び免疫
的に１５ｋｄの蛋白質と交差反応性のポリペプチドをコ
ードする核酸プローブと免疫的に反応性である。この１
５ｋｄの蛋白質は、例えば、試料中の細胞溶解性リンパ
球を同定するために用いられ得る。この抗原をコードす
るクローン化ｃＤＮＡはこの抗原を産生するために用い
られ得る。
Description
【０００１】
【発明の背景】この発明は、モノクローナル抗体及び関
連する抗原、並びに特にリンパ球の細胞内抗原に対する
モノクローナル抗体に関する。
連する抗原、並びに特にリンパ球の細胞内抗原に対する
モノクローナル抗体に関する。
【０００２】Ｔ細胞表面分子と反応性のモノクローナル
抗体は、末梢血中リンパ球ポピュレーション中の表現型
及び機能的不均一性（heterogeneity)の定義に利用され
てきた。ＣＤ４及びＣＤ８と呼ばれる表面マーカーは、
ヘルパー／インデューサー及び細胞毒性／サプレッサー
機能をそれぞれ有する細胞の定義のために示されてき
た。ＣＤ４+ 及びＣＤ８+ リンパ球は両者とも、特異的
な活性化刺激に応答して遊離される細胞内エフェクター
分子を発現する。ＣＤ４+ ヘルパー細胞では、これらの
エフェクターはＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＦＮ−γなど
のリンホカインである。ＣＤ８+ 細胞溶解性細胞も又リ
ンホカインを産生できるが、それらは、パーホリン、セ
リンプロテアーゼ及びプロテオグリカンなどの推定上の
細胞溶解エフェクター分子を含む細胞質顆粒を含むこと
により特徴づけられる。標的細胞認識はこれらの細胞内
エフェクターの分泌を伴う。
抗体は、末梢血中リンパ球ポピュレーション中の表現型
及び機能的不均一性（heterogeneity)の定義に利用され
てきた。ＣＤ４及びＣＤ８と呼ばれる表面マーカーは、
ヘルパー／インデューサー及び細胞毒性／サプレッサー
機能をそれぞれ有する細胞の定義のために示されてき
た。ＣＤ４+ 及びＣＤ８+ リンパ球は両者とも、特異的
な活性化刺激に応答して遊離される細胞内エフェクター
分子を発現する。ＣＤ４+ ヘルパー細胞では、これらの
エフェクターはＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＦＮ−γなど
のリンホカインである。ＣＤ８+ 細胞溶解性細胞も又リ
ンホカインを産生できるが、それらは、パーホリン、セ
リンプロテアーゼ及びプロテオグリカンなどの推定上の
細胞溶解エフェクター分子を含む細胞質顆粒を含むこと
により特徴づけられる。標的細胞認識はこれらの細胞内
エフェクターの分泌を伴う。
【０００３】
【発明の概要】一般的に、この発明の一つの面は、細胞
溶解性Ｔリンパ球及びナチュラルキラー細胞中の細胞質
顆粒と結合した１５ｋｄの蛋白質と免疫的に反応性のモ
ノクローナル抗体（好ましくは、ＩｇＧクラス）の記述
である。“免疫的に反応性”という語句は、抗体及び抗
原が、抗原又は抗体のイムノアッセイを可能にするのに
十分な特異性をもって結合するということを意味する。
この語句は、抗体が他の抗原、例えば下記のような抗原
又は関連蛋白質の多量体などと結合する可能性を必ずし
も排除しない。
溶解性Ｔリンパ球及びナチュラルキラー細胞中の細胞質
顆粒と結合した１５ｋｄの蛋白質と免疫的に反応性のモ
ノクローナル抗体（好ましくは、ＩｇＧクラス）の記述
である。“免疫的に反応性”という語句は、抗体及び抗
原が、抗原又は抗体のイムノアッセイを可能にするのに
十分な特異性をもって結合するということを意味する。
この語句は、抗体が他の抗原、例えば下記のような抗原
又は関連蛋白質の多量体などと結合する可能性を必ずし
も排除しない。
【０００４】この発明の他の面は、１５ｋｄの蛋白質、
１５ｋｄの蛋白質と免疫的に交差反応性のアミノ酸配列
から構成されるポリペプチドをコードする工作された核
酸及び工作された核酸の発現によるポリペプチドの産生
方法の記述である。“免疫的に交差反応性”という語句
は、工作された核酸によりコードされたポリペプチドが
１５ｋｄの蛋白質に免疫的に反応性の抗体と同じ抗体に
特異的に結合するという意味である。
１５ｋｄの蛋白質と免疫的に交差反応性のアミノ酸配列
から構成されるポリペプチドをコードする工作された核
酸及び工作された核酸の発現によるポリペプチドの産生
方法の記述である。“免疫的に交差反応性”という語句
は、工作された核酸によりコードされたポリペプチドが
１５ｋｄの蛋白質に免疫的に反応性の抗体と同じ抗体に
特異的に結合するという意味である。
【０００５】好ましい具体例において、抗体はモノクロ
ーナル抗体ＴＩＡ−１であり、蛋白質は末梢血中単核細
胞由来のＣＤ８+ Ｔリンパ球のサブポピュレーション中
に見出され、そして核酸は、実質的に、ＡＴＣＣに、株
番号ＡＴＣＣＨＢ１０３１９で寄託された核酸に対応す
る。
ーナル抗体ＴＩＡ−１であり、蛋白質は末梢血中単核細
胞由来のＣＤ８+ Ｔリンパ球のサブポピュレーション中
に見出され、そして核酸は、実質的に、ＡＴＣＣに、株
番号ＡＴＣＣＨＢ１０３１９で寄託された核酸に対応す
る。
【０００６】この１５ｋｄの蛋白質は特に細胞溶解性リ
ンパ球に特徴的なので、この発明の他の面は、試料（例
えば、末梢血中単核細胞を含む試料）中の細胞溶解性リ
ンパ球の同定方法の記述である。その方法は、試料の上
述のモノクローナル抗体又は上述の１５ｋｄの蛋白質を
コードするＤＮＡとハイブリダイズ条件下で特異的にハ
イブリダイズする核酸配列を持つ核酸プローブ（例え
ば、少なくとも６ヌクレオチド長のもの）との接触、及
び抗体又は核酸プローブとの結合の測定を含む。
ンパ球に特徴的なので、この発明の他の面は、試料（例
えば、末梢血中単核細胞を含む試料）中の細胞溶解性リ
ンパ球の同定方法の記述である。その方法は、試料の上
述のモノクローナル抗体又は上述の１５ｋｄの蛋白質を
コードするＤＮＡとハイブリダイズ条件下で特異的にハ
イブリダイズする核酸配列を持つ核酸プローブ（例え
ば、少なくとも６ヌクレオチド長のもの）との接触、及
び抗体又は核酸プローブとの結合の測定を含む。
【０００７】他の面において、この発明は、患者の特異
的な組織へのＴ細胞の浸潤の程度の測定方法を記述す
る。その方法は、患者の特異的組織由来の固定組織切片
の上述の抗体又は核酸プローブの任意の一つとの接触、
及び抗体又は核酸プローブの固定組織切片との結合の測
定を含む。
的な組織へのＴ細胞の浸潤の程度の測定方法を記述す
る。その方法は、患者の特異的組織由来の固定組織切片
の上述の抗体又は核酸プローブの任意の一つとの接触、
及び抗体又は核酸プローブの固定組織切片との結合の測
定を含む。
【０００８】抗体結合による細胞溶解性リンパ球の存在
の監視の能力は、ＨＩＶウイルスなどの感染性因子の患
者内の存在の早期警告を提供するであろう。新しいエフ
ェクター蛋白質、ＴＩＡ抗原をコードする核酸を検出で
きるｃＤＮＡプローブはそれらの抗原の初期の存在の特
に鋭敏な検出方法を提供する。この発明の他の特徴及び
利点は、下記の好ましい具体例及び特許請求の範囲から
明らかと成るであろう。
の監視の能力は、ＨＩＶウイルスなどの感染性因子の患
者内の存在の早期警告を提供するであろう。新しいエフ
ェクター蛋白質、ＴＩＡ抗原をコードする核酸を検出で
きるｃＤＮＡプローブはそれらの抗原の初期の存在の特
に鋭敏な検出方法を提供する。この発明の他の特徴及び
利点は、下記の好ましい具体例及び特許請求の範囲から
明らかと成るであろう。
【０００９】
【好ましい具体例の説明】モノクローナル抗体ＴＩＡ−
１は、透過性及び非透過性のＴ細胞を区別するものとし
て選択され、１５ｋｄの細胞内蛋白質、ＴＩＡ−１抗原
を認識する。それは、末梢血中単核細胞由来のＣＤ８+
リンパ球のサブポピュレーション中及びナチュラルキラ
ー細胞中に見出される。ＴＩＡ−１抗原は、免疫電子顕
微鏡により、細胞溶解性Ｔリンパ球の細胞質顆粒の膜に
結合して観察される。
１は、透過性及び非透過性のＴ細胞を区別するものとし
て選択され、１５ｋｄの細胞内蛋白質、ＴＩＡ−１抗原
を認識する。それは、末梢血中単核細胞由来のＣＤ８+
リンパ球のサブポピュレーション中及びナチュラルキラ
ー細胞中に見出される。ＴＩＡ−１抗原は、免疫電子顕
微鏡により、細胞溶解性Ｔリンパ球の細胞質顆粒の膜に
結合して観察される。
【００１０】ＴＩＡ−１の単離方法 細胞内抗原と反応性の抗体の産生によりスクリーニング
されるのに適したハイブリドーマは、６週齢のＢＡＬＢ
／ｃマウスを透過性Ｔリンパ球（２５−３０×１０6 ）
で２１日の間隔で９−１２週間に渡って免疫することに
より調製された。免疫原は、ヒツジ赤血球でロゼット形
成された血小板フェレーシス残渣から得られ、Ficoll精
製された末梢血中単核細胞を用いて調製された(Layラ 、N
ature、300 巻、267頁、1971 年) 。精製されたＴリンパ球
は、ＰＢＳ中で３回洗われ、５×１０6 細胞／ｍｌに再
懸濁され、そして氷上で５分間ジギトニンを加える（１
０μｇ／ｍｌ）ことにより透過性にされた。適度の透過
性がトリパンブルーの取り込みの測定により監視された
が、それは典型的には９０％以上であった。透過性のリ
ンパ球はペレット化され、２５−３０×１０6 細胞／ｍ
ｌに無菌ＰＢＳ中に再懸濁され、そしてＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの腹腔に注射された。免疫されたマウス由来の脾臓
細胞は、ハイブリドーマ作成のためにＮＳ−１ミエロー
マ細胞と融合された(Kohler ラ 、 Nature、256巻、495頁、1
975 年 )。
されるのに適したハイブリドーマは、６週齢のＢＡＬＢ
／ｃマウスを透過性Ｔリンパ球（２５−３０×１０6 ）
で２１日の間隔で９−１２週間に渡って免疫することに
より調製された。免疫原は、ヒツジ赤血球でロゼット形
成された血小板フェレーシス残渣から得られ、Ficoll精
製された末梢血中単核細胞を用いて調製された(Layラ 、N
ature、300 巻、267頁、1971 年) 。精製されたＴリンパ球
は、ＰＢＳ中で３回洗われ、５×１０6 細胞／ｍｌに再
懸濁され、そして氷上で５分間ジギトニンを加える（１
０μｇ／ｍｌ）ことにより透過性にされた。適度の透過
性がトリパンブルーの取り込みの測定により監視された
が、それは典型的には９０％以上であった。透過性のリ
ンパ球はペレット化され、２５−３０×１０6 細胞／ｍ
ｌに無菌ＰＢＳ中に再懸濁され、そしてＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの腹腔に注射された。免疫されたマウス由来の脾臓
細胞は、ハイブリドーマ作成のためにＮＳ−１ミエロー
マ細胞と融合された(Kohler ラ 、 Nature、256巻、495頁、1
975 年 )。
【００１１】上述の様にして調製されたハイブリドーマ
の個々のクローンは、透過性のＴリンパ球との反応性
で、フローサイトメトリーの変法によってスクリーニン
グされた。細胞を、不都合な損傷又は細胞内成分の過度
の損失を伴わずに透過性にするために、そして透過性の
細胞をフローサイトメトリー分析のための試料調製で必
要な多くの洗浄で崩壊しないように保護するために、ヒ
ツジ赤血球のロゼッティングによって精製されたＴリン
パ球は、最初に、ＰＢＳ中の０．０１％ホルムアルデヒ
ドでの氷上での２０分間の穏やかな固定により安定化さ
れた。細胞は、それから、氷冷ＰＢＳで４回洗われ、Ｐ
ＢＳ中に５×１０6 細胞／ｍｌに再懸濁され、そして氷
上で５分間ジギトニンを加える（１０μｇ／ｍｌ）こと
により透過性にされた。適度の透過性がトリパンの取り
込みにより確認された後、細胞はペレット化され、ＰＢ
Ｓ中で２０×１０6 細胞／ｍｌに再懸濁された。ハイブ
リドーマ上清は透過性の細胞を１：１の比で加えられ
た。氷上で３０分後、細胞は結合していない抗体を除去
するために０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで
３回洗われ、更にヤギの抗マウスＦＩＴＣと共にインキ
ュベートされ、洗われ、ＰＢＳ及び１％ホルムアルデヒ
ド中に再懸濁され、そしてＥｐｉｃｓ７５２フローサイ
トメーターを用いてフローサイトメトリーで分析され
た。
の個々のクローンは、透過性のＴリンパ球との反応性
で、フローサイトメトリーの変法によってスクリーニン
グされた。細胞を、不都合な損傷又は細胞内成分の過度
の損失を伴わずに透過性にするために、そして透過性の
細胞をフローサイトメトリー分析のための試料調製で必
要な多くの洗浄で崩壊しないように保護するために、ヒ
ツジ赤血球のロゼッティングによって精製されたＴリン
パ球は、最初に、ＰＢＳ中の０．０１％ホルムアルデヒ
ドでの氷上での２０分間の穏やかな固定により安定化さ
れた。細胞は、それから、氷冷ＰＢＳで４回洗われ、Ｐ
ＢＳ中に５×１０6 細胞／ｍｌに再懸濁され、そして氷
上で５分間ジギトニンを加える（１０μｇ／ｍｌ）こと
により透過性にされた。適度の透過性がトリパンの取り
込みにより確認された後、細胞はペレット化され、ＰＢ
Ｓ中で２０×１０6 細胞／ｍｌに再懸濁された。ハイブ
リドーマ上清は透過性の細胞を１：１の比で加えられ
た。氷上で３０分後、細胞は結合していない抗体を除去
するために０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで
３回洗われ、更にヤギの抗マウスＦＩＴＣと共にインキ
ュベートされ、洗われ、ＰＢＳ及び１％ホルムアルデヒ
ド中に再懸濁され、そしてＥｐｉｃｓ７５２フローサイ
トメーターを用いてフローサイトメトリーで分析され
た。
【００１２】ＴＩＡ−１抗原の発現の特異性 活性化されたＴリンパ球は他の細胞表面蛋白質と共にＣ
Ｄ４又はＣＤ８を含み得る。精製されたＣＤ４+ 及びＣ
Ｄ８+ リンパ球のポピュレーションはＴＩＡ−１抗原を
選択的にＣＤ８+ サブセット中に含むことを見出され
た。平均すると、透過性細胞の抗体結合アッセイにおい
て、ＴＩＡ−１はＣＤ４+ 細胞の６±２％及びＣＤ８+
細胞の５５±７％を染色した。ＴＩＡ−１抗原はナチュ
ラルキラー（ＮＫ）細胞においても又発現されるが、不
死化されたＴ細胞系統（Jurkat、ＨＰＢ−ＡＬＬ、ＣＥ
Ｍ、ＨＵＴＬ−７８）においても、Ｂ細胞系統（Daudi
、ＢＪＡＢ、Raji) においても発現されない。
Ｄ４又はＣＤ８を含み得る。精製されたＣＤ４+ 及びＣ
Ｄ８+ リンパ球のポピュレーションはＴＩＡ−１抗原を
選択的にＣＤ８+ サブセット中に含むことを見出され
た。平均すると、透過性細胞の抗体結合アッセイにおい
て、ＴＩＡ−１はＣＤ４+ 細胞の６±２％及びＣＤ８+
細胞の５５±７％を染色した。ＴＩＡ−１抗原はナチュ
ラルキラー（ＮＫ）細胞においても又発現されるが、不
死化されたＴ細胞系統（Jurkat、ＨＰＢ−ＡＬＬ、ＣＥ
Ｍ、ＨＵＴＬ−７８）においても、Ｂ細胞系統（Daudi
、ＢＪＡＢ、Raji) においても発現されない。
【表１】 ─────────────────────────────────── 透過性の肝臓幹細胞（hepatopoetic cell)におけるＴＩＡ−１抗原の発現のフ ローサイトメトリー分析 細胞のタイプ 相対的発現度 Ｂ細胞 − Ｔ細胞 ＋ ＣＤ４+ Ｔ細胞 ＋／− ＣＤ８+ Ｔ細胞 ＋＋＋ 胸腺細胞 − ＣｏｎＡ活性化胸腺細胞 ＋ ＪＪ１（ＮＫクローン） ＋＋＋ ＣＮＫ６（ＮＫクローン） ＋＋＋ ＪＴ１８（ＮＫクローン） ＋＋＋ ＹＴB （ＮＫクローン） ＋ Ｔ４Ｔ８Ｃｌ（ＣＤ４+ 、ＣＤ８+ クローン） ＋＋＋ Ａ２ｐ（ＣＤ８+ 細胞系統） ＋＋ Ｍ（ＣＤ４+ クローン） ＋ ＭＭ（ＣＤ４+ クローン） ＋ Ｎ（ＣＤ４+ クローン） ＋／− Ｐ（ＣＤ４+ クローン） ＋ ───────────────────────────────────
【００１３】Ｔ細胞活性化のＴＩＡ−１抗原の発現にお
ける影響 末梢血中リンパ球が、１０％ウシ胎児血清を補われたRo
swell Park MemorialInstitute （ＲＰＭＩ）培地中
で、活性化刺激を受けて又は受けずに培養されるとき、
非活性化Ｔ細胞は、ＴＩＡ−１と免疫ブロット法におい
て反応する１５ｋｄの蛋白質を発現する。８日間活性化
刺激なしで培養された細胞は、漸進的に、１５ｋｄの蛋
白質を発現する能力を失うが、他方、２８ｋｄの免疫反
応性分子種を得る。ホルボールミリステートアセテート
の存在下では、両形態のＴＩＡ−１抗原の発現が減少す
る。Ｔ細胞分裂促進物質、ＣｏｎＡは１５ｋｄ及び２８
ｋｄの両方の免疫反応性の形態を大量に発現させる。
ける影響 末梢血中リンパ球が、１０％ウシ胎児血清を補われたRo
swell Park MemorialInstitute （ＲＰＭＩ）培地中
で、活性化刺激を受けて又は受けずに培養されるとき、
非活性化Ｔ細胞は、ＴＩＡ−１と免疫ブロット法におい
て反応する１５ｋｄの蛋白質を発現する。８日間活性化
刺激なしで培養された細胞は、漸進的に、１５ｋｄの蛋
白質を発現する能力を失うが、他方、２８ｋｄの免疫反
応性分子種を得る。ホルボールミリステートアセテート
の存在下では、両形態のＴＩＡ−１抗原の発現が減少す
る。Ｔ細胞分裂促進物質、ＣｏｎＡは１５ｋｄ及び２８
ｋｄの両方の免疫反応性の形態を大量に発現させる。
【００１４】更に、２種のより高分子の分子種が、Ｃｏ
ｎＡを伴う培養の６日目に現れる。ＣＤ３と反応性の抗
体は同様にこれらの高分子形態のＴＩＡ−１反応性抗原
の発現を導くが、他方、フィトヘマグルチニンはＴＩＡ
−１反応性抗原の発現を減らす。高分子量の免疫反応性
の分子種は１５ｋｄの単量体がジスルフィド結合された
多量体であるらしい。６日間ＣｏｎＡで活性化されたＴ
細胞から調製された細胞溶解物がＳＤＳ−ＰＡＧＥで還
元条件下で分離され、それから、ＴＩＡ−１を用いた免
疫ブロット法にかけられるとき、すべての高分子免疫反
応性分子種は１５ｋｄの単量体に還元される。
ｎＡを伴う培養の６日目に現れる。ＣＤ３と反応性の抗
体は同様にこれらの高分子形態のＴＩＡ−１反応性抗原
の発現を導くが、他方、フィトヘマグルチニンはＴＩＡ
−１反応性抗原の発現を減らす。高分子量の免疫反応性
の分子種は１５ｋｄの単量体がジスルフィド結合された
多量体であるらしい。６日間ＣｏｎＡで活性化されたＴ
細胞から調製された細胞溶解物がＳＤＳ−ＰＡＧＥで還
元条件下で分離され、それから、ＴＩＡ−１を用いた免
疫ブロット法にかけられるとき、すべての高分子免疫反
応性分子種は１５ｋｄの単量体に還元される。
【００１５】ＴＩＡ−１抗原の細胞内局在性 ＴＩＡ−１抗原の細胞内局在性は、窒素キャビテーショ
ンによる細胞破壊と溶解物のPercoll 勾配中での分画に
より測定された。培養された細胞溶解性Ｔリンパ球の同
様の分析は、細胞溶解エフェクター分子、セリンプロテ
アーゼ及びパーホリンを含む高密度の顆粒の存在を示し
た（Pasternackラ 、 Nature、322巻、740頁、1986 年）。細
胞溶解活性を有するクローン化ＣＤ８+ 細胞系統（Ｔ４
Ｔ８Ｃｌ）がこの方法で分画されたとき、２つのセリン
プロテアーゼ活性のピークが観察された。Percoll 勾配
画分が免疫ブロット法でＴＩＡ−１反応性の物質の存在
を試験されたとき、その多くはセリンプロテアーゼ活性
をも有する低密度膜画分に見出された。（低密度膜画分
は、成熟細胞溶解性顆粒を、まだ形成途中のため、少し
しか含まないと信じられている（Henkart ラ 、J.Immuno
l.139巻、2398 頁、1987 年）。）
ンによる細胞破壊と溶解物のPercoll 勾配中での分画に
より測定された。培養された細胞溶解性Ｔリンパ球の同
様の分析は、細胞溶解エフェクター分子、セリンプロテ
アーゼ及びパーホリンを含む高密度の顆粒の存在を示し
た（Pasternackラ 、 Nature、322巻、740頁、1986 年）。細
胞溶解活性を有するクローン化ＣＤ８+ 細胞系統（Ｔ４
Ｔ８Ｃｌ）がこの方法で分画されたとき、２つのセリン
プロテアーゼ活性のピークが観察された。Percoll 勾配
画分が免疫ブロット法でＴＩＡ−１反応性の物質の存在
を試験されたとき、その多くはセリンプロテアーゼ活性
をも有する低密度膜画分に見出された。（低密度膜画分
は、成熟細胞溶解性顆粒を、まだ形成途中のため、少し
しか含まないと信じられている（Henkart ラ 、J.Immuno
l.139巻、2398 頁、1987 年）。）
【００１６】免疫電子顕微鏡検査において、ＴＩＡ−１
抗原はＴ４Ｔ８Ｃｌ細胞の細胞表面ではなく特異的なコ
ンパートメント内、被覆された膜孔又は原形質膜に沿っ
て局在化していることが見出された。標識は粗面小胞体
又はゴルジ装置には見られなかった。強度の標識が、１
次ゴルジ後コンパートメント内、膜即ち電子透過性の核
(electron lucent cores) を有するエンドソーム様構造
上、電子不透過性（electron dense）のリソソーム顆粒
の膜の周囲及び小さな多小胞体(multivesiculate body)
に含まれる小さな小胞（microvesicle) の膜の周囲に見
出された。電子透過性のエンドソーム及び電子不透過性
の小胞は共にその膜が標識された。いくつかの細胞質小
胞は電子透過性から電子不透過性構造に移行中の様に見
えた。すべての場合において、標識はコンパートメント
膜とのみ結合する様に見えた。ＴＩＡ−１抗原は成長性
の細胞質顆粒に特異的なマーカーであるらしい。
抗原はＴ４Ｔ８Ｃｌ細胞の細胞表面ではなく特異的なコ
ンパートメント内、被覆された膜孔又は原形質膜に沿っ
て局在化していることが見出された。標識は粗面小胞体
又はゴルジ装置には見られなかった。強度の標識が、１
次ゴルジ後コンパートメント内、膜即ち電子透過性の核
(electron lucent cores) を有するエンドソーム様構造
上、電子不透過性（electron dense）のリソソーム顆粒
の膜の周囲及び小さな多小胞体(multivesiculate body)
に含まれる小さな小胞（microvesicle) の膜の周囲に見
出された。電子透過性のエンドソーム及び電子不透過性
の小胞は共にその膜が標識された。いくつかの細胞質小
胞は電子透過性から電子不透過性構造に移行中の様に見
えた。すべての場合において、標識はコンパートメント
膜とのみ結合する様に見えた。ＴＩＡ−１抗原は成長性
の細胞質顆粒に特異的なマーカーであるらしい。
【００１７】ＴＩＡ−１抗原と既知の蛋白質との比較 その組織分布、細胞内局在性及び生化学的構造におい
て、ＴＩＡ−１抗原は、いくつかの既知の細胞溶解エフ
ェクター分子に似ている。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及び
リンホトキシン（ＬＴ）などの構造（Krigler ラ 、Cell、
53巻、45 頁、1988年、Yamamoto ラ 、J.Immunol.137巻、1878
頁、1986 年、Schmid ラ 、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、83巻、
1881 頁、1986 年) は、ＴＩＡ−１抗原とほぼ同じ大き
さであり、多分その組織分布及び細胞内局在性を共にす
るであろう。しかしながら、ＴＩＡ−１がヒトＴＮＦ及
びリンホトキシンを用いて免疫ブロット法で試験された
ときには、ＴＮＦもＬＴもこの抗体によって認識されな
かった。ＴＩＡ−１が以前に報告されたことのないセリ
ンプロテアーゼであるのかどうかを決定するために、Ｔ
４Ｔ８Ｃ１溶解物はＦｅｒｇｕｓｏｎらの方法（Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１６７巻、５２８頁、１９８８年）によ
り分析された。全細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥは３０
ｋｄ付近の移動度のセリンプロテアーゼ活性のバンドを
示すが、 3Ｈジイソプロピルホスホフルオリデートで標
識された物質はＴＩＡ−１と反応せず、このことは、Ｔ
ＩＡ−１抗原がセリンプロテアーゼではないことを示唆
する。
て、ＴＩＡ−１抗原は、いくつかの既知の細胞溶解エフ
ェクター分子に似ている。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及び
リンホトキシン（ＬＴ）などの構造（Krigler ラ 、Cell、
53巻、45 頁、1988年、Yamamoto ラ 、J.Immunol.137巻、1878
頁、1986 年、Schmid ラ 、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、83巻、
1881 頁、1986 年) は、ＴＩＡ−１抗原とほぼ同じ大き
さであり、多分その組織分布及び細胞内局在性を共にす
るであろう。しかしながら、ＴＩＡ−１がヒトＴＮＦ及
びリンホトキシンを用いて免疫ブロット法で試験された
ときには、ＴＮＦもＬＴもこの抗体によって認識されな
かった。ＴＩＡ−１が以前に報告されたことのないセリ
ンプロテアーゼであるのかどうかを決定するために、Ｔ
４Ｔ８Ｃ１溶解物はＦｅｒｇｕｓｏｎらの方法（Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１６７巻、５２８頁、１９８８年）によ
り分析された。全細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥは３０
ｋｄ付近の移動度のセリンプロテアーゼ活性のバンドを
示すが、 3Ｈジイソプロピルホスホフルオリデートで標
識された物質はＴＩＡ−１と反応せず、このことは、Ｔ
ＩＡ−１抗原がセリンプロテアーゼではないことを示唆
する。
【００１８】ＴＩＡ−１抗原をコードするｃＤＮＡの単
離と配列分析 標準的技術を用いて、細胞障害性Ｔ細胞クローンから単
離されたＲＮＡから調製されたλｇｔ１１ｃＤＮＡライ
ブラリーはＴＩＡ−１を用いた免疫スクリーニングにか
けられた。ＴＩＡ−１と反応性の融合蛋白質を発現して
いる３つの独立のクローンがプラークから精製され、組
換えｃＤＮＡは、クローン化挿入物を延長するためにｐ
ＳＰ６５プラスミッドＤＮＡ中にサブクローン化された
（Meltonラ 、Nucl.Acids Res.、12 巻、7035 頁、1984
年）。挿入ＤＮＡはベクターから切り取られ、低融点ア
ガロースゲル上で分離され、そしてフェノール抽出され
た。最大の挿入物（１．５ｋｂ）は32Ｐ−ｄＡＴＰでニ
ックトランスレーションにより標識され、元の３つの分
離株とのクロスハイブリダイゼーション分析で用いられ
た。そのプローブは、各独立した分離株とはクロスハイ
ブリダイズするが、ＴＩＡ−１と反応しないλ分離株と
はクロスハイブリダイズしないことが示された。このプ
ローブは、それから、ｃＤＮＡの全長を得るために、元
のｃＤＮＡライブラリーを再探査するのに用いられた。
32Ｐプローブとハイブリダイズする１０個の組換えプラ
ークが、プラークから精製され、挿入ＤＮＡはアガロー
スゲル電気泳動にかけられた。これらの挿入物のうち７
つは１．５ｋｂの大きさであった。
離と配列分析 標準的技術を用いて、細胞障害性Ｔ細胞クローンから単
離されたＲＮＡから調製されたλｇｔ１１ｃＤＮＡライ
ブラリーはＴＩＡ−１を用いた免疫スクリーニングにか
けられた。ＴＩＡ−１と反応性の融合蛋白質を発現して
いる３つの独立のクローンがプラークから精製され、組
換えｃＤＮＡは、クローン化挿入物を延長するためにｐ
ＳＰ６５プラスミッドＤＮＡ中にサブクローン化された
（Meltonラ 、Nucl.Acids Res.、12 巻、7035 頁、1984
年）。挿入ＤＮＡはベクターから切り取られ、低融点ア
ガロースゲル上で分離され、そしてフェノール抽出され
た。最大の挿入物（１．５ｋｂ）は32Ｐ−ｄＡＴＰでニ
ックトランスレーションにより標識され、元の３つの分
離株とのクロスハイブリダイゼーション分析で用いられ
た。そのプローブは、各独立した分離株とはクロスハイ
ブリダイズするが、ＴＩＡ−１と反応しないλ分離株と
はクロスハイブリダイズしないことが示された。このプ
ローブは、それから、ｃＤＮＡの全長を得るために、元
のｃＤＮＡライブラリーを再探査するのに用いられた。
32Ｐプローブとハイブリダイズする１０個の組換えプラ
ークが、プラークから精製され、挿入ＤＮＡはアガロー
スゲル電気泳動にかけられた。これらの挿入物のうち７
つは１．５ｋｂの大きさであった。
【００１９】免疫スクリーニングで選択されたｃＤＮＡ
がＴＩＡ−１抗原をコードしていることを確かめるため
に、ｃＤＮＡの全長がｐＳＰ６５に両方向向きにクロー
ン化された。組換えプラスミッドは、展開され、Ｐｓｔ
１（制限酵素で、その切断部位はマルチリンカー中には
存在するが、挿入ＤＮＡ中には存在しない）で線形化さ
れ、そしてＭｅｌｔｏｎら、同書に従って、ＳＰ６ Ｒ
ＮＡポリメラーゼを用いたイン・ビトロ転写反応におい
てテンプレートとして用いられた。センス及びアンチセ
ンスの両転写産物がＤＮＡテンプレートから低融点アガ
ロース電気泳動により分離された。ＲＮＡ転写産物は、
切り取られ、フェノール抽出され、そしてウサギ網状赤
血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたイン・ビトロ翻
訳反応においてテンプレートとして用いられた。これら
の反応は35Ｓメチオニンを含む培地中で行われ、翻訳産
物は１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離され
た。（＋）鎖ＲＮＡは、（−）鎖ＲＮＡによっては産生
しない１５ｋｄの35Ｓ標識された蛋白質産物を生じた。
翻訳産物がゲルから切り取られ、代謝的に標識されたＴ
ＩＡ−１抗原免疫沈降物と並べて泳動したところ、これ
らの蛋白質は同じ移動度であった。
がＴＩＡ−１抗原をコードしていることを確かめるため
に、ｃＤＮＡの全長がｐＳＰ６５に両方向向きにクロー
ン化された。組換えプラスミッドは、展開され、Ｐｓｔ
１（制限酵素で、その切断部位はマルチリンカー中には
存在するが、挿入ＤＮＡ中には存在しない）で線形化さ
れ、そしてＭｅｌｔｏｎら、同書に従って、ＳＰ６ Ｒ
ＮＡポリメラーゼを用いたイン・ビトロ転写反応におい
てテンプレートとして用いられた。センス及びアンチセ
ンスの両転写産物がＤＮＡテンプレートから低融点アガ
ロース電気泳動により分離された。ＲＮＡ転写産物は、
切り取られ、フェノール抽出され、そしてウサギ網状赤
血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたイン・ビトロ翻
訳反応においてテンプレートとして用いられた。これら
の反応は35Ｓメチオニンを含む培地中で行われ、翻訳産
物は１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離され
た。（＋）鎖ＲＮＡは、（−）鎖ＲＮＡによっては産生
しない１５ｋｄの35Ｓ標識された蛋白質産物を生じた。
翻訳産物がゲルから切り取られ、代謝的に標識されたＴ
ＩＡ−１抗原免疫沈降物と並べて泳動したところ、これ
らの蛋白質は同じ移動度であった。
【００２０】上述の１．５ｋｄの挿入物は、ｐＳＰ６５
プラスミッドＤＮＡ中にサブクローン化され、エキソヌ
クレアーゼＩＩＩ（１塩基削除、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用
いて５’末端が削除された一連の変異体を作るのに用い
られた。Ｓａｎｇｅｒのジデオキシ法（シーケナーゼ、
Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、重複する変異体の配列分析
により、ＴＩＡ−１抗原をコードするｃＤＮＡの配列が
得られた（図１）。この配列の分析は、１９１アミノ酸
のオープンリーディングフレームをｃＤＮＡの５’末端
に示す。もし翻訳が２番目のメチオニンから始まるなら
ば、それは真核生物の共通の開始配列（Kozak、Nucleic
Acids Research、12 巻、857頁、1984 年)であり、それか
ら、コードされる翻訳産物の予想される大きさは１６５
０２ｋｄである。予想されるアミノ酸配列も又６つのメ
チオニンと１つのシステインを含むが、代謝的標識実験
と一致する結果である。この配列とGenbank ／ＥＭＢＬ
ＤＮＡデータベース、翻訳されたGenbank 、及びＮＢＲ
Ｆ蛋白質データベースとの比較は、既知の配列との有意
の相同性を示さなかった。これらの結果は、免疫スクリ
ーニングによりＴＩＡ−１抗原をコードしているとして
単離されたｃＤＮＡは以前には報告されていないＴリン
パ球の成分をコードするということを示唆する。
プラスミッドＤＮＡ中にサブクローン化され、エキソヌ
クレアーゼＩＩＩ（１塩基削除、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用
いて５’末端が削除された一連の変異体を作るのに用い
られた。Ｓａｎｇｅｒのジデオキシ法（シーケナーゼ、
Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、重複する変異体の配列分析
により、ＴＩＡ−１抗原をコードするｃＤＮＡの配列が
得られた（図１）。この配列の分析は、１９１アミノ酸
のオープンリーディングフレームをｃＤＮＡの５’末端
に示す。もし翻訳が２番目のメチオニンから始まるなら
ば、それは真核生物の共通の開始配列（Kozak、Nucleic
Acids Research、12 巻、857頁、1984 年)であり、それか
ら、コードされる翻訳産物の予想される大きさは１６５
０２ｋｄである。予想されるアミノ酸配列も又６つのメ
チオニンと１つのシステインを含むが、代謝的標識実験
と一致する結果である。この配列とGenbank ／ＥＭＢＬ
ＤＮＡデータベース、翻訳されたGenbank 、及びＮＢＲ
Ｆ蛋白質データベースとの比較は、既知の配列との有意
の相同性を示さなかった。これらの結果は、免疫スクリ
ーニングによりＴＩＡ−１抗原をコードしているとして
単離されたｃＤＮＡは以前には報告されていないＴリン
パ球の成分をコードするということを示唆する。
【００２１】利用 モノクローナル抗体ＴＩＡ−１は末梢血中単核細胞ポピ
ュレーション中の又は病理学の検体からの組織切片中の
細胞溶解性リンパ球の同定に用いられるであろう。細胞
溶解性Ｔ細胞が侵入した病原体に対する宿主の防御機構
に関係するので、細胞溶解性リンパ球の存在を監視する
能力は、ＨＩＶウイルスなどの感染性因子の存在の早期
の警告を提供するであろう。
ュレーション中の又は病理学の検体からの組織切片中の
細胞溶解性リンパ球の同定に用いられるであろう。細胞
溶解性Ｔ細胞が侵入した病原体に対する宿主の防御機構
に関係するので、細胞溶解性リンパ球の存在を監視する
能力は、ＨＩＶウイルスなどの感染性因子の存在の早期
の警告を提供するであろう。
【００２２】より鋭敏な細胞溶解性Ｔ細胞の試験でも、
例えばポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain react
ion)又はイン・サイチュ（in situ)ハイブリダイゼーシ
ョン技術を用いるときに、ＴＩＡ−１抗原をコードする
核酸の存在のプローブとしてのＴＩＡ−１抗原をコード
するｃＤＮＡ又はそのフラグメントを用いるであろう。
例えばポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain react
ion)又はイン・サイチュ（in situ)ハイブリダイゼーシ
ョン技術を用いるときに、ＴＩＡ−１抗原をコードする
核酸の存在のプローブとしてのＴＩＡ−１抗原をコード
するｃＤＮＡ又はそのフラグメントを用いるであろう。
【００２３】寄託 下記の寄託は、ブダペスト条約の要求により、Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎに行われた。
ｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎに行われた。
【表２】 ─────────────────────────────────── 寄託 日付け 受理番号 ─────────────────────────────────── Ｅ．ｃｏｌｉ株 １９９０年１月５日 ６８２０２ Ｔ４Ｔ８．９−５ ハイブリドーマＴＩＡ−１ １９９０年１月５日 ＨＢ１０３１９ ─────────────────────────────────── 出願人、Dana-Farber Cancer Institute Inc. は、ＡＴ
ＣＣがこの寄託に永続性を与える寄託所であり、特許が
許可になれば公衆が入手できる様準備ができていると述
べる。こうして寄託されたものを公衆が入手することに
対するすべての制限は、特許が許可になれば最終的に取
り除かれるであろう。それは、この特許出願が係属中
は、米国特許庁長官により米国特許法規則３７ＣＦＲ
１．１４及び米国特許法１２２条に基づいて権利を与え
られたものは入手できる。寄託されたものは、生育しう
る様に及び雑菌混入しない状態に保持するために必要な
すべての注意を払って、寄託された微生物試料の供給の
最も最近の要求から少なくとも５年の期間維持され、い
かなる場合でも、寄託の日後少なくとも３０年の期間又
は特許の有効期間のいずれか長い方の期間維持されるで
あろう。出願人である、譲受人は、寄託所が要求された
ときに寄託物の状態のために試料を供給できないときは
寄託物を交換する義務を認める。他の具体例は上記の特
許請求の範囲に含まれる。
ＣＣがこの寄託に永続性を与える寄託所であり、特許が
許可になれば公衆が入手できる様準備ができていると述
べる。こうして寄託されたものを公衆が入手することに
対するすべての制限は、特許が許可になれば最終的に取
り除かれるであろう。それは、この特許出願が係属中
は、米国特許庁長官により米国特許法規則３７ＣＦＲ
１．１４及び米国特許法１２２条に基づいて権利を与え
られたものは入手できる。寄託されたものは、生育しう
る様に及び雑菌混入しない状態に保持するために必要な
すべての注意を払って、寄託された微生物試料の供給の
最も最近の要求から少なくとも５年の期間維持され、い
かなる場合でも、寄託の日後少なくとも３０年の期間又
は特許の有効期間のいずれか長い方の期間維持されるで
あろう。出願人である、譲受人は、寄託所が要求された
ときに寄託物の状態のために試料を供給できないときは
寄託物を交換する義務を認める。他の具体例は上記の特
許請求の範囲に含まれる。
【図１】ＴＩＡ−１抗原をコードするｃＤＮＡのヌクレ
オチド配列及びその抗原の予想されるアミノ酸配列を表
す。このｃＤＮＡは、ＡＴＣＣに、株番号ＡＴＣＣ６８
２０２で寄託されている。
オチド配列及びその抗原の予想されるアミノ酸配列を表
す。このｃＤＮＡは、ＡＴＣＣに、株番号ＡＴＣＣ６８
２０２で寄託されている。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ステュアート・エフ・シュロスマン 米国マサチューセッツ州ニュートン・セン ター、ワン・フォクス・プレイス（番地な し)
Claims (11)
- 【請求項１】 細胞溶解性Ｔリンパ球及びナチュラルキ
ラー細胞中の細胞質顆粒に結合した１５ｋｄの蛋白質と
免疫的に反応性のモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 上記の抗体により認識される上記の１５
ｋｄの蛋白質が末梢血由来のＣＤ８+ のＴリンパ球サブ
ポピュレーション中に見出される、請求項１に記載のモ
ノクローナル抗体。 - 【請求項３】 モノクローナル抗体ＴＩＡ−１。
- 【請求項４】 試料の請求項１〜３の任意のモノクロー
ナル抗体との接触及び上記の抗体の上記の末梢血中細胞
への結合からなる、試料中の細胞溶解性リンパ球の同定
方法。 - 【請求項５】 上記の試料が末梢血中単核細胞のポピュ
レーションを含む、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 上記の試料が患者の特定の組織を含み、
上記の方法がＴ細胞の上記組織への浸潤の程度の測定を
提供し、上記の患者の上記の特定の組織由来の固定組織
切片のモノクローナル抗体との接触を含む、請求項４に
記載の方法。 - 【請求項７】 細胞溶解性Ｔリンパ球及びナチュラルキ
ラー細胞中の細胞質顆粒に結合した１５ｋｄの蛋白質と
免疫的に交差反応性のポリペプチドをコードする工作さ
れた核酸。 - 【請求項８】 上記ポリペプチドがＴＩＡ−１モノクロ
ーナル抗体と免疫的に反応性である、請求項７に記載の
工作された核酸。 - 【請求項９】 上記ポリペプチドが細胞溶解性Ｔリンパ
球及びナチュラルキラー細胞中の細胞質顆粒に結合した
１５ｋｄの蛋白質であり、末梢血由来のＣＤ８+ のＴリ
ンパ球サブポピュレーション中に見出される、請求項７
に記載の工作された核酸。 - 【請求項１０】 細胞溶解性Ｔリンパ球及びナチュラル
キラー細胞中の細胞質顆粒に結合したものと実質的に同
じものであり、末梢血由来のＣＤ８+ のＴリンパ球サブ
ポピュレーション中に見出される、精製された１５ｋｄ
の蛋白質。 - 【請求項１１】 上記リンパ球由来の核酸の、請求項１
０で請求される蛋白質をコードするＤＮＡ配列由来の少
なくとも６ヌクレオチド長の核酸プローブとの接触を含
む、細胞溶解性のリンパ球の同定方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US460678 | 1990-01-05 | ||
| US07/460,678 US5079343A (en) | 1990-01-05 | 1990-01-05 | Intracellular antigen found in subpopulation of cd8+ t lymphocytes and monoclonal antibody reactive with same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05184387A true JPH05184387A (ja) | 1993-07-27 |
Family
ID=23829643
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2415435A Pending JPH05184387A (ja) | 1990-01-05 | 1990-12-28 | Ｃｄ８＋ ｔリンパ球のサブポピュレーション中に見出される細胞内抗原及びそれに対するモノクローナル抗体 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5079343A (ja) |
| EP (1) | EP0436400B1 (ja) |
| JP (1) | JPH05184387A (ja) |
| AT (1) | ATE183777T1 (ja) |
| CA (1) | CA2033644A1 (ja) |
| DE (1) | DE69033260D1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5340935A (en) * | 1990-01-05 | 1994-08-23 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | DNAS encoding proteins active in lymphocyte-medicated cytotoxicity |
| US5277892A (en) * | 1990-08-08 | 1994-01-11 | Rhomed Incorporated | In vivo lymphocyte tagging |
| US5643549A (en) * | 1992-02-20 | 1997-07-01 | Rhomed Incorporated | Leukostimulatory agent for in vivo leukocyte tagging |
| US5798245A (en) * | 1993-10-07 | 1998-08-25 | Dana-Farber Cancer Institute | TIA-1 binding proteins and isolated complementary DNA encoding the same |
| US5968816A (en) * | 1993-10-12 | 1999-10-19 | Yeda Research And Development Company Ltd. | Tumor suppressor genes, proteins encoded thereby and use of said genes and proteins |
| US5605826A (en) * | 1994-06-10 | 1997-02-25 | Panorama Research, Inc. | 24 kilodalton cytoplasmic protease activating DNA fragmentation in apoptosis |
| US5952189A (en) * | 1994-06-10 | 1999-09-14 | Panorama Research, Inc. | Assay for inhibitors of a 24 kD cytoplasmic protease which activates DNA fragmentation in apoptosis |
| JPH0856655A (ja) * | 1994-08-16 | 1996-03-05 | Frontier:Kk | 細胞致死剤および細胞死抑制剤 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4122215A (en) * | 1976-12-27 | 1978-10-24 | Bell Telephone Laboratories, Incorporated | Electroless deposition of nickel on a masked aluminum surface |
| US4882268A (en) * | 1985-12-24 | 1989-11-21 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for determining tissue of origin and degree of malignancy of tumor cells |
| US5039606A (en) * | 1987-10-29 | 1991-08-13 | Virginia Mason Research Center | Diagnostic probe for diabetes type I predisposition |
| US4925648A (en) * | 1988-07-29 | 1990-05-15 | Immunomedics, Inc. | Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions |
| WO1990015822A1 (en) * | 1989-06-15 | 1990-12-27 | Dana-Farber Cancer Institute | Monoclonal antibody to intracellular epitope of human t cell receptor zeta chain and method of preparation |
| WO2000015822A1 (en) * | 1998-09-17 | 2000-03-23 | University Of Florida | Methods for treatment of degenerative retinal diseases |
-
1990
- 1990-01-05 US US07/460,678 patent/US5079343A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-28 JP JP2415435A patent/JPH05184387A/ja active Pending
- 1990-12-31 EP EP90314456A patent/EP0436400B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-31 DE DE69033260T patent/DE69033260D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-31 AT AT90314456T patent/ATE183777T1/de not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-01-04 CA CA002033644A patent/CA2033644A1/en not_active Abandoned
- 1991-07-10 US US07/726,607 patent/US5298407A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE183777T1 (de) | 1999-09-15 |
| DE69033260D1 (de) | 1999-09-30 |
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| US5079343A (en) | 1992-01-07 |
| EP0436400A1 (en) | 1991-07-10 |
| CA2033644A1 (en) | 1991-07-06 |
| US5298407A (en) | 1994-03-29 |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20001107 |