JPH0518559B2 - - Google Patents
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- JPH0518559B2 JPH0518559B2 JP4003284A JP4003284A JPH0518559B2 JP H0518559 B2 JPH0518559 B2 JP H0518559B2 JP 4003284 A JP4003284 A JP 4003284A JP 4003284 A JP4003284 A JP 4003284A JP H0518559 B2 JPH0518559 B2 JP H0518559B2
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明はトロンビン阻害物質の一つであるヘパ
リンコフアクタ−（以下HCと略す）の測定
法に関する。 血栓形成機序に重要な役割を果たす物質として
アンチトロンビン（以下ATと略す）が存在
する。ATは、活性型凝固因子であるトロンビ
ン、ａ因子等のセリンタンパク分解酵素を不活
性化させる物質であり、ヘパリンと結合してその
作用を増強させることが知られている。 近年、ATと同様にヘパリンと結合して抗ト
ロンビン作用を示す物質の存在が明らかになり、
このものはヘパリンコフアクタ−（以下HC
と略す）と称されている。HCはATととも
に血栓形成機序に重要な役割を果すものであり、
その動態を把握することは血栓症の病態生理上重
要な意義を有し、その測定方法の確立は非常に望
まれるところであつた。 本発明者等はかかる観点から、HCの定量方
法について鋭意検討した結果本発明を完成した。 本発明は、試料溶液、即ち、血液中に存在する
HCを測定するに際し、試料溶液、トロンビン
及びPH緩衝液の混液にデルマタン硫酸とトロンビ
ン用発色性基質を添加し一定条件下でインキユベ
ートした後吸光度を測定することによりHCの
含量を測定する方法である。なおHCと同様な
作用を有するATの測定法については、既に下
記の方法が確立されている。 即ち、ATを含む試料（血漿等）にヘパリン
を加えAT・ヘパリン複合体を形成させ、次い
で一定過剰量のトロンビンを加えAT・ヘパリ
ン・トロンビンの複合体を形成させAT量に対
応するトロンビンを不活性化させた後、これにト
ロンビン用発色性基質を添加し、残存トロンビン
含量を測定することにより間接的にATの活性
を測定するものである。 この測定法は試料中の総抗トロンビン物質の測
定法として実用化されている方法ではあるが、血
液中におけるHCの濃度がATに比べ低いこ
と及びHCの活性がATに比べ低いことから、
HCの分離定量法としては使用できない。 そこで、本発明者等はHCの測定法について
先づ、ATとは反応せずHCと選択的に反応
する物質について詳細に検討した結果、数多くの
ムコ多糖類のうちデルマタン硫酸が選択的にHC
と反応し、HC・デルマタン硫酸・トロンビ
ンの複合体の形成が選択的に形成されることを確
認した。 次いで、この複合体の形成がATの存在下で
も特異的であるか、即ち、血漿等の実際の試料に
おいて特異的であるか否かについて調べた。そそ
の結果、血漿中のHCとATの量比と略同じ
である３倍量のAT存在下でもこの複合体の形
成はほぼ影響されないこと、従つて、血漿等の試
料におけるHCの単独測定が可能であることを
見い出した。 かかる検討結果に基づき本発明は完成された
が、試料中のHCの測定に障害はないが、AT
も極く少量ではあるがデルマタン硫酸及びトロ
ンビンと複合体を形成する傾向がみとめられた。
それ故に本発明者等はHCのより精度の高い測
定法について検討した結果、反応系のインキユベ
ーシヨン時間をコントロールすることにより、
ATとの複合体の形成を阻止しうることを見い
出した。更に具体的に述べれば約37℃で反応系を
インキユベーシヨンする場合にはインキユベーシ
ヨン時間を約３分位とするとATの影響を完全
に除去することが出来ることを見い出した。 かかる総合的知見を基に本発明は完成されたも
のであり、本発明の好ましい実施態様は下記の通
りである。 試料にデルマタン硫酸、トロンビン、緩衝液を
加え約37℃で約３分間インキユベーシヨンした後
トロンビン用発色性基質を加え、更に同温度で数
分間インキユベートした後クエン酸を添加し、発
色を吸光度測定し、検量線からHCの試料中含
量を測定する。 上記測定法において使用される発色性基質とし
ては市販のトロンビン用発色基質が広く使用でき
るが、本実験においてはＨ−Ｄ−フエニルアラニ
ル−Ｌ−ヒペコリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニト
ロアニリド・二塩酸塩（商品名 Ｓ−2238）を使
用した。 以下試験例を挙げて本発明を説明する。 試験例 １ 各種ムコ多糖類と抗トロンビン物質との反応性 HC又はAT3.6μｇ／ml、トロンビン
3.5nKat／ml、Tris−HCl（PH8.4）16.7ミリモル、
食塩100ミリモルに各種ムコ多糖類の一定量（０
〜1000μｇ／ml）を加え37℃５分間インキユベー
シヨンし、これに0.8ミリモルのＳ−2238（100μ
）を加える。混液を37℃５分間インキユベーシ
ヨンした後２％クエン酸1.0mlを加え該溶液を
405nｍの波長で吸光度を測定し、それぞれの反
応系においてトロンビンを50％阻害するに必要な
ムコ多糖類の濃度を求めた。その結果は表−１に
示される。表において、数値が小さい程HCま
たはATと結合して抗トロンビン活性を増加さ
せる能力が大きいことを意味する。表−１からも
明らかな如く、デルマタン硫酸はその他のムコ多
糖類に比べATとの反応性は極めて低く、HC
とは高い反応性を有することが認められた。
リンコフアクタ−（以下HCと略す）の測定
法に関する。 血栓形成機序に重要な役割を果たす物質として
アンチトロンビン（以下ATと略す）が存在
する。ATは、活性型凝固因子であるトロンビ
ン、ａ因子等のセリンタンパク分解酵素を不活
性化させる物質であり、ヘパリンと結合してその
作用を増強させることが知られている。 近年、ATと同様にヘパリンと結合して抗ト
ロンビン作用を示す物質の存在が明らかになり、
このものはヘパリンコフアクタ−（以下HC
と略す）と称されている。HCはATととも
に血栓形成機序に重要な役割を果すものであり、
その動態を把握することは血栓症の病態生理上重
要な意義を有し、その測定方法の確立は非常に望
まれるところであつた。 本発明者等はかかる観点から、HCの定量方
法について鋭意検討した結果本発明を完成した。 本発明は、試料溶液、即ち、血液中に存在する
HCを測定するに際し、試料溶液、トロンビン
及びPH緩衝液の混液にデルマタン硫酸とトロンビ
ン用発色性基質を添加し一定条件下でインキユベ
ートした後吸光度を測定することによりHCの
含量を測定する方法である。なおHCと同様な
作用を有するATの測定法については、既に下
記の方法が確立されている。 即ち、ATを含む試料（血漿等）にヘパリン
を加えAT・ヘパリン複合体を形成させ、次い
で一定過剰量のトロンビンを加えAT・ヘパリ
ン・トロンビンの複合体を形成させAT量に対
応するトロンビンを不活性化させた後、これにト
ロンビン用発色性基質を添加し、残存トロンビン
含量を測定することにより間接的にATの活性
を測定するものである。 この測定法は試料中の総抗トロンビン物質の測
定法として実用化されている方法ではあるが、血
液中におけるHCの濃度がATに比べ低いこ
と及びHCの活性がATに比べ低いことから、
HCの分離定量法としては使用できない。 そこで、本発明者等はHCの測定法について
先づ、ATとは反応せずHCと選択的に反応
する物質について詳細に検討した結果、数多くの
ムコ多糖類のうちデルマタン硫酸が選択的にHC
と反応し、HC・デルマタン硫酸・トロンビ
ンの複合体の形成が選択的に形成されることを確
認した。 次いで、この複合体の形成がATの存在下で
も特異的であるか、即ち、血漿等の実際の試料に
おいて特異的であるか否かについて調べた。そそ
の結果、血漿中のHCとATの量比と略同じ
である３倍量のAT存在下でもこの複合体の形
成はほぼ影響されないこと、従つて、血漿等の試
料におけるHCの単独測定が可能であることを
見い出した。 かかる検討結果に基づき本発明は完成された
が、試料中のHCの測定に障害はないが、AT
も極く少量ではあるがデルマタン硫酸及びトロ
ンビンと複合体を形成する傾向がみとめられた。
それ故に本発明者等はHCのより精度の高い測
定法について検討した結果、反応系のインキユベ
ーシヨン時間をコントロールすることにより、
ATとの複合体の形成を阻止しうることを見い
出した。更に具体的に述べれば約37℃で反応系を
インキユベーシヨンする場合にはインキユベーシ
ヨン時間を約３分位とするとATの影響を完全
に除去することが出来ることを見い出した。 かかる総合的知見を基に本発明は完成されたも
のであり、本発明の好ましい実施態様は下記の通
りである。 試料にデルマタン硫酸、トロンビン、緩衝液を
加え約37℃で約３分間インキユベーシヨンした後
トロンビン用発色性基質を加え、更に同温度で数
分間インキユベートした後クエン酸を添加し、発
色を吸光度測定し、検量線からHCの試料中含
量を測定する。 上記測定法において使用される発色性基質とし
ては市販のトロンビン用発色基質が広く使用でき
るが、本実験においてはＨ−Ｄ−フエニルアラニ
ル−Ｌ−ヒペコリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニト
ロアニリド・二塩酸塩（商品名 Ｓ−2238）を使
用した。 以下試験例を挙げて本発明を説明する。 試験例 １ 各種ムコ多糖類と抗トロンビン物質との反応性 HC又はAT3.6μｇ／ml、トロンビン
3.5nKat／ml、Tris−HCl（PH8.4）16.7ミリモル、
食塩100ミリモルに各種ムコ多糖類の一定量（０
〜1000μｇ／ml）を加え37℃５分間インキユベー
シヨンし、これに0.8ミリモルのＳ−2238（100μ
）を加える。混液を37℃５分間インキユベーシ
ヨンした後２％クエン酸1.0mlを加え該溶液を
405nｍの波長で吸光度を測定し、それぞれの反
応系においてトロンビンを50％阻害するに必要な
ムコ多糖類の濃度を求めた。その結果は表−１に
示される。表において、数値が小さい程HCま
たはATと結合して抗トロンビン活性を増加さ
せる能力が大きいことを意味する。表−１からも
明らかな如く、デルマタン硫酸はその他のムコ多
糖類に比べATとの反応性は極めて低く、HC
とは高い反応性を有することが認められた。
【表】
試験例 ２
AT存在下におけるデルマタン硫酸とHC
との反応性 デルマタン硫酸を具体的試料（血漿等）に添加
してそのなかのHCを選択的に測定可能か否か
について調べる目的で、デルマタン硫酸と、HC
、AT及びHC＋AT（１：３）との反応
性を調べた。 即ち、20μｇ／mlのデルマタン硫酸、トロンビ
ン3.5nKat／ml、This−HCl（PH8.4）16.7ミリモ
ル、食塩100ミリモルの混液に、純化精製した
HC、AT（HCの３倍濃度）又はHC＋
ATの１：３混合物の各々を濃度を変化させて
混合した反応系を作り、試験例１と同様に操作し
各々の反応性を測定した。結果は表−２で示され
る通り、HC単独反応系では濃度に比例した吸
光度の低下が認められ、AT単独反応系では極
く小さい低下しか認められず、混合反応系では
HC単独反応系とほぼ同様な傾向が認められ
た。
との反応性 デルマタン硫酸を具体的試料（血漿等）に添加
してそのなかのHCを選択的に測定可能か否か
について調べる目的で、デルマタン硫酸と、HC
、AT及びHC＋AT（１：３）との反応
性を調べた。 即ち、20μｇ／mlのデルマタン硫酸、トロンビ
ン3.5nKat／ml、This−HCl（PH8.4）16.7ミリモ
ル、食塩100ミリモルの混液に、純化精製した
HC、AT（HCの３倍濃度）又はHC＋
ATの１：３混合物の各々を濃度を変化させて
混合した反応系を作り、試験例１と同様に操作し
各々の反応性を測定した。結果は表−２で示され
る通り、HC単独反応系では濃度に比例した吸
光度の低下が認められ、AT単独反応系では極
く小さい低下しか認められず、混合反応系では
HC単独反応系とほぼ同様な傾向が認められ
た。
【表】
試験例 ３
インキユベーシヨン条件の検討
試験例２のAT単独反応系で若干の反応性が
認められたので、この影響を完全にさせることが
インキユベーシヨン条件の選択で可能か否かにつ
いて検討した結果、インキユベーシヨン時間を選
択することにより可能であることを確認した。即
ち、HC3.57μｇ／ml又はその３倍量に相当する
AT存在下に０〜５分間のインキユベーシヨン
時間で試験例１の操作をおこなつた。結果は表−
３に示される通りATは約３分迄はほとんど抗
トロンビン作用を示さずHCは３分と５分でそ
の活性にほとんど差がない。従つてインキユベー
シヨン時間を約３分とすることによりATの影
響なくHCの選択的定量が可能であることが確
認された。
認められたので、この影響を完全にさせることが
インキユベーシヨン条件の選択で可能か否かにつ
いて検討した結果、インキユベーシヨン時間を選
択することにより可能であることを確認した。即
ち、HC3.57μｇ／ml又はその３倍量に相当する
AT存在下に０〜５分間のインキユベーシヨン
時間で試験例１の操作をおこなつた。結果は表−
３に示される通りATは約３分迄はほとんど抗
トロンビン作用を示さずHCは３分と５分でそ
の活性にほとんど差がない。従つてインキユベー
シヨン時間を約３分とすることによりATの影
響なくHCの選択的定量が可能であることが確
認された。
【表】
【表】
試験例 ４
血漿中のHC含量の測定
試験例１〜３の確認事項をもとに具体的試料と
して血漿を使用しHCの含量を測定した。即
ち、試料としてHC（2.68μｇ／ml）、AT
（80.4μｇ／ml）又は50ミリモルTris−HCl（PH8.4）
緩衝液で10倍に希釈した血漿を各々量を変えて反
応系に添加したこと、デルマタン硫酸を20μｇ／
ml使用したこと及び反応系のインキユベーシヨン
時間を３分間としたこと以下は試験例１と同じ条
件を採用しててHCの反応性を調べた。結果は
表−４に示される通り、本発明方法は具体的試料
中のHCの測定において優れた方法であること
が確認された。
して血漿を使用しHCの含量を測定した。即
ち、試料としてHC（2.68μｇ／ml）、AT
（80.4μｇ／ml）又は50ミリモルTris−HCl（PH8.4）
緩衝液で10倍に希釈した血漿を各々量を変えて反
応系に添加したこと、デルマタン硫酸を20μｇ／
ml使用したこと及び反応系のインキユベーシヨン
時間を３分間としたこと以下は試験例１と同じ条
件を採用しててHCの反応性を調べた。結果は
表−４に示される通り、本発明方法は具体的試料
中のHCの測定において優れた方法であること
が確認された。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 試料にトロンビン、デルマタン硫酸及びPH調
整用緩衝液を添加し、トロンビン、デルマタン硫
酸及び試料中のヘパリンコフアクタ−の三者の
複合体を形成させ、残存トロンビン量を測定する
ことを特徴とするヘパリンコフアクタ−の測定
法。 ２ 試料、トロンビン、デルマタン硫酸及びPH調
整用緩衝液の反応系液のインキユベーシヨン時間
が３分以内である特許請求の範囲第１項記載の方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4003284A JPS60185163A (ja) | 1984-03-02 | 1984-03-02 | 抗トロンビン物質の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4003284A JPS60185163A (ja) | 1984-03-02 | 1984-03-02 | 抗トロンビン物質の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60185163A JPS60185163A (ja) | 1985-09-20 |
| JPH0518559B2 true JPH0518559B2 (ja) | 1993-03-12 |
Family
ID=12569567
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4003284A Granted JPS60185163A (ja) | 1984-03-02 | 1984-03-02 | 抗トロンビン物質の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60185163A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU1983699A (en) * | 1998-01-30 | 1999-08-16 | Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. | Method for measuring heparin cofactor ii activity and reagent kit |
-
1984
- 1984-03-02 JP JP4003284A patent/JPS60185163A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60185163A (ja) | 1985-09-20 |
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